CN110172477B - 一种优化的获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用。本发明创造性的将其载体***中整个诱导删除***和选择标记基因表达框置于两个loxP/FRT删除位点之间；同时在删除位点外还引入了两个同向排列的MAR序列，可将整个外源基因表达框***其中，增强外源基因表达的稳定性。将本发明优化后的***诱导的删除载体转化水稻后，外源基因在选择标记基因删除前即可正常表达，便于尽早获得具有目的性状的株系。此外，未删除的选择标记基因能大大减少纯合株系的筛选工作量，加快筛选速度。本发明能更方便、快捷得获得具有目的性状、无选择标记的转基因纯合株系，具有广阔的应用前景。

Description

一种优化的获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达 载体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用，特别涉及一种优化的Cre/LoxP介导的获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用。

背景技术

植物转基因技术自1983年问世以来，得到了长足的发展，它可以打破不同物种之间生物隔离，使物种之间的基因交流成为可能，让转基因作物向需要的方向发展。目前研究人员已发现多种不同的转基因方法，如农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法、显微注射法、脂质体法等。利用这些转化方法将外源基因导入到植物细胞时，通常只有部分细胞可以成为稳定的转化细胞，选择标记基因的应用使转化细胞在相应的选择压力下仍可继续存活并分化成植株，而非转化细胞将死亡。然而，选择标记基因及其蛋白产物毕竟不是基因工程的目的产品，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。主要有以下几点：

一是抗生素类基因编码产物可能对人类或动物有潜在的毒性或致敏性；二是标记基因有可能会通过不同的途径在物种间传播，威胁生态环境，包括转基因作物导致杂草问题、产生病毒或加重病害对非目标生物的影响。此外，选择标记基因的存在还限制了转基因作物的进一步改良，当转基因植物中已存在某一选择标记基因时，该基因在随后的再次转化中就不能再作为选择标记，这样便给植物再次导入外源基因带来一定的限制。而由于目前可供利用的选择标记基因为数甚少，不可能每次转化都更换新的选择标记基因，重复转化将难以实现。因此，建立无选择标记植物转化***，培育无选择标记的转基因植物将从根本上解决这个问题，且无论是从安全性考虑，还是从转基因技术本身考虑均具有着重要的意义。

无选择标记转基因植物的研究和培育已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。迄今，已有一些方法可获得不带选择标记基因的转化植物，主要的有共转化方法、转座子成份介导法、染色体同源重组介导法、位点特异性重组***介导法等。此外，作为调控基因表达的一种策略，使用化学诱导性启动子的化学诱导表达***相比于组成型启动子介导的组成型表达***更加适合研究植物基因功能。2017年福建省农科院王锋研究员课题组研发了一套由***诱导的基于Cre/LoxP***的去选择标记载体pXCLF(cheng et al.,Front Plant Sci,2017)，其Cre酶的识别位点为LoxP-FRT融合序列，比单独的LoxP序列具有更高的重组效率。但是这套***缺乏增强外源基因表达的载体元件，而且在β-***诱导去除选择标记基因之前，目的基因和启动子之间被诱导删除***隔开，导致其不能表达，这样选择标记基因删除之前无法对目的基因的表达量进行分析，为后续筛选带来不便。因此建立一种优化的化学诱导删除体系对于无选择标记转基因植物的培育具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种优化的Cre/LoxP介导的化学诱导删除载体。

第一方面，本发明保护植物表达载体甲。

本发明保护的植物表达载体甲包括一个T-DNA区域，所述T-DNA区域依次包括T-DNA右边界、第一个loxP/FRT位点、***诱导的转录激活***XVE的编码基因表达盒、选择标记基因表达盒、Cre重组酶的编码基因表达盒、第二个loxP/FRT位点、第一个MAR序列、用于***外源基因表达盒的多克隆位点、第二个MAR序列、T-DNA左边界。

进一步的，所述植物表达载体甲还包括增强外源基因表达的元件。

更进一步的，所述增强外源基因表达的元件为可用于增强外源基因表达的MAR序列。所述MAR序列是一段核基质结合序列，置于外源表达结构的两侧可提高外源基因的表达水平，或明显减少外源基因在转基因植株间的表达差异。利用MARs来稳定、提高外源基因的表达是克服外源基因失活的一种有效方法。

在本发明的一个具体实施例中，所述植物表达载体甲包括两个MAR序列：第一个MAR序列和第二个MAR序列。所述第一个MAR序列和所述第二个MAR序列为同向排列。所述T-DNA区域依次包括T-DNA右边界、第一个loxP/FRT位点、***诱导的转录激活***XVE的编码基因表达盒、选择标记基因表达盒、Cre重组酶的编码基因表达盒、第二个loxP/FRT位点、第一个MAR序列、用于***外源基因表达盒的多克隆位点、第二个MAR序列、T-DNA左边界。

上述植物表达载体甲中，所述选择标记基因可以包括任何适用于遗传转化的选择标记基因，例如新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase-II，Npt-II)基因、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，Cat)基因、二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)基因、潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase，HPT)基因、膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin-N-acetyltransferase，Bar)基因和5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPs)基因等。在本发明的一个具体实施例中，所述选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPT。

上述植物表达载体甲中，

所述***诱导的转录激活***XVE的编码基因表达盒包括用于启动融合转录因子XVE的编码基因表达的Ubiquitin启动子、融合转录因子XVE的编码基因和用于终止融合转录因子XVE的编码基因表达的rbsc E9终止子。

所述选择标记基因表达盒包括用于启动选择标记基因表达的35S启动子、选择标记基因和用于终止选择标记基因表达的NOS终止子。

所述Cre重组酶的编码基因表达盒包括用于启动Cre重组酶的编码基因表达的LexA-35S启动子、Cre重组酶的编码基因和用于终止Cre重组酶的编码基因表达的NOS终止子。

所述用于***外源基因表达盒的多克隆位点依次包括KpnI、SbfI。

上述植物表达载体甲中，

所述T-DNA右边界的核苷酸序列如序列1自5’末端第1-26位所示。

所述第一个loxP/FRT位点的核苷酸序列如序列1自5’末端第93-178位所示。

所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列如序列1自5’末端第277-2262位所示。

所述融合转录因子XVE的编码基因的核苷酸序列如序列1自5’末端第2271-3836位所示。

所述rbsc E9终止子的核苷酸序列如序列1自5’末端第3863-4163位所示。

所述35S启动子的核苷酸序列如序列1自5’末端第4246-5014位所示。

所述潮霉素磷酸转移酶基因的核苷酸序列如序列1自5’末端第5049-6074位所示。

用于终止所述潮霉素磷酸转移酶基因表达的NOS终止子的核苷酸序列如序列1自5’末端第6113-6388位所示。

所述LexA-35S启动子的核苷酸序列如序列1自5’末端第6451-6741位所示。

所述Cre重组酶的编码基因的核苷酸序列如序列1自5’末端第6763-7964位所示。

用于终止所述Cre重组酶的编码基因表达的NOS终止子的核苷酸序列如序列1自5’末端第7978-8390位所示。

所述第二个loxP/FRT位点的核苷酸序列如序列1自5’末端第8395-8480位所示。

所述第一个MAR序列如序列1自5’末端第8544-9290位所示。

所述用于***外源基因表达盒的多克隆位点的核苷酸序列如序列1自5’末端第9507-9563位所示。

所述第二个MAR序列如序列1自5’末端第9827-10688位所示。

所述T-DNA左边界的核苷酸序列如序列1自5’末端第10792-10817位所示。

上述植物表达载体甲中，所述T-DNA区域的核苷酸序列如序列1所示。

上述植物表达载体甲具体可按照如下方法制备：首先，以待改造的载体pXCLF为模板，利用PCR分别扩增原始载体上的XVE-loxP序列、Ubiquitin启动子序列，分别连接pEASY-Blunt载体，分别得到中间载体pEASY-XVE-loxPR和pEASY-pU。然后，分别双酶切载体pEASY-XVE-loxPR和pEASY-pU，并回收前者产物的片段和后者作为载体骨架的片段，利用T4DNA连接酶将这两个片段相连，获得重组载体pE-UXL。同样，以载体pXCLF为模板，利用PCR扩增loxP-FRT位点的片段，回收后连入pEASY-Blunt克隆载体中，得到中间载体pEASY-loxp。酶切载体pEASY-loxp，回收片段作为载体骨架，将pE-UXL酶切后的产物连到回收的载体骨架中，获得重组载体pEASY-XCLFm。以载体pDTmar-hyg为模板，利用PCR扩增获得包含MAR序列的片段，回收后连入pEASY-Blunt克隆载体中，得到中间载体pEASY-Mar。再利用酶切回收、连接将其连入载体pC2300，获得重组载体pMarmini。用酶切后的pMarmini的回收片段作为载体骨架，将pEASY-XCLFm的酶切产物用T4DNA连接酶连入酶切后的pMarmini骨架中，得到重组载体即为植物表达载体甲。

