KR20230163460A - 식물에서의 증가된 형질전환성 및 반수체 유도 - Google Patents
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Abstract
HI-NA 식물로 지칭되는 고도로 형질전환 가능한 옥수수 식물, 및 이들을 생산하고 이용하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 개시된 바와 같은 HI-NA 식물은 파타틴-유사 포스포리파제 A2α(MATL) 유전자의 기능 상실 돌연변이 대립유전자에 대해 동형접합성이고, 식물에서 증가된 반수체 유도 및/또는 형질전환 빈도에 관여하는 하나 이상의 QTL 및/또는 유전자 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. 본원에서 개시된 바와 같은 HI-NA 식물은 또한 세포형 A 백그라운드를 가질 수 있으며, 이는 HI-NA 식물을 고도로 형질전환 가능하게 만들 수 있다. 또한, HI-NA 식물을 생산하는 방법, 및 식물 게놈 DNA를 편집하기 위해 HI-NA 식물을 이용하는 방법이 제공된다.
Description
본 개시내용은 식물 생명공학의 분야에 관한 것이다. 특히, 이는 예컨대 외래 전이유전자의 수용에 저항성(recalcitrant)인 식물에서, 식물 형질전환 및 식물 육종, 뿐만 아니라 유전자 편집에 관한 것이다.
EFS-WEB을 통해 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 관한 참조
서열 목록의 공식 사본은, 2022년 3월 25일에 생성되고 크기가 231 KB이며 파일명이 82222_ST25.txt인 ASCII 형식의 서열 목록으로 EFS-Web을 통해 전자 제출되고, 명세서와 동시에 제출된다. 이 ASCII 형식 문서에 포함된 서열 목록은 명세서의 일부이고, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
식물 형질전환, 즉, 외래 DNA("전이유전자")를 식물 게놈 내로 안정적으로 통합하는 것은 수십 년 동안 작물에 새롭고 유용한 형질을 부가하기 위해 사용되어 왔다. 일부 옥수수 계통은 상대적으로 형질전환시키기에(즉, 전이유전자 DNA를 수용하기에) 용이하지만, 대부분의 계통은 그렇지 않다. 예를 들어, 순수하거나 거의 순수한 동형접합성 게놈을 수득하기 위해 몇몇 세대에 걸쳐 자가수분에 의해 생산되고, 상업적으로 가치 있는 잡종을 생성하기 위해 모본 계통(parent line)으로서 사용되는 대부분의 엘리트(elite) 근교계는 흔히 외래 DNA를 이용하여 형질전환될 수 없다. 따라서, 전이유전자 형질을 근교계로 이동시키기 위해, 먼저 전이유전자 형질을 형질전환 가능한 옥수수 계통으로 형질전환시켜야 한다. 이 형질전환된 옥수수 계통은 육종 플랫폼에서 모본 계통으로 사용하기에 거의 적합하지 않다. 따라서, 형질전환된 옥수수 계통을 근교계로 교배하여 자손 식물을 생성하는데, 이는 이형접합성 방식으로 근교 모본과 형질전환된 모본 둘 모두의 게놈을 포함할 것이다. 그 다음, 전이유전자 형질을 유지하면서, 형질전환된 모본에 의해 기여되는 게놈을 가능한 한 많이 제거하기 위해, 전이유전자를 포함하는 자손 식물을 대략 여섯 또는 일곱 세대 동안 근교계로 역교배해야 한다. 이 형질 유전자이입 과정에는 일반적으로 3 내지 7년이 걸린다.
옥수수는 적어도 5가지의 상이한 세포형을 갖는 것으로 알려져 있다(미토콘드리아 게놈에 기초하여 분류됨): 정상 A("NA"), 정상 B("NB"), 세포질-웅성-불임 C("CMS-C" 또는 "C"), 세포질-웅성-불임 S("CMS-S" 또는 "S") 및 세포질-웅성-불임 T("CMS-T" 또는 "T"). 다른 세포형이 여전히 발견될 수 있다. 따라서, 이들 다양한 세포형에 존재하는 미토콘드리아 및 엽록체는 비교하자면, 이들의 게놈에 의해 식물 세포의 표현형에 큰 효과를 나타낼 수 있다. 이들 효과는 이제서야 결정되고 있다. 예를 들어, 형질전환성과 세포형 간에 관계가 있음이 최근에 발견되었다. 형질전환 가능한 것으로 알려져 있는 옥수수 계통은 NA 세포형을 갖는 반면, 형질전환 가능하지 않은(저항성인) 것으로 알려져 있는 옥수수 계통은 NB 세포형을 갖는다.
식물 육종에서의 또 다른 중요한 도구는 반수체 유도("HI")이며, 이는 수정 동안 또는 그 이후의 언젠가, 흔히 초기 배 발달(early embryo development) 동안에 배로부터 하나의 모본의 염색체(반수체 유도인자 모본으로부터의 염색체) 세트의 손실을 특징으로 하는 부류의 식물 현상이다. 반수체 유도는 수수, 보리, 밀, 옥수수, 아라비돕시스(Arabidopsis) 및 많은 기타 종과 같은 수많은 식물 종에서 관찰되어 왔다. 옥수수에서, 반수체 종자 또는 배는 반수체 유도인자 웅성(즉, "반수체 유도인자 화분")과 당업자가 선택한 사실상 모든 이삭 간의 교배에 의해 생산될 수 있다. 모계 HI 시스템, 예를 들어, 모계-기반 시스템의 경우에, 반수체 유도인자 화분 DNA가 배의 첫 세포 분열을 통해 완전히 전달 및/또는 유지되지 않을 때 반수체가 생산된다. 생성된 낟알은 오직 모계 DNA + 정상(수정된) 삼배체 내배유를 함유하는 반수체 배를 갖는다. 부계 HI 시스템, 예를 들어, CENH3-기반 또는 ig1-기반 시스템의 경우에, 난자가 정자 세포에 의해 수정되고, 모계 염색체가 세포 분열 시에 손실된 후에 반수체가 생산된다. 생성된 낟알은 오직 부계 DNA + 정상(수정된) 삼배체 내배유를 함유하는 반수체 배를 갖는다. 사용된 HI 시스템과 관계없이, 생성된 표현형은 완전히 침투성인 것은 아니며, 일부 밑씨는 반수체 배를 함유하고, 다른 밑씨는 이배체 배, 이수성 배, 키메라 배 또는 발육 부전 배를 함유한다. 반수체 유도 후, 반수체 배 또는 종자는 전형적으로 표현형 또는 유전자 마커 스크린을 이용하여 이배체 및 이수성 자매로부터 분리되고, 반수체 식물로 성장 또는 배양된다. 이이서, 이들 식물은 자연적으로 또는 화학적 조작(예를 들어, 콜키신과 같은 항-미세소관제의 사용)을 통해 배가 반수체("DH") 식물로 전환되며, 이는 이어서 근교 종자를 생산한다.
DH 식물의 생산은 식물 육종가가 다세대 근친교배 없이 근교계를 수득할 수 있게 하며, 이에 따라, 동형접합성 식물을 생산하는 데 필요한 시간을 감소시킨다. DH 식물은, 특히 근교계의 생성, 양적 형질 유전자좌(QTL) 맵핑(mapping), 세포질 전환, 형질 유전자이입 및 고출력 형질 개선을 위한 F2 스크리닝을 위해 식물 육종가에게 유용한 도구를 제공한다. 동형접합성 계통은 본질적으로 한 세대에서 생성되므로 많은 시간이 절약되며, 이는 다세대 단일-종자 후대(single-seed descent)(통상적인 근친교배)의 필요성을 없앤다. 특히, DH 식물은 전적으로 동형접합성이기 때문에, 양적 유전학 연구를 거치기 매우 쉽다. 반수체 종자의 생산은 배가 반수체 육종 과정에 매우 중요하다.
식물 형질전환은 특히 옥수수에서 난해하다. 자연적으로 형질전환 가능한 식물 계통은 거의 없으며; 대다수가 자연적으로 형질전환 가능하지 않다. 또한, 반수체 유도인자 계통은 특이한 생식 특징(예를 들어, 생식 동안 DNA의 자가-결실)을 갖기 때문에 육종하기 난해하다. "HI-NA 식물"로 지칭되는 고도로 형질전환 가능한 옥수수 식물, 및 이들을 생산하고 이용하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 개시된 바와 같은 HI-NA 식물은 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(다양한 간행물에서 매트리니얼[MATRILINEAL, MATL], 낫 라이크 대드[NOT LIKE DAD, NLD] 및 포스포리파제 A1[PHOSPHOLIPASE A1, PLA1]로도 지칭되고, 옥수수 B73_v4 유전자 ID GRMZM2G471240으로 표시됨)의 기능 상실 돌연변이 대립유전자에 대해 동형접합성이며, QTL의 하나 이상의 대립유전자 및/또는 식물에서 증가된 반수체 유도에 관여하는 유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. 예를 들어, HI-NA 식물은 기능 상실 matl 돌연변이 대립유전자에 대해 동형접합성일 수 있고 qhir8 QTL에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성일 수 있다. 또한, HI-NA 식물은 세포형 정상 A("NA") 백그라운드를 가지며, 이는 HI-NA 식물을 고도로 형질전환 가능하게 만든다. 본원에 제공되는 HI-NA 식물은 주목할 만한 반수체 유도 능력(적어도 12%, 적어도 15% 또는 적어도 18%의 반수체 유도율을 가짐), 뿐만 아니라 뛰어난 형질전환성(적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 12% 또는 적어도 15%의 형질전환 비율)을 갖는다. HI-NA 계통은 다양한 이형잡종 군(heterotic group)(하기에서 정의됨)으로부터의 식물로부터 생산될 수 있다.
이들 고도로 형질전환 가능한 HI-NA 식물은 식물 형질을 개선하기 위해 관심 식물 계통의 게놈 DNA를 편집하는 유전자 편집 기구를 이용하여 형질전환될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 미국 특허 제10,285,348호 및 제10,519,456호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 강력한 반수체 유도인자이자 고도로 형질전환 가능한, 용이하게 형질전환 가능한 HI-NA 식물을 제공함으로써, 본 개시내용은 작물 게놈을 효율적으로, 그리고 비용 효과적으로 편집하여 원하는 형질을 갖는 식물 계통을 생산하는 데 유용한 도구를 제공한다.
일 양태에서, 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL)의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 증가된 반수체 유도와 관련된 적어도 하나의 양적 형질 유전자좌(QTL)(HI-QTL)에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 옥수수 식물이 본원에 제공되며, 옥수수 식물은 정상 A("NA") 세포형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 적어도 하나의 HI-QTL에서 HI 대립유전자에 대해 동형접합성이다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 증가된 형질전환 빈도와 관련된 적어도 하나의 QTL(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 DNA 변형 효소 및 선택적으로 적어도 하나의 가이드 핵산을 발현할 수 있다.
또 다른 양태에서, 증가된 형질전환 빈도와 관련된 적어도 하나의 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 옥수수 식물이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 증가된 형질전환 빈도와 관련된 적어도 하나의 QTL(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 동형접합성이다.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다: a) 제1 옥수수 식물로부터의 화분을 제공하는 단계로서, 제1 옥수수 식물이 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL) 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, 형질전환 저항성(transformation recalcitrant)인 반수체 유도인자 식물 계통인 단계; b) 제2 옥수수 식물을 제공하는 단계로서, 제2 옥수수 식물이 정상 A("NA") 세포질을 포함하고, 선택적으로, 제2 옥수수 식물이 증가된 형질전환 빈도와 관련된 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계; c) 제2 옥수수 식물을 제1 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키고, 이로부터 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 수득하는 단계; d) 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 자가생식시키고/시키거나 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 적어도 한 세대 동안 제1 옥수수 식물 또는 제2 옥수수 식물과 역교배하는 단계; 및 e) 단계 d의 교배로부터 자손을 선택하는 단계로서, 선택된 자손이 NA 세포형을 포함하고, MATL 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, 선택적으로, TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다: a) 제1 옥수수 식물로부터의 화분을 제공하는 단계로서, 제1 옥수수 식물이 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL) 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, 형질전환 저항성인 반수체 유도인자 식물 계통인 단계; b) 제2 옥수수 식물을 제공하는 단계로서, 제2 옥수수 식물이 증가된 형질전환 빈도와 관련된 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계; c) 제2 옥수수 식물을 제1 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키고, 이로부터 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 수득하는 단계; d) 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 자가생식시키고/시키거나 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 적어도 한 세대 동안 제1 옥수수 식물 또는 제2 옥수수 식물과 역교배하는 단계; 및 e) 단계 d의 교배로부터 자손을 선택하는 단계로서, 선택된 자손이 MATL 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 생산하는 방법이 본원에 제공된다: a) 제1 옥수수 식물로부터의 화분을 제공하는 단계로서, 제1 옥수수 식물이 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL) 유전자의 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성이고, DUF679 도메인 막 단백질 7(DMP) 유전자의 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 단계; b) 제2 옥수수 식물을 제공하는 단계로서, 제2 옥수수 식물이 정상 A("NA") 세포질을 포함하고, 선택적으로, 제2 옥수수 식물이 증가된 형질전환 빈도와 관련된 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계; c) 제2 옥수수 식물을 제1 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키고, 이로부터 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 수득하는 단계; d) 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 자가생식시키고/시키거나 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 적어도 한 세대 동안 제1 옥수수 식물 또는 제2 옥수수 식물과 역교배하는 단계; e) 단계 d의 교배로부터 자손을 선택하는 단계로서, 선택된 자손이 NA 세포형을 포함하고, 선택적으로, TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계; 및 f) 적어도 하나의 자손 식물을 편집하여, 야생형 MATL 유전자 및/또는 DMP 유전자에 기능 상실 돌연변이를 유발함으로써, 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 수득하는 단계.
또 다른 양태에서, 하기를 포함하는 식물 게놈 DNA를 편집하는 방법이 본원에 제공된다: a) 표적 식물을 제공하는 단계로서, 표적 식물이 편집될 식물 게놈 DNA를 포함하는 단계; b) 표적 식물을 본원에 기술된 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키는 단계로서, 옥수수 식물이 DNA 변형 효소 및 선택적으로 적어도 하나의 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계; 및 c) 단계 c에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계로서, 반수체 자손이 표적 식물의 게놈을 포함하고, 옥수수 식물의 게놈을 포함하지 않고, 반수체 자손의 게놈이 옥수수 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되는 단계.
일부 실시형태에서, 상기 양태 중 임의의 것의 HI-QTL은 9번 염색체 상의 qhir8(HI-QTL qhir8)이다. 일부 실시형태에서, 상기 양태 중 임의의 것의 HI-QTL qhir8에서의 HI 대립유전자는 DUF679 도메인 막 단백질 7(DMP) 유전자의 기능 상실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 양태 중 임의의 것의 TF-QTL은 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)이다.
도 1은 본 개시내용의 양태에 따른 HI-NA 식물을 생성하는 과정의 예시적인 단계를 보여준다.
도 2는 구축물 26258에서의 유전 요소의 다이어그램을 보여준다.
도 3은 구축물 24288에서의 유전 요소의 다이어그램을 보여준다.
서열의 간단한 설명
도 2는 구축물 26258에서의 유전 요소의 다이어그램을 보여준다.
도 3은 구축물 24288에서의 유전 요소의 다이어그램을 보여준다.
서열의 간단한 설명
I. 용어
본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는, 하기에서 달리 정의하지 않는 한, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 하고자 한다. 본원에서 이용된 기법에 대한 언급은 당업계에서 흔히 이해되는 바와 같은 기법을 지칭하는 것으로 하고자 하며, 이들 기법에 대한 변형 및/또는 당업자에게 명백할 동등한 기법의 치환을 포함한다. 하기 용어가 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 잘 이해되는 것으로 여겨질지라도, 하기 정의는 본원에 개시된 주제의 설명을 용이하게 하기 위해 개시되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 선택적으로 둘 이상의 이러한 분자 등의 조합을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 본 기술 분야의 숙련자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭하며, 예를 들어, ± 20%, ± 10% 또는 ± 5%가 언급된 값의 의도된 의미 내에 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함한다(comprise)"는 개방형이다. 대상 핵산(또는 아미노산 서열)과 함께 사용되는 경우, 이는 대상 서열을 부분으로서 또는 이의 전체 서열로서 포함하는 핵산 서열(또는 아미노산 서열)을 지칭한다.
용어 "복수"는 하나 초과의 엔티티(entity)를 지칭한다. 따라서, "복수의 개체"는 적어도 2개의 개체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 복수라는 용어는 전체의 절반 초과를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 "복수의 집단"은 그 집단의 구성원의 절반 초과를 지칭한다.
"식물"은 임의의 발달 단계에 있는 임의의 식물, 특히 종자 식물이다. 특히, 본 개시내용의 맥락에서, 식물은 옥수수 식물을 지칭한다.
"식물 세포"는 원형질체 및 세포벽을 포함하는 식물의 구조적 및 생리적 단위이다. 식물 세포는 분리된 단일 세포 또는 배양된 세포의 형태일 수 있거나, 예를 들어 식물 조직, 식물 기관, 또는 식물 전체와 같은 더 고도로 조직화된 단위의 일부로서 존재할 수 있다.
"식물 세포 배양물"은, 예를 들어, 다양한 발달 단계에 있는 원형질체, 세포 배양물 세포, 식물 조직 내의 세포, 화분, 화분관, 밑씨, 배낭, 접합자 및 배와 같은 식물 단위의 배양물을 의미한다.
"식물 기관"은 뿌리, 줄기, 잎, 꽃눈, 또는 배와 같은 식물의 별개의, 그리고 시각적으로 구조화되고 분화된 부분이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "식물 조직"은 구조적 및 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 군을 의미한다. 인플란타(in planta) 또는 배양 중인 식물의 임의의 조직이 포함된다. 이 용어는 식물 전체, 식물 기관, 식물 종자, 조직 배양물 및 구조적 및/또는 기능적 단위로 조직화된 임의의 식물 세포의 군을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 상기 열거된 바와 같은 또는 이 정의에 달리 포괄되는 임의의 특정 유형의 식물 조직과 함께 또는 이의 부재 하에, 이 용어의 사용은 임의의 다른 유형의 식물 조직을 배제하고자 하는 것이 아니다.
용어 "식물 부분"은 단일 세포 및 세포 조직, 예컨대 식물에서 온전한 식물 세포, 세포 클럼프(cell clump), 및 식물이 재생될 수 있는 조직 배양물을 포함하는 식물의 부분을 나타낸다. 식물 부분의 예로는 화분, 밑씨, 접합자, 잎, 배, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 꽃 부분, 열매, 줄기, 묘조(shoot), 삽수 및 종자; 뿐만 아니라 화분, 밑씨, 난 세포, 접합자, 잎, 배, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 꽃 부분, 열매, 줄기, 묘조, 삽수, 접가지, 대목, 종자, 원형질체, 캘러스 등으로부터의 단일 세포 및 조직이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
용어 "변종(variety)" 또는 "재배종(cultivar)"은 구조적 또는 유전적 특징 및/또는 성능에 의해 동일한 종 내의 다른 변종과 구별될 수 있는 유사한 식물의 군을 의미한다.
용어 "집단"은 공통의 유전적 기원(common genetic derivation)을 공유하는 유전학적으로 이질적인 식물의 집합물을 의미한다.
용어 "자손"은 특정 교배의 후대(descendant)(들)를 지칭한다. 전형적으로, 자손은 두 개체의 육종으로 인해 초래되지만, 일부 종(특히, 일부 식물 및 자웅동체 동물)은 자가생식할 수 있다(즉, 동일한 식물이 웅성 및 자성 배우자 둘 모두의 공여자로서 작용한다). 후대(들)는, 예를 들어, F1, F2, 또는 임의의 후속 세대를 가질 수 있다.
용어 "후손(offspring)" 식물은 하나 이상의 모본 식물 또는 이의 후대로부터 영양 또는 유성 생식으로부터의 자손으로서 생성된 임의의 식물을 지칭한다. 예를 들어, 후손 식물은 모본 식물의 클로닝 또는 자가생식 또는 두 모본 식물의 교배에 의해 수득될 수 있으며, 자가생식뿐만 아니라 F1 또는 F2 또는 추가의 세대를 포함한다. F1은 모본으로부터 생산된 1 세대 후손이고, 이 중 적어도 하나는 형질의 공여자로서 처음 사용되는 한편, 2 세대(F2) 또는 후속 세대(F3, F4 등)의 후손은 F1, F2 등의 자가생식으로부터 생산된 표본이다. 따라서, F1은 두 개의 순수 육종 모본(순수 육종은 형질에 대해 동형접합성임) 간의 교배로 인헤 초래된 잡종일 수 있는 한편, F2는 상기 F1 잡종의 자가수분으로 인해 초래된 후손일 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서 문구 "유성 교배" 및 "유성 생식"은 (예를 들어, 식물에서 수분에 의해 종자를 생산하기 위한 것과 같이 수정에 의해) 자손을 생산하기 위한 배우자의 융합을 지칭한다. 일부 실시형태에서, "유성 교배" 또는 "타화수정"은 또 다른 개체에 의한 한 개체의 수정(예를 들어, 식물에서 타화수분)이다. 일부 실시형태에서, 용어 "자가생식"은 자가수정 또는 자가수분에 의한 종자의 생산을 지칭하며; 즉, 화분과 밑씨는 동일한 식물로부터의 것이다.
"선택적 육종"은 본 개시내용의 범위 내에서 바람직한 형질을 지니거나 나타내는 식물을 모본으로서 사용하는 육종의 프로그램을 지칭하는 것으로 이해된다.
식물 육종의 맥락에서 용어 "잡종", "잡종 식물" 및 "잡종 자손"은 두 근교계 간의 교배를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 상이한 계통 또는 품종 또는 종의 식물을 교배함으로써 생산된 유전학적으로 같지 않은 모본의 후손인 식물을 지칭한다(예를 들어, 유전학적으로 이형접합성이거나 대부분 이형접합성인 개체). 문구 "단교배 FI 잡종"은 두 근교계 간의 교배로부터 생산된 FI 잡종을 지칭한다.
문구 "근교계"는 유전학적으로 동형접합성이거나 거의 동형접합성인 집단을 지칭한다. 근교계는, 예를 들어, 몇몇 주기의 형제/자매 육종 또는 자가생식을 통해 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 근교계는 하나 이상의 관심 표현형 형질에 대해 순수 육종된다. "근친교배", "근친교배 개체" 또는 "근친교배 자손"은 근교계로부터 샘플링된 개체이다. 용어 "근친교배"는 실질적으로 동형접합성인 개체 또는 계통을 의미한다. 근교계는 육종 프로그램에서 사용될 때 "모본 계통"으로도 지칭될 수 있다.
용어 "역교배"는 본 개시내용의 범위 내에서, 잡종 자손이 모본 중 하나와 반복적으로 역교배되는 과정을 지칭하는 것으로 이해된다.
용어 "유전자이입", "유전자이입된" 및 "유전자이입하는 것"은 하나의 종, 변종 또는 재배종의 게놈 영역이 또 다른 종, 변종 또는 재배종의 게놈 내로 이들 종의 교배에 의해 이동하는 자연적 및 인공적 과정 둘 모두를 지칭한다. 과정은 선택적으로 반복친과 역교배함으로써 완료될 수 있다.
본원에서 "반수체"로 지칭되는 식물은 반수체 식물에서 감소된 염색체 수(n)를 가지며, 이의 염색체 세트는 배우자의 염색체 세트와 같다. 반수체 유기체에서, 정상적인 염색체 수의 절반만이 존재한다. 따라서, 이배체(2n) 유기체(예를 들어, 옥수수)의 반수체는 일배성(1n)을 나타내고; 사배체(4n) 유기체(예를 들어, 독보리)의 반수체는 이배성(2n)을 나타내고; 육배체(6n) 유기체(예를 들어, 밀)의 반수체는 삼배성(3n)을 나타내고 하는 식이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "배가 반수체"로 지칭되는 식물은 염색체의 반수체 세트를 배가함으로써 발달된다. 임의의 세대수까지 자가생식된 배가 반수체 식물로부터 수득된 식물 또는 종자는 여전히 배가 반수체 식물로서 식별될 수 있다. 배가 반수체 식물은 동형접합성 식물로 간주된다. 식물의 영양 부분 전체가, 배가된 염색체 세트를 갖는 세포로 이루어지지 않는 경우에도, 식물이 임성이면, 식물은 배가 반수체인 것으로 간주되며; 즉, 식물의 영양 조직이 키메라인 경우에도 식물이 생존 가능한 배우자를 함유하면, 식물은 배가 반수체로 간주될 것이다.
"재조합"은 새로운 뉴클레오티드 서열 배열을 생산하기 위한 DNA 가닥의 교환이다. 이 용어는 폴리뉴클레오티드가 주형으로 사용되어 상동성 폴리뉴클레오티드를 복구하는 이중-가닥 DNA 파단(break) 복구에서 발생하는 상동성 재조합의 과정을 지칭할 수 있다. 이 용어는 감수분열 동안의 2개의 상동성 염색체 간의 정보의 교환도 지칭할 수 있다. 이중 재조합의 빈도는 단일 재조합체의 빈도의 곱이다. 예를 들어, 10 cM 영역에서의 재조합체는 10%의 빈도로 발견될 수 있으며, 이중 재조합체는 10% x 10% = 1 %의 빈도로 발견된다(1 센티모르간은 검정교배에서 1% 재조합체 자손으로 정의된다).
"테스터 식물"은 본 개시내용의 범위 내에서 시험될 식물에서 형질을 유전학적으로 특징규명하기 위해 사용된 식물을 지칭하는 것으로 이해된다. 전형적으로, 시험될 식물을 "테스터" 식물과 교배하고, 교배의 자손에서의 형질의 분리 비를 점수화한다.
용어 "테스터"는 표준 유전자형, 알려져 있는 특징 및 확립된 성능을 갖는 계통 또는 개체를 지칭한다. "테스터 모본"은 유성 교배에서 모본으로서 사용되는 테스터 계통으로부터의 개체이다. 전형적으로, 테스터 모본은 그와 교배되는 개체와는 관련이 없고, 유전학적으로 상이하다. 테스터는 전형적으로, 표현형 평가를 위해 개체 또는 근교계와 교배되는 경우 FI 자손을 생성하기 위해 사용된다.
용어 "이형잡종 군" 및 "이형잡종 풀"은 상호교환 가능하게 사용되며, 다른 유전학적으로 별개의 생식질 군으로부터의 유전자형 또는 근교계와 교배되는 경우에 유사한 이형잡종 반응을 나타내는 유전자형 또는 근교계의 군을 지칭한다. 이형잡종 군 간에 비교된 계통의 더욱 먼 유전학적 관계의 정도에 비해, 이형잡종 군 내에 함유된 계통의 유전학적 관계의 정도는 더 가깝다. 일반적으로, 동일한 이형잡종 군 내에서 함께 교배되는 두 근교계의 잡종은, 상이한 이형잡종 군으로부터의 근교계와 교배되는 하나의 이형잡종 군으로부터의 근교계의 잡종보다 훨씬 더 낮은 헤테로시스를 보인다. 특정 이형잡종 군은 다양한 유전학을 갖는 다수의 계통을 포함할 수 있다. 각각의 개별 이형잡종 군 내의 예시적인 이형잡종 군 및 특허권이 있는(proprietary) 생식질 계통은 표 7에 기재되어 있다. 본 개시내용에서, 이형잡종 군 전체의 유전자형의 총체는 이형잡종 군의 생식질로도 지칭될 수 있다. 광범위하게, 이형잡종 풀에 대한 주요 명칭은 다음과 같다: 스티프 스토크(Stiff Stalk)("SS", 아이오와 스티프 스토크 신테틱(Iowa Stiff Stalk Synthetic) 또는 "BSSS"로도 불림), 논-스티프 스토크(Non-Stiff Stalk)("NSS"), 열대(Tropical) 및 논-스티프 스토크 이오덴트(Non-Stiff Stalk Iodent)("IDT"). 문헌[J. Hweerwaarden, et al., Historical genomics of North American maize, PROC. NAT'L ACAD. SCI. U.S.A. 109(31): 12420-25 (2012)]을 참조한다. 그러나, 이들은 배타적인 것은 아니며, 다른 명칭, 예를 들어, 랭커스터 슈어 크롭(Lancaster Sure Crop; "LSC")이 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[C. Livini, et al., Genetic diversity of maize inbred lines with and among heterotic groups revealed by RFLPs, THEOR. APPL. GENET. 84: 17-25 (1992)]을 참조한다.
용어 "헤테로시스"는 잡종 강세, 즉, 모본에 비하여 잡종 후손에서의 임의의 생물학적 품질(예를 들어, 크기, 성장률, 번식력, 수율 등)의 개선된 또는 증가된 기능을 지칭한다. 예를 들어, 상이한 이형잡종 군으로부터의 근친교배 식물 계통 간의 교배의 후손은 상기 기재된 바와 같이, 이의 모본 계통보다 더 많은 헤테로시스를 나타낼 가능성이 있다. 이러한 교배의 1 세대 후손은 일반적으로 두 모본 모두의 원하는 특징을 더 많이 보인다. 1 세대 잡종이 함께 교배되면, 이 헤테로시스는 후속 세대에서 감소할 수 있다.
용어 "종자 세트"는 배(즉, 낟알 또는 종자)를 생산하는 옥수수 이삭의 부분의 척도를 지칭한다. 종자 세트는 질적으로(예를 들어, 낮음, 우수함 또는 높음) 또는 양적으로 표현될 수 있다. 양적 측정에서, 측정치는 이삭당 종자의 수 또는 백분율로 제공될 수 있다. 이 용어는 일반적으로 정상적인 낟알(즉, 비-발육 부전, 내배유-생존 가능한 낟알)의 백분율 또는 수를 지칭한다. 정상적인 옥수수 계통(즉, 반수체 유도인자 계통이 아님)의 경우, 80% 초과(또는 이삭당 300개 초과의 낟알)의 종자 세트가 우수한 종자 세트로 간주된다. 반수체 유도인자 계통의 경우, 종자 세트는 더 낮은 경향이 있으므로, 50% 초과(예를 들어, 60% 초과, 70% 초과 또는 80% 초과)의 종자 세트 또는 이삭당 180개 초과(예를 들어, 200개 초과, 220개 초과, 260개 초과 또는 280개 초과)의 낟알은 일반적으로 높은 종자 세트로 간주된다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환 가능하게 사용되며, 본원에 사용되는 바와 같이, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 미토콘드리아 DNA 및 상기의 합성 형태 및 혼합된 중합체의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 두 뉴클레오티드 유형 모두의 변형된 형태 및 이들의 조합을 지칭한다. 이 용어는 또한, 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA 및/또는 RNA를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 원형 DNA 주형, 본원에 개시된 핵산 콘카타머는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결기에 의해 함께 연결된 자연 발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다. 핵산 분자는, 당업자가 용이하게 인식할 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나, 비-자연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형에는, 예를 들어, 표지, 메틸화, 유사체를 이용한 자연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 하전되지 않은 연결기(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카바메이트 등), 하전된 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티(예를 들어, 폴리펩티드), 인터칼레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이트제, 알킬화제 및 변형된 연결기(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)가 포함된다. 상기 용어는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 듀플렉스화된, 삼중체, 헤어핀, 원형 및 자물쇠 입체형태를 포함하는, 임의의 토폴로지 입체형태를 포함하는 것으로 하고자 한다. 핵산 서열에 대한 언급은, 달리 명시되지 않는 한, 이의 보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 언급은 이의 상보적인 서열과 함께 이의 상보적인 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 뉴클레오티드 서열은 (예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성 규칙에 따라) 이들이 용액에서 특이적으로 혼성화되는 경우에 "상보적"이다. 이 용어에는 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산도 포함된다. 또한, 핵산이 정제될 수 없거나, 정제될 수 있거나, 예를 들어, 합성 물질, 예컨대 비드 또는 컬럼 매트릭스에 부착될 수 있음이 이해된다.
핵산 서열의 맥락에서 용어 "~에 상응하는"은 특정 서열의 핵산 서열이 서로 정렬되는 경우, 본 발명에서 특정 열거된 위치에 "상응하는" 핵산이 기준 서열 내의 이들 위치와 정렬되는 것이지만, 본 발명의 특정 핵산 서열에 비하여 이들 정확한 수치적 위치에 반드시 존재하는 것은 아님을 의미한다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 알려져 있는 알고리즘의 컴퓨터 구현 또는 시각 검사에 의해 수행될 수 있다. 용이하게 이용 가능한 서열 비교 및 다중 서열 정렬 알고리즘은 각각 인터넷(예를 들어, EMBL-EBI의 웹사이트)에서 이용 가능한 기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST) 및 ClustalW/ClustalW2/Clustal Omega 프로그램이다. 기타 적합한 프로그램에는 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 악셀리스 인코포레이티드(Accelrys, Inc.)로부터 입수 가능한 악셀리스 GCG 패키지의 일부인 GAP, BestFit, Plot Similarity 및 FASTA가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 또한, 문헌[Smith & Waterman, 1981]; 문헌[Needleman & Wunsch, 1970]; 문헌[Pearson & Lipman, 1988]; 문헌[Ausubel et al., 1988]; 및 문헌[Sambrook & Russell, 2001]을 참조한다.
용어 "유전자"는 염색체 상의 특정 위치를 차지하고 유기체 내의 특정 특징 또는 트레인에 대한 유전학적 명령(genetic instruction)을 함유하는 DNA의 서열을 포함하는 유전 단위를 지칭한다.
용어 "양적 형질 유전자좌" 또는 "QTL"은 특정 표현형 형질, 즉, 수치적으로 측정될 수 있고, 정도가 달라지며, 다유전자 효과, 즉, 둘 이상의 유전자의 산물 및 이들의 환경에 기인할 수 있는 표현형과 관련된 DNA의 영역을 지칭한다. 전형적으로, QTL은 질적(즉, 별개의) 형질과는 반대로, 연속 형질(연속적으로 달라지는 이들 형질, 예를 들어, 반수체 유도율)의 기저를 이룬다.
용어 "대립유전자(들)"는 하나 이상의 대안적인 형태의 유전자 중 임의의 것 의미하며, 이러한 대립유전자 모두는 적어도 하나의 형질 또는 특징과 연관된다. 이배체 세포에서, 주어진 유전자의 2개의 대립유전자는 한 쌍의 상동성 염색체 상의 상응하는 유전자좌를 점유한다. 일부 예에서, (예를 들어, QTL의 경우), "대립유전자" 대신에 "반수체형"(즉, 염색체 세그먼트의 대립유전자)을 지칭하는 것이 더 정확하지만, 이들 예에서, 용어 "대립유전자"는 용어 "반수체형"을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 2개의 개체(예를 들어, 2개의 식물)가 특정 유전자좌에 동일한 대립유전자를 지닌다면, 대립유전자는 대립유전자가 하나의 공통 조상으로부터 유전되는(즉, 대립유전자가 동일한 모본 대립유전자의 카피인) 경우, "기원에 따라 일치하는(identical by descent)" 것으로 명명된다. 대안은 대립유전자가 "상태에 따라 일치하는(identical by state)" 것이다(즉, 대립유전자는 동일한 것으로 보이지만, 대립유전자의 2개의 상이한 카피로부터 유래됨). 연관 연구(linkage study)에는 기원에 따른 일치 정보가 유용하며; 관련 연구(association study)에서는 기원에 따른 일치 및 상태에 따른 일치 정보 둘 모두가 사용될 수 있지만, 기원에 따른 일치 정보가 특히 유용할 수 있다.
용어 "반수체형"은 개체가 하나의 모본으로부터 유전된 대립유전자의 세트를 지칭할 수 있다. 따라서, 이배체 개체는 2개의 반수체형을 갖는다. 용어 "반수체형"은 표현형 형질과 관련된 물리적으로 연결된 및/또는 연결되지 않은 유전자 마커(예를 들어, 서열 다형성)를 지칭하기 위해 보다 제한된 의미로 사용될 수 있다. 문구 "반수체형 블록(block)"(때때로 문헌에서 간단히 반수체형으로도 지칭됨)은 단일 염색체(또는 이의 부분) 상에 물리적으로 연결된 둘 이상의 유전자 마커의 군을 지칭한다. 전형적으로, 각각의 블록은 소수의 공통 반수체형을 가지며, 이들 반수체형 각각을 독특하게 식별하는 유전자 마커(즉, "반수체형 태그")의 하위세트가 선택될 수 있다.
용어 "유전자형" 및 이의 변형은 예를 들어, 이배체 유기체가 하나 이상의 유전자 또는 유전자좌에 대해 이형접합성인지(즉, 주어진 유전자 또는 QTL에 대해 2개의 상이한 대립유전자를 갖는지) 또는 동형접합성인지(즉, 주어진 유전자 또는 QTL에 대해 동일한 대립유전자를 갖는지)를 포함하여, 유기체의 유전학적 조성을 지칭한다(예를 들어, SNP, 반수체형, 유전자 돌연변이, 삽입 또는 결실). 본원에 사용되는 바와 같이, 특정 대립유전자에 대한 용어 "적어도 이형접합성"은 적어도 하나의 카피의 대립유전자가 존재하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 유전자의 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 옥수수 식물은 하나 또는 2개의 카피(즉, 이형접합성 또는 동형접합성)의 HI 대립유전자를 갖는다.
"표현형"은 본 개시내용의 범위 내에서 유전학적으로 제어된 형질의 구별 가능한 특징(들)을 지칭하는 것이 이해된다. 문구 "표현형 형질"은 그의 게놈과 환경의 상호작용으로 인해 초래되는, 개체의 외양 또는 다른 검출 가능한 특징을 지칭한다.
문구 "질적 형질"은 둘 이상의 특질 값을 갖는 카테고리로 설명될 수 있는 주요 표현형 효과를 나타내는 하나의 또는 소수의 유전자에 의해 제어되는 표현형 형질을 지칭한다. 이 때문에, 질적 형질은 전형적으로 단순히 유전된다. 식물에서 예는 꽃색, 속대 색상 및 내병성, 예를 들어, 북부 옥수수 잎마름병 내성(Northern corn leaf blight resistance) 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
용어 "다형성" 및 이의 변형은 집단 내의 둘 이상의 유전학적으로 결정된 대안적인 서열 또는 대립유전자의 발생을 지칭한다. "다형성 부위"는 분기가 발생하는 유전자좌를 지칭한다. 바람직한 다형성 부위는 적어도 2개의 대립유전자를 가지며, 각각은 집단 내에서 특정 빈도로 발생한다. 다형성 유전자좌는 1개 염기쌍만큼 작을 수 있다. 다형성의 대립유전자 중 하나는 기준 대립유전자로서 임의로 지정되며, 다른 대립유전자는 대안적인 대립유전자, "변이체 대립유전자" 또는 "변이(variance)"로 지정된다. 선택된 집단에서 가장 빈번하게 발생하는 대립유전자는 때때로 "야생형" 대립유전자로 지칭될 수 있다. 이배체 유기체는 변이체 대립유전자에 대해 동형접합성이거나 이형접합성일 수 있다. 변이체 대립유전자는 변이체 대립유전자를 보유하는 개체에서 관찰 가능한 물리적 또는 생화학적 특징(표현형)을 생산하거나, 생산하지 않을 수 있다. 예를 들어, 변이체 대립유전자는 관심 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 효소 활성을 변경할 수 있거나, 대안적으로, 변이체 대립유전자는 인코딩된 단백질의 효소 활성에 대한 효과를 갖지 않을 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "마커," "다형성 마커" 또는 "유전자 마커"는 대립유전자의 존재 또는 부재를 나타내는 알려져 있는 염색체 유전자좌를 갖는 유전자 또는 DNA 서열을 지칭한다. 마커는 유전자형 분석을 위해 사용되는 유전자 내에 존재하거나, 이에 연결될 수 있다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 이의 인코딩된 산물(예를 들어, mRNA 전사물, 비코딩 RNA 전사물 또는 단백질)로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 측접한 뉴클레오티드 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 및/또는 프라이머로서 사용되는 뉴클레오티드 서열도 지칭한다. 이 용어는 다형성에 상보적이거나 이에 측접한 뉴클레오티드 서열의 부재도 지칭할 수 있다. 마커는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 단일 뉴클레오티드 변이체(SNV), 작은 삽입 또는 결실(인델), 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 가변적인 수의 탠덤 반복부(VNTR), 초가변 영역, 미소부수체, 디뉴클레오티드 반복부, 트리뉴클레오티드 반복부, 테트라뉴클레오티드 반복부, 간단한 서열 반복부 및 삽입 요소, 예컨대 트랜스포존을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "기능 상실 돌연변이"는 야생형 유전자의 분자 기능을 결여한 돌연변이된 유전자 산물을 초래하는 유전자의 DNA 서열의 변화(즉, "돌연변이")이다. 기능 상실 돌연변이를 야기할 수 있는 4가지 주요 유전학적 변이가 존재한다: 1) 절단된 단백질 서열을 생산하는 조기 정지 코돈을 초래하는 돌연변이; 2) 스플라이싱에 영향을 미치는 정규 스플라이스 부위에서 발생하는 돌연변이(mRNA 전사물에서 인트론의 포함 또는 엑손의 배제를 초래함); 3) 전장 전사물을 파괴함으로써 프레임시프트를 야기하는, 유전자 코딩 영역에 위치한 3의 정수배가 아닌 삽입 또는 결실 변이체; 및 4) 돌연변이 근처에 대안적인 출발 코돈이 없는 경우 유전자 전사를 방지하는 개시 코돈(전사 출발 코돈, 예를 들어, ATG)의 상실을 초래하는 돌연변이. 또한, 유전자의 프로모터 또는 비번역 영역(UTR)에서 돌연변이는 유전자 발현을 감소시키거나 제거하여, 기능 상실을 야기할 수 있다.
용어 "마커-기반 선택"은, 본 개시내용의 범위 내에서, 핵산이 원하는 형질과 관련된 식물로부터 하나 이상의 핵산을 검출하여, 바람직한(또는 바람직하지 않은) 형질에 대한 유전자를 보유한 식물을 식별하고, 그에 따라 이들 식물을 임의의 목적을 위해, 예를 들어, 형질전환 프로그램에서 또는 선택적 육종 프로그램에서 사용하기(또는 회피하기) 위한 유전자 마커의 이용을 지칭하는 것으로 이해된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 정상 A 세포질을 나타내는 마커는 정상 B 세포질을 갖는 비-CMS 식물과 정상 B 세포질을 갖지 않는, 즉, 정상 A 세포질을 갖는 것들을 판별할 것이다. 마커는 게놈의 유전자좌 내의 돌연변이(예를 들어, 단일 뉴클레오티드 다형성("SNP") 또는 하나의 대립유전자 내의 돌연변이)일 수 있다.
용어 "마커 프로브" 및 "프로브"는 본원에 사용되는 바와 같이, 더 큰 서열 내의 서열(예를 들어, 본원에서 개시된 마커)의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 핵산 프로브는 마커 또는 마커 유전자좌 모두 또는 그 일부에 상보적이며, 예를 들어, 핵산 혼성화를 통해 마커의 존재 또는 부재를 검출할 수 있다. 마커 프로브의 길이는 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 마커 프로브는 8 내지 200개 뉴클레오티드, 예를 들어, 10 내지 100개 뉴클레오티드, 또는 15 내지 60개 뉴클레오티드의 범위의 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 프로브의 약 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 연속 뉴클레오티드는 마커에 상보적이며, 핵산 혼성화를 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 핵산 표적에 어닐링되어(일부 실시형태에서, 핵산 표적에 특이적으로 어닐링되어) DNA 중합효소 및/또는 역전사효소가 이에 부착되는 것을 가능하게 함으로써, 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에(예를 들어, 적합한 온도 및 pH에서 뉴클레오티드 및 DNA 중합효소와 같은 중합을 위한 작용제의 존재 하에) 배치될 때 DNA 합성의 개시점 역할을 할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 식물 핵산을 증폭시키기 위해 하나 이상의 복수의 프라이머가 이용된다(예를 들어, 중합효소 연쇄 반응; PCR을 사용).
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "~와 관련된"은 2개의 엔티티 간의 인지 가능한 및/또는 검정 가능한 관계를 지칭한다. 예를 들어, 문구 "반수체 유도(HI)와 관련된"은 형질, 유전자좌, 유전자, 대립유전자, 마커, 표현형 등 또는 이의 발현 산물을 지칭하는데, 이의 존재 또는 부재는 식물 또는 이의 자손이 HI를 나타내는 정도 및/또는 범위에 영향을 미치거나 이를 나타낼 수 있다. 이와 같이, 마커가 형질에 연결된 경우 및 마커의 존재가 마커를 포함하는 식물/생식질에서 원하는 형질 또는 형질 형태가 발생할 것인지 및/또는 어느 정도로 발생할 것인지의 지표인 경우, 마커는 형질과 "관련"되어 있다. 유사하게, 마커가 대립유전자에 연결된 경우 및 마커의 존재(또는 부재)가 마커를 포함하는 식물, 생식질 또는 집단에서 대립유전자가 존재(또는 부재)하는지의 지표인 경우, 마커는 대립유전자와 "관련"되어 있다. 예를 들어, "HI와 관련된 마커"는 이의 존재 또는 부재가 식물이 HI를 나타낼 것인지의 여부 및/또는 어느 정도로 나타낼 것인지를 예측하기 위해 사용될 수 있는 마커를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 물질"은 옥수수의 단일 이삭 또는 이삭의 세트로부터 생겨난 종자, 배 또는 기타 재생 조직, 또는 이로부터 성장된 식물을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 계통"은 단일 식물 물질 또는 유전학적으로 동일한 물질의 세트를 지칭한다.
용어 "생식질"은 개체의 다른 군 또는 집단(예를 들어, 종 또는 식물 계통)의 유전자형의 총체를 지칭한다. 문구 "적응 생식질(adapted germplasm)"은, 예를 들어, 주어진 환경 또는 지리적 영역에 대해, 유전학적 우위가 입증된 식물 물질을 지칭하는 한편, 문구 "비적응 생식질", "원시 생식질(raw germplasm)", 및 "외래 생식질(exotic germplasm)"은, 예를 들어, 주어진 환경 또는 지리적 영역에 대해, 알려져 있지 않거나 입증되지 않은 유전학적 가치의 식물 물질을 지칭하고, 이와 같이, 문구 "비적응 생식질"은 일부 실시형태에서는 확립된 육종 집단의 일부가 아니며, 확립된 육종 집단의 구성원과 알려져 있는 관계를 갖지 않는 식물 물질을 지칭한다.
용어 "세포형"은 식물 계통과 관련된, 미토콘드리아 및 엽록체의 유전학적 기여를 포함하는, 세포질의 분류를 지칭한다. 현재 알려져 있는 세포형은 정상 A("NA") 및 정상 B("NB") 세포질을 포함하지만, 세포질 웅성 불임 세포형: 세포질-웅성-불임 C("C" 또는 "CMS-C") 세포질, 세포질-웅성-불임 S("S" 또는 "CMS-S") 세포질 및 세포질-웅성-불임 T("T" 또는 "CMS-T") 세포질도 포함한다. 세포형 및 세포질이라는 용어는 상호교환 가능하게 사용된다.
"형질전환 가능한", "형질전환성" 등은 외래 DNA를 더욱 용이하게 수용하고, 외래 DNA를 이의 게놈 내로 안정적으로 통합할 수 있는 식물, 식물의 계통 또는 식물 세포(예컨대, 캘러스 조직 또는 원형질체)를 지칭한다.
"형질전환 빈도", "TF", "형질전환 효율" 및 "형질전환 비율"은 성공적으로 형질전환된 식물의 수를, 형질전환을 시도한 총 식물(예를 들어, 배)의 수로 나눈 척도를 의미한다. 이 척도는 양적으로, 예를 들어, 백분율, 원수치로서, 또는 질적으로, 예를 들어, "저" 또는 "고"로서 표현될 수 있다.
용어 "TF 대립유전자"는 식물(예를 들어, 옥수수 식물)에서의 이의 존재가, 동일한 유전자 또는 유전자좌에 대한 대안적인 대립유전자와 비교하여 증가된 TF와 관련된 유전자 또는 유전자좌의 대립유전자를 지칭한다. 일부 경우에, TF 대립유전자는 유전자, QTL 또는 QTL 내의 유전자좌의 대립유전자이다.