第二方面，本发明保护DNA片段。

本发明保护的DNA片段为上述T-DNA区域。

含有所述DNA片段的重组载体、重组菌或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述重组载体具体可为实施例中的化学诱导删除载体pMOCN。

所述重组菌具体可为含有所述重组载体的农杆菌。所述农杆菌可为根癌农杆菌；所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌LBA4404。

第三方面，本发明保护植物表达载体乙。

本发明保护的植物表达载体乙为将外源基因表达盒***上述植物表达载体甲中的用于***外源基因表达盒的多克隆位点得到的载体。

上述任一所述的植物表达载体中，所述外源基因可以包括任何在生产上有应用价值的基因，如抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗衰老基因、抗逆基因、品质改良等基因或由上述基因组成的融合或多价基因。在本发明的一个具体实施例中，所述外源基因具体为抗虫基因HY151。所述外源基因的启动子可以包括组成型启动子、器官特异性启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或者由启动子和调控元件组成的复合启动子。

进一步的，所述外源基因表达盒包括韧皮部特异启动子pRSs1、Ubiquitin启动子第一内含有子、抗虫基因HY151和水稻谷蛋白基因GluB-5的终止子TgluB。

更进一步的，所述外源基因表达盒的核苷酸序列如序列2所示。

所述植物表达载体乙为将序列2所示的抗虫基因HY151表达盒***植物表达载体甲的KpnI和SbfI酶切位点间得到的载体。所述植物表达载体乙使外源基因能在***诱导去除选择标记基因之前进行表达，在选择标记基因删除之前就可实现对外源基因的表达量进行分析，便于尽早获得具有目的性状的株系。

上述植物表达载体甲或上述DNA片段或上述植物表达载体乙在培育无选择标记基因的转基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。

第四方面，本发明保护培育无选择标记基因的转基因植物的方法。

本发明保护的培育无选择标记基因的转基因植物的方法包括如下步骤：

1)将上述植物表达载体乙转化出发植物，通过选择标记基因筛选得到含有外源基因和选择标记基因的转基因植物；

2)将所述转基因植物在***诱导条件下培养，得到含有外源基因且不含有选择标记基因的转基因植物。

上述方法中，所述***为β-***。

以上任一所述的植物表达载体或应用或方法中，上述植物包括双子叶植物和单子叶植物，如烟草、棉花、大豆、花生、番茄、辣椒、油菜或白菜，以及水稻、小麦、玉米、高梁、大麦、燕麦或黑麦等。进一步，所述单子叶植物具体为水稻。更进一步的，所述水稻为籼稻。所述籼稻品种具体为明恢86。

定义

“植物表达载体”是指能驱动目的基因或外源基因在植物体内表达的载体。

“Ti质粒”是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中的一种双链环状DNA分子，一般具有T-DNA区(transferred-DNA regions)、毒性区(virulence region)、质粒复制起点(origin of replication)和质粒结合转移位点(regions encoding conjugation)。在农杆菌侵染植物细胞时，T-DNA区在毒性区的激活下能从Ti质粒上转移并整合到植物染色体中。Ti质粒载体***目前被广泛应用于植物基因工程领域。

“T-DNA”是根癌农杆菌内Ti质粒上的一段能从质粒上转移并整合到寄主植物基因组中的DNA，即transferred DNA。T-DNA两端各有一段长约25bp的边界序列(bordersequence)，分别称为左边界(LB)和右边界(RB)。边界序列的存在是T-DNA保留转移特性的必需元件。当保留T-DNA的边界序列时，以目的基因取代野生型T-DNA的部分基因组后，改造后的T-DNA仍能进入植物细胞并整合到植物染色体组中。T-DNA在受体植物染色体上的整合位点是随机的。目前，在植物基因工程应用中，野生型根癌农杆菌T-DNA中的致瘤基因被外源基因和选择标记基因替换，仅保留边界序列。

“基因”是指编码一种特定蛋白的全部或部分的核酸片段，并包括该编码区前面(5’非编码区)和后面(3’非编码区)的调控序列。

“外源基因”是指正常情况下宿主生物中没有的、通过基因转移导入的基因；也可指正常存在于宿主生物中的，但又被重新导入其基因组中其天然基因座之外的另一基因座的基因，这种变化会导致一种内源基因的编码序列的一个或几个额外拷贝的出现。

本发明在合作单位福建农科院王锋研究员课题组所研制的***诱导删除***的载体pXCLF的基础上，创造性的将其载体***中整个诱导删除***和选择标记基因表达框置于两个loxP/FRT删除位点之间；同时在删除位点外还引入了两个同向排列的MAR序列，可将整个外源基因表达框***其中，增强外源基因表达的稳定性。通过实验证明：将本发明优化后的***诱导的删除载体转化水稻后，外源基因在选择标记基因删除前即可正常表达，使得T0代转基因植株即可表现出目的基因的功能，便于尽早获得具有目的性状的株系。此外，在获得纯合株系前保留选择标记基因能大大减少纯合株系的筛选工作量，加快筛选速度。本发明能更方便、快捷得获得具有目的性状、无选择标记的转基因纯合株系，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为***诱导的删除载体pXCLF的物理图谱。

图2为载体pEASY-xve-loxPR的物理图谱。

图3为载体pEASY-pU的物理图谱。

图4为载体pE-UXL的物理图谱。

图5为载体pEASY-loxp的物理图谱。

图6为载体pEASY-XCLFm的物理图谱。

图7为载体pDTmar-hyg的物理图谱。

图8为载体pEASY-Mar的物理图谱。

图9为载体pC2300的物理图谱。

图10为载体pMarmini的物理图谱。

图11为优化的Cre/LoxP介导的化学诱导删除载体pMOCN的物理图谱。

图12为载体pDTmarNR151g的物理图谱。

图13为整合外源基因HY151的优化的化学诱导删除载体pMOCN-HY151的物理图谱。

图14为转整合HY151的优化的化学诱导删除载体T₀代水稻植株PCR分析的电泳图谱。

图15为转整合HY151的优化的化学诱导删除载体T₀代水稻植株qPCR分析的电泳图谱。

图16为转整合HY151的优化的化学诱导删除载体经β-***诱导后T₁代水稻植株PCR分析的电泳谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的载体pXCLF记载于文献“cheng et al.,Front Plant Sci,2017，8,1447”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中的载体pDTmar-hyg记载于文献“中国科学院博士研究生学位论文，Cry30Fa1及Cry54Aa1的改造及其在抗褐飞虱转基因水稻中的应用研究，陈书元，2016年”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)。