용어 "TF-QTL"은 증가된 형질전환 빈도(TF)와 관련된 QTL을 지칭한다. TF-QTL에서의 TF 대립유전자의 존재는 비-TF 대립유전자가 TF-QTL에 존재하는 경우와 비교하여 증가된 TF를 초래한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "저항성"은 형질전환 가능하지 않거나 본질적으로 형질전환 가능하지 않은 식물 계통을 지칭한다. 다시 말하면, 이의 형질전환 효율은 0%이거나 본질적으로 0%이다. 저항성이라는 용어는 "비형질전환 가능한"과 동의어이며, 이들 용어는 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "반수체 유도율" 또는 "HIR"은 이삭이 반수체 유도인자 화분과 수분된 후의 총 낟알의 수로 나눈 생존 중인 반수체 낟알의 수를 지칭한다.
용어 "HI 대립유전자"는 식물(예를 들어, 옥수수 식물)에서의 이의 존재가, 동일한 유전자 또는 유전자좌에 대한 대안적인 대립유전자와 비교하여 증가된 HI와 관련된 유전자 또는 유전자좌의 대립유전자를 지칭한다. 일부 경우에, HI 대립유전자는 유전자, QTL 또는 QTL 내의 유전자좌의 대립유전자이다.
용어 "HI-QTL"은 반수체 유도(HI)와 관련된 QTL을 지칭한다. HI-QTL에서의 HI 대립유전자의 존재는 비-HI 대립유전자가 HI-QTL에 존재하는 경우와 비교하여 증가된 반수체 유도율(HIR)을 초래한다. 예시적인 HI-QTL은 B73v5 기준 게놈에서 위치 3,444,422와 위치 11,360,090 사이의 9번 염색체 상에 위치한 qhir8이다.
II. HI-NA 옥수수 식물
일 양태에서, 적어도 2가지 특징을 지니는 옥수수 식물이 본원에 제공된다: 1) 반수체 유도를 효율적으로 유도하는 능력; 및 2) 높은 수준의 형질전환성. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 파타틴-유사 포스포리파제 A2α(MATL) 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 적어도 하나의 HI-QTL에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, HI-QTL은 (B73v5 기준 게놈에서 위치 3,444,422와 위치 11,360,090 사이의 9번 염색체 상에 위치한) qhir8일 수 있다. 본원에 제공된 옥수수 식물은 또한, 정상 A("NA") 세포형을 가지며, 이는 일부 실시형태에서, 증가된 형질전환성에 기여한다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 증가된 형질전환성과 관련된 적어도 하나의 유전자 또는 QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 또한 높은 화분하(pollen load) 및/또는 웅수 중량(tassel weight)을 나타낸다.
A. 반수체 유도
흔히, 반수체 유도 육종 동안, 유도 교배에서 사용된 두 모본 계통 모두는 이배체이므로, 이들의 배우자(즉, 난 세포 및 정자 세포)는 반수체이다. 반수체 유도는 빈번히 유도인자 계통의 중간 내지 낮은 침투 형질이므로, 생성된 자손은 종 또는 상황에 따라, 이배체(게놈 제거가 일어나지 않는 경우) 또는 반수체(게놈 제거가 발생하는 경우)일 수 있다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, "반수체"는 어느 모본이든 그 모본의 염색체 수의 절반을 지니며; 따라서 이배체 유기체(예를 들어, 옥수수)의 반수체는 일배성을 나타내고; 사배체 유기체(예를 들어, 독보리)의 반수체는 이배성을 나타내고; 육배체 유기체(예를 들어, 밀)의 반수체는 삼배성을 나타내고 하는 식이다.
일부 실시형태에서, 반수체 유도는 반수체 유도인자 웅성 계통을 또 다른 계통과 교배하고, 이것이 반수체 유도인자 계통으로부터의 염색체 세트의 손실의 유도 및 반수체 배의 생산을 초래함으로써 달성된다(즉, 효율적인 반수체 유도). 반수체 유도 효율은 반수체 유도율("HIR")로 표현될 수 있으며, 이는 반수체 유도인자 계통과 또 다른 계통 간의 교배로부터의 반수체인 총 자손 배의 백분율이다. 예시적인 HIR을 결정하는 방법은 섹션 II.B 및 또한 본 개시내용의 실시예에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 몇몇 게놈 유전자좌에서의 변이체 HI 대립유전자는 효율적인 반수체 유도를 촉진할 수 있다(예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 12% 또는 적어도 15%의 HIR). 일부 실시형태에서, HI 대립유전자는 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(PLPA2α, Zm00001d029412[B73_v5]로도 알려져 있고, 매트리니얼[MATL], 낫 라이크 대드1[NLD1] 및 포스포리파제 A1[PLA1]로도 알려져 있는 1번 염색체 상의 옥수수 B73 유전자 ID GRMZM2G471240[이 유전자 ID는 B73_v4 게놈으로부터의 것임])의 대립유전자이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 HI-QTL에서의 HI 대립유전자는 반수체 유도도 촉진할 수 있다. 일부 실시형태에서, HI 대립유전자는 9번 염색체 상의 qhir8 HI-QTL에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 옥수수 식물은 MATL 유전자에 HI 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, HI 대립유전자는 MATL의 기능 상실 돌연변이(일반적으로 matl로 지칭됨)이다. 일부 실시형태에서, 변이체 대립유전자는 MATL 코딩 서열에 4개 염기쌍 삽입 프레임시프트 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 4개 염기쌍 삽입은 SEQ ID NO:125의 위치 1146 내지 1149에서의 4개의 뉴클레오티드에 상응한다. 일부 실시형태에서, 변이체 대립유전자는 상이한 돌연변이(즉, 4개 염기쌍 삽입 돌연변이 이외의 것) 또는 MATL에 의해 인코딩되는 단백질 산물의 기능 상실을 초래하는 상이한 돌연변이를 포함한다. MATL의 기능 상실 돌연변이를 식별할 수 있는 임의의 검정을 사용하여, 본원에 기재된 식물을 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정은 하기 섹션 II.E에 기재된 유전자형 분석 방법 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, MATL의 기능 상실 돌연변이를 식별하기 위한 검정은 유전자의 야생형 cDNA 서열(SEQ ID NO:124)에 기초하여 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, MATL의 기능 상실 돌연변이를 식별하기 위한 검정은 마커 SM7246, SM7252, 검정 2826 및 검정 2827 중 하나 이상에서 개체를 유전자형 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 마커에서의 유전자형은 TaqMan® 실시간 PCR 검정(예를 들어, 본원에서 섹션 II.E 또는 실시예 1에 상세히 설명된 방법에 따름)을 사용하여 검출될 수 있다. 표 1에는 TaqMan 실시간 PCR 유전자형 분석 검정에서 사용될 수 있는 예시적인 프라이머 및 프로브와 함께, 일부 실시형태에 따른, 이들 마커 각각에서의 예상되는 유전자형 및 서열 컨텍스트가 열거되어 있다. 마커 SM7246 및 SM7252에 대해 표 1에 기재된 TaqMan 검정은 각각 열거된 유전자형을 구별할 수 있는 상이한 형광단을 갖는 2개의 프로브를 포함한다. 검정 2826 및 검정 2827에 대해 표 1에 기재된 TaqMan 검정은 각각 MATL 게놈 유전자좌 및 비교용 대조군의 일부의 증폭 및 형광 프로브-기반 검출을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검정 2826에서 MATL-특이적 프로브는 야생형 MATL 서열을 검출한다(즉, 돌연변이 서열이 검출되지 않는다). 일부 실시형태에서, 검정 2827에서 matl-특이적 프로브는 4 bp 삽입을 갖는 기능 상실 돌연변이 matl 서열을 검출한다(즉, 야생형 서열은 검출되지 않는다).
[표 1]
MATL의 기능 상실 돌연변이를 유전자형 분석하기 위해 사용되는 예시적인 마커.
C/C: 마커에서 시토신에 대해 동형접합성; G/G: 마커에서 구아닌에 대해 동형접합성; I/I: 마커에서 4 bp 삽입 돌연변이 대립유전자에 대해 동형접합성; D/D: 마커에서 4 bp 삽입이 없는 WT 대립유전자에 대해 동형접합성.
일부 실시형태에서, MATL의 기능 상실 돌연변이를 식별하기 위한 검정은 표현형 검정일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 MATL 서열에 의해 인코딩된 단백질의 수준은 당업자에게 알려져 있는 다양한 방법(예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광, 질량분석법 등) 중 임의의 것에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능적 검정을 사용하여, 돌연변이된 MATL 서열에 의해 인코딩된 단백질이 이의 통상의 기능을 수행할 수 있는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 추정상의 MATL 돌연변이를 포함하는 식물을 테스터 식물과 교배하여, MATL에 의해 인코딩된 단백질의 정상적인 기능과 관련된 형질을 평가할 수 있다(예를 들어, 하기 실시예에 상세히 설명된 바와 같은, 종자 세트 또는 반수체 유도율).
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 옥수수 식물은 증가된 반수체 유도와 관련된 적어도 하나의 양적 형질 유전자좌(QTL)(HI-QTL) 대립유전자에 HI 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 적어도 하나의 HI-QTL에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성(예를 들어, 이형접합성 또는 동형접합성)이다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 적어도 하나의 HI-QTL에서 HI 대립유전자에 대해 동형접합성이다. 일부 실시형태에서, HI-QTL에서 HI 대립유전자에 대해 동형접합성인 옥수수 식물은 HI-QTL에서 HI 대립유전자에 대해 이형접합성인 옥수수 식물에 비하여 더욱 효율적인 반수체 유도를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 9번 염색체 상의 qhir8 HI-QTL에 HI 대립유전자를 포함한다. QTL을 식별하거나 유전자형 분석할 수 있는 임의의 검정을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 qhir8 HI-QTL에 HI 대립유전자를 포함하는 식물을 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, qhir8 HI-QTL에서 HI 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 하기 섹션 II.E에 기재된 유전자형 분석 방법 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, qhir8 HI-QTL에서 HI 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 알려져 있는 qhir8 HI-QTL 마커 중 임의의 것에 기초하여 개발될 수 있다. 일부 실시형태에서, qhir8 HI-QTL에서 HI 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 유전자좌의 야생형 서열과 증가된 반수체 유도와 관련된 유전자좌의 변이체 대립유전자의 서열 간의 임의의 차이에 기초하여 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, qhir8 HI-QTL에서 HI 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 마커 SM4849, SM8047, SM8133, SM8029, SM4257 및 SM0956BQ 중 하나 이상에서 개체를 유전자형 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 마커에서의 유전자형은 TaqMan 실시간 PCR 검정(예를 들어, 본원에서 섹션 E 또는 실시예 1에 상세히 설명된 방법에 따름)을 사용하여 검출될 수 있다. 표 2에는 TaqMan 실시간 PCR 유전자형 분석 검정에서 사용될 수 있는 예시적인 프라이머 및 프로브와 함께, 일부 실시형태에 따른, 이들 마커 각각에서의 예상되는 유전자형 및 서열 컨텍스트가 열거되어 있다.
[표 2]
qhir8 HI-QTL을 유전자형 분석하기 위해 사용되는 예시적인 마커.
A/A: 마커에서 아데닌에 대해 동형접합성; T/T: 마커에서 티민에 대해 동형접합성; C/C: 마커에서 시토신에 대해 동형접합성; G/G: 마커에서 구아닌에 대해 동형접합성.
일부 실시형태에서, qhir8 HI-QTL에서 HI 대립유전자는 qhir8 HI-QTL 내에 위치한 DUF679 도메인 막 단백질 7(DMP) 유전자(B73v5 기준 게놈에서 Zm00001d044822)에 변이체 대립유전자를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zhong, et al., 2019, "Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize," Nature Plants 5:575-580]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 DMP 유전자에서 HI 변이체 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성(예를 들어, 이형접합성 또는 동형접합성)이다. 일부 실시형태에서, 변이체 대립유전자는 DMP의 기능 상실 돌연변이이다. DMP의 기능 상실 돌연변이를 식별할 수 있는 임의의 검정을 사용하여, 본원에 기재된 식물을 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정은 하기 섹션 E에 기재된 유전자형 분석 방법 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, DMP의 기능 상실 돌연변이를 식별하기 위한 검정은 유전자의 야생형 서열(SEQ ID NO:126)에 기초하여 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, DMP의 기능 상실 돌연변이를 식별하기 위한 검정은 표현형 검정일 수 있다. 예를 들어, DMP에 의해 인코딩된 단백질의 수준은 당업자에게 알려져 있는 다양한 방법(예를 들어, 웨스턴 블롯, 면역형광, 질량분석법 등) 중 임의의 것에 의해 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 기능적 검정을 사용하여, DMP에 의해 인코딩된 단백질이 이의 통상의 기능을 수행할 수 있는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 추정상의 DMP 돌연변이를 포함하는 식물을 테스터 식물과 교배하여, DMP에 의해 인코딩된 단백질의 정상적인 기능과 관련된 형질을 평가할 수 있다(예를 들어, 하기 실시예에 상세히 설명된 바와 같은, 종자 세트 또는 반수체 유도율).
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 옥수수 식물은 관심 후손(예를 들어, 반수체가 되는 후손 낟알)의 스크리닝 및 선택을 용이하게 하도록 적어도 하나의 선택 가능한 마커를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 선택 가능한 마커라는 용어는 스크리닝 또는 리포터 마커(예를 들어, 관심 후손에 대해 시각적으로 스크리닝하기 위해 사용될 수 있는 발색 지시약) 및 선택 마커(예를 들어, 관심 후손의 항생제-매개된 농축을 위해 사용될 수 있는 항생제 내성 유전자)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 식물은 선택 가능한 마커 유전자를 포함한다. 선택 가능한 마커 유전자는 예를 들어, 전이유전자 또는 내인성 유전자의 돌연변이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커 유전자는 검출 가능한 단백질 산물을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 식물은 선택 가능한 마커에 대해 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 식물은 선택 가능한 마커에 대해 동형접합성이다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커 유전자는, 이배체 배에만 존재하여 하기에 및 실시예에 상세히 설명된 바와 같이 반수체 배의 선택을 용이하게 할 안료 또는 다른 검출 가능한 산물을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, CI, NPTII, HPT, ACC3, AADA, 고 오일 함량(예를 들어, 문헌[Melchinger et al. 2013. Sci. Reports 3:2129] 및 문헌[Chaikam et al. 2019. Theor. and Appl. Genet. 132:3227-3243] 참조), R-나바조(R-navajo, R-nj), R1-배반(R1-SCM2) 및/또는 안토시아닌 안료 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 다른 선택 가능한 마커 유전자는 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Ziemienowicz. 2001. Acta Physiologiae Plantarum 23:363-374] 참조). 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 항생제 내성 유전자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 (B73v5 기준 게놈에서 위치 약 139 Mb에서 약 140 Mb 주위의) 10번 염색체 상의 R1 유전자좌에 R-나바조("R-nj") 또는 R1-배반("R1-SCM2") 변이체 대립유전자를 포함한다. 이들 대립유전자는 종자의 배 및 내배유 둘 모두에서 자색 또는 적색 색상을 발현할 우성 안토시아닌 형질을 부여한다. R-nj 대립유전자는 호분층(내배유의 최외층)에서의 매우 강력한 안토시아닌 발현 및 배에서의 더 약한 발현과 관련된다. R1-SCM2 대립유전자는 배의 배반에서의 강력한 안토시아닌 발현 및 호분층에서의 더 약한 발현과 관련된다. 이들 우성으로 발현되는 대립유전자를 포함하는 반수체 유도인자 계통과 또 다른 계통 간의 교배로 인해 초래되는 이배체 배는 자색 또는 적색 색상을 나타낼 것이다. 반수체 유도인자 계통의 모본 염색체 세트를 손실한 배는 색상을 나타내지 않을 것이다.
야생형 R1 유전자좌와 변이체 대립유전자 R-nj 및/또는 R1-SCM2를 구별할 수 있는 임의의 검정을 사용하여, 본원에 기재된 식물을 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정은 하기 섹션 E에 기재된 유전자형 분석 방법 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정은 유전자좌의 야생형 서열, 및/또는 변이체 대립유전자 R-nj 및/또는 R1-SCM2의 서열에 기초하여 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, R1 유전자좌에 변이체 R1-SCM2 대립유전자를 포함하는 식물을 식별하기 위한 검정은 마커 SM0954, SM0954HQ, SM6568, SM0953BQ 및 SM6604 중 하나 이상에서 개체를 유전자형 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 마커에서의 유전자형은 TaqMan 실시간 PCR 검정(예를 들어, 본원에서 섹션 E 또는 실시예 1에 상세히 설명된 방법에 따름)을 사용하여 검출될 수 있다. 표 3에는 TaqMan 실시간 PCR 유전자형 분석 검정에서 사용될 수 있는 예시적인 프라이머 및 프로브와 함께, 일부 실시형태에 따른, 이들 마커 각각에서의 예상되는 유전자형 및 서열 컨텍스트가 열거되어 있다.
[표 3]
R1 유전자좌를 유전자형 분석하기 위해 사용되는 예시적인 마커.
A/A: 마커에서 아데닌에 대해 동형접합성; T/T: 마커에서 티민에 대해 동형접합성; C/C: 마커에서 시토신에 대해 동형접합성; G/G: 마커에서 구아닌에 대해 동형접합성.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 옥수수 식물은 B73v5 기준 게놈에서 위치 8 Mb와 10 Mb 사이에 위치한 9번 염색체 상의 색상 저해인자 유전자좌에 야생형 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 식물은 색상 저해인자 유전자좌에서 야생형 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성(예를 들어, 이형접합성 또는 동형접합성)이다. 이 색상 저해인자 유전자좌에서의 변이체 대립유전자는 R1 유전자좌에 R1-SCM2 대립유전자를 포함하는 옥수수 계통의 배에서 자색 및/또는 적색 색소형성을 감소시킬 수 있다. 감소된 색소형성은 자색 또는 적색 배(즉, 이배체 배)를 백색 또는 미색-색상의 배(즉, 반수체 배)와 구별하기 더욱 어렵게 만들 수 있다. 일부 실시형태에서, 색상 저해인자 유전자좌에 이 변이체 대립유전자를 갖지 않는 옥수수 식물에 대한 선택은 상기 식물의 이배체 후손이 강력한 자색 또는 적색 색상을 나타내는 것을 보장할 수 있고, 이는 이들을 백색 또는 미색-색상의 반수체 배와 구별하는 것을 용이하게 만든다. 일부 실시형태에서, 이 선택은 색상 저해인자 유전자좌에 야생형 대립유전자를 갖는 식물을 선택함으로써 달성된다. 야생형 색상 저해인자 유전자좌와 변이체 대립유전자를 구별할 수 있는 임의의 검정을 사용하여, 본원에 기재된 식물을 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정은 하기 섹션 E에 기재된 유전자형 분석 방법 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정은 유전자좌의 야생형 서열 및/또는 변이체 색상 저해인자 대립유전자의 서열에 기초하여 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, 9번 염색체 색상 저해인자 유전자좌에서 야생형 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 마커 SM8040 및 SM8091 중 하나 또는 그 둘 모두에서 개체를 유전자형 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 마커에서의 유전자형은 TaqMan 실시간 PCR 검정(예를 들어, 본원에서 섹션 E 또는 실시예 1에 상세히 설명된 방법에 따름)을 사용하여 검출될 수 있다. 표 4에는 TaqMan 실시간 PCR 유전자형 분석 검정에서 사용될 수 있는 예시적인 프라이머 및 프로브와 함께, 일부 실시형태에 따른, 이들 마커 각각에서의 예상되는 유전자형 및 서열 컨텍스트가 열거되어 있다.
[표 4]
9번 염색체 색상 저해인자 유전자좌를 유전자형 분석하기 위해 사용되는 예시적인 마커.
A/A: 마커에서 아데닌에 대해 동형접합성; C/C: 마커에서 시토신에 대해 동형접합성; G/G: 마커에서 구아닌에 대해 동형접합성.
B. 반수체 유도율(HIR)을 결정하는 방법
반수체 유도율은 수분 후에(예를 들어, 수분 후 약 15일 내지 20일째에) 검정교배된 이삭을 수확함으로써 결정될 수 있다. 낟알로부터의 배를 분리하고, 배의 생존력을 유지하기에 적합한, 적절한 배지(배 구제(rescue) 배지로 지칭됨)에서 인큐베이션시킬 수 있다. 일 실시형태에서, HIR 결정을 위해 사용되는 구제 배지는 비타민, 30 그램의 수크로스 및 70 mg의 살리실산을 갖는 무라시지 및 스쿡(Murashige and Skoog) 기본 배지 4.43 그램을 포함한다. 구제 배지 중 배를 색 지표 유전자(color indicator gene)(예를 들어, R1-SCM2)의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배치할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 배 중 일부가 R1-SCM2 유전자의 발현으로 인하여 자색으로 변할 때까지, 배를 22 내지 31℃에서 16 내지 24시간 동안 100 내지 400 마이크로몰 광 하에 배치한다. 예를 들어, 제WO2015/104358호에 기재된 바와 같은 프로토콜을 참조한다. 자색(이배체) 및 미색-색상의(반수체) 배를 각각의 이삭으로부터 계수할 수 있다. 반수체 유도율로 알려져 있는 반수체의 빈도는 총 배에 비한 반수체의 수에 기초하여 결정될 수 있다.
C. 식물 형질전환성
본원에 제공된 옥수수 식물은 높은 수준의 형질전환성을 갖는다. 형질전환성은 당업자에게 알려져 있는 다양한 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 시험 벡터를 형질전환시키고, 성공적으로 형질전환된 배의 백분율(즉, 형질전환 비율)을 검출함으로써 배를 형질전환성에 대해 시험할 수 있다. 형질전환은 본원에 사용되는 바와 같이, 외래 DNA를 옥수수 게놈 내로 도입하는 임의의 방법(예를 들어, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환, 입자 충격(particle bombardment) 등)을 지칭할 수 있다. 예시적인 옥수수 형질전환 방법은 하기 섹션 IV에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공되는 옥수수 식물은 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 8%, 적어도 10%, 적어도 12% 또는 적어도 15%의 형질전환 비율을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 높은 수준의 형질전환성을 갖는 본원에 제공되는 옥수수 식물은 정상 A 세포형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 높은 수준의 형질전환성을 갖는 본원에 제공되는 옥수수 식물은 적어도 하나의 TF-QTL(예를 들어, 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성(즉, 이형접합성 또는 동형접합성)이다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 적어도 하나의 TF-QTL(예를 들어, qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 동형접합성이다. 일부 실시형태에서, TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 동형접합성인 옥수수 식물은 TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 이형접합성인 옥수수 식물보다 더 높은 수준의 형질전환성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 높은 수준의 형질전환성을 갖는 본원에 제공되는 옥수수 식물은 적어도 하나의 TF-QTL(예를 들어, 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL)에 정상 A 세포형 및 TF 대립유전자 둘 모두를 포함한다. TF-QTL에 TF 대립유전자를 포함하는 옥수수 식물은 본원에 기재된 것들을 포함하는 임의의 알려져 있는 유전자형 분석 전략을 사용하여 식별될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 식물 및 방법은 정상 A(NA) 세포형을 갖는 식물을 포함한다. 식물의 세포형은 다양한 알려져 있는 방법을 통해 결정될 수 있다. 정상 B(NB) 및 세포질-웅성-불임(CMS) 세포형을 포함하는 다른 알려져 있는 세포형과 NA 세포형을 구별할 수 있는 임의의 검정이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검정은 하기 섹션 II.E에 기재된 유전자형 분석 방법 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, NA 세포형을 구별하기 위한 검정은 문헌[Allen, et al., 2007, "Comparisons among two fertile and three male-sterile mitochondrial genomes of maize," Genetics 177: 1173-1192]에 의해 개시된 NA 및 NB 미토콘드리아 게놈에 기초하여 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, NA 세포형을 다른 세포형과 구별하기 위한 검정은 마커 SM2918, SM4813, SM2914 및 SM4812 중 하나 이상에서 개체를 유전자형 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 마커에서의 유전자형은 TaqMan 실시간 PCR 검정(예를 들어, 본원에서 섹션 II.E 또는 실시예 1에 상세히 설명된 방법에 따름)을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 마커 SM2918 및 SM4813 중 하나 또는 그 둘 모두는 정상 세포형(즉, NA 또는 NB)을 CMS 세포형과 구별하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 마커 SM2914 및 SM4812 중 하나 또는 그 둘 모두는 NA 세포형을 NB 세포형과 구별하기 위해 사용된다. 표 5에는 TaqMan 실시간 PCR 유전자형 분석 검정에서 사용될 수 있는 예시적인 프라이머 및 프로브와 함께, 일부 실시형태에 따른, 이들 마커 각각에서의 예상되는 유전자형 및 서열 컨텍스트가 열거되어 있다.
[표 5]
정상 A 세포형을 정상 B 세포형 및 CMS 세포형 개체와 구별하기 위해 사용되는 예시적인 마커.
C/C: 마커에서 시토신에 대해 동형접합성; A/A: 마커에서 아데닌에 대해 동형접합성; I/I: 마커에서 6 bp 삽입 대립유전자에 대해 동형접합성; D/D: 마커에서 6 bp 결실 대립유전자에 대해 동형접합성.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 옥수수 식물은 증가된 형질전환성과 관련된 적어도 하나의 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에 TF 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 B73v5 기준 게놈에서 위치 14,742,407과 70,562,070 사이의 3번 염색체 상에 위치한 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에 TF 대립유전자를 포함한다. QTL을 식별하거나 유전자형 분석할 수 있는 임의의 검정을 사용하여, 본원에 기재된 바와 같은 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에 TF 대립유전자를 포함하는 식물을 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서의 TF 대립유전자는 옥수수 SYN-INBC34 계통과 일치한다. 일부 실시형태에서, TF-QTL에 상이한 대립유전자(예를 들어, 옥수수 RWKS/Z21S//RWKS 계통의 대립유전자)를 포함하는 식물은 형질전환의 여지가 보다 작다. 일부 실시형태에서, qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서 TF 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 하기 섹션 II.E에 기재된 유전자형 분석 방법 중 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서 TF 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 본원에 기재된 마커(예를 들어, 하기 실시예 1에 기재되고, 표 6, 표 19 및/또는 표 20에 열거된 것들) 중 임의의 것에서 옥수수 식물을 유전자형 분석하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서 TF 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 유전자좌에서의 RWKS 대립유전자(즉, 증가된 형질전환성과 관련되지 않은 TF-QTL 대립유전자)의 서열과 유전자좌에서의 SYN-INBC34 대립유전자(즉, TF-QTL에서의 TF 대립유전자)의 서열 간의 임의의 차이에 기초하여 개발될 수 있다.
일부 실시형태에서, qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서 TF 대립유전자를 식별하기 위한 검정은 마커 SM3158, SM4787, SM3814, SM3362, SM0634AQ 및 SM4586 중 하나 이상에서 개체를 유전자형 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 마커에서의 유전자형은 TaqMan 실시간 PCR 검정(예를 들어, 본원에서 섹션 II.E 또는 실시예 1에 상세히 설명된 방법에 따름)을 사용하여 검출될 수 있다. 표 6에는 TaqMan 실시간 PCR 유전자형 분석 검정에서 사용될 수 있는 예시적인 프라이머 및 프로브와 함께, 일부 실시형태에 따른, 이들 마커 각각에서의 예상되는 유전자형 및 서열 컨텍스트가 열거되어 있다.
[표 6]
qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL을 유전자형 분석하기 위해 사용되는 예시적인 마커.
A/A: 마커에서 아데닌에 대해 동형접합성; C/C: 마커에서 시토신에 대해 동형접합성; G/G: 마커에서 구아닌에 대해 동형접합성.
D. 형질전환 빈도(TF)를 결정하는 방법
형질전환 빈도(TF)는 당업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 관심 유전자를 포함하는 구축물은 하기 섹션 IV에 기재된 방법을 사용하여 식물, 식물의 계통 또는 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 형질전환을 시도한 식물 또는 식물 부분(예를 들어, 배)의 수에 비한 전이유전자를 발현하는 식물의 수를 계산하며, 이는 TF와 같다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 관심 전이유전자는 지표 전이유전자(indicator transgene)를 포함하며, 이의 발현은 식물에서 용이하게 관찰될 수 있는 표현형을 초래한다. 따라서, 식물에서의 표현형의 관찰은 성공적인 형질전환을 나타낸다.
E. 유전자형 분석 방법
다양한 수단을 사용하여, 관심 다형성 부위, 예컨대 유전자(예를 들어, MATL, DMP), QTL(예를 들어, qhir8, qCYTO-A_TF3.1 3번 염색체 QTL) 또는 미토콘드리아 게놈 유전자좌에서 개체(예를 들어, 식물)를 유전자형 분석할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자형 분석 검정은 샘플(예를 들어, 핵산 샘플)이 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커)를 함유하는지, 반수체형을 함유하는지를 결정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 개체로부터의 핵산의 효소적 증폭을 편리하게 사용하여, 후속 분석을 위해 핵산을 수득할 수 있다. 하나 이상의 관심 유전자좌에서의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재는 또한, 효소적 증폭 없이 개체의 핵산으로부터 직접적으로 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 개체를 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 다형성 부위, 예컨대 하나 이상의 관심 유전자좌에서의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에서 유전자형 분석한다. 일부 실시형태에서, 개체를 미토콘드리아 게놈 내의 하나 이상의 관심 유전자좌에서의 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 다형성 부위에서 유전자형 분석한다(예를 들어, NA 세포형 개체를 다른 세포형의 개체와 구별하기 위해).
개체로부터의 핵산의 유전자형 분석은 증폭 여부에 관계없이 다양한 기법 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 기법은 비제한적으로 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기반 분석 검정, 서열 분석 검정, 전기영동 분석 검정, 제한 길이 다형성 분석 검정, 혼성화 분석 검정, 대립유전자-특이적 혼성화, 올리고뉴클레오티드 라이게이션 대립유전자-특이적 신장/라이게이션, 대립유전자-특이적 증폭, 단일-염기 연장, 분자 반전 프로브, 침습적 절단, 선택적 종결, 제한 길이 다형성, 시퀀싱, 단일 가닥 입체형태 다형성(SSCP), 단일 가닥 사슬 다형성, 불일치-절단, 및 변성 구배 겔 전기영동과 같은 검정을 포함하고, 이들 모두는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다.
핵산을 함유하는 물질은 관례적으로 개체로부터 수득된다. 이러한 물질은 핵산을 제조할 수 있는 임의의 생물학적 물질이다. 비제한적인 예로서, 물질은 식물 부분(예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 열매, 화분, 난 세포, 접합자, 종자, 삽수, 세포 또는 조직 배양물 또는 식물의 임의의 다른 부분 또는 산물) 또는 핵산을 포함하는 임의의 식물 조직 또는 다른 식물 부분일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 유묘로부터의 잎 펀치(leaf punch)를 사용하여 실시하며, 이는 비-침습적인 수단에 의해 용이하게 수득되고, 게놈 및/또는 미토콘드리아 DNA를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 유전자형 분석은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용한 개체의 핵산의 증폭을 포함한다.
다양한 상이한 프라이머 중 임의의 것을 사용하여, 개체의 핵산을 PCR에 의해 증폭시켜, 본 개시내용의 식물 또는 방법에서 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커)의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, PCR 분석을 위한 프라이머는 관심 유전자 내의 관심 다형성 부위(들)에 측접한 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 비제한적인 예로서, 서열 프라이머는 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 관심 다형성 부위의 상류 또는 하류에 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드의 서열을 함유할 수 있다. 이러한 프라이머는 일반적으로 증폭 반응에서 안정적인 어닐링 단계를 가능하게 하는 높은 용융 온도를 달성하기에 충분한 구아닌 및 시토신 함량을 갖도록 설계된다. 몇몇 컴퓨터 프로그램, 예컨대 Primer Select는 PCR 프라이머의 설계를 돕기 위해 이용 가능하다.
대립유전자 판별 검정(예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 입수 가능한 TaqMan® 검정)은 개체를 다형성 부위에서 유전자형 분석함으로써, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 결정하는 데 유용할 수 있다. TaqMan® 대립유전자 판별 검정에서, 각각의 대립유전자에 대한 특이적 형광 염료-표지된 프로브를 구축한다. 프로브는 각각의 대립유전자의 증폭을 판별하기 위해 상이한 형광 리포터 염료, 예컨대 FAM 및 TET를 함유한다. 또한, 각각의 프로브는 하나의 말단에 형광 공명 에너지 전달에 의해 형광을 켄칭하는 켄처(quencher) 염료를 갖는다. PCR 동안, 각각의 프로브는 개체로부터의 핵산 내의 상보적인 서열에 특이적으로 어닐링된다. Taq 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성을 사용하여, 대립유전자에 혼성화되는 프로브만을 절단한다. 절단은 켄처 염료로부터 리포터 염료를 분리하여, 리포터 염료에 의한 형광의 증가를 초래한다. 따라서, PCR 증폭에 의해 생성된 형광 신호는 어떤 대립유전자가 샘플에 존재하는 지를 나타낸다. 프로브와 대립유전자 간의 불일치는 프로브 혼성화 및 Taq 중합효소에 의한 절단 둘 모두의 효율을 감소시켜, 형광 신호가 거의 없거나 형광 신호가 부재하는 결과를 초래한다. 당업자는 대립유전자 판별 검정에서 개선된 특이성이 예를 들어, 문헌[Kutyavin et al., Nuc. Acids Research 28:655-661 (2000)]에 기재된 바와 같이 DNA 좁은 홈(minor groove) 결합제(MGB) 기를 DNA 프로브에 컨쥬게이션시킴으로써 달성될 수 있음을 이해한다. 좁은 홈 결합제에는 디하이드로사이클로피롤로인돌 트리펩티드(DPI3)와 같은 화합물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
서열 분석은 또한, 본원에 기재된 방법에 따라 개체를 유전자형 분석하여, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 결정하는 데 유용할 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 관심 변이체 대립유전자는 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 관심 다형성 부위에 측접한 서열에 기초하여 설계되는 적절한 프라이머를 사용하여 서열 분석에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 변이체 대립유전자는 당업자에 의해 설계된 프라이머를 사용하는 서열 분석에 의해 검출될 수 있다. 추가적 또는 대안적인 서열 프라이머는 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 관심 다형성 부위의 상류 또는 하류에 약 40 내지 약 400개 염기쌍의 서열에 상응하는 약 15 내지 약 30개 뉴클레오티드의 서열을 함유할 수 있다. 이러한 프라이머는 일반적으로 시퀀싱 반응에서 안정적인 어닐링 단계를 가능하게 하는 높은 용융 온도를 달성하기에 충분한 구아닌 및 시토신 함량을 갖도록 설계된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 분석"은 핵산 내의 뉴클레오티드의 순서를 결정하는 임의의 수동의 또는 자동화 과정을 포함하며, 비제한적으로 화학적 및 효소적 방법을 포함한다.
전기영동 분석은 또한, 본 개시내용의 방법에 따라 개체를 유전자형 분석하여, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 결정하는 데 유용할 수 있다. 하나 이상의 핵산, 예컨대 증폭된 단편에 관하여 본원에 사용되는 바와 같은 "전기영동 분석"은 하전된 분자가 전계의 영향 하에서 정지 매질을 통해 이동하는 과정을 포함한다. 전기영동 분석 방법 및 이의 변형은 예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology Chapter 2 (Supplement 45) John Wiley & Sons, Inc. New York (1999)]에 기재된 바와 같이, 당업계에 널리 알려져 있다.
제한 단편 길이 다형성(RFLP) 분석은 또한, 본 개시내용의 방법에 따라 개체를 유전자형 분석하여, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 결정하는 데 유용할 수 있다(문헌[Jarcho et al. in Dracopoli et al., Current Protocols in Human Genetics pages 2.7.1-2.7.5, John Wiley & Sons, New York; Innis et al.,(Ed.), PCR Protocols, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)] 참조). RFLP 분석은 PCR 증폭 산물에서 수행될 수 있다.
또한, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화는 본원에 기재된 식물 또는 방법에서 개체를 유전자형 분석하여, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 결정하는 데 유용할 수 있다. 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화는 예를 들어, 변이체 대립유전자를 포함하는 서열에 대해 완벽하게 상보성인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 이용에 기초한다. 적절한 조건 하에서, 변이체 대립유전자-특이적 프로브는 변이체 대립유전자를 함유하는 핵산에 혼성화되지만, 프로브와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 불일치를 갖는 하나 이상의 다른 대립유전자에는 혼성화되지 않는다. 필요에 따라, 대안적인(예를 들어, 야생형) 대립유전자와 일치하는 제2 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브도 사용될 수 있다. 유사하게, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 증폭의 기법을 사용하여 예를 들어, 변이체 대립유전자의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적이지만, 다른 대립유전자와 비교하여 하나 이상의 불일치를 갖는 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용함으로써 변이체 대립유전자를 선택적으로 증폭시킬 수 있다(상기 문헌[Mullis et al.]). 당업자는 변이체 대립유전자와 다른 대립유전자를 구별하는 하나 이상의 뉴클레오티드 불일치가 흔히 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화에 사용될 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 중앙에 위치하는 것을 이해한다. 대조적으로, PCR 증폭에 사용될 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 프라이머의 3' 말단에서 변이체와 다른 대립유전자를 구별하는 하나 이상의 뉴클레오티드 불일치를 함유한다.
헤테로듀플렉스 이동도 검정(HMA)은 본 개시내용의 식물 또는 방법에서 유전자형 분석하여, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 검출하는 데 유용할 수 있는, 또 다른 널리 알려져 있는 검정이다. HMA는 불일치를 보유한 DNA 듀플렉스가 폴리아크릴아미드 겔에서, 완벽하게 염기 쌍형성된 듀플렉스의 이동도와 비교하여 감소된 이동도를 갖기 때문에, 변이체 대립유전자의 존재를 검출하는 데 유용하다(문헌[Delwart et al., Science, 262:1257-1261 (1993)]; 문헌[White et al., Genomics, 12:301-306 (1992)] 참조).
단일 가닥 입체형태 다형성(SSCP)의 기법은 또한, 본원에 기재된 식물 또는 방법에서 유전자형 분석하여, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 결정하는 데 유용할 수 있다(문헌[Hayashi, Methods Applic., 1:34-38 (1991)] 참조). 이 기법은 비-변성 겔 전기영동 시에 변경된 전기영동 이동도를 야기하는 단일-가닥 DNA의 이차 구조의 차이에 기초하여 변이체 대립유전자를 검출하는 데 사용된다. 변이체 대립유전자는 알려져 있는 대립유전자를 함유하는 상응하는 표준 단편에 대한 시험 단편의 전기영동 패턴의 비교에 의해 검출된다.
변성 구배 겔 전기영동(DGGE)은 또한, 본 개시내용의 식물 또는 방법에서, 관심 유전자 또는 유전자좌 내의 특정 변이체 대립유전자(예를 들어, 돌연변이 또는 QTL 마커) 또는 반수체형의 존재 또는 부재를 결정하는 데 유용할 수 있다. DGGE에서, 이중-가닥 DNA를 증가하는 농도의 변성제를 함유하는 겔에서 전기영동하고; 불일치 대립유전자로 구성된 이중-가닥 단편은 더욱 신속하게 용융하는 세그먼트를 갖고, 이는 이러한 단편이 완벽하게 상보적인 서열과 비교하여 상이하게 이동하게 한다(문헌[Sheffield et al., "Identifying DNA Polymorphisms by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis" in Innis et al., supra, 1990] 참조).
개체를 유전자형 분석하는 데 유용한 다른 분자적 방법은 당업계에 알려져 있으며, 본 개시내용의 식물 또는 방법에서 유용하다. 이러한 널리 알려져 있는 유전자형 분석 접근법에는 비제한적으로 자동화 시퀀싱 및 RNase 불일치 기법이 포함된다(문헌[Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:7575-7579 (1985)] 참조). 또한, 당업자는 다수의 변이체 대립유전자의 존재 또는 부재가 결정되어야 하는 경우, 개별 변이체 대립유전자가 분자적 방법의 임의의 조합에 의해 검출될 수 있음을 이해한다. 일반적으로, 문헌[Birren et al. (Eds.) Genome Analysis: A Laboratory Manual Volume 1 (Analyzing DNA) New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997)]을 참조한다. 또한, 당업자는 다수의 변이체 대립유전자가 개별 반응 또는 단일 반응에서 검출될 수 있음을 이해한다("다중" 검정).
F. DNA 변형 효소
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 HI-NA 옥수수 식물은 DNA 변형 효소를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 식물은 또한, 선택적으로 적어도 하나의 가이드 핵산(예를 들어, 가이드 RNA)을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA 변형은 Cas9 뉴클레아제, Cas12a 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(MN), 아연-핑거 뉴클레아제, (ZFN), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), dCas9-Fokl, dCas12a-FokI, 키메라 Cas9-시티딘 데아미나제, 키메라 Cas9-아데닌 데아미나제, 키메라 FENl-FokI, MegaTAL, 닉카제 Cas9(nCas9), 키메라 dCas9 비-Fokl 뉴클레아제, dCas12a 비-Fokl 뉴클레아제, 키메라 Cas12a-시티딘 데아미나제 및 Cas12a-아데닌 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위-지정 뉴클레아제이다. 이러한 식물을 수득하는 방법은 하기 섹션 III에 더욱 상세히 기재되어 있다.
G. 식물 이형잡종 군
유리하게는, 본원에 논의된 HI-NA 식물을 생산하기 위해 육종에서 사용되는 HI 식물 및 NA 식물을 포함하는 본 개시내용의 옥수수 식물은 임의의 알려져 있는 이형잡종 군으로부터 유래될 수 있다. 형질 유전자이입 외에도, 식물 육종의 목적은 잡종의 모본 계통뿐만 아니라 변종 계통에서 유전학적 개선을 이루는 것이다. 효과적인 잡종 육종 프로그램은 잡종의 자성 모본 이형잡종 군과 잡종의 웅성 모본 이형잡종 군 둘 모두에서 모본 계통에 대해 유전학적 개선을 이룬다. 따라서, 육종 프로그램에서 사용되는 모든 이형잡종 군에서 유전학적 개선을 이루는 것이 유리하다. 표 7은 다양한 생식질이 속하는 통상적인 이형잡종 군을 보여준다. HI-NA 식물은 또한, 임의의 이형잡종 군으로부터의 옥수수 식물과 교배하여, 이의 게놈을 편집하고, 이의 형질을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 옥수수 식물은 표 7의 이형잡종 군 중 임의의 것에 속한다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 스티프 스토크 생식질, 논-스티프 스토크 생식질, 논-스티프 스토크 이오덴트 생식질, 열대 생식질 또는 아열대(subtropical) 생식질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 옥수수 식물은 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 이형잡종 군으로 분류되는 생식질을 포함한다(예를 들어, 문헌[L. Reid, et al., 2011, "Genetic diversity analysis of 119 Canadian maize inbred lines based on pedigree and simple sequence repeat markers," Can. J. Plant Sci. 91: 651-661] 및 문헌[M. Mikel and J. Dudley, 2006, "Evolution of North American Dent Corn from Public to Proprietary Germplasm," Crop Sci. 46: 1193-1205](이들 각각은 본원에 그 전체가 참조로 포함됨) 참조). 본 개시내용의 옥수수 식물은 또한, 임의의 공개적으로 알려져 있는 또는 특허권이 있는 계통으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 옥수수 식물은 계통 스톡(Stock) 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS 및/또는 NP2222 중 임의의 것으로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 옥수수 식물은 임의의 다른 관심 계통으로부터 유래된다.
[표 7]
이형잡종 군 및 예시적인 생식질 계통.
III. HI-NA 식물의 생산
또 다른 양태에서, 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물(HI-NA 식물)을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, HI-NA 식물의 생산은 화분 공여자로서의 HI 식물 계통(상기 개시된 바와 같은 유전자 또는 HI-QTL 중 임의의 것에 HI 대립유전자의 조합을 지님)을 수여자로서의 NA 식물 계통과 교배하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수여자 식물 계통은 또한, 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 TF-QTL에 TF 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수여자 식물 계통은 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에 TF 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 식물 계통 및/또는 수여자 식물 계통은 높은 화분하 및/또는 웅수 중량을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 야생형 대립유전자는 하나 이상의 유전자 및/또는 HI-QTL에서 상응하는 HI 대립유전자를 형성하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 모든 HI 대립유전자 및 HI-QTL을 편집하기 위한 유전자 편집 기구는 예를 들어, 동시-형질전환 과정을 통해, 동일한 표적 식물에 전달된다. 일부 실시형태에서, HI-QTL/HI 대립유전자의 편집은 순차적으로 발생한다. 예를 들어, 야생형 대립유전자를 편집하여 (예를 들어, qhir8 QTL에서) 제1 HI 대립유전자를 생산하기 위한 유전자 편집 기구가 먼저 전달될 수 있으며, 제1 HI 대립유전자를 포함하는 식물이 선택된다. 이후에, (예를 들어, MATL 유전자에서) 제2 HI 대립유전자를 표적화하는 유전자-편집 기구가, 제1 HI 대립유전자를 이미 포함하고 있는 동일한 식물 또는 후속 세대의 동일한 식물에 도입되고 하는 식이다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 HI-QTL/HI 대립유전자가 동시에 편집된 후, 추가의 HI-QTL/HI 대립유전자의 편집이 이어진다. 전술된 형질전환 계획의 다양한 대안도 고려되며, 본 개시내용에 포함된다. HI 식물의 생산의 예시적인 실시형태는 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제10,285,348호에 개시되어 있다.
A. 육종 전략
다양한 방법을 사용하여 본 개시내용에서 HI-NA 식물을 생산할 수 있다. 방법의 한 예시적인 실시형태는 도 1에 예시되어 있다. 일부 실시형태에서, HI 식물은 화분 공여자 모본(웅성 모본)으로서의 역할을 하며, 자성 모본으로서의 NA 식물과 교배되어 F1 식물을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 모본은 MATL 유전자에서 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성(예를 들어, 이형접합성 또는 동형접합성)이다. 일부 실시형태에서, HI 대립유전자는 qhir8 HI-QTL에 HI 대립유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, HI 대립유전자는 qhir8 HI-QTL 내의 DMP 유전자에 기능 상실 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 모본은 형질전환 저항성이다. 일부 실시형태에서, 자성 모본 옥수수 식물은 제3 유전자좌에서(예를 들어, TF-QTL에서) TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성(예를 들어, 이형접합성 또는 동형접합성)이다. 일부 실시형태에서, 자성 모본은 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 모본으로부터의 화분은 자성 모본 옥수수 식물을 수분시키기 위해 사용된다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 교배로부터의 F1 자손 식물은 모두 모계 세포질 유전으로 인하여 NA 세포질을 가질 것이다. 일부 실시형태에서, F1 자손 식물은 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성일 것이다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 HI 식물은 상기 기재된 바와 같이, 선택 가능한 마커에 대한 대립유전자를 보유하여, 반수체와 이배체 자손 배 간의 구별을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 HI 식물은 선택 가능한 마커에 대해 동형접합성이다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, CI, NPTII, HPT, ACC3, AADA, 고 오일 함량, R-나바조(R-nj), R1-배반(R1-SCM2) 및/또는 안토시아닌 안료 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커는 10번 염색체 상의 R1 유전자좌에서의 R1-SCM2 대립유전자이다. 일부 실시형태에서, R1-SCM2 대립유전자를 포함하는 화분 공여자 HI 식물은 또한, 상기 기재된 바와 같이, 9번 염색체 상의 색상 저해인자 유전자좌에서 야생형 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. R1-SCM2 대립유전자에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 이배체 배는 자색 색상을 나타낼 것인 한편, R1-SCM2 대립유전자를 갖지 않는 반수체 배는 미색 색상을 나타낼 것이다. 색 지표 유전자는 HI 대립유전자와 동일한 모본으로부터의 것이기 때문에, 배의 색상은 이것이 HI 대립유전자를 보유하는지 여부를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 자색 색상인 배는 이배체이다.