下述实施例中的载体pDTmarNR151g是将优化后的HY151序列(序列表2自5’末端第3187-5031位所示)、韧皮部特异启动子pRSs1序列(序列2自5’末端第1-2096位所示)及水稻谷蛋白基因GluB-5的终止子TgluB序列(序列2自5’末端第5050-5546位所示)整合到pDTmar-hyg载体的多克隆位点上得到的载体。

下述实施例构建载体过程中质粒提取、酶切、DNA回收、纯化均按分子克隆(分子克隆：实验室手册，Sambrook et al,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中的方法进行。

下述实施例籼稻品种明恢86记载于文献“苏军等.农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立。福建农业学报，2003，18(4)，209-213.”中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。籼稻品种明恢86以下简称为明恢86或野生型水稻。

下述实施例中的培养基配方：

YEB液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgSO₄·7H₂O 0.04g溶于1L去离子水，用10M NaOH水溶液调节pH至7.2，高温高压灭菌20min。

诱导培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2，4-D 2.0mg、蔗糖30.0g和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min。

共培养培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2,4-D 2.0mg、蔗糖30.0g、植物凝胶4.5g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.2，121℃灭菌15min，待冷却至50-60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的葡萄糖10g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg和乙酰丁香酮，乙酰丁香酮在体系中的终浓度为100μM。

预培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2，4-D 2.0mg、蔗糖30.0g、植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至50-60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的葡萄糖10g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg。

分化培养基：将20×MS大量母液50mL、200×MS微量母液5mL、200×MS铁盐母液5mL、200×MS有机母液5mL、水解酪蛋白1000mg、谷氨酰胺500mg、蔗糖30.0g、山梨醇20g、NAA0.4mg、6-BA 2.0mg、KT 1mg和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min。

生根培养基：将20×MS大量母液25mL、200×MS微量母液2.5mL、200×MS铁盐母液2.5mL、200×MS有机母液2.5mL、蔗糖15g和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至50-60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的潮霉素30mg。

1/2MS培养液：将20×MS大量母液25mL、200×MS微量母液2.5mL、200×MS铁盐母液2.5mL、200×MS有机母液2.5mL溶于1L蒸馏水中，调节pH至5.8。

50×N6大量母液的溶剂为水，溶质及其浓度为：141.50g/L KNO₃、20g/L KH₂PO₄、23.15g/L(NH₄)₂SO₄、9.25g/L MgSO₄·7H₂O、8.30g/L CaCl₂·2H₂O，pH自然。

100×B5微量母液的溶剂为水，溶质及其浓度为：0.3g/L H₃BO₃、1g/L MnSO₄·4H₂O、0.0025g/L CoCl₂·6H₂O、0.0025g/L CuSO₄·5H₂O、0.2g/L ZnSO₄·7H₂O、0.025g/LNa₂MoO₄·2H₂O、0.075g/L KI，pH自然。

1000×B5有机母液的溶剂为水，溶质及其浓度为：2g/L甘氨酸、100g/L肌醇、1g/L烟酸、1g/L盐酸吡哆醇、10g/L盐酸硫胺素，pH自然。

20×MS大量母液的溶剂为水，溶质及其浓度为：38.00g/L KNO₃，8.80g/L CaCl₂·2H₂O，7.40g/L MgSO₄·7H₂O，3.40g/L KH₂PO₄，33.00g/L NH₄NO₃，pH自然。

200×MS微量母液的溶剂为水，溶质及其浓度为：4.46g/L MnSO₄·4H₂O，0.166g/LKI，1.24g/L H₃BO₃，1.72g/L ZnSO₄·7H₂O，0.050g/L Na₂MoO₄·2H₂O，0.005g/L CuSO₄·5H₂O，0.005g/L CoCl₂·6H₂O，pH自然。

200×MS铁盐母液的溶剂为水，溶质及其浓度为：5.56g/L FeSO₄·7H₂O，7.46g/LNa₂·EDTA·2H₂O，pH自然。

200×MS有机母液的溶剂为水，溶质及其浓度为：20g/L肌醇，100mg/L烟酸，100mg/L盐酸吡哆醇，100mg/L盐酸硫胺素，400mg/L甘氨酸，pH自然。

CTAB缓冲液：30g/L CTAB，1.4mol/L NaCl，0.2％巯基乙醇，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl，pH8.0。

植物营养液(10×)：KNO₃ 19g、CaCl₂·2H₂O 4.4g、MgSO₄·7H₂O 3.7g、KH₂PO₄1.7g、NH₄NO₃ 16.5g、铁盐0.415g，定容至1L。

实施例1、优化的化学诱导删除载体pMOCN的构建

1、以待改造的载体pXCLF(载体示意图见图1)为模板，用引物primer-1：5'-cgactagtgaagatctg-3'和primer-2：5'-agcgctatgaaagcgttaacggcc-3'(下划线为AfeI酶切位点)进行PCR扩增，获得6280bp的产物，回收后连入pEASY-Blunt克隆载体(TransGenBiotech)中，得到中间载体pEASY-XVE-loxPR(载体示意图见图2)。

2、以待改造的载体pXCLF(载体示意图见图1)为模板，用引物primer-3：5'-gggcacctgcagggtgcagcgtgacccggtcgt-3'(下划线为SbfI酶切位点)和primer-4：5'-agcgctctgcagaagtaacacc-3'(下划线为AfeI酶切位点)进行PCR扩增，获得2007bp的Ubiquitin启动子片段，回收后连入pEASY-Blunt克隆载体中，得到中间载体pEASY-pU(载体示意图见图3)。

3、用AfeI和SpeI分别双酶切载体pEASY-XVE-loxPR和pEASY-pU，并回收前者产物中6274bp的片段和后者作为载体骨架的5898bp片段。利用T4DNA连接酶将这两个片段相连，获得重组载体pE-UXL(载体示意图见图4)。

4、以待改造的载体pXCLF(载体示意图见图1)为模板，用引物primer-5：5'-ggactagtggaattcgataaacc-3'(下划线为SpeI酶切位点)和primer-6：5'-cgaccgggtcacgctgcaccggatttaattgaagttcc-3'进行PCR扩增，获得141bp的含loxP-FRT位点的片段，回收后连入pEASY-Blunt克隆载体中，得到中间载体pEASY-loxp(载体示意图见图5)。

5、用EcoRV单酶切载体pEASY-loxp，回收4070bp片段作为载体骨架。同时，用KpnI和SbfI双酶切pE-UXL，回收长度为8285bp的DNA片段，并用T4DNA聚合酶平端化片段两端的酶切位点。将该片段用T4DNA连接酶连入上述EcoRV单酶切所得骨架中，获得重组载体pEASY-XCLFm(载体示意图见图6)。

6、以载体pDTmar-hyg(载体示意图见图7)为模板，用引物primer-7：5'-cggtatcgataagctggatcc-3'和primer-8：5'-gatagtttcgataagctggatcaac-3'进行PCR扩增，获得2185bp的包含MAR序列的片段，回收后连入pEASY-Blunt克隆载体中，得到中间载体pEASY-Mar(载体示意图见图8)。

7、用SpeI和ApaI双酶切中间载体pEASY-Mar，回收长度为2281bp的片段并T4 DNA聚合酶平端化片段两端的酶切位点。同时，用PmeI和AseI双酶切载体pC2300(CAMBIA，Canberra，Australia，载体示意图见图9)，回收长度为6385bp的片段并T4 DNA聚合酶平端化片段两端的酶切位点。将上述这两个平端化后的片段用T4 DNA连接酶连接，获得重组载体pMarmini(载体示意图见图10)。

8、用SpeI单酶切pMarmini，回收长度为8652bp的片段作为载体骨架。同时，用SpeI酶切pEASY-XCLFm，回收长度为8419bp的片段，用T4DNA连接酶连入SpeI单酶切后的pMarmini骨架中，得到重组载体。将多个PCR鉴定为阳性的克隆进行测序分析，获得***方向正确的优化的化学诱导删除重组载体，命名为载体pMOCN(载体示意图见图11)。