일부 실시형태에서, 이배체 F1 식물을 선택하고, 자가수분시켜, F2 세대를 위한 배를 생산한다. 다른 실시형태에서, 이배체 F1 식물을 NA 모본 식물 계통과 역교배하여, BC1 세대를 생산한다. 일부 실시형태에서, 이배체 F1 식물을 선택 가능한 마커를 사용하여 식별한다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커 산물을 갖는 것들(예를 들어, R1-SCM2 대립유전자의 경우에 자색 색상을 갖는 것들)은 또한 HI 대립유전자를 보유한다. 상기 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 HI 대립유전자의 존재를 확인하기 위해 F2 식물 및 BC1 식물을 유전자형 분석할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 기재된 바와 같은 HI 대립유전자에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인 F2 및/또는 BC1 식물을 추가의 육종을 위해 선택한다. 일부 실시형태에서, F2 및/또는 BC1 자손 식물을, MATL 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, (예를 들어, qhir8 HI-QTL에서) 추가의 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 NA 세포형 식물에 대해 선택한다. 일부 실시형태에서, F2 및/또는 BC1 자손 식물을 (예를 들어, 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서) TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 식물에 대해 선택한다.
일부 실시형태에서, 선택된 F2 식물을 자가수분시켜, F3 식물을 생산한다. 일부 실시형태에서, 선택된 BC1 식물을 자가수분시켜, BC1F2 식물을 생성한다. F3 식물 및/또는 BC1F2 식물을 HI 대립유전자, TF 대립유전자 및/또는 선택 가능한 마커의 존재에 대해 유전자형 분석할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 식물을 또한, 본원에 개시된 방법을 사용하여 HIR에 대해 시험한다. 적합한 F3 식물 및/또는 BC1F2 식물은, 원하는 HI 대립유전자 조합에 대해 적어도 이형접합성이고, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7% 또는 적어도 10%의 HIR도 갖는 경우, 추가의 육종을 위해 선택될 수 있다.
선택된 F3 식물 및/또는 BC1F2 식물을 자가수분시켜, F4 식물 및/또는 BC1F3 식물을 유사한 방식으로 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들 식물의 HIR 및 형질전환 빈도(TF)가 결정된다. 일부 실시형태에서, 충분히 높은 HIR, 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 12% 또는 적어도 15%, 및 또한, 높은 TF, 예를 들어, 적어도 2%, 적어도 5%, 적어도 7%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60%를 나타내는 식물은 HI-NA 식물로서 선택된다.
일부 실시형태에서, 충분히 높은 HIR을 나타내는 F4 식물 및/또는 BC1F3 식물을 추가로 자가수분을 통해 육종하여, 추가의 세대의 식물, 예를 들어, F5, F6, F7, BC1F4, BC1F5, BC1F6을 생산한다. 이들 식물을 이들이 원하는 HIR 및 TF 비율을 갖는 것을 확인하기 위해 시험할 수 있다.
상기 기재된 육종 전략의 추가의 실시형태도 본원에서 고려된다. 예를 들어, 상기 기재된 BC1 식물을 NA 모본 계통과 역교배하여, BC2 식물을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 세대를 모본 계통과 반복적으로 역교배한다(예를 들어, BC3 식물, BC4 식물, BC5 식물 등을 생성하기 위해). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 역교배 세대 후에 자가수분 교배를 수행한다(예를 들어, BC2F2 식물, BC2F3 식물, BC3F2 식물, BC2F3 식물 등을 생성하기 위해). 일부 실시형태에서, HI 대립유전자에 대한 유전자형 분석, TF 대립유전자에 대한 유전자형 분석, HIR 및/또는 TF에 대한 표현형 분석 등 중 하나 이상을 각각의 세대에서 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 방법의 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 표 7의 이형잡종 군 중 임의의 것에 속한다. 일부 실시형태에서, 웅성 모본은 자성 모본과는 상이한 이형잡종 군에 속한다. 일부 실시형태에서, 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 스티프 스토크 생식질, 논-스티프 스토크 생식질, 논-스티프 스토크 이오덴트 생식질, 열대 생식질 또는 아열대 생식질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 이형잡종 군으로 분류되는 생식질을 포함한다(예를 들어, 문헌[L. Reid, et al., 2011, "Genetic diversity analysis of 119 Canadian maize inbred lines based on pedigree and simple sequence repeat markers," Can. J. Plant Sci. 91: 651-661] 및 문헌[M. Mikel and J. Dudley, 2006, "Evolution of North American Dent Corn from Public to Proprietary Germplasm," Crop Sci. 46: 1193-1205](이들 각각은 본원에 그 전체가 참조로 포함됨) 참조). 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 또한, 임의의 공개적으로 알려져 있는 또는 특허권이 있는 계통으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 계통 스톡 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS 및/또는 NP2222 중 임의의 것으로부터 유래된다.
B. 육종 및 돌연변이 표적화
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 생산하기 위한 방법은 육종을 통한 형질 유전자이입과 유전자의 직접적인 돌연변이 표적화의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 야생형 대립유전자는 HI 대립유전자를 형성하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, MATL 및/또는 DMP 유전자의 돌연변이 표적화를 사용하여 HI 대립유전자(예를 들어, 기능 상실 돌연변이 matl 및/또는 dmp)를 생산한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 표적화는 유전자 편집을 통해 달성된다. 일부 실시형태에서, 모든 HI 대립유전자를 편집하기 위한 유전자 편집 기구는 예를 들어, 가이드 RNA 다중화에 의해 또는 동시-형질전환 과정을 통해, 동일한 표적 식물에 전달된다. 일부 실시형태에서, HI 대립유전자의 편집은 순차적으로 발생한다. 예를 들어, 야생형 대립유전자를 편집하여 제1 HI 대립유전자(예를 들어, DMP의 기능 상실 돌연변이)를 생산하기 위한 유전자 편집 기구가 먼저 전달될 수 있으며, 제1 HI 대립유전자를 안정적으로 발현하는 식물이 선택된다. 이후에, 제2 HI 대립유전자를 표적화하는 유전자-편집 기구(예를 들어, MATL의 기능 상실 돌연변이)가, 제1 HI 대립유전자를 이미 발현한 동일한 식물 또는 후속 세대의 동일한 식물에 도입되고 하는 식이다. 일부 실시형태에서, 둘 이상의 HI 대립유전자가 동시에 편집된 후, 추가의 HI 대립유전자의 편집이 이어진다. 전술된 형질전환 계획의 다양한 대안도 고려되며, 본 개시내용에 포함된다. HI 식물의 생산의 예시적인 실시형태는 개시내용 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제10,285,348호에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, MATL 및 DMP 유전자의 야생형 대립유전자를 포함하는 옥수수 식물을 또 다른 옥수수 식물(즉, 자성 모본 식물)과의 교배에서 화분 공여자(즉, 웅성 모본 식물)로서 사용한다. 일부 실시형태에서, 자성 모본 식물은 NA 세포질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자성 모본 식물은 TF-QTL에서(예를 들어, 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서) TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성(예를 들어, 이형접합성 또는 동형접합성)이다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 식물은 상기 기재된 바와 같이, 선택 가능한 마커 유전자 대립유전자를 보유하여, 반수체와 이배체 자손 배 간의 구별을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 화분 공여자 식물은 선택 가능한 마커 유전자 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커 유전자 대립유전자는 GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, CI, NPTII, HPT, ACC3, AADA, 고 오일 함량, R-나바조(R-nj), R1-배반(R1-SCM2) 및/또는 안토시아닌 안료 중 임의의 하나를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택 가능한 마커 유전자 대립유전자는 10번 염색체 상의 R1 유전자좌에서의 R1-SCM2 대립유전자이다. 일부 실시형태에서, R1-SCM2 대립유전자를 포함하는 화분 공여자 식물은 또한, 상기 기재된 바와 같이, 9번 염색체 상의 색상 저해인자 유전자좌에서 야생형 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이다.
일부 실시형태에서, F1 식물을 자가수분시켜, F2 세대를 위한 배를 생산한다. 다른 실시형태에서, F1 식물을 자성 또는 웅성 모본 식물 계통과 역교배하여, BC1 세대를 생산한다. F2 식물 및/또는 BC1 식물을 상기 기재된 바와 같은 유전자형 분석 방법을 사용하여 NA 세포질, TF-QTL에서의 TF 대립유전자, 선택 가능한 마커 유전자 대립유전자 및/또는 9번 염색체 상의 색상 저해인자 유전자좌에서의 야생형 대립유전자의 존재에 대해 선택할 수 있다. 선택된 F2 및/또는 BC1 식물을 상기 기재된 바와 같이, 하나의 또는 몇몇 더 많은 세대를 위해 자가수분시키고/시키거나 역교배할 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택된 F2 및/또는 BC1 식물, 또는 이로부터의 자손을 상기 및 하기 섹션 V에 기재된 바와 같이 편집하여, 형질전환 가능한 반수체 유도인자 식물을 수득하기 위해 MATL 유전자 및/또는 DMP 유전자에서 기능 상실 돌연변이를 야기한다. 일부 실시형태에서, 형질전환 가능한 반수체 유도인자 식물을 하나의 또는 몇몇 세대를 위해 자가수분시키고/시키거나 역교배한다. 형질전환 가능한 반수체 유도인자 식물 또는 이로부터의 자손을 상기 기재된 바와 같이 유전자형 분석하고/하거나 표현형 분석하여, 높은 형질전환성 및 높은 반수체 유도를 갖는 식물을 선택할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 방법의 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 표 7의 이형잡종 군 중 임의의 것에 속한다. 일부 실시형태에서, 웅성 모본은 자성 모본과는 상이한 이형잡종 군에 속한다. 일부 실시형태에서, 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 스티프 스토크 생식질, 논-스티프 스토크 생식질, 논-스티프 스토크 이오덴트 생식질, 열대 생식질 또는 아열대 생식질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 이형잡종 군으로 분류되는 생식질을 포함한다(예를 들어, 문헌[L. Reid, et al., 2011, "Genetic diversity analysis of 119 Canadian maize inbred lines based on pedigree and simple sequence repeat markers," Can. J. Plant Sci. 91: 651-661] 및 문헌[M. Mikel and J. Dudley, 2006, "Evolution of North American Dent Corn from Public to Proprietary Germplasm," Crop Sci. 46: 1193-1205](이들 각각은 본원에 그 전체가 참조로 포함됨) 참조). 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 또한, 임의의 공개적으로 알려져 있는 또는 특허권이 있는 계통으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 웅성 모본 및/또는 자성 모본은 계통 스톡 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS 및/또는 NP2222 중 임의의 것으로부터 유래된다.
IV. HI-NA 옥수수 식물의 형질전환
또 다른 양태에서, 상기 기재된 HI-NA 식물을 형질전환시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 관심 유전자(예를 들어, 상기 개시된 바와 같은 DNA 변형 효소를 인코딩하는 유전자 및 하나 이상의 가이드 RNA)가 상기 기재된 HI-NA 옥수수 식물 내로 도입될 수 있다. 식물의 형질전환을 위한 적합한 방법은 폴리에틸렌 글리콜-유도된 DNA 흡수에 의한 원형질체 형질전환, 유전자 총 - "입자 충격" 방법을 사용한 바이오리스틱(biolistic) 과정, 세포-투과 펩티드(CPP)-매개된 형질전환, 글리콜 매개된 형질전환, 전기천공법, 미세주입 및 아그로박테리움에 의해 매개되는, 상기 기재된 유전자 전달이다. 언급된 과정은 예를 들어, 문헌[B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by S. D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143] 및 문헌[Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225)]에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 관심 유전자를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에서 형질전환되기에 적합한 벡터 내에 클로닝한다. 이어서, 이러한 벡터를 사용하여 형질전환된 아그로박테리아(Agrobacteria)는 식물의, 특히 농작물(crop plant)의 형질전환을 위해 알려져 있는 방식으로, 예를 들어, 상처가 있는 잎 또는 잎의 조각을 아그로박테리아 용액 중에 담근 후에 적합한 배지 중에서 배양함으로써 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 형질전환성을 증가시키는 능력을 갖는 것으로 알려져 있는 하나 이상의 유전자를 HI-NA 식물로 관심 유전자와 동시-형질전환시킨다. 이들 유전자는 이 응용에서 형태형성 인자 또는 부스터 유전자로 지칭된다. 형태형성 인자의 부류는 베이비 붐(BABY BOOM, BBM), BBM-유사(BBM-like), 엠브리오메이커(EMBRYOMAKER, EMK), 아인테구멘타(AINTEGUMENTA, ANT), 아인테구멘타-유사(AINTEGUMENTA-LIKE, AIL), 플레쏘라(PLETHORA, PLT), 우쉘(WUSCHEL, WUS) 또는 WUS 호메오박스(WUS homeobox, Wox), GRF(성장 조절 인자), 슈트 메리스템리스(SHOOT MERISTEMLESS, STM), 아가모스-유사(AGAMOUS-Like, AGL), MYB115, MYB118, 체세포 배발생 수용체-유사 키나제(SERK), 체세포 배 관련 인자(SOMATIC EMBRYO RELATED FACTOR, SERF) 및 국소화된 핵을 함유하는 AT-후크 모티프(AT-HOOK MOTIF CONTAINING NUCLEAR LOCALIZED, AHL)를 포함한다. 부스터 유전자의 비제한적인 예는 밑씨 발달 펩티드(OVULE DEVELOPMENT PEPTIDE, ODP), 베이비 붐(BBM), 우쉘2(WUSCHEL2, WUS2), 우쉘-관련 호메오박스 5(WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 5, WOX5), 성장-조절 인자 5(GROWTH-REGULATING FACTOR 5, GRF5) 또는 성장-조절 인자 4(GROWTH-REGULATING FACTOR 4, GRF4)와 이의 보조인자 GRF-상호작용 인자 1(GRF-INTERACTING FACTOR 1, GIF1)을 조합한 키메라 단백질을 포함한다. 관심 유전자를 이용한 부스터 유전자의 동시-형질전환을 수행하여, 형질전환 효율을 부스팅하는 방법은 예를 들어, 문헌[Lowe et al. (2016) "Morphogenic Regulators Baby boom and Wuschel Improve Monocot Transformation", Plant Cell 28, 1998-2015]; 문헌[Hoerster, et al. (2020) "Use of non-integrating ZmWus2 vectors to enhance maize transformation", In Vitro Cellular & Developmental Biology]; 문헌[Mookkan et al., (2017) "Selectable marker independent transformation of recalcitrant maize inbred B73 and sorghum P898012 mediated by morphogenic regulators BABY BOOM and WUSCHEL2", Plant Cell Reports 36:1477-1491]; 문헌[Kong et al. (2020) "Overexpression of Transcription Factor Growth Regulating Factor5 Improves Transformation of Monocot and Dicot Species", Front. in Plant Sci, 10.3389/fpls.2020.572319)]에 개시된 바와 같이 알려져 있거나, 문헌[Debernardi, J.M. et al. (2020), "A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants", Nature Biotechnology 38: 1274-1279]에 기재된 바와 같은 GRF4-GIF1을 이용함으로써 이루어진다. 전술된 참고문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 또한, 미국 특허 제7,151,170호; 미국 특허 제7,579,529호; 미국 특허 제7,256,322호; 미국 특허 제7,700,829호; WO 2018/224001호; WO 2018/098420호; 및 PCT/US2020/45573호를 참조하며; 이의 모든 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에서, 동시-형질전환에서 사용되는 부스터 유전자는 관심 유전자와는 상이한 벡터에 존재한다. 일부 실시형태에서, 부스터 유전자는 관심 유전자와 동일한 벡터에 존재한다. 하기 실시예 2 및 7은 본원에 개시된 HI-NA 식물로의 하나 이상의 부스터 유전자와 관심 유전자의 동시-형질전환의, 실례가 되는 예시적인 실시형태를 보여준다.
V. 표적 식물의 유전자 편집
본원에 기재된 방법의 다양한 실시형태는 유전자 편집을 이용한다. 일부 실시형태에서, 식물의 게놈에 돌연변이를 일으키기 위해 유전자 편집을 사용하여, 하나 이상의 HI 대립유전자(예를 들어, 유전자의 HI 대립유전자 및/또는 HI-QTL에서의 HI 대립유전자) 및/또는 (예를 들어, TF-QTL에) 하나 이상의 TF 대립유전자를 갖는 식물을 생산한다.
일부 실시형태에서, 상기 기재된 유전자-편집 기구를 이용하여 형질전환되고, 이를 발현하고, 표적 식물과 교배되는 경우, 표적 식물에서 유전자 편집을 초래하는 HI-NA 식물이 본원에 제공된다.
일반적으로, 유전자 편집은 유전자 편집 구성요소 또는 시스템의 일시적인, 유도 가능한 또는 구성적인 발현을 포함할 수 있다. 유전자 편집은 유전자 편집 구성요소 또는 시스템의 게놈 통합 또는 에피솜 존재를 포함할 수 있다.
유전자 편집은 일반적으로, 뉴클레오티드 서열을 원하는 위치에서 절단하기 위한 부위-지정 뉴클레아제(CRISPR/Cas, 아연 핑거, 메가뉴클레아제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음)의 이용을 지칭한다. 이는 삽입/결실("인델") 돌연변이(즉, "SDN1"), 염기 편집(즉, "SDN2"), 또는 대립유전자 삽입 또는 대체(즉, "SDN3")를 야기하기 위한 것일 수 있다. SDN2 또는 SDN3 유전자 편집은 식물 내에서 상동 인도 복구(HDR)을 위해 사용될 수 있는(즉, 식물 게놈 내로 도입될) 관심 유전자 서열을 포함하는 (예를 들어, 벡터 내의) 하나 이상의 재조합 주형의 제공을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 유전자는 식물 게놈 내로 도입되어, HI 식물 또는 HI-NA 식물을 생성할 HI 대립유전자(예를 들어, matl 또는 dmp)일 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심 유전자 또는 대립유전자는 식물에 개선된 형질, 예를 들어, 개선된 수율을 부여할 수 있는 것이다. 재조합 주형은 형질전환을 통해 또는 재조합 주형을 포함하는 공여자 식물과의 육종을 통해 편집될 식물 내로 도입될 수 있다. 식물 게놈에서 파단은 표적 서열 내에, 이의 상류에, 및/또는 이의 하류에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중 가닥 DNA 파단은 표적 서열 유전자좌 내에서 또는 이 근처에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 파단은 표적 서열 유전자좌의 상류 및 하류에서 이루어지며, 이는 게놈으로부터의 이의 절제를 야기할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 단일 가닥 DNA 파단(닉(nick))은 (예를 들어, 닉카제 Cas9 변이체를 사용하여) 표적 서열 내에서, 이의 상류에서, 및/또는 이의 하류에서 이루어진다. 이들 DNA 파단, 뿐만 아니라 당업자에게 알려져 있는 다른 방법을 통해 도입된 것들 중 임의의 것은 HDR을 유도할 수 있다. HDR을 통하여, 표적 서열은 제공되는 재조합 주형의 서열에 의해 대체된다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 관심 유전자 서열(예를 들어, matl 또는 dmp 대립유전자 서열)은 주형 상에/주형으로서 제공될 수 있다. 하나 이상의 단일 가닥 또는 이중 가닥 파단이 관심 유전자 서열을 포함하지 않는 식물의 게놈 내의 상응하는 영역 내에, 이의 상류에 및/또는 이의 하류에 도입되도록 시스템을 설계함으로써, 이 영역은 관심 유전자 서열을 포함하는 주형으로 대체될 수 있다. 이 방식으로, 식물 내의 관심 유전자 서열의 도입은 특히 특정 유전학적 백그라운드의 식물에서 다수의 역교배를 포함할 필요는 없다. 유사하게, 돌연변이된 관심 유전자 서열(예를 들어, matl 또는 dmp)은 주형으로서 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 관심 유전자(예를 들어, matl 또는 dmp)에서 돌연변이는 DNA 이중 가닥 파단의 표적화된 도입을 통해 재조합 주형을 이용하지 않고 생성될 수 있다. 이러한 파단은 비-상동성 말단 연결(NHEJ)의 과정을 통해 복구될 수 있으며, 이는 복구 부위에서 작은 삽입 또는 결실(인델)의 생성을 초래할 수 있다. 이러한 인델은 프레임시프트 돌연변이로 이어져, 표적화된 유전자에서 조기 정지 코돈 또는 다른 유형의 기능 상실 돌연변이를 야기할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 편집은 표적 식물에서 유전자 편집 구성요소 또는 시스템의 일시적인, 유도 가능한 또는 구성적인 발현을 포함할 수 있다. 유전자 편집은 또한, 표적 식물에서의 유전자 편집 구성요소 또는 시스템의 게놈 통합 또는 에피솜 존재를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 핵산 변형 또는 돌연변이는 (변형된) 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN) 시스템에 의해 달성된다. ZFN 시스템은 원하는 DNA 서열을 표적화하도록 조작될 수 있는 DNA-절단 도메인에 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 융합시킴으로써 생성되는 인공 제한 효소를 이용한다. ZFN을 사용하는 게놈 편집의 예시적인 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,746,838호; 제6,794,136호; 제6,824,978호; 제6,866,997호; 제6,933,113호; 및 제6,979,539호에서 찾을 수 있다.
특정 실시형태에서, 핵산 변형은 큰 인식 부위(12 내지 40개 염기쌍의 이중-가닥 DNA 서열)를 특징으로 하는 엔도데옥시리보뉴클레아제인 (변형된) 메가뉴클레아제에 의해 달성된다. 메가뉴클레아제를 사용하기 위한 예시적인 방법은 구체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 제8,163,514호; 제8,133,697호; 제8,021,867호; 제8,119,361호; 제8,119,381호; 제8,124,369호; 및 제8,129,134호에서 찾을 수 있다.
특정 실시형태에서, 핵산 변형은 (변형된) CRISPR/Cas 복합체 또는 시스템에 의해 달성된다. 특정 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템 또는 복합체는 부류 2 CRISPR/Cas 시스템이다. 특정 실시형태에서, 상기 CRISPR/Cas 시스템 또는 복합체는 II형, V형 또는 VI형 CRISPR/Cas 시스템 또는 복합체이다. CRISPR/Cas 시스템은 특이적인 서열을 표적화하기 위해 맞춤형 단백질의 생성을 필요로 하지 않고, 단일 Cas 단백질이 특이적인 핵산 표적을 인식하도록 RNA 가이드(gRNA)에 의해 프로그래밍될 수 있고, 다시 말하면, Cas 효소 단백질은 상기 짧은 RNA 가이드를 사용하여 특이적인 관심 핵산 표적 유전자좌(RNA 및/또는 DNA를 포함하거나, 이로 이루어질 수 있음)에 동원될 수 있다.
일반적으로, CRISPR/Cas 또는 CRISPR 시스템은 본원의 상기 문헌에서 사용되는 바와 같이, CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성의 유도에 관여하는 전사물 및 기타 요소(Cas 유전자를 인코딩하는 서열, 및 tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트(mate) 서열("직접 반복부" 및 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 tracrRNA-처리된 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨) 또는 용어가 본원에 사용되는 바와 같은 "RNA(들)"(예를 들어, Cas, 예컨대 Cas9를 가이드하기 위한 RNA(들), 예를 들어, CRISPR RNA 및 적용 가능한 경우, 트랜스활성화(tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)(키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물 중 하나 이상을 포함함)를 집합적으로 지칭한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭됨)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, gRNA는 키메라 가이드 RNA 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)이다. 특정 실시형태에서, gRNA는 가이드 서열 및 tracr 메이트 서열(또는 직접 반복부)을 포함한다. 특정 실시형태에서, gRNA는 가이드 서열, tracr 메이트 서열(또는 직접 반복부) 및 tracr 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR/Cas 시스템 또는 복합체는 (예를 들어, Cas 단백질이 Cas12a이면) tracr 서열을 포함하지 않고/않거나 이의 존재에 의존하지 않는다.
본원에서 지칭된 바와 같은 Cas 단백질, 예컨대 비제한적으로 Cas9, Cas12a(이전에 Cpf1로 지칭됨), Cas12b(이전에 C2c1로 지칭됨), Cas13a(이전에 C2c2로 지칭됨), C2c3, Cas13b 단백질은 임의의 적합한 공급원으로부터 기원할 수 있으며, 이에 따라, 당업계에서 널리 문서화된 바와 같이, 다양한 (원핵) 유기체로부터 기원하는 상이한 오솔로그(orthologue)를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, Cas 단백질은 (변형된) Cas9, 바람직하게는 (변형된) 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9(SaCas9) 또는 (변형된) 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9)이다. 특정 실시형태에서, Cas 단백질은 선택적으로 악시다미노코커스(Acidaminococcus) 종, 예컨대 악시다미노코커스 종 BV3L6 Cpf1(AsCas12a) 또는 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) Cas12a, 예컨대 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020 또는 라크노스피라세아에 박테리움 MD2006(LBCas12a)으로부터의 Cas12a이다. 본원에 전체가 참조로 포함되는 미국 특허 제10,669,540호를 참조한다. 대안적으로, Cas12a 단백질은 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi) AAX08_00205[Mb2Cas12a] 또는 모락셀라 보보쿨리 AAX11_00205[Mb3Cas12a]로부터의 것일 수 있다. 본원에 전체가 참조로 포함되는 제WO 2017/189308호를 참조한다. 특정 실시형태에서, Cas 단백질은 (변형된) C2c2, 바람직하게는 렙토트리키아 와데이(Leptotrichia wadei) C2c2(LwC2c2) 또는 리스테리아 뉴이오르켄시스(Listeria newyorkensis) FSL M6-0635 C2c2(LbFSLC2c2)이다. 특정 실시형태에서, (변형된) Cas 단백질은 C2c1이다. 특정 실시형태에서, (변형된) Cas 단백질은 C2c3이다. 특정 실시형태에서, (변형된) Cas 단백질은 Cas13b이다. 다른 Cas 효소가 당업자에게 이용 가능하다.
식물(예를 들어, HI-NA 식물) 내로 도입되는 유전자-편집 기구(예를 들어, DNA 변형 효소)는 옥수수에서 재조합 유전자 발현을 구동할 수 있는 임의의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터, 예를 들어, 화분-특이적 프로모터 또는 정자 세포 특이적 프로모터, 접합자 특이적 프로모터 또는 정자, 난자 및 접합자에서 고도로 발현되는 프로모터(예를 들어, prOsActin1)이다. 적합한 프로모터는 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제10,519,456호에 개시되어 있다. 예시적인 프로모터는 하기 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
식물에서 편집 기구의 발현을 구동하기 위한 적합한 프로모터의 목록.
또 다른 양태에서, 식물 게놈 DNA를 편집하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 편집할 게놈 DNA를 포함하는 표적 식물을 수분시키기 위한, 상기 기재된 바와 같은 DNA 변형 효소 및 적어도 하나의 선택적인 가이드 핵산을 발현하는 HI-NA 옥수수 식물의 이용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 교배로부터 적어도 하나의 반수체 자손을 선택한다. 일부 실시형태에서, 반수체 자손은 표적 식물의 게놈을 포함하며, HI-NA 옥수수 식물의 게놈을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 반수체 자손은 DNA 변형 효소를 발현하지 않는다. 일부 실시형태에서, 반수체 자손의 게놈은 HI-NA 옥수수 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형된다. HI-Edit로 알려져 있는 이 과정은 미국 특허 제10,519,456호 제10,285,348호에 기재되어 있다. 이어서, 편집된 반수체 식물을 식별하고, 배가제(doubling agent)로 처리함으로써 편집된 배가 반수체 자손을 생성할 수 있다. 염색체 배가제의 비제한적인 예는 콜키신, 프로나미드(pronamide), 드티피르(dthipyr), 트리플루알린(triflualin), 또는 또 다른 알려져 있는 항-미세소관제를 포함한다. 이어서, 이배체 식물을 성숙기까지 성장시키고, 자가수분시켜, 편집된 이배체 종자를 생성하며, 이를 추가의 육종 및 종자 생산 과정을 위해 사용할 것이다. 선택적으로, 모든 이배체 세대 계통을 평가하여, 동형접합성 표적-부위 편집의 존재 및 유전자 편집 기구의 결여를 확인할 수 있다.
실시예
실시예 1. 형질전환 가능한 반수체 유도인자의 육종
옥수수 계통 및 유전자형 분석 마커
반수체 유도인자 계통과 형질전환 가능한 계통을 함께 교배함으로써, 형질전환 가능한 반수체 유도인자 계통을 육종할 수 있다. 자성 모본으로서 "정상 A" 세포형(즉, 상기 기재된 바와 같이, 마커 SM2918 및/또는 SM4813 및 SM2914에 대해 C/C 유전자형, 및/또는 마커 SM4812에 대해 I/I 유전자형을 가짐) 및 웅성 모본으로서 반수체 유도인자 계통 화분-공여자를 갖는 형질전환 가능한 계통을 사용하는 것이 바람직한데, 왜냐하면 이는 정상 A 세포형이 모든 자손에게 전달되는 것을 보장하기 때문이다. 이 세포형은 형질전환성에 이익을 부여할 것이다. 또한, 고-성능(15% 초과의 반수체 유도율) 유도인자 및 고도로 형질전환 가능한 변종(15% 초과의 형질전환 빈도)으로부터 시작하는 것이 바람직하다. 또한, 높은 화분하 및/또는 웅수 중량을 선택하는 것이 도움이 될 수 있다.
이 실시예에서는, 반수체 유도인자 BC1 물질 "RWKS/Z21S//RWKS"(BC1은 역교배1 세대 = 75% RWKS 및 25% Z21S임을 의미함)를 2가지 형질전환 가능한 변종과 교배하였다. 반수체 유도인자는 15 내지 18%의 반수체 유도율(매우 우수) 및 0%의 형질전환 비율을 갖는다. 이 유도인자를 웅성 화분 공여자로서 사용하고, 2가지 상업적으로 중요한 형질전환 가능한 옥수수 계통으로부터의 이삭과 교배하였다: i) 5% 형질전환 빈도, 높은 화분하 및 0% 반수체 유도율을 갖는 SYN-INBB23(논-스티프 스토크 계통); 및 ii) 50% 형질전환 빈도, 높은 화분하 및 0% 반수체 유도율을 갖는 SYN-INBC34(스티프 스토크 계통). 이들 교배는 2018년 봄에 RTP, 노쓰 캐롤라이나(North Carolina) 연구 기지에서 행했다. SYN-INBB23 및 SYN-INBC34 계통은 둘 모두 "정상 A" 세포형으로서 식별된 반면, RWKS/Z21S//RWKS 계통은 "정상 B" 세포형을 갖는다. 표 9에 나타낸 검정에서, SM2918 및 SM4813의 경우, CMS 세포질(A/A)과 정상 A 또는 B 세포질(C/C)이 구별되며; 육종 과정을 시작하기 위해 사용되는 3가지 계통 모두는 정상 세포질을 갖는다(마커 SM2918 및 SM4813에 대해 C/C). SM2914 및 SM4812의 경우, 정상 B 세포질(각각 A/A 및 D/D)과 정상 A 세포질(각각 C/C 및 I/I)이 구별된다. 정상 A 세포질은 옥수수에서 형질전환되고 전이유전자 식물을 재생하는 능력과 관련되는 반면(예를 들어, WO 2020/205334호(Skibbe et al.) 참조), 정상 B 세포질은 형질전환에 더욱 저항성이다.
[표 9]
옥수수 계통의 세포질 유형을 검출하기 위해 사용되는 검정
검정 SM4812에서 "I": 삽입 대립유전자; 검정 SM4812에서 "D": 결실 대립유전자.
RWKS/Z21S//RWKS는 반수체 유도인자 물질로서 식별된다. 중요한 점은, 이 반수체 유도인자가 고유 모계 돌연변이(matl; 4 bp 삽입)를 갖는다는 것이다. 매트리니얼(낫 라이크 대드 및 PLA1로도 알려져 있음; 1번 염색체 상의 옥수수 B73 유전자 ID GRMZM2G471240)의 돌연변이는 예를 들어, 미국 특허 제10,448,588호(Kelliher et al.) 및 문헌[Kelliher, et al., Nature, 2017]에 기재되어 있다. 매트리니얼의 돌연변이는 단독으로(즉, qhir8 HI 대립유전자 없이, 하기 참조) 1% 내지 7%의 모계 반수체 유도율(HIR)을 부여한다. HIR은 반수체인 교배의 후손의 비를 지칭하며; 다른 93 내지 99%는 이배체이다. 이 비율은 유도인자 계통 및 교배되는 자성 계통 둘 모두의 환경 조건뿐만 아니라 유전학적 백그라운드에 영향을 받을 수 있다. 하기에 나타낸 반수체 유도율 결과는 반수체 유도인자(예를 들어, RWKS/Z21S//RWKS) 및 비-유도인자(예를 들어, SYN-INBB23 또는 SYN-INBC34) 계통에 있어서는 전형적인 결과를 나타냈다. RWKS/Z21S//RWKS는 다른 QTL(예를 들어, qhir8, 하기 참조)에 HI 대립유전자, 또는 matl과 조합하여 더 높은 HIR을 부여하는 유전자를 갖기 때문에, 더 높은 유도율을 갖는다. 4 bp 삽입 matl 대립유전자는 하기 및 표 10에 기재된 바와 같이 부위-특이적 SNP 마커(SM7246 및 SM7252) 또는 대립유전자-특이적 TaqMan 마커(검정 2826 및 2827)를 사용하여 검출될 수 있다. 검정 2826은 야생형 대립유전자를 검출하며; 검정 2827은 4 bp 삽입, 반수체 유도를 촉발시키는 돌연변이 대립유전자를 검출한다. 검정 SM7252에서 "I" 유전자형이 반수체 유도인자 계통에서 모계 유전자 내의 4개 염기쌍 삽입 대립유전자(유전자의 낙아웃을 야기함)를 지칭하며, "D" 유전자형이 삽입이 존재하지 않는 대립유전자를 지칭하는 것에 주목한다. "D" 대립유전자는 기능적 단백질 산물이 존재하는 야생형 버전의 유전자이다.
[표 10]
매트리니얼 유전자의 유도인자 및 비-유도인자 대립유전자를 검출하기 위해 사용되는 검정 및 마커.
또한, RWKS/Z21S//RWKS는 종래 연구에서 qhir8로 지칭된, 9번 염색체 상에 위치한 유전자좌에 반수체 유도 인핸서 대립유전자(HI 대립유전자)를 갖는다. 이 대립유전자는 반수체 유도율을 향상시킨다. matl 돌연변이 대립유전자와 조합되어, 반수체 유도율은 다양한 다른 요인, 예컨대 기타 QTL/유전자, 환경 조건, 자성 생식질 유전학적 군 및 잠재적으로 기타 요인에 따라 이 QTL 대립유전자에 의해 약 10 내지 20%까지 부스팅된다. 표 11의 마커를 사용하여 qhir8 HI 대립유전자를 갖는 계통을 이를 갖지 않는 것들과 구별할 수 있다. qhir8의 위치를 마커 SM4849와 SM0956BQ 사이에 맵핑하였다. 미세 맵핑 및 게놈 편집에 의해, qhir8 HI 대립유전자에 관여하는 유전자는 DUF679 도메인 막 단백질 7(약칭하여 DMP)로 알려져 있는 Zm00001d044822(B73v5) 또는 GRMZM2G465053(B73_v4)이며, 이는 B73v5 게놈에서 위치 3,919,235와 3,919,852 사이에 위치하는 것으로 나타났다. 검정 SM8133은 DMP 유전자 내에 위치한다.
[표 11]
qhir8 영역을 유전자형 분석하기 위해 사용되는 검정.
빈칸은 유전자형이 알려져 있지 않거나, 이들 검정을 사용하여 결정될 수 없음을 나타낸다.
matl-기반 반수체 유도 교배 동안, 대다수의 생성된 배는 이배체이며(통상적으로 65 내지 99%), 대략 1 내지 35%는 반수체이다("우수한" 반수체 유도인자에 대해 아마도 평균 15 내지 20%). 배가 반수체 육종 파이프라인이 유도인자 염색체 세트 또는 DNA(반수체)를 결여한 그러한 배를 식별하고, 이들을 유도인자 염색체 세트 또는 DNA(이배체)를 갖는 것들로부터 분류하기 위해 유전학적으로 제어된 시각적 형질을 갖는 것이 중요하다. 옥수수에서, 대부분의 배가 반수체 육종 파이프라인은 종자의 배 및 내배유 둘 모두에서 자색 또는 적색 색상을 발현할 우성 안토시아닌 형질을 부여하는 R1 유전자의 대립유전자를 보유하는 유도인자 계통을 이용한다. 적어도 2가지 옵션이 있다: R-나바조(R-nj), 호분층(내배유의 최외 레이터)에서의 매우 강력한 발현 및 배에서의 더 약한 발현과 관련된 대립유전자, 및 R1-배반(R1-SCM2), 미성숙 배에서의 강력한 발현 및 내배유 호분에서의 더 약한 발현과 관련된 대립유전자. 두 대립유전자 모두는 옥수수 B73 근친교배 게놈의 버전 5(B73v5)에서 대략 위치 약 139 Mb 내지 약 140 Mb의 10번 염색체 상에 존재하는 R1 유전자좌와 관련된다. 이 실시예에서, 육종을 위해 사용되는 유도인자, RWKS/Z21S//RWKS는 R1-SCM2를 갖는다. SYN-INBB23 및 SYN-INBC34 식물 계통은 대부분의 옥수수 엘리트 생식질과 같이, R1 유전자좌에 이 대립유전자 또는 R-nj 대립유전자를 갖지 않는다(이들 계통은 R1에 대해 야생형이며, 종자 또는 낟알에서 임의의 색상 유도를 갖지 않는다). 결정적으로, R-nj 및 R1-SCM2 색상-유도 대립유전자는 야생형에 대해 우성이다. 옥수수 생식질을 하기 3개의 연관된 마커(표 12에 나타냄)를 사용하여 검정하여, R1-SCM2(RWKS/Z21S//RWKS) 대립유전자를 야생형 SYN-INBB23 및 SYN-INBC34 대립유전자와 구별할 수 있다. SM0953BQ, SM6568 및 SM0954BQ에 대해, R1-SCM2 유전자형은 A/A, T/T 및 C/C인 반면, 야생형 유전자형은 각각 G/G, A/A 및 A/A이다.
또한, SYN-INBC34 생식질에서 위치 8 Mb와 10 Mb 사이의 9번 염색체 상에 색상 저해인자 유전자좌가 존재한다. 이 유전자좌에서 색상 저해인자 대립유전자는 R1-SCM2에 의해 촉발되는 배 안료의 축적을 방지한다. 메커니즘이 명확하지는 않지만, 이 대립유전자가 R1-SCM2의 맥락에서 존재한다면, 배 색상은 정상만큼 강하지 않을 수 있다. SYN-INBB23을 이용한 새로운 유도인자의 육종 동안, RWKS/Z21S//RWKS 모본으로부터의 색상-유도 R1-SCM2 대립유전자를 선택하고; SYN-INBC34를 이용한 새로운 유도인자의 육종 동안, 9번 염색체 상의 색상 저해인자에 대한 야생형 대립유전자(즉, 색상 저해인자 대립유전자가 아님) 외에도 동일한 대립유전자를 선택하여(표 12에 나타낸 검정 사용), 생성된 유도인자는 강력한 색상 잠재력을 가질 것이다.
[표 12]
색상 마커 및 색상 저해인자 대립유전자를 유전자형 분석하기 위해 사용되는 검정.
빈칸은 유전자형이 알려져 있지 않거나, 이들 검정을 사용하여 결정될 수 없음을 나타낸다.
HI-NA 계통의 육종
새로운 형질전환 가능한 반수체 유도인자를 육종하는 제1 단계가 매우 중요하다: 형질전환 가능한 계통(예를 들어, SYN-INBB23 또는 SYN-INBC34)을 반수체 유도인자 계통(예를 들어, RWKS/Z21S//RWKS)과의 교배에서 자성으로서 사용한다. 이러한 교배는 모계 세포질 유전으로 인하여, 정상 A-세포질을 F1 후손에 자동으로 부여할 것이다(즉, 자성 난 세포는 이의 미토콘드리아(및 이에 따라 미토콘드리아 게놈)를 이의 자손에 공여하는 반면, 웅성 생식 세포(화분립에서 관찰되는 정자 세포)는 미토콘드리아를 자손에게 전달하지 않음). 약 20개의 F1 식물을 성장시키고, 자가수분시키고, 소수의 다른 F1 식물을 RWKS/Z21S/RWKS와 역교배하여, 총 약 7000개의 F2 또는 "BC1"(역교배 세대 1) 자손을 생성하였다. 정상 A 세포질 또한 이들 자손 종자에 자동으로 유전된다. 자색 색상을 갖는 종자를 선택함으로써 SYN-INBB23 및 SYN-INBC34 종자를 R1-SCM2 형질에 대해 분류하였다. 황색 종자를 폐기하였다. 우성 R1-SCM2 대립유전자의 멘델의 분리 때문에, 황색 종자는 총 종자의 약 1/4을 차지하였다(3/4는 자색이었다). 하기 기재된 바와 같이, 유묘를 발아시키고, 잎 펀치를 약 5200개의 자색-종자의 BC1 또는 F2 식물로부터 취하고, 상기 기재된 반수체 유도인자 마커에 대해 유전자형 분석하였다.
SYN-INBB23 x RWKS/Z21S/RWKS F2 및 BC1 세대를 2018년/2019년 겨울에 RTP, 노쓰 캐롤라이나 온실에서 성장시켰다. 모든 발아된 식물(총 5219개)을 샘플링하였다(4개의 잎 펀치를 유묘 잎으로부터 수득함). DNA를 추출하고, 상기 개략된 바와 같이 검정에서 TaqMan을 시행하였다. 구체적으로, 실시간 PCR을 다중화 TaqMan 반응에서 준비하여, 표적 유전자 및 내인성 대조군 유전자를 동시에 증폭시켰다. 각각의 샘플에 대해, 추출된 게놈 DNA 샘플을 TaqMan PCR 마스터 믹스(master mix)(프라이머 및 프로브가 보충된 Jumpstart Taq ReadyMix(시그마(Sigma))를 함유함)와 조합함으로써 검정을 준비하였다. 실시간 PCR을 하기의 파라미터를 사용하여 실시간 PCR 기계에서 수행하였다: 5분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 60℃의 40 사이클. 시행-후 데이터 분석을 제조사의 설명에 따라 수행하였다. 추가적인 TaqMan 절차의 세부사항에 대해서는, 예를 들어, 본원에 전체가 참조로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2011/0300544호(출원일: 2009년 12월 7일)를 참조한다.
유전자형 분석 콜(call)을 점수화한 후, 5000+개의 식물 중에, 유리한 반수체 유도인자 유전자형 조합을 갖는 것으로 유전자형 분석된 117개를 선택하고(이들의 유전자형과 함께, 선택된 및 선택되지 않은 식물의 요약에 대해서는 표 13 참조), 큰 화분(pot)에 이식하고, 자가수분시켜, 다음 세대를 위한 종자를 제조하였지만, 소수가 반수체였으며, 불임으로 인하여 자가수분시킬 수 없었다. 많은 개체가 모든 반수체 유도인자 유전자좌에 대해 고정된 동형접합성인 것으로 관찰되었지만, matl 및 qhir8 HI 대립유전자에 대한 분리 변형(segregation distortion)으로 인하여, F3/BC1F2 과들 간의 더 큰 유전학적 다양성을 유지하기 위해, R1-SCM2 또는 qhir8 HI 대립유전자에 대해 이형접합성이었던 추가의 식물을 유지하였다. 이들 식물로부터 생겨난 자손이 분리되므로, 이들은 하기 기재된 바와 같이 HIR 표현형 분석(검정교배) 이전에 F3/BC1F2 세대로서 유전자형 분석되는 것을 필요로 한다. SYN-INBB23 백그라운드에서 색상 유도에 영향을 미치는 것으로 알려져 있지 않은 색상 저해인자를 이 117개 식물의 세트에서 반수체 유도인자 대립유전자(즉, 야생형 대립유전자)에 대해 일관되게 고정하여, 색상 유도를 보장하였다. 선택된 F3 또는 BC1F2 이삭을 2019년 여름에 위스콘신주 제인스빌(Janesville)로 보냈다(하기 기재됨).
[표 13]
다음 세대를 위한 SYN-INBB23 F2 및 BC1 식물의 선택.
검정 SM7252에서 "II"는 반수체 유도에 관여하는 돌연변이 4개 염기쌍 삽입 돌연변이 matrilineal 대립유전자에 대한 동형접합성을 지칭한다.
SYN-INBC34 F2 집단에서, 194개의 개체는 바람직한 반수체 유도인자 유전자형 조합을 갖는 것으로 식별되었다(이들의 유전자형과 함께, 선택된 및 선택되지 않은 식물의 요약에 대해서는 표 14 참조). 이들을 선택하고, 자가수분시켜, 다음 세대를 위해 종자를 제조하였지만, 일부는 반수체였고, 불임으로 인하여 자가수분시킬 수 없었다. 몇몇을 모든 반수체 유도인자 유전자좌에 대해 고정하였다(동형접합성). matl 및 qhir8 HI 대립유전자에 대한 분리 변형으로 인하여, F3 과들 간의 더 큰 유전학적 다양성을 유지하기 위해, R1-SCM2, matl 또는 qhir8 HI 대립유전자 + 9번 염색체 상의 qhir8 근처의 색상 저해인자 대립유전자에 대해 이형접합성인 것으로 관찰된 다른 식물을 유지하였다. 이들 식물로부터 생겨난 자손이 분리되므로, 이들은 하기 기재된 바와 같이 HIR 표현형 분석(검정교배) 이전에 F3 세대에서 유전자형 분석되는 것을 필요로 하였다. SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS F2에서, 또한, 9번 염색체 상의 색상-저해인자 유전자에 대한 RWKS/Z21S/RWKS 대립유전자의 이형접합성 또는 동형접합성에 대해 식물을 선택하여, 색상 축적의 저해인자로서 작용하는 SYN-INBC34 대립유전자를 야기하는 것을 피하였다. 이 SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS F2 집단을 2019년 여름 동안 위스콘신주 제인스빌에서 성장시켰다. 선택된 F3 이삭(자가수분된 F2로부터의 것)을 이어서 하기 기재된 바와 같은 표현형 분석을 위해 칠레 소재의 그라네로스(Graneros)로 보냈다.
[표 14]
다음 세대를 위한 SYN-INBC34 F2 식물의 선택.
다음 SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS 세대에 대해, 4벌로 심었던 95개의 F3 및 35개의 BC1F2 아과를 포함하는 520개의 이랑(row) + 대조군을 2019년 여름에 제인스빌, 위스콘신 육종 기지에서 심었다. 각각의 이랑에 대해, 하나 이상의 자성 테스터 이랑을 나란히 심었다. SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS에 대해, 약 187개의 F3 아과를 나타내는 699개의 이랑(2벌 또는 4벌로 심음)을 자성 테스터 이랑과 나란히 그라네로스, 칠레 육종 기지에서 심었다. 대부분의 아과에 대해, 반수체 유도인자 유전자좌 qhir8 및/또는 R1-SCM2에 대해(및 색상 저해인자 유전자좌에 대해서는 SYN-INBC34에 대해) 유전자형 분석하기 위해 잎 샘플을 수득하였다. RWKS/Z21S//RWKS 대립유전자에 대해 동형접합성이었던 선택된 개체를 웅성으로서 자성 테스터로부터의 몇몇 이삭과 검정교배되도록 정하였다. SYN-INBB23 F3 세대로부터 총 777개의 개체 + 몇몇 대조군을 검정교배하였다. 유사하게, SYN-INBC34 F3 세대로부터 대조군을 포함하는 813개의 개체를 검정교배하였다. 현장팀은 음성 표현형, 예컨대 낮은 화분 생산 또는 큰 개화-출사 간격(anthesis-silking interval)으로부터 선택하였다. 수분 후 약 15일 내지 20일째에 검정교배된 이삭을 수확한 다음, 배를 낟알로부터 배 구제 배지(비타민, 30 그램의 수크로스 및 70 밀리그램의 살리실산을 갖는 4.43 그램의 무라시지 및 스쿡 기본 배지)를 함유하는 페트리 접시 상으로 분리함으로써 반수체 유도율을 결정하였다. 페트리 접시를 광에 노출시켰다(예를 들어, 제WO2015/104358호에 기재된 바를 참조). 자색(이배체) 및 미색-색상의(반수체) 배의 수를 각각의 이삭으로부터 계수하여, 반수체 유도율(HIR)로 알려져 있는 반수체의 빈도 및 이삭당 총 배를 알아냈다. 검정교배를 위해 사용하였던 식물을 또한 자가수분시키고; 종자를 이 F3 또는 BC1F2 식물의 선택 세트로부터의 자가수분된 이삭으로부터 수집하여, F4 또는 BC1F3 종자를 생성하였다. 에러! 참조 소스가 발견되지 않음. (SYN-INBC34) 및 에러! 참조 소스가 발견되지 않음. (SYN-INBB23)에서, 대표적인 플롯으로부터 반수체 유도율, 마커 유전자형 및 총 배(반수체 및 이배체 배로 나뉨), 뿐만 아니라 고정된 matl 및 qhir8 HI 대립유전자가 없는 일부 중간 및 저 성능 계통이 나타나 있다. 에러! 참조 소스가 발견되지 않음. 모든 HI 대립유전자에 대해 고정된 F3 SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS 계통 뿐만 아니라 qhir8 HI 대립유전자 및/또는 matl에 대해 동형접합성 야생형이거나 이형접합성이었던 계통을 보여준다. 모든 계통을 색상 저해인자 대립유전자, 및 이배체에서 자색 색상 배를 제공하는 R1-SCM2 유전자에 대해 고정하였다. 모든 유도인자 대립유전자에 대해 고정된 계통은 대조군(RWKS/Z21S//RWKS)과 유사하게 10 내지 19% HIR의 범위였던 반면, 다른 계통은 더 낮은 반수체 유도율을 가졌다. 에러! 참조 소스가 발견되지 않음. 모든 HI 대립유전자에 대해 고정된 F3 SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS 계통을 보여준다. 모든 계통을 이배체에서 자색 색상 배를 제공하는 R1-SCM2 유전자에 대해 고정하였다.
SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS에서 F3 세대로부터, matl, qhir8 및 R1-SCM2에 대한 반수체 유도인자 대립유전자에 대해 고정되고, 적어도 10%의 반수체 유도율 및 이삭 종자 세트당 적어도 70개의 낟알을 갖는 47개의 상이한 F2-유래 과로부터 유래하는 63개의 개별 식물을 식별하였다. 적어도 20개의 낟알을 가졌던 이들 개체로부터의 자가수분된 이삭을 수확하고, 다음 세대로 진행시키고, 이를 이용하여, 추가의 검정교배(반수체 유도율을 결정하기 위한 F4 세대 검정교배)를 위해 하나 이상의 웅성 이랑을 심었으며, 추가적으로, 대부분의 경우에, 일부 종자를 F4-세대 형질전환 비율 시험을 위해 보냈다. 마찬가지로, SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS 집단에서 F3 세대로부터의 데이터를 사용하여, 유도인자 유전자에 대해 고정되고, 10% 초과의 반수체 유도율 및 높은 종자 세트를 가졌던 41개의 F3 과로부터 유래하는 71개의 개체를 식별하였으며, 여기서, 자가수분된 이삭당 적어도 20개의 낟알이 존재하였다. 이들을 F4 세대로 보냈다.
[표 15]
[표 16]
SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS F4 세대(2019/2020 시즌에 칠레 소재의 그라네로스에서 각각 1개, 또는 통상적으로 2개 이랑 x 2개의 웅성 테스터를 사용한 F4 HIR 표현형 분석으로부터의 데이터에 기초한 81개의 상이한 식물 계통으로부터의 140개의 웅성 이랑)에 대해서는, 모든 계통이 반수체 유도율 유전자/유전자좌에 대해 이제 완전히 고정되었기 때문에, 유전자형 분석을 행하지 않았다. 반수체 유도율 표현형 분석을 아리카(Arica), 칠레 육종 및 배가 반수체 시설(Chile breeding and doubled haploid facility)에서 수행하였으며, 형질전환 시험을 RTP, 노쓰 캐롤라이나 연구 센터(North Carolina research center)에서 약 60개의 동일한 F4 식물 물질의 하위세트에서 수행하였다. 형질전환 비율 시험을 위해, 이원 벡터 #12672를 균주 LBA4404를 사용하여 아그로박테리움-매개된 형질전환을 통해 3 내지 10개의 자가수분된 F4 이삭으로부터 풀링된 배에 전달하였다(pAL4404, pVGW7). pAL4404 및 pVGW7 헬퍼 플라스미드 및 병원성 영역(virulence region)에 관한 세부적인 정보는 하기 참고문헌에 의해 기재되어 있다: Teruyuki Imayama, T. et al., 일본 특허 출원 제20160083737호, JAPAN TOBACCO INC., JAPAN, 2016; 문헌[Ishida, Y., High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat. Biotechnol. 14, 745-750 (1996)]; 및 문헌[Negrotto, D., et al., The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell Rep. 19, 798-803 (2000)]. 이원 벡터 및 시험 구축물을 함유하는 아그로박테리움 균주를 상기 언급된 문헌[Negrotto et al. (2000)]에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다. 옥수수 형질전환을 위해, 온실 성장된 옥수수 근교계 NP2222로부터의 미성숙 배를 문헌[Heng Zhong, et al., Advances in Agrobacterium-mediated Maize Transformation. Methods Mol Biol 1676, 41-59 (2018)]에 따라 외식편으로서 사용하였다. 미성숙 배 분리, 아그로박테리움 접종 및 아그로박테리움과 미성숙 배의 동시-배양을 상기 언급된 바와 같은 문헌[Zhong et al.]에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다. 형질전환된 조직 및 추정상의 전이유전자 이벤트를 이전에 기재된 바와 같은 만노스 선택을 사용하여 배지에서 생성하였다(문헌[Negrotto et al. (2000)]). F4 식물 계통(식물 물질)에 대한 표현형 분석 결과는 표 15에 요약되어 있다.
[표 15]
SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS 집단으로부터의 F4 식물 물질의 반수체 유도율(HIR) 및 형질전환 빈도(TF).
대부분의 이벤트는 시험된 구축물 및 프로토콜을 이용하여 형질전환 가능하지 않았지만, 많은 이벤트는 강력한 반수체 유도율을 가졌다. 이는 반수체 유도율 유전자를 F2 및 F3 세대에서 선택하였고, 표현형을 F3에서 선택한 반면, 형질전환성에 대한 선택이 존재하지 않았기 때문에(그리고 SYN-INBB23에서 시작하기 위해 오직 약 5% 형질전환 빈도 및 RWKS/Z21S//RWKS에 0%만이 존재하였음) 타당하다. 반수체 유도율이 2개의 테스터 계통에 걸친 몇몇 검정교배된 이삭에 기초하는 것에 주목한다. 총 배(즉, 종자 세트)는 닉 및 수분된 이삭의 수에 강력하게 영향을 받았다. 총 배는 선택 지표(selection metric)로서 사용되지 않았으며; 이는 단지 반수체 유도율이 기초로 하는 배의 수를 보여주기 위한 것일 뿐이다. 10%+ 형질전환 비율을 갖는 3개의 식물 물질이 식별되었다: 19BD915147, 19BD915875 및 19BD915158. 또한 앞의 2개는 유망한 15% 초과의 HIR을 가졌다.
추가의 HIR 시험을 사용하여, 또한 형질전환이 가능하였던 최상의 유도인자로 좁혀나갔다. 제인스빌, 위스콘신 육종 기지에서, 2020년 여름에, 10개의 F3 세대 과 및 몇몇 F4 아과로부터 유래한 41개의 SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS F5 세대 웅성 이랑을 검정교배를 위해 3개의 자성 테스터 이랑과 나란히 심어, 반수체 유도율을 평가하였다. 이들 계통 중 일부로부터의 종자를 형질전환 빈도에 대해 재시험하기 위해, 노쓰 캐롤라이나 설비로 보냈다. F4 및 F5 세대 시험의 선택 세트의 결과는 표 16에 나타나 있다. 이들 5개의 계통은 F5 세대에서의 고성능 반수체 유도인자 계통이며; (F4 또는 F5 형질전환 비율 시험으로부터) 처음 3개의 계통에 형질전환성의 일부 증거가 있다. 나타낸 계통은 하기에 기재된 바와 같이 F6 세대에서의 HI-Edit 실험으로 보내기 위해 선택된 것들이다.
[표 16]
SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS F4 및 F5 세대에서의 반수체 유도율(HIR) 및 형질전환 빈도(TF) 시험.
F6 세대 종자를 이들 식물로부터의 자가수분된 이삭으로부터 수확하고, HI-Edit 시험을 위해 다음 세대로 보냈다. CRISPR-Cas 형질전환 및 HI-Edit 시험에 대해 실시예 2를 참조한다. 이전의 시험에서, BBM의 이용은 모본 식물 물질의 형질전환 빈도를 증가시켰다(표 17 참조).
[표 17]
BBM-매개된 형질전환은 모본 식물 물질에서 형질전환 효율을 증가시킨다.
SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS F4 세대를 위해, 반수체 유도 시험을 2020년 여름에 제인스빌, 위스콘신 육종 기지에서 행하였다. 상기 언급된 71개의 선택된 식물 물질을 심고, 자성 테스터 이삭의 3개 세트와 검정교배하였으며; 수분 후 15일 내지 20일째에, 이삭을 HIR 평가를 위해 다시 한번 RTP, NC 현장으로 배송하였다. 동시에, 계통의 하위세트의 형질전환 비율을 상기 기재된 것과 동일한 형질전환 과정을 사용하여 RTP 현장에서 결정하였으며, F5 세대 종자를 자가수분된 식물의 선택된 하위세트로부터 수득하고, 다음 세대로 보냈다. 결과는 표 18에 나타나 있다.
[표 18]
SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS 집단으로부터의 F4 식물 물질의 반수체 유도율(HIR) 및 형질전환 빈도(TF).
이 실험에서 높은 형질전환 빈도를 나타낸 계통은 많지 않았지만, 대부분의 계통은 매우 높은 반수체 유도율을 가졌다(대부분은 10% 초과 및 일부는 15% 초과). 이 결과는 F2 및 F3 세대에서의 반수체 유도 유전자(마커)의 선택 및 F3 세대에서의 높은 HIR 표현형의 선택과 일치한다. 따라서, 이 집단을 반수체 유도율 유전학을 위해 농축시켰다. 대조적으로, 기반이 되는 잡종 교배에서 정상 A 세포형 모계 모본(SYN-INBC34)을 사용하는 것 외에는, 이 시점까지 형질전환성 표현형 또는 유전자(마커)에 대한 선택이 존재하지 않았다. HIR은 2개의 테스터 계통에 걸친 몇몇 검정교배된 이삭에 기초하며, 총 이삭 수가 제공된다. 종자 세트는 개화-출사 간격(유도인자 웅성 화분 방출 윈도우(window)와 자성 테스터 이삭 출사기(silking date)의 동시화)에 영향을 받을 수 있었다. 이 실험에서, 개화-출사 간격은 F3 세대에서보다 더 낮았다(즉, 화분 방출과 테스터 이삭 출사 사이의 시간의 감소가 존재하였다). 따라서, 반수체 유도율 및 형질전환 비율 외에도, 종자 세트는 다음 라운드의 평가(F5 세대)로 보내기 위한 최상의 계통을 식별하기 위한 선택 지표로서 사용되고 있다. 두 테스터 모두를 조합하여, 정상적인(비-발육 부전, 내배유-생존 가능한) 낟알의 총 수를 이삭의 수로 나눔으로써 종자 세트 평균을 구했다.
2개의 F4 계통은 유망한 성과를 나타내었다. 먼저, 58% 형질전환 빈도(TF)(임의의 다른 알려져 있는 옥수수 계통 형질전환 비율보다 더 높음), 13% 초과의 유망한 HIR 및 우수한 종자 세트를 가졌던 계통 19SN952196이 있다. 두 번째로, 13.7% TF, 15% 초과의 HIR 및 우수한 종자 세트를 가졌던 계통 19SN952454가 있다. 이들 2개의 계통은 각각 이삭당 평균 27 및 33개의 반수체였다. 테스터 이삭의 사진에 의해, 웅성과 자성 간의 완벽한 동시화가 존재하지 않았음이 드러났다 - 이삭의 상측 1/3이 수분되지 않았기 때문에, 이삭은 조금 조기에 수분되었을 수 있다. 따라서, 이삭당 종자 세트 및 반수체 지표가 훨씬 더 높을 수 있었을 가능성이 있다. 이들 2개의 식물 물질로부터의 몇몇 개별 식물을 자가수분시켜, 반수체 유도율 성능 시험뿐만 아니라 상이한 옥수수 변종에 걸쳐 HI-Editing 비율을 평가하기 위한 CRISPR-Cas 구축물을 사용한 형질전환(HI-Edit 스펙트럼 시험)을 포함하는 추가의 평가를 위해 F5 종자 로트(lot)를 생성하였다. 19SN952196으로부터 유래된 F5 계통을, F4 세대에 대해 상기 개략된 바와 같이 단순한 아그로박테리움-기반 과정을 사용하되, 이번에는 CRISPR-Cas 구축물을 사용하여 형질전환시켰다. 19SN952454로부터의 F5 계통을 또한, F4 세대에 대해 상기 개략된 바와 같이 단순한 아그로박테리움-기반 과정을 사용하되, 이번에는 CRISPR-Cas 구축물을 사용하여 형질전환시켰다. 또한, 19SN952454로부터의 F5 계통을 BBM-보조 형질전환 과정을 사용하여 형질전환시켰으며, 여기서, BBM 구축물 및 CRISPR-Cas 구축물을 함께 동시-형질전환시켜, CRISPR-Cas 구축물의 형질전환 빈도를 개선하였다. 형질전환에 대해서는 실시예 2를 참조한다.
또한, 강력한 반수체 유도율 성능을 갖지만 우수한 형질전환 빈도를 갖지 않거나(예를 들어, 19SN951924) 또는 형질전환 비율 데이터가 없는(시험에 이용 가능한 종자의 결여에 기인함, 예를 들어, 19SN951958, 19SN952019 및 19SN952072) 소수의 계통이 존재하였다. 이들 계통은 이삭당 평균 35 내지 40개 반수체였다. 이들 4개의 F4 식물 물질로부터의 몇몇 개체를 자가수분시켜, 추가적인 반수체 유도율 성능 시험뿐만 아니라 상이한 옥수수 변종에 걸쳐 HI-Editing 비율을 평가하기 위한 CRISPR-Cas 구축물을 사용한 형질전환(HI-Edit 스펙트럼 시험)을 포함하는 추가의 평가를 위해 F5 종자 로트를 생성하였다. 19SN951924, 19SN951958, 19SN952019 및 19SN952072로부터 유래된 F5 계통을 BBM-보조 형질전환을 통해 형질전환시켰으며, 여기서, BBM 구축물 및 CRISPR-Cas 구축물을 함께 동시-형질전환시켜, 형질전환 빈도를 개선하였다(실시예 2 참조).
SYN-INBC34 백그라운드에서 형질전환성에 관여하는 유전학적 인자를 식별하기 위해, 상기 연구된 F4 계통을 생성하는 데 사용되는 모본 식물(표 18)을 옥수수 게놈에 걸쳐 균일하게 분산된 480개의 다형성 SNP 마커를 사용하여 유전자형 분석하였다. 형질전환 시험된 표 18의 계통의 GWAS 분석에 의해, 마커 SM3158(SYN-INBC34의 유전자형은 GG이며, 마커는 B73v5 위치 14,742,407에 존재함)과 SM4586(SYN-INBC34의 유전자형은 GG이며, 마커는 B73v5 위치 70,562,070에 존재함) 사이에서, 3번 염색체 상의 QTL을 식별하였다. 마커 SM4787(GG의 SYN-INBC34 유전자형), SM3814(CC의 SYN-INBC34 유전자형), SM3362(GG의 SYN-INBC34 유전자형) 및 SM0634AQ(GG의 SYN-INBC34 유전자형)는 SM3158과 SM4586 사이에 위치하며, 또한, QTL을 식별하기 위해 연구할 수 있다. 5% 초과의 형질전환 빈도를 갖는 계통의 세트를 0%를 갖는 것들과 비교해보면, SM4787은 1.7의 GWAS log10 값 및 0.02 미만의 p-값을 가지며, SM4586은 0.57의 log10 값을 가지며, SM3362는 0.90의 log10 값을 갖는다. 5% 초과의 TF를 갖는 계통의 세트를 5% 미만의 TF를 갖는 것들과 비교해보면, SM3814는 1.6의 GWAS log10 값을 가지며, SM4787 및 SM3158은 1.3이다. 에러! 참조 소스가 발견되지 않음. 하기에, TF-시험된 식물 계통 모두의 유전자형이 나타나 있다. 가장 높은 형질전환 비율을 갖는 상위 10개의 형질전환 가능한 계통 중 7개는 유리한 SYN-INBC34 유전자형(밑줄이 그어짐)을 갖는다. 1% 미만의 TF 또는 비-형질전환 가능한 계통의 대다수는 유리하지 않은(RWKS) 대립유전자를 갖는다.
이 정보에 기초하여, F2, F3 또는 임의의 기타 세대에서의 이 QTL(본원에서 qCYTO-A_TF3.1로 지칭됨)에 SYN-INBC34 대립유전자를 갖는 식물에 대한 선택은 정상 A 세포형과 조합하여 또는 단독으로, 형질전환성을 위해 생성된 계통을 농축할 수 있다(즉, 이는 더 높은 형질전환 빈도를 야기할 수 있다). 이 높은 형질전환 비율의 QTL 대립유전자는 옥수수 형질전환에 대한 종래 연구에서 식별된 바 없다. 임의의 특정 이론에 결부시키지 않고, 이 QTL 내의 하나 이상의 유전자좌와 조합하여, 정상 A 세포형에서(미토콘드리아 또는 엽록체에서) 하나 이상의 유전자좌에 의해 조성된 핵-세포질 상호작용 또는 소통은 높은 형질전환 비율을 제공하기 위해 조합될 수 있다.
[표 21]
옥수수 형질전환성에서 이 QTL의 중요성을 입증하기 위해, 정상 A 세포형을 갖는 다양한 세트의 식물 물질을 형질전환 성능에 대해 평가하고, 이 QTL에 대해 유전자형 분석하였다. 5개의 최소로 형질전환 가능한 계통(0.5% 미만의 TF)은 이들 마커 모두에 대해 유리한 유전자형을 갖지 않았다. 대조적으로, 13% 초과의 TF를 가졌던 모든 계통은 모든 마커에 대해 유리한 유전자형을 가졌거나, 충분한 데이터를 갖지 않았다(표 19 참조). 나타낸 모든 계통은 마커에 대해 동형접합성이었으며, 이는 이들이 근친교배 식물 계통이기 때문에 놀라운 것은 아니다.
172개의 마커를 3번 염색체 QTL 구간에서 평가하였으며, 존재하는 SNP가 SYN-INBC34로부터의 SNP와 일치하는지 여부에 기초하여 유전자형 분석 콜을 생성하였다. 표 20에는 3번 염색체 QTL 구간에서 평가되는 추가의 마커와 함께, SYN-INBC34에서의(즉, qCYTO-A_TF3.1 TF-QTL에서의 TF 대립유전자에서의) 각 마커의 유전자형 및 B73v5 기준 게놈의 게놈 좌표가 열거되어 있다. 주어진 변종과 SYN-INBC34 간의 임의의 불일치를 계수하였으며, QTL 영역 내의 총 불일치 수는 표 19에 제시되어 있다. 이 데이터로부터, 해석 노트를 작성하였다("유리함"은 SYN-INBC34와의 적어도 85% 또는 적어도 95% 일치를 지칭한다). 고도로 형질전환 가능한 변종은 모두 유리한 대립유전자를 갖는 한편, 비-형질전환 가능한 변종이 유리한 대립유전자를 갖지 않는 경향이 있었음에 주목한다.
[표 19]
논-스티프 스토크 및 스티프 스토크 생식질 둘 모두로부터의 다양한 정상 A 변종 옥수수 계통에 대한 3번 염색체 QTL에 대한 형질전환 비율 시험 및 유전자형 분석 데이터.
[표 20]
3번 염색체 TF-QTL 구간에서 평가되는 추가의 마커.
실시예 2. 형질전환 비율 및 HI-Edit 시험
표 21에 나타낸 SYN-INBB23 x RWKS 유래 식물 물질의 개별 F6 세대 이삭 종자 로트로부터의 적어도 40개의 종자를 2020년 12월에 노쓰 캐롤라이나 소재의 리서치 트라이앵글 파크(Research Triangle Park)에 위치한 신젠타 바이오테크놀로지 이노베이션 센터(Syngenta Biotechnology Innovation Center)에서 온실 내에 형질전환을 위해 심었다.
[표 21]
형질전환 비율 시험을 위해 심은 SYN-INBB23 x RWKS/Z21S//RWKS 유래 식물 물질.
개별적으로, 표 22에 나타낸 SYN-INBC34 x RWKS 식물 물질의 4개의 F5 세대 이삭으로부터의 약 40개의 풀링된 종자를 2021년 1월에, 동일한 시설에서 온실 내에 형질전환을 위해 심었다.
[표 22]
형질전환 비율 시험을 위해 심은 SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS 유래 식물 물질.
이원 구축물, 벡터 ID #26258(도 2; SEQ ID NO: 171)을 이들 식물 물질로부터의 F7-세대 미성숙 배의 형질전환을 위해 구축하였다. 벡터는 포스포만노스 이소머라제(PMI) 선택 가능한 마커 카세트, 뿐만 아니라 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeat; CRISPR) - Cas12a 카세트, 및 하기의 유전자 및 서열을 표적화하도록 설계된 Cas12a 가이드 RNA를 함유하는 2개의 카세트를 포함한다: 7번 염색체 상의 Opaque2(Zm00001d018971, CTGTATCTCGAGCGTCTGGCTGA; SEQ ID NO: 172), 9번 염색체 상의 Waxy1(Zm00001d045462, GGGAAAGACCGAGGAGAAGATCT; SEQ ID NO: 173), 6번 염색체 상의 황색 내배유(Yellow Endosperm)1(Zm00001d036345, CTATCTTATCCTAAAGATGGTGG; SEQ ID NO: 174), 2번 염색체 상의 E3 유비퀴틴 리가제2(Zm00001d004139, GGAGGGAAAAGGTGTCTGAGGC; SEQ ID NO: 175) 및 5번 염색체 상의 추정상 유비퀴틴-단백질 리가제(Zm00001d014920, GGAAGGAAAAGGTATCTGAAGG; SEQ ID NO: 176). CRISPR/LbCas12a 가이드 RNA는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 LbCrRNA의 직접 반복부를 포함하였다. Cas9 카세트(상이한 가이드RNA 및 다중화 방법의 이용을 필요로 할 것임)도 (실제로, 미국 특허 제10519456호(Q. Que and T. Kelliher), 미국 특허 제10285348호(Q. Que and T. Kelliher), 뿐만 아니라 문헌[Kelliher, T. et al., One step genome editing of elite crop germplasm (2019) Nature Biotechnology Volume 37, pages 287-292 a Cas9 vector was used for HI-Edit based genome editing]에서) Cas12a 대신에 사용될 수 있었음에 주목한다. 표준 형질전환 프로토콜(상기 실시예 1에서 개략됨)을 사용하여 4개의 형질전환 가능한 식물 물질(19SN952821, 19SN952822, 19SN952871 및 19SN952196)을 이 벡터를 이용하여 형질전환시키는 것 외에도, 이들 계통 중 처음 3개 + 높은 HIR 및 종자 세트를 갖는 7개의 다른 계통(19SN952763, 19SN953098, 19SN952454, 19SN952019, 19SN951958, 19SN951924, 19SN952072)으로부터의 배를 소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor) 우쉘 카세트(WUSCHEL cassette)(cSbWUS-01; SEQ ID NO: 178) 및 특정 변종에서 형질전환체의 수를 부스팅하기 위한 브라시카 나푸스(Brassica napus) 베이비붐1(BABYBOOM1) 카세트(cBnBBM1-02; SEQ ID NO: 179), 발근 후에 WUS, CRE 및 BBM1 카세트의 제거를 가능하게 하기 위한 가뭄-유도 가능한 CRE-LOX 절제 시스템을 보유하는 벡터 24288(도 3; SEQ ID NO: 177)과 동시-형질전환시켰다. 이들 실험 모두의 형질전환 빈도는 표 24 및 표 25에 보고되어 있다.