优化的化学诱导删除载体pMOCN的T-DNA区域依次包括T-DNA右边界、第一个loxP/FRT位点、Ubiquitin启动子(含Ubiquitin第一内含子)、融合转录因子XVE的编码基因、rbscE9终止子、35S启动子、潮霉素磷酸转移酶编码基因HPT、NOS终止子、LexA-35S启动子、Cre重组酶的编码基因、NOS终止子、第二个loxP/FRT位点、第一个MAR序列、用于***外源基因表达盒的多克隆位点、第二个MAR序列和T-DNA左边界。

上述T-DNA区域的两个loxP/FRT位点间共包含三个表达盒：***诱导的转录激活***XVE的编码基因表达盒、选择标记基因表达盒、Cre重组酶的编码基因表达盒。其中，***诱导的转录激活***XVE的编码基因表达盒包括Ubiquitin启动子、融合转录因子XVE的编码基因和rbsc E9终止子；选择标记基因表达盒包括35S启动子、潮霉素磷酸转移酶基因HPT和NOS终止子；Cre重组酶的编码基因表达盒包括LexA-35S启动子、Cre重组酶的编码基因和NOS终止子。

上述用于***外源基因表达盒的多克隆位点依次包括KpnI、SbfI。

上述T-DNA区域的核苷酸序列如序列1所示。各部分的核苷酸序列如下所示：序列1自5’末端第1-26位核苷酸为T-DNA右边界；自5’末端第93-178位核苷酸为第一个loxP/FRT位点；自5’末端第277-2262位核苷酸为Ubiquitin启动子；自5’末端第2271-3836位核苷酸为融合转录因子XVE的编码基因；自5’末端第3863-4163位核苷酸为rbsc E9终止子；自5’末端第4246-5014位核苷酸为35S启动子；自5’末端第5049-6074位核苷酸为潮霉素磷酸转移酶基因；自5’末端第6113-6388位核苷酸为NOS终止子；自5’末端第6451-6741位核苷酸为LexA-35S启动子；自5’末端第6763-7964位核苷酸为Cre重组酶的编码基因；自5’末端第7978-8390位核苷酸为NOS终止子；自5’末端第8395-8480位核苷酸为第二个loxP/FRT位点；自5’末端第8544-9290位核苷酸为第一个MAR序列；自5’末端第9507-9563位核苷酸为用于***外源基因表达盒的多克隆位点；自5’末端第9827-10688位核苷酸为第二个MAR；自5’末端第10792-10817位核苷酸为T-DNA左边界。

实施例2、优化的化学诱导删除载体pMOCN-HY151的构建

1、KpnI和SbfI双酶切载体pDTmarNR151g(载体示意图见图12)，得到长度为5552bp的酶切产物，该酶切产物包含抗虫基因HY151表达盒，该表达盒包括韧皮部特异启动子pRSs1、Ubiquitin启动子第一内含子、抗虫基因HY151和水稻谷蛋白基因GluB-5的终止子TgluB。抗虫基因HY151表达盒的核苷酸序列如序列2所示，其中，序列2自5’末端第1-2096位核苷酸为韧皮部特异启动子pRSs1、自5’末端第2098-3105位核苷酸为Ubiquitin启动子第一内含子、自5’末端第3187-5031位核苷酸为抗虫基因HY151、自5’末端第5050-5546位核苷酸为水稻谷蛋白基因GluB-5的终止子TgluB。

2、将步骤1获得的酶切产物连入由KpnI和SbfI双酶切实施例1所得载体pMOCN后的回收片段(17044bp)中，得到优化的化学诱导删除载体pMOCN-HY151(载体示意图见13)。并对其进行测序鉴定。

经过测序鉴定表明：优化的化学诱导删除载体pMOCN-HY151为将序列表中序列2所示的抗虫基因HY151表达盒***优化的化学诱导删除载体pMOCN载体的KpnI和SbfI酶切位点间得到的载体。

从图13所示的结构示意图可以看出，植物表达载体pMOCN-HY151创造性的将其载体***中整个诱导删除***和选择标记基因表达框置于两个loxP/FRT删除位点之间；同时，在删除位点外还引入了两个同向排列的MAR序列，可将整个外源基因表达盒***其中。潮霉素磷酸转移酶编码基因(HPT)表达盒作为选择标记基因，抗虫基因HY151表达盒作为报告基因，代表外源基因。在外源基因的两侧同时还含有两段同向来源于豌豆的MAR序列，该序列可以提高和稳定外源基因在受体植物中的表达(Li X G,et al.2001.Science inChina(series C)44:400-408)。

实施例3、优化的化学诱导删除载体pMOCN-HY151在培育无选择标记转基因植物中的应用

一、T₀代转基因水稻植株的获得

取开花后12-15d水稻明恢86幼穗，剥去颍壳后在70％酒精中漂洗2min，然后在25％次氯酸钠中消毒30min，用无菌水冲洗3次后吸干水渍，取出幼胚，接种于诱导培养基上诱导愈伤组织。

将优化的化学诱导删除载体pMOCN-HY151通过电激法转化到根癌农杆菌LBA4404中，得到农杆菌LBA4404/pMOCN-HY151(提取质粒，用KpnI和SbfI酶切，得到17044bp和5552bp片段的为阳性)。

将农杆菌LBA4404/pMOCN-HY151接种于20mL YEB液体培养基(含Km，Rif各50mg/L)中，28℃避光培养过夜，次日按2％-4％转接到无抗菌素的YEB培养基(含乙酰丁香酮100μM)中，剧烈振荡培养3h。测OD值稀释至相应浓度(OD约0.5)。选取生长状态好的胚性愈伤为受体，加入相应浓度的根癌土壤杆菌液浸泡3-5min后将愈伤组织转接于共培养基上，28℃暗培养3d。将共培养愈伤组织于无菌培养皿中，用含Cef 400mg/L的无菌水漂洗3次，在无菌滤纸上吸干后转接于预培养基中25℃暗培养5-7d。然后依次经30-50mg/L HygB的严格筛选。获得的抗性愈伤组织在含50mg/L HygB的分化培养基上进行分化(初期为暗培养，10-15d后为14h/d的光周期培养)。得到的抗性小芽在生根培养基上进一步生根成完整的抗性植株。待植株长至6-10cm时，进行开放式水培养，长出新根后移栽温室，得到T₀代转pMOC-HY151水稻。

二、T₀代转基因水稻植株的分子检测

1、水稻总DNA的提取

分别称取T₀代转pMOCN-HY151水稻新鲜叶片0.3mg置于研钵中，加液氮研成粉末，再加入0.6mL 60℃预热的CTAB缓冲液。60℃保温30min，其间轻摇数次。然后加等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次，上清液转移到新的离心管中加入等体积异丙醇，形成的沉淀即是DNA，加入少许洗液(体积分数为76％的乙醇，10mmol/L NH₄AC)洗涤沉淀一次，干燥后用500μL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA)溶解DNA。随后加入RNase A(终浓度10mg/L)，37℃保温30min，依次用等体积的苯酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、氯仿:异戊醇(24:1)各抽提一次，水相加入2.5倍体积无水乙醇沉淀DNA。DNA干燥后溶解于100μL无菌水中，得到基因组DNA。

2、T₀代转基因水稻PCR检测

对46个T₀代转pMOCN-HY151水稻植株进行PCR检测，具体步骤如下：

取1μL基因组DNA作模板进行PCR反应；PCR所用引物包括选择标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)的检测引物和外源基因(HY151)的检测引物；引物序列如下：

HPT基因的检测引物如下：引物1：5'-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'；引物2：5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'，扩增片段为845bp的HPT基因(图14)；

HY151基因的检测引物如下：引物1：5’-CAGGGAGTGGGAGGCAGATCCAAC-3'；引物2：5'-GCGGAACTGGTTGTACCTGAT-3'，扩增片段为358bp的HY151基因(图14)。

上述每个反应体系均包括：2μL 10×PCR反应缓冲液、0.5μL 10mM引物1、0.5μL10mM引物2、1μL DNA模板、2.5μL 2.5mM dNTPs，补加无菌水至总体积20μL。每个PCR反应条件均为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、54℃复性30秒、72℃延伸1分钟，进行30个循环，最后72℃延伸5分钟。

所获得的PCR产物混合后在同一个泳道进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。T₀代转pMOCN-HY151水稻HPT基因和HY151基因结果如图14所示(M为DL200DNA marker；P为阳性质粒pMOCN-HY151；N为野生型水稻，1-10为T₀代转pMOCN-HY151水稻)，从图中可以看出：大部分转基因株系为HPT基因和HY151基因均为阳性的T₀代转基因水稻。

三、T₀代转基因水稻植株的分子检测

1、水稻总RNA的提取

水稻总RNA的提取采用天根公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，并按照其说明书进行。首先制备样品，分别称取T₀代转pMOCN-HY151水稻新鲜叶片0.1mg置于研钵中，加液氮研成粉末；然后加入500μL裂解液SL(用前加入5％β-巯基乙醇)，立即涡旋振荡混匀，12000rpm离心2min(本方法所有离心均在室温进行)；将上清转移至CS柱中，12000rpm离心2min，小心取上清加入0.4倍无水乙醇，混匀后转入吸附柱CR3中，并离心(12000rpm离心15s)弃滤过液；向CR3中加350μL去蛋白液RW1，离心弃滤过液；向CR3中央膜上加入80μLDNaseI工作液，室温处理15min；重复去蛋白液步骤；然后向CR3中加500μL漂洗液RW，离心弃滤液，并重复该步骤一次；12000rpm离心2min，彻底去除漂洗液后，加入35μL RNase-freeddH₂O，室温放置2min；最后12000rpm离心1min，收集洗脱液，用NanoDrop测定RNA溶液的浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。RNA溶液置于-70℃保存。

2、cDNA合成

总RNA先通过RNase free的RQ1DNaseI(Promega)处理，去除微量基因组DNA。消化10μg RNA时，建立100μL的消化体系：RNA约10μg，RQ1 10×DNaseI Reaction Buffer 10μL，RQ1DNaseI 10μL，RNase-free H₂O补至100μL，37℃恒温放置35min，然后再用氯仿-异丙醇抽提并纯化获得RNA。

取4μg去除DNA后的RNA，用Promega公司的反转录试剂盒中的M-MLV反转录酶合成cDNA。具体实验步骤如下：在RNase-free的0.2mL离心管中加入Oligo(dT)15引物1μL，RNA 4μg和RNase-free H₂O至总体积10μL，混匀后70℃孵育5min，立即置于冰上5min。然后向反应体系中依次加入5×GoScript Reaction Buffer 4μL，MgCl₂缓冲液3.5μL，PCR NucleotideMix 1μL，Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5μL，GoScript ReverseTranscriptase 1μL，混匀后在PCR仪上运行以下程序：25℃ 5min，42℃ 1h，70℃ 15min，4℃ 15min。反转录完成后，各cDNA放置-20℃保存。

3、T₀代转基因水稻qPCR检测

实时定量PCR参照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书规范操作。配制20μL PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq(2×)10μL，5'端引物(10μM)0.4μL，3'端引物(10μM)0.4μL，cDNA模板(<100ng)2μL，灭菌的ddH₂O补至20μL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，以95℃ 10s，58℃ 10s，72℃ 10s为一个PCR反应周期，共进行45个循环，然后95℃ 5s，65℃ 1min进行熔解曲线分析，最后40℃ 30s降温。每个反应平行重复三次，同时选用actin为内参基因，在Rocher LightCycler480定量PCR仪上进行扩增。目的基因的相对表达量采用2^-ΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)进行计算。qPCR检测HY151基因的转录水平的引物序列如下：5’CAGGGAGTGGGAGGCAGATCCAAC-3'和5'-CACATCCCTGAGCACGCT-3'。

结果如图15所示。由于所转的是水稻外源基因，野生型水稻MH86中检测不到外源基因HY151的表达。从图中可以看到，选取的12个T0代转基因水稻株系中外源基因HY151均检测到不同程度的表达，表明该优化载体确实能够在选择标记删除前的T0代转基因水稻材料中检测到外源基因的表达，载体优化成功。

4、***诱导处理后T₁代转基因水稻植株的PCR检测

将一个T0代转基因水稻株系的种子放到含有20μMβ-***的水中37℃培养箱暗培养催芽三天，然后将处理后的发芽的种子移到0.5×植物营养液中大约培养两周后提取单株转基因水稻的叶片组织的DNA，并以该DNA作为模板，然后用HPT基因引物(5'-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'和5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3')和抗虫基因HY151引物(5’-CAGGGAGTGGGAGGCAGATCCAAC-3’和5’-AGGAGTAGTTGATGCCGTTTG-3’)对水稻叶片组织的DNA进行PCR扩增，扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，部分植株的电泳结果见图16。从结果中可以看出，部分单株出现了HY151阳性、HPT阴性的结果，说明选择标记基因成功被删除。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种优化的获得无选择标记转基因植物的化学诱导删除表达载体及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>10817

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagtttc tctagatgca tgctcgagta 60

tgcggatcca ctagtggaat tcgataaacc taataacttc gtatagcata cattatacga 120

agttattcag gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata ggaacttcaa 180

ttaaatccgg tgcagcgtga cccggtcgaa gggcaattct gcagatgggt gcagcgtgac 240

ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt ctaagttata aaaaattacc 300

acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat ctatctttat acatatattt 360

aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa taatatcagt gttttagaga 420

atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat tgagtatttt gacaacagga 480

ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt tttttttgca aatagcttca 540

cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt agggtttagg gttaatggtt 600

tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat tttagcctct aaattaagaa 660

aactaaaact ctattttagt ttttttattt aataatttag atataaaata gaataaaata 720

aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa aaaaactaag gaaacatttt 780

tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt cgacgagtct aacggacacc 840

aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc agacggcacg gcatctctgt 900

cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt tggacttgct ccgctgtcgg 960

catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc 1020

tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc accgctcctt cgctttccct 1080

tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc tctttcccca acctcgtgtt 1140

gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat ccacccgtcg gcacctccgc 1200

ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt 1260

ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt 1320

ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt 1380

tctgattgct aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc 1440

cgcagacggg atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct 1500

tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt 1560

tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt 1620

ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata 1680

ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt 1740

tgatgcgggt tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat 1800

gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact 1860

acctggtgta tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg 1920

agtttaagat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac 1980

tgatgcatat acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct 2040

atctattata ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat 2100

ggcatatgca gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg 2160

cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcagagcg 2220

ctatgaaagc gttaacggcc aggcaacaag aggtgtttga tctcatccgt gatcacatca 2280

gccagacagg tatgccgccg acgcgtgcgg aaatcgcgca gcgtttgggg ttccgttccc 2340

caaacgcggc tgaagaacat ctgaaggcgc tggcacgcaa aggcgttatt gaaattgttt 2400

ccggcgcatc acgcgggatt cgtctgttgc aggaagagga agaagggttg ccgctggtag 2460

gtcgtgtggc tgccggtgaa ccgtcgagcg cccccccgac cgatgtcagc ctgggggacg 2520

agctccactt agacggcgag gacgtggcga tggcgcatgc cgacgcgcta gacgatttcg 2580

atctggacat gttgggggac ggggattccc cgggtccggg atttaccccc cacgactccg 2640

ccccctacgg cgctctggat atggccgact tcgagtttga gcagatgttt accgatgccc 2700

ttggaattga cgagtacggt ggggatccgt ctgctggaga catgagagct gccaaccttt 2760

ggccaagccc gctcatgatc aaacgctcta agaagaacag cctggccttg tccctgacgg 2820

ccgaccagat ggtcagtgcc ttgttggatg ctgagccccc catactctat tccgagtatg 2880

atcctaccag acccttcagt gaagcttcga tgatgggctt actgaccaac ctggcagaca 2940

gggagctggt tcacatgatc aactgggcga agagggtgcc aggctttgtg gatttgaccc 3000

tccatgatca ggtccacctt ctagaatgtg cctggctaga gatcctgatg attggtctcg 3060

tctggcgctc catggagcac ccagggaagc tactgtttgc tcctaacttg ctcttggaca 3120

ggaaccaggg aaaatgtgta gagggcatgg tggagatctt cgacatgctg ctggctacat 3180

catctcggtt ccgcatgatg aatctgcagg gagaggagtt tgtgtgcctc aaatctatta 3240

ttttgcttaa ttctggagtg tacacatttc tgtccagcac cctgaagtct ctggaagaga 3300

aggaccatat ccaccgagtc ctggacaaga tcacagacac tttgatccac ctgatggcca 3360

aggcaggcct gaccctgcag cagcagcacc agcggctggc ccagctcctc ctcatcctct 3420

cccacatcag gcacatgagt aacaaaggca tggagcatct gtacagcatg aagtgcaaga 3480

acgtggtgcc cctctatgac ctgctgctgg agatgctgga cgcccaccgc ctacatgcgc 3540

ccactagccg tggaggggca tccgtggagg agacggacca aagccacttg gccactgcgg 3600

gctctacttc atcgcattcc ttgcaaaagt attacatcac gggggaggca gagggtttcc 3660

ctgccacagt ctgagagctc cctggcggaa ttcccagaga tgttagctga aatcatcact 3720

aatcagatac caaaatattc aaatggaaat atcaaaaagc ttctgtttca tcaaaaatga 3780

ctcgacctaa ctgagtaagc tagcttgttc gagtattatg gcattgggaa aactgttttt 3840

cttgtaccat ttgttgtgct tgtaatttac tgtgtttttt attcggtttt cgctatcgaa 3900

ctgtgaaatg gaaatggatg gagaagagtt aatgaatgat atggtccttt tgttcattct 3960

caaattaata ttatttgttt tttctcttat ttgttgtgtg ttgaatttga aattataaga 4020

gatatgcaaa cattttgttt tgagtaaaaa tgtgtcaaat cgtggcctct aatgaccgaa 4080

gttaatatga ggagtaaaac actagatccc caaacaagct tgaaactgaa ggcgggaaac 4140

gacaatctga tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg ccgatgacgc 4200

gggacaagcc gttttacgtt tggaactgac caccatggtg gagcacgaca ctctcgtcta 4260

ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca 4320

aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa 4380

aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 4440

tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 4500

catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgaaca 4560

tggtggagca cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc 4620

aaagggctat tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt 4680

gcccagctat ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat 4740

gccatcattg cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca 4800

aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 4860

caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact 4920

atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacacgct 4980

gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctcgag ctttcgcaga tccggggggc 5040

aatgagatat gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa 5100

agttcgacag cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca 5160

gcttcgatgt aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct 5220

acaaagatcg ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc 5280

ttgacattgg ggaattcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg 5340

tcacgttgca agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg 5400

ccatggatgc gatcgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac 5460

cgcaaggaat cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc 5520

atgtgtatca ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc 5580

tcgatgagct gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg 5640

atttcggctc caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga 5700

gcgaggcgat gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt 5760

ggttggcttg tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag 5820

gatcgccgcg gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct 5880

tggttgacgg caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc 5940

gatccggagc cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga 6000

ccgatggctg tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccgg 6060

gatcttggag gtgatgtaac atgatcacaa gctgatcccc cgaatttccc cgatcgttca 6120

aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc 6180

atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta 6240

tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa 6300

aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta 6360

gatcgggaat tgatcccccc tcgacagctt gcatgccgct tgggctgcag gtcgaggcta 6420

aaaaactaat cgcattatca tcccctcgac gtactgtaca tataaccact ggttttatat 6480

acagcagtac tgtacatata accactggtt ttatatacag cagtcgacgt actgtacata 6540

taaccactgg ttttatatac agcagtactg tacatataac cactggtttt atatacagca 6600

gtcgaggtaa gattagatat ggatatgtat atggatatgt atatggtggt aatgccatgt 6660

aatatgctcg actctaggat cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 6720

tttggagagg acacgctgaa gctagtcgac tctagcctcg acatgtccaa tttactgacc 6780

gtacaccaaa atttgcctgc attaccggtc gatgcaacga gtgatgaggt tcgcaagaac 6840

ctgatggaca tgttcaggga tcgccaggcg ttttctgagc atacctggaa aatgcttctg 6900

tccgtttgcc ggtcgtgggc ggcatggtgc aagttgaata accggaaatg gtttcccgca 6960

gaacctgaag atgttcgcga ttatcttcta tatcttcagg cgcgcggtct ggcagtaaaa 7020

actatccagc aacatttggg ccagctaaac atgcttcatc gtcggtccgg gctgccacga 7080

ccaagtgaca gcaatgctgt ttcactggtt atgcggcgga tccgaaaaga aaacgttgat 7140

gccggtgaac gtgcaaaaca ggctctagcg ttcgaacgca ctgatttcga ccaggtaagt 7200

cttcttttcc tttactcttt acagaaatgg taatctcaga tatagtaatg gataagatcc 7260

aaaaatgaca cttttaacca agattgtacg aagatctttt taaactccat tttttatttt 7320

gacatctaaa ttggatttaa ctcggccttg ctgtattttg gcaggttcgt tcactcatgg 7380

aaaatagcga tcgctgccag gatatacgta atctggcatt tctggggatt gcttataaca 7440

ccctgttacg tatagccgaa attgccagga tcagggttaa agatatctca cgtactgacg 7500

gtgggagaat gttaatccat attggcagaa cgaaaacgct ggttagcacc gcaggtgtag 7560

agaaggcact tagcctgggg gtaactaaac tggtcgagcg atggatttcc gtctctggtg 7620

tagctgatga tccgaataac tacctgtttt gccgggtcag aaaaaatggt gttgccgcgc 7680

catctgccac cagccagcta tcaactcgcg ccctggaagg gatttttgaa gcaactcatc 7740

gattgattta cggcgctaag gatgactctg gtcagagata cctggcctgg tctggacaca 7800

gtgcccgtgt cggagccgcg cgagatatgg cccgcgctgg agtttcaata ccggagatca 7860

tgcaagctgg tggctggacc aatgtaaata ttgtcatgaa ctatatccgt aacctggata 7920

gtgaaacagg ggcaatggtg cgcctgctgg aagatggcga ttagtaagaa ttcgcatgca 7980

ttcatcaata ttattcatgc ggggaaaggc aagattaatc caactggcaa atcatccagc 8040

gtgattggta acttcagttc cagcgacttg attcgttttg gtgctaccca cgttttcaat 8100

aaggacgaga tggtggagta aagaaggagt gcgtcgaagc agatcgttca aacatttggc 8160

aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 8220

tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 8280

gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 8340

agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcataact 8400

tcgtatagca tacattatac gaagttattc aggaagttcc tatactttct agagaatagg 8460

aacttcggaa taggaacttc agatcttcac tagtaacggc cgccagtgtg ctggaattgc 8520

ccttcggtat cgataagctg gatcaactca tcgggagata ctagaggaga agcatgcaca 8580

actaaattat gttgaggatg tcttgcctat atgtcgttgc attgtggaga ttgcgcagat 8640

atacattggc aaatgtatct ttcctaatgt gtctgatgtg agacatgtcc tagatgccat 8700

catgacgtag gcacatgggg acattgatat accggagaca acgccggagg acgggggatt 8760

gatggcttac gagacataac tgacagagga ggcagagacg atgtagttag acatacacat 8820

tagtgcatta atatataata gtagtagtgt catggatttt attttatttt gacattatgc 8880

tactctatcg ttgttcttga ctttttttga cacttattga tctttattta tatatgacac 8940

ttttggacta tctgaattta tgtacgtcat tttttacata ttgtttgtaa ggtttaaatc 9000

ttcatctgag caaacataaa cgaagatgca tctccataat attttaaatt ataaaatgac 9060

cttcgaatgt gatgtatagt ataggtttta aattgttacg aagatacgtc tccaaaatat 9120

tttaacgttt aattagaatt tgatgcatct gaatatgtat ctccaaaatg ttacgaataa 9180

ttatgtattt ttgtatgatg cataagaaat ctataaaata tattaaaaaa tttcgtaatc 9240

ataaatgtgt acagccctcc attggtagta cattaacatg tgaggcatgg atcgaattaa 9300

actgaaggcg ggaaacgaca atctgatcca agctcaagct gctctagcat tcgccattca 9360

ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg 9420

cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac 9480

gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat 9540

ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca tgtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 9600

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 9660

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 9720

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 9780

gtattggcta gagcagcttg ccaagggctg caggaattaa ttcgatcaac tcatcgggag 9840

atactagagg agaagcatgc acaactaaat tatgttgagg atgtcttgcc tatatgtcgt 9900

cgcattgtgg agattgcgta gatagacatt gacaaatgta tcttgctgat ctggctgatg 9960

tgagacatgt cctaaatgcc atcatgacgt aggcacatgg gacattgatg taccggagac 10020

aacgtcggag gacgggggat tgatggccta cgagacataa ctgacagagg aggcagaggc 10080

gatgtagtta gacatacaca ttagtgcatt aatatataat agtagtagtg tcatggattt 10140

tattttattt tgacattata ctactctatc gttgtttttg actttttttg acacttcttg 10200

atcttttatt tataacattt ttggaccatc taaatttatg tacgtcattt tttgcacatt 10260

gcttgtaagg tttaaatctt catctgagca aacataaaca aaatatagca tgaacaattc 10320

tattatgata aattacgaaa atatatctcc gtaaaaataa acgaagatgc atctccataa 10380

tattttaaat tataaaatga cctatgaatg tgatctataa tatacatttt aaattgttac 10440

gaaaatacgt ctctaaaata ttttaaaatt taattagaat ttgatacgtc actaaaatat 10500

tttaaaattt aattagaatt tgatacgtca gaatatgtat ctcaaaatcg tatgattaat 10560

tatgtatttt tatatgatgg ataagaaatc tataaaatat attaaaaagt ttcctaatca 10620

taaatgtgta catgaacatg tgaggcatgg aagcctccat tggtagtaca ttaacatgtg 10680

aggcatggat ccagcttatc gataccgaag ggcaattctg cagatattcg gcgttaattc 10740

agtacattaa aaacgtccgc aatgtgttat taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac 10800

cacaatatat cctgcca 10817

<210>2

<211>5546

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gaaggcagct agcacgatcg tgcaactgca gagaagagag gcgatcagaa cgtgatctgc 60

atgcacaaaa ccagaaatcc cccaaatttt cctgctgatt tgagagctgg atttggaaca 120

gactggttac catctgaaaa actgaacctt tttctaaact ttcttttctt tttccgtggg 180

tcaagcccac aggattgaag aaaatccagg acctttcgtg acttgttttc gcaggcaaaa 240

cagaagattt tttttcacta taaaatgctc ttctggcctt ccctgcatct ccatcgtcgg 300

ctctgaattc cgttcaccgc cgtgtttttc gttcgttctg tttcttggtg ttcttgaaga 360

ggtaatttct tggcctattt gctctccttc attttcagtg caaatgtgca atgctgatta 420

gagtttgcag atgctgtttg gtttagttta gatgtggcat tttgttagtg gtttctttga 480

tgaaaaattc ttggctatga taaagtttgc tttctgaata tatgaatagt ggccatggtt 540

caagaaactc cagttaggtg ggataattta tggtgattct gggcgcaatt cggggaaatt 600

ttttttggcg agaatcttat cattgagata aagagggcaa gaatatcaac agacttttaa 660

tcttaataaa aagcactctt agcgtaagag caaagcattg caatctcgtg tgacaagaac 720

gtttcttttt ctccatcttt ttctttttta ccaaaaaatg agtgttgcca actgctgcac 780

cttcttaggc cggtttgttc ttgtttggaa cgcacggaat gcccgatgca aaaaaaaaaa 840

aatgctgtta acaaatcact gtcctgacac ggctaattag gtggtaattt ggtgcatctg 900

caaagaagca acagatgctt tctttcactg aaagcatatt tgcatgattt cttgtttctg 960

cttgtcctct ctctgatgct gactgtattc cactctgcgc tgtaatgcca tgttagtgat 1020

taatatgttc aaaagagcat aaaagaattg ccaattggat gttagagatt actgtgttgt 1080

tcaaaagagc ataaaagaat taccaatttg atggtagatg ttactagcac caccttggtg 1140

tttccccatg gttttctgca attctgccca tgatctttct gcttttctga aagacctatg 1200

tttcagaggt caagcttctg gaaggttatt aggagggatg agtcgtcatt ttgtctgtgg 1260

gccccactag tcagtgtcaa tagttgtaaa gggtagaaat tttcttgctg tttttcttgg 1320

aaacaatttc attgcgcctg atctgatggt cggtctggta atcaaatcac cagatcctga 1380

aatccaccaa atcaaaccgt gagatttttg cagaggcaaa acaagaaaag catctgcttt 1440

atttctctct tgctttcttt tcatccccaa ccagtccttt tttcttctgt ttatttgtag 1500

aagtctacca cctgcagtct attattctac agagaaaaag attgaagctt tttttctcca 1560

aagctgacaa tggtgccggc atatgctaat aggatactcc cttcgtctag taaaaaacca 1620

acccactaca attttgaata tatatttatt cagatttgtt atgcttccta ctccttctca 1680

ggtatggtga gatattttat agtataatga atttggacat atatttgtct aaattcatcg 1740

cattatgaaa tgtcttgttc gatctaggtt gttatattat gagatggaga gagtagattc 1800

ggttattttt ggacggagaa agtactcgcc tgtgctagtg acatgattag tgacaccatc 1860

agattaaaaa aacatatgtt ttgattaaaa aaatggggaa tttgggggga gcaataattt 1920

ggggttatcc aatgctgttt catcatgtca gctgaaaggc cctaccacta aaccaatatc 1980

tgtactattc taccacctat cagaattcag agcactgggg ttttgcaact atttattggt 2040

ccttctggat ctcggagaaa ccctccattc gtttgctcgt ctctgaccac cattgggtac 2100

gccgctcgtc ctcccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg 2160

ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat 2220

ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta 2280

acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga 2340

tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt 2400

tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt 2460

tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac 2520

tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac 2580

gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt 2640

ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt 2700

gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat 2760

ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg 2820

gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata 2880

catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa 2940

taaacaagta tgttttataa ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag 3000

cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt 3060

ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagcccgg gtatttttac 3120

aacaattacc aacaacaaca aacaacaaac aacattacaa ttactattta caattacagc 3180

ggccgcatgg ataacaaccc gaacatcaac gagtgcatcc cgtacaactg cctcagcaac 3240

ccagaggtgg aggtgctcgg aggagagagg atcgagaccg gatacacccc gatcgacatc 3300

agcctctccc tcacccagtt cctcctcagc gagttcgtgc cgggcgcagg attcgtgctc 3360

ggactcgtgg atatcatctg gggaatcttc ggaccatccc agtgggacgc cttcctcgtg 3420

cagatcgagc agctcatcaa ccagcgcatc gaggagttcg ccaggaacca ggcaatcagc 3480

cgcctggagg gactctccaa cctctaccag atctacgccg agtccttcag ggagtgggag 3540

gcagatccaa ccaacccagc actcagggag gagatgagga tccagttcaa cgacatgaac 3600

agcgcactca ccaccgcaat cccactcttc gccgtgcaga actaccaggt gccgctcctc 3660

tccgtctacg tgcaggcagc caacctccac ctcagcgtgc tcagggatgt gtccgtgttc 3720

ggacagcgct ggggattcga cgcagcaacc atcaacagca ggtacaacga tctcacccgc 3780

ctcatcggca actacaccga ccacgccgtg aggtggtaca acaccggact ggagagggtg 3840

tggggaccag actcccgcga ttggatcagg tacaaccagt tccgcaggga gctcaccctc 3900

accgtgctcg acatcgtgag cctcttcccg aactacgatt ccaggaccta cctcatcagc 3960

accaagtccc agctcacccg cgagatctac accgacgccc tcatcgatgc cttcgccaac 4020

gcccacttca acatcaacga tatcgagaac agcctcacca ggccgccggg cctcgtgacc 4080

tggatcaacc gcctcgactt ctacaccggc atgttcacca agagcgtgcc gggcctcacc 4140

gcaaacggca tcaactactc cttcaccaac ggcaacagca acgactcccc gatctacggc 4200

tacaggctct ccgacgattc cagcaccccg atccagatcc cgcgcaacca gtatgtgtac 4260

aacatgctca tcacctacct cagggatagc ccgtccgtga tccagaagat cgagttcaac 4320

ctcaacaacc agcagacccg cacctacgac accggactca ccctcgcccc gacctaccag 4380

agcaccatca acctctccct gccgggcaag gataggagct tcccaccgaa gttcaacaac 4440

tacacccact tcctctccta cgtgaagacc gcgccgggcg acgagaggcc gtccagctcc 4500

cgcgccagga acgtgtgctt cggctggatg cacttcagcg tgaacgacta cgatgtgctc 4560

gccggcggct acaacatcat cgccagcgac tccatcaccc agatcccggc cgtgaagggc 4620

aacttcctct tcaacggcag cgtgatctcc ggcccaggct tcaccggagg cgatctcgtg 4680

aggctcaaca gctccggcaa caacatccag aaccgcggct acatcgaggt gccgatccac 4740

ttcccaagca cctccacccg ctacagggtg cgcgtgaggt acgcatccgt gaccccgatc 4800

cacctcaacg tgaactgggg caacagctcc atcttcagca acaccgtgcc ggcaaccgca 4860

acctccctcg acaacctcca gagctccgat ttcggctact tcgagagcgc caacgccttc 4920

accagctccc tcggcaacat cgtgggcgtg aggaacttct ccggcaccgc cggcgtgatc 4980

atcgacaggt tcgagttcat cccggtgacc gccaccctcg aagccgagtg actcgagtaa 5040

gtaggtgaga cccaaggcat tatatactaa aaaataaagc cacatgcata aagctttgtg 5100

gagttttgta ttttgtcgta tgtgtaagtt aaataaaaaa agaattgcct tcatttaatc 5160

gatttgtgca cttactccct ttatatccca tcttattttt ttctttagta aattaaatta 5220

ctcttgcctc tctaaggcgc ctttgttttt agcaaaaatc aacatttaaa aattgactac 5280

taatttaact aaaatatata tgtgttacgt gttatatact ctcatacatg taccttatat 5340

tcgtgtttta aagtaatttt atatgatact gattaagtgg ttattgacaa catattaaca 5400

aaaggtcaat gataaaaaga tagtgtcgga gactatgtca aaaagttaaa attgccttat 5460

attgtatttt agaacggaaa agacgtaatt tgcatacttg cgttccatca ctgcctcacg 5520

gcaaacagtg tcgtggcacc aagttt 5546

Claims (12)

1.一种植物表达载体甲，其包括一个T-DNA区域，所述T-DNA区域依次包括T-DNA右边界、第一个loxP/FRT位点、***诱导的转录激活***XVE的编码基因表达盒、选择标记基因表达盒、Cre重组酶的编码基因表达盒、第二个loxP/FRT位点、第一个MAR序列、用于***外源基因表达盒的多克隆位点、第二个MAR序列和T-DNA左边界；

所述第一个MAR序列如序列1自5’末端第8544-9290位所示；

所述第二个MAR序列如序列1自5’末端第9827-10688位所示。

2.根据权利要求1所述的植物表达载体甲，其特征在于：所述***诱导的转录激活***XVE的编码基因表达盒包括用于启动融合转录因子XVE的编码基因表达的Ubiquitin启动子、融合转录因子XVE的编码基因和用于终止融合转录因子XVE的编码基因表达的rbsc E9终止子；

所述选择标记基因表达盒包括用于启动选择标记基因表达的35S启动子、选择标记基因和用于终止选择标记基因表达的NOS终止子；

所述Cre重组酶的编码基因表达盒包括用于启动Cre重组酶的编码基因表达的LexA-35S启动子、Cre重组酶的编码基因和用于终止Cre重组酶的编码基因表达的NOS终止子。

3.根据权利要求2所述的植物表达载体甲，其特征在于：所述选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPT。

4.根据权利要求3所述的植物表达载体甲，其特征在于：

所述T-DNA右边界的核苷酸序列如序列1自5’末端第1-26位所示；

所述第一个loxP/FRT位点的核苷酸序列如序列1自5’末端第93-178位所示；

所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列如序列1自5’末端第277-2262位所示；

所述融合转录因子XVE的编码基因的核苷酸序列如序列1自5’末端第2271-3836位所示；

所述rbsc E9终止子的核苷酸序列如序列1自5’末端第3863-4163位所示；

所述35S启动子的核苷酸序列如序列1自5’末端第4246-5014位所示；

所述潮霉素磷酸转移酶基因HPT的核苷酸序列如序列1自5’末端第5049-6074位所示；

所述用于终止选择标记基因表达的NOS终止子的核苷酸序列如序列1自5’末端第6113-6388位所示；

所述LexA-35S启动子的核苷酸序列如序列1自5’末端第6451-6741位所示；

所述Cre重组酶的编码基因的核苷酸序列如序列1自5’末端第6763-7964位所示；

所述用于终止Cre重组酶的编码基因表达的NOS终止子的核苷酸序列如序列1自5’末端第7978-8390位所示；

所述第二个loxP/FRT位点的核苷酸序列如序列1自5’末端第8395-8480位所示；

所述用于***外源基因表达盒的多克隆位点的核苷酸序列如序列1自5’末端第9507-9563位所示；

所述T-DNA左边界的核苷酸序列如序列1自5’末端第10792-10817位所示。

5.根据权利要求1所述的植物表达载体甲，其特征在于：所述T-DNA区域的核苷酸序列如序列1所示。

6.一种DNA片段，为权利要求1-5中任一所述的T-DNA区域。

7.含有权利要求6所述DNA片段的重组载体、重组菌。

8.一种植物表达载体乙，为将外源基因表达盒***权利要求1-5中任一所述的用于***外源基因表达盒的多克隆位点得到的载体。

9.权利要求1-5任一所述的植物表达载体甲或权利要求6所述的DNA片段或权利要求8所述的植物表达载体乙在培育无选择标记基因的转基因植物中的应用。

10.一种培育无选择标记基因的转基因植物的方法，包括如下步骤：

1）将权利要求8所述的植物表达载体乙转化出发植物，通过选择标记基因筛选得到含有外源基因和选择标记基因的转基因植物；

2）将所述转基因植物在***诱导条件下培养，得到含有外源基因且不含有选择标记基因的转基因植物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为水稻。

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