또한 하기의 발달 중인 다른 유전자를 사용하여 형질전환 빈도를 증가시킬 수 있다: BBM, BBM-WOX5, WOX5(예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2020/045573호 참조). 참고로, BBM, WUS2 또는 BBM-WUS2 보조 형질전환은 옥수수에서 입증된 바 있다(문헌[Lowe et al. (2016) Morphogenic Regulators Baby boom and Wuschel Improve Monocot Transformation, Plant Cell 28, 1998-2015]; 문헌[Hoerster, et al. (2020) Use of non-integrating ZmWus2 vectors to enhance maize transformation, In Vitro Cellular & Developmental Biology]; 문헌[Mookkan et al., (2017) Selectable marker independent transformation of recalcitrant maize inbred B73 and sorghum P898012 mediated by morphogenic regulators BABY BOOM and WUSCHEL2, Plant Cell Reports 36:1477-1491]). 대안적으로, GRF5 시스템(문헌[Kong et al. (2020) Overexpression of Transcription Factor Growth Regulating Factor5 Improves Transformation of Monocot and Dicot Species, Front. in Plant Sci, Vol. 11, Art. 572319])을 사용하여 또는 GRF4-GIF1(문헌[J.M. Debernardi, et al. (2020), A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants. Nature Biotechnology 38: 1274-1279])을 이용함으로써 형질전환을 부스팅할 수 있다.
표 24 및 표 25의 형질전환 실험과 동시에, 형질전환을 시작하는 모본 계통을 또한, (각각 2개의 테스터 계통으로부터의 3개의 이삭으로부터의 평균 HIR 및 종자 세트에 기초하여) 2021년 여름에 반수체 유도 성능 특징에 대해 재시험하였으며, 높은 유도율 및 종자 세트가 일반적으로 모든 계통에 대해 확인되었으며, 이들을 Cas12a 26258 형질전환을 거치게 하였다. 2021년 연구 후의 SYN-INBC23 x RWKS(이오덴트 백그라운드)로부터의 상위 계통은 20BD917233(19SN952822로부터의 것)였으며, 이는 매우 강한 반수체 유도율 및 종자 세트 특징을 유지하였으며(2021년에, 이삭당 207개의 종자와 함께 유도율은 15.8%(이삭당 총 32.3개의 반수체)였음), 현장 시험에서 뛰어난 성능 및 농업 형질을 가졌으며, 낮지만 안정적인 형질전환 비율(1.5%)을 가졌으며, 이는 벡터 24288(cSbWUS-01 및 cBnBBM1-02 부스터)과의 아그로박테리움을 통한 동시-전달에 의해 8.0%까지 향상되었다(표 24). 개별 실험에서, Cas12a 게놈 편집 벡터의 아그로박테리움-매개된 형질전환을 통한 20BD917233의 형질전환 비율은 1.0%였으며(196개의 배 중 2개의 Cas12a-양성 이벤트), 이는 옥수수 Ubi1 프로모터(SEQ ID NO: 182)에 의해 구동되는 브라키포디움 디스타치온(Brachypodium distachyon)으로부터의 우쉘 호메오박스(WUSCHEL homeobox) 유전자 BdWOX5/7(SEQ ID NO: 181)(Bradi2g55270)을 함유하는 벡터 25072(SEQ ID NO: 180)와의 아그로박테리움 동시-전달을 사용하여 7.0%(242개의 배 중 17개의 Cas12a-양성 이벤트)까지 향상되었다.
SYN-INBC34 x RWKS 과에 대해, 상위 계통은 명백하지 않았다. 20ALL1134VG_MM은 강한 유도인자였으며, BBM / WUS의 존재 하에 7%의 형질전환 비율을 가졌지만, 현장 노트에는 황화 및 다른 농업적 문제가 표기되어 있었다. 가장 형질전환 가능한 생식질은 20ALL1134VK_MM(20.7% TF)이었지만, 이는 2021년에 중간 내지 낮은(약 6%) 반수체 유도율을 가졌다(표 26). SYN-INBC34 x RWKS 과로부터 뛰어난 계통(즉, 높은 TF 비율 및 강한 HIR을 갖는 새로운 스티프 스토크 HI-Edit 계통)을 식별하기 위해, 본 발명자들은 2021년 HIR 데이터를 사용하여, 원래 19SN952454 및 19SN952196로부터 유래된 본 발명자들이 시험한 형질전환 가능한 유도인자와 밀접하게 관련된 새로운 엘리트 유도인자의 패널을 선택하였다(이들은 동일한 F4 과로부터 유래된, F5 내지 F7 세대 동족(cousin)/동류(relative) 계통이다). 표 26에서 볼드체인 것들은 본 명세서의 최종 제출 시에 형질전환 중이었고 캘러스를 재생하는 중이었다.
[표 26]
SYN-INBC34 x RWKS/Z21S//RWKS로부터의 상위 2개의 F4-유래 형질전환 가능한 유도인자, 19SN952454 및 19SN952196의 F5 내지 F7 유도체의 2021년 반수체 유도율 성능의 결과. 볼드체인 것들은 TF 비율을 평가하기 위한 형질전환 시험 중이다.
이벤트를 생성하고, TaqMan 검정 2723(PMI-14 유전자를 증폭시킴) 및 3633(LbCas12a 전이유전자를 증폭시킴)을 사용하여 T-DNA 삽입에 대해 시험하였다. T0 이벤트를 온실로 보내고, 개화 시까지 성장시키고, 자가수분시켜 T1 종자를 생성하였다. T0 세대 식물을 편집에 대해 시험하여, 어떤 T1 이벤트가 HI-Edit 시험에서 사용하기 위해 높은 CRISPR 활성을 갖는지를 식별하였다. 표적 부위 편집을 평가하기 위해, 고유 대립유전자 TaqMan 검정을 이용할 것이며, 이는 비편집된 "야생형" 대립유전자에 대해 높은 PCR 카피수를 제공하지만, 편집된 대립유전자에서는 강력하게 증폭시키거나 프로빙하지 않는다. 본 발명자들은 Cas12a를 사용하고 있기 때문에, 전형적인 편집은 작은 결실일 것으로 예상한다(흔히, Cas12a 편집은 PAM 부위로부터 대략 8 bp 하류에서 시작하여 6 내지 18개 뉴클레오티드 길이의 결실을 야기한다). 따라서, 검정은 Cas12a에 의해 결실된 이 영역을 포괄하는 프로브 서열을 가질 것이다. 예를 들어, Waxy1에 대해 검정 3686(TQ2817)을 사용하였다: 프로브 GGTTTCAGGTTTGGGGAAAGA(SEQ ID NO:127)는 gRNA 표적 서열 GGGAAAGACCGAGGAGAAGATCT(SEQ ID NO:128)와 중첩된다. 표 27은 다른 검정 프라이머를 보여준다.
[표 27]
벡터 26258 Cas12a 게놈 편집 표적 유전자, gRNA 서열 및 검정 ID, 프라이머 및 프로브 서열.
단일 카피의 Cas12a 벡터 T-DNA 삽입을 갖고, 백본이 부재하였던 몇몇 T0 이벤트를 생산하고, 일부 백본을 포함하는 다수의 카피를 가졌던 다른 것들과 함께, 이들 이벤트를 자가수분시켜 Tl 종자를 제조하였다. CRISPR T-DNA에 대해 동형접합성인 T1 식물(즉, 이들을 게놈 편집 전이유전자의 접합성을 결정하기 위해 TaqMan 검정을 사용하여 유전자형 분석하였으며, 이들은 단일 또는 다수의 삽입 이벤트와 함께, 안정적으로 형질전환된 적어도 2개의 카피의 Cas12a 및 가이드 RNA 편집 기구를 가졌음)을 선택하여, 자가수분시켜, T2 종자를 생성하였다(표 28).
[표 28]
엘리트 HI-Edit 유도인자 계통에서의 대표적인 이벤트 및 이들의 Taqman 데이터.
"BB"로 지명된 열은 아그로박테리움 백본을 지칭하며; "O2"는 Opaque2를 지칭하며; "UPL"은 5번 염색체 상의 추정상 유비퀴틴-단백질 리가제를 지칭하며; "UPL2"는 2번 염색체 상의 E3 유비퀴틴 리가제2를 지칭한다.
생성된 T2 식물은 편집 기구(T-DNA)에 대해 동형접합성으로 고정된다(다시, 이들은 단일 또는 선택적으로 다수-카피일 수 있음). T0 또는 T1 또는 T2 세대 중 임의의 것에서, T-DNA+ 식물을 임의의 옥수수 근교계와 이종교배하여, "HI-Edit"를 행할 수 있다. 이 실험에서, T2 종자를 스티프 스토크 계통, 예컨대 NP2222 및 SYN-INBD45(논-스티프 스토크 이오덴트 계통), SYN-INBE56(논-스티프 스토크 계통), SYN-INBF67(스티프 스토크 계통), SYN-INBG78(논-스티프 스토크 이오덴트 계통), SYN-INBH89(논-스티프 스토크 이오덴트 계통, SYN-INBI90(논-스티프 스토크 이오덴트 계통), SYN-INBJ13(논-스티프 스토크 Mo17 - 유사 계통) 및 SYN-INBK14(열대 계통)를 포함하는 다양한 옥수수 변종과 이종교배할 것이다. 반수체를 식별하고, (미국 특허 제10,285,348호; 문헌[Kelliher, T. et al., One step genome editing of elite crop germplasm (2019) Nature Biotechnology 37(3):287-292])에 개략된 과정에 따라 편집에 대해 시험할 것이다. 이어서, 온대, 열대, 아열대 또는 기타 생식질로부터의 편집된 반수체 식물을 식별하고, 배가시키고, 성숙기까지 성장시키고, 자가수분시켜, 추가의 육종 및 종자 생산 과정을 위해 사용될 편집된 DH 종자(순종 근교 편집 계통(pure inbred edited line))를 생성할 것이다. 모든 DH 및 DH1 세대 계통 및 식물을 평가하여, 동형접합성 표적-부위 편집의 존재 및 CRISPR 전이유전자(반수체 유도 과정 동안 제거되어야 했음)의 결여를 확인할 것이다.
이들 이벤트가 모두 적어도 matl, qhir8 HI 대립유전자 및 R1-SCM2에 대해 고정된 새로운 반수체 유도인자 계통으로부터 유래되기 때문에, 이들은 강력한 반수체 유도율을 가져야 하며, 전이유전자의 부가로, 많은 옥수수 계통에서 유효 수준의 HI-Edit를 달성할 수 있어야 한다. 이 실험에서, T0 이벤트로부터의 화분을 사용하여 HI-Edit를 행하는 것이 실현 가능하다. 그러나, 동형접합성 T1 및 T2 식물에서 HI-Edit를 행하는 것이 바람직할 수 있는데, 왜냐하면 이들 식물에서, 모든 화분립이 HI-Edit 능력을 보유할 것이기 때문이다: 모두가 유전자/QTL에 대해 반수체 유도인자 대립유전자를 가질 것이며, 모두 CRISPR 전이유전자를 보유할 것이다. T0 화분이 사용된다면, 반수체 유도인자 유전자좌가 모든 화분립에 존재할지라도, CRISPR 기구는 그렇지 않을 것이다: 단일-카피 T0 이벤트에 대해, 오직 50%의 화분이 CRISPR 전이유전자를 가질 것이며, 2개의-카피 이상의 이벤트에 대해, 분리에 따라 50% 초과의 화분이 전이유전자를 가질 가능성이 있다.
HI-Edit 수분 동안, 편집할 자성 계통은 비-반수체 유도인자 계통이다(이들은 MATL 및 qhir8 및 R1-SCM2 유전자좌에 대해 동형접합성 야생형 대립유전자를 가지며, CRISPR-Cas 게놈 편집 전이유전자를 결여한다). 자손 배를 실험실에서 타화수분된 이삭으로부터 페트리 접시 내로 추출할 것이며, 이어서, 몇몇 검정을 거치게 하여, 이들이 편집된 반수체임을 결정할 것이다. 자손 종자를 또한 성숙기까지 성장시킬 수 있으며, 이 시점에서, 배 색상을 조사함으로써 반수체를 식별한 다음, 토양에서 발아시킬 수 있다. 계획된 실험실-기반 방법에서, 배를 추출하고, 플레이팅한 다음, 이것이 자색 색상(R1-SCM2 대립유전자의 작용에 기인함)을 나타내면 이배체 잡종으로 또는 이들의 색상이 미색이면 반수체로 기록할 것이다. 다른 색상 마커, 예컨대 R1-nj를 대안으로 사용할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Vijay Chaikam, et al. (2015), "Analysis of effectiveness of R1-nj anthocyanin marker for in vivo haploid identification in maize and molecular markers for predicting the inhibition of R1-nj expression," Theor. Appl. Genet. 128(1):159-171]을 참조한다. 이는 이배체 잡종이 웅성 반수체 유도인자 화분-공여자 계통으로부터의 우성 R1-SCM2 대립유전자를 보유하는 반면, 반수체가 오직 모계 게놈만으로 구성되고, 이에 따라, 유도인자 계통으로부터의 R1-SCM2 대립유전자를 갖지 않기 때문이다(즉, 웅성 게놈은 소실됨). R1-SCM2 형질이 종자에서, 그리고 심지어 식물의 일부 부분에서 발현되기 때문에, 반수체는 또한, 성숙기 또는 유묘기에 배에서 색상이 결여되는 것에 의해 식별될 수 있다. 많은 경우에, 이삭 및 발달 중인 낟알이 수분 후 조기 종자 성숙 단계 동안 제공받는 광의 양에 따라, 이배체 잡종 배는 추출 시에 자색이 아니고, 이들이 자색으로 변하기 전에, 어디서든 2 내지 36시간 동안 광에 노출될 필요가 있다(광은 안토시아닌 경로를 활성화시킨다). 배를 수분 후 13일 내지 22일(DAP)째에 추출할 것이지만, 16 내지 24시간 동안 광에 노출시켜, 10 내지 25 DAP의 추출이 이론적으로 가능하며, 반수체를 유지할 것이며; 이배체를 폐기할 것이다. 광 처리 동안, 배를 염색체 배가제, 예컨대 콜키신(바람직함), 트리플루랄린 또는 또 다른 염색체 배가제와 접촉시킬 것이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제US2004/0210959호(C.L. Armstrong et al.)를 참조한다. 대안적으로, 염색체 배가제를 발아 동안 분리된 배에 또는 토양에서 발아된 반수체의 유묘에 도포할 수 있다. 예정된 실험에서, 추정상의 반수체 배(미색 색상)를 파이타트레이(phytatray)에서 발아시키고, 뿌리 및 잎을 생성할 것이다. 6 내지 14일의 성장 후에, 작은 잎 샘플을 취하여, 추정상의 반수체 중 어느 것이 편집되는지를 결정할 것이다. 다시, TaqMan 검정 또는 전형적인 PCR 검정을 사용하여, 표적 부위가 이들 추정상의 반수체에서 편집되는지 여부를 평가할 것이다. 표적 부위에서의 돌연변이의 존재는 유전자 표적에 따라, 서열 분석(DNA 시퀀싱)에 의해, 마커 분석에 의해, 또는 심지어 시각적 표현형에 의해 확인될 수 있다. 반수체 식물에서 돌연변이시키기 위한 오직 하나의 카피의 DNA만이 존재하기 때문에 열성 표현형이 나타날 것이고, 그에 따라, 열성 표현형은 편집된 반수체를 식별하기 위한 또 다른 방식이 될 수 있다. 동시에, 표적 부위에 대한 TaqMan 검정이 시행되고 있으며, 추정상의 반수체가 웅성 모본으로부터의 CRISPR-Cas 편집 전이유전자 및 반수체 유도인자 마커를 검출하도록 설계된 TaqMan 검정에 의해 진정한 반수체로서 확인될 것이다(진정한 반수체는 이들 유전자 또는 대립유전자 모두를 결여할 것이다(마커는 야생형으로서 나타나거나 존재하지 않을 것이다)). 표 29는 편집된 반수체 마커 결과의 일례를 보여준다.
[표 29]
반수체, 편집된 반수체, 및 거짓(false) 반수체에 대한 유전자형 분석 결과를 나타내는 예시적인 편집 결과.
WT 대립유전자를 비편집 대조군만큼 강하게 증폭시키지 않는 표적 부위 검정에 의해 추정상의 편집된 반수체를 식별할 것이며, 즉, 추정상의 편집된 반수체는 비편집 대조군에 대한 "2 카피" 판독과 비교하여, "야생형" 대립유전자에 대해 "0" 또는 "1" 결과를 제공할 것이다. 동시에, 모든 반수체가 MATL, qhir8 및 R1-SCM2에 대해 동형접합성 야생형 유전자형을 가질 것이며(적어도 TaqMan 마커 검정 SM7252 및 SM4849), 전이유전자 Cas12a 검정 3633에 대해 "널(null)"일 것임이 예상되며, 이는 이들이 웅성 모본에 의해 제공되는 유도인자 대립유전자 또는 편집 기구를 갖지 않음을 의미하고, 이들이 편집되는 경우, 이들은 웅성 게놈 제거 및 반수체 유도 이전에 편집되었음이 예상된다.
이 실험에서, 본 발명자들이 발아시키고 TaqMan을 위해 샘플링한 미색-색상의 배 중 일부가 색상 저해(즉, R1-SCM2 마커가 발현되지 않거나, 자색 색상이 발색되지 않음), 부분적(불완전한) 웅성 게놈 제거(즉, 배는 유도인자 DNA를 부분적으로 결여한 키메라 또는 이수체임) 또는 화분 오염(자성 자가수분 또는 다른 화분)으로 인한 거짓 반수체인 것도 예상된다. 화분 오염에 의해 생산되는 배는 편집되지 않을 것이다. 거짓-양성 반수체가 (표적 부위 검정에 기초하여) 편집되는 경우, 이들은 다른 검정의 경우에는 별개의 패턴을 가질 것이며(MATL, qhir8, R1-SCM2의 유도인자 대립유전자 또는 CRISPR T-DNA 전이유전자가 증폭될 것임), 이에 따라 진정한 편집된 반수체로부터 식별되고 분류될 수 있다.
유세포분석을 통한 배수성 분석을 또한, 배수성 분석기에서 잎 조직을 사용하여 임의의 추정상의 편집된 반수체 유묘에서 수행하여, 식물의 상태를 반수체로서 확인할 것이다. 이때, 식물은 잠재적으로 배가 반수체(자발적 또는 유도된 게놈 배가에 기인함)일 수 있으며, 이는 유세포분석 결과에서, 이배체와 동일하게 판독될 것이다: 따라서, 어떤 추정상의 반수체(미색 색상의 배)가, 편집되지만 유도인자 게놈 및 편집 기구를 결여하는 어린 식물로 발아되는 지를 명확하게 하기 위한 유전자 마커가 매우 중요하다: 이들은 진정한 편집된 반수체이다.
HI-Edit 화분에 의한 교배로부터 각각의 자성 "엘리트" 계통으로부터 분리된 1000개의 배 중에, 대략 100 내지 200개가 반수체일 것이며, 이들 반수체 중에, 0 내지 100개가 가이드 RNA 표적 부위에서 편집될 것으로 예상된다. 전형적으로, 반수체의 편집의 효율은 전형적인 형질전환된 식물보다 더 낮은데, 왜냐하면 CRISPR 전이유전자 및 Cas 단백질-가이드RNA 복합체는 수정 후에, 그러나 반수체 유도 동안의 반수체 유도인자 DNA의 자연적 제거 이전에 단기간 동안 자성 "엘리트" 게놈과 동일한 핵 내에만 존재하기 때문이다: 웅성 게놈 제거는 수정 이전에, 수정 동안 또는 수정 후 수 시간 또는 수일 이내에 발생할 수 있다. 지난 HI-Edit 노력(미국 특허 제10519456호(Q. Que and T. Kelliher), 미국 특허 제10285348호(Q. Que and T. Kelliher) 및 문헌[Kelliher, T. et al. 2019. One Step Genome Editing of Elite Crop Germplasm, Nature Biotechnology Volume 37, pages 287-292] 참조)에서, 반수체 편집 빈도는 옥수수에서 0 내지 10%인 것으로 관찰되었다.
각각의 표적 유전자의 가이드 RNA 표적 부위에서 발생하는 편집의 성질을 결정하기 위해, 편집에 대해 양성 히트(hit)를 제공하는 TaqMan-검정으로부터의 PCR 단편을 상업적으로 이용 가능한 TOPO Blunt IV 키트의 이용을 통해 서브-클로닝할 것이며, 각각의 서브클로닝 반응에 대해 적어도 4개의 콜로니를 정방향 및 역방향 프라이머 생어(Sanger) 시퀀싱을 사용하여 시퀀싱할 것이다. 야생형 서열과 비교하여, Cas12a 가이드 RNA 절단 부위(PAM 부위의 약 8 내지 10개 염기쌍 하류에서 시작)에서 작은 결실이 추정상의 편집된 식물로부터의 PCR 산물에서 식별될 것으로 예상된다. 또한, 관심 가이드 RNA 표적 부위에 대해 "0 카피" TaqMan 결과(즉, PCR 산물 증폭이 전혀 없거나 거의 없음)를 제공하는 식물에서 편집이 예상될 수 있다. 하나 초과의 표적 부위가 편집된 몇몇 반수체가 관찰될 수 있다(미국 특허 제10,285,348호 및 문헌[Kelliher, T. et al. 2019] 참조). 편집을 예측된 단백질 서열에 대한 영향에 대해 분석할 것이다.
실시예 3. 역교배 전략을 사용한 HI-NA 계통의 육종
모든 세대(F2, F3, F4부터 F5까지)에 대해 자가생식 대신에, 형질전환 가능한 백그라운드(예를 들어, SYN-INBC34 또는 SYN-INBB23)와의 역교배가 사용될 것을 제외하고, 과정의 하나 이상의 단계에서 실시예 1에서와 동일한 과정을 사용하여, 육종 집단에서 이들 게놈의 비를 증가시킬 것이다. 역교배 동안, 역교배는 이들 근교계(웅성 또는 자성 식물로서 이들을 이용)와, 결정적인 반수체 유도인자 유전자좌(matl, qhir8, R1-SCM2 및 선택적으로 색상 저해인자) 각각에 적어도 하나의 카피의 HI 대립유전자를 보유하는 육종 집단 식물 간에 이루어질 것이다. 마커 보조 선택(유전자형 분석)을 사용하여, 이들 대립유전자에 대해 이형접합성인 식물을 선택할 것이다(교배 이전에 또는 이후에). 1회 이상 역교배한 후에, 생성된 계통을 이들 대립유전자의 유전자형에 대해 다시 스크리닝할 것이며, 모든 유전자좌에 대해 이형접합성인 식물을 자가수분시킨 다음, 유전자형 분석을 다시 한번 이용하여, 대부분의 또는 모든 이들 유전자좌에 대한 반수체 유도인자 대립유전자에 대해 동형접합성인 식물을 식별할 것이다. 선택적인 추가 라운드의 자가수분을 수행하여, 이들 유전자좌 모두를 동형접합성으로 만들 것이며, 이어서, 생성된 계통(예를 들어, BC2F3)을 형질전환 비율 및 반수체 유도율 시험을 위해 사용할 것이다. 두 표현형 분석 평가 모두에서 성능이 좋은 계통을 HI-Edit를 위해 이용할 것이다(예를 들어, 5% 초과의 형질전환 비율 및 12% 초과의 HIR을 갖는 것들).
실시예 4. 열대 또는 아열대 HI-NA 계통의 육종
실시예 1 및 3에 개략된 것과 동일한 과정을 이용하여, 형질전환 가능한 열대 반수체 유도인자 계통을 선택할 것이다. 즉, 형질전환 가능한, 세포형 A 열대 또는 아열대 계통(예를 들어, SYN-INBA12)을 자성 식물로서, RWKS/Z21S//RWKS 또는 또 다른 반수체 유도인자 계통으로부터 공여된 화분과 교배할 것이다. 이어서, F2 또는 BC1 집단(열대 세포형 A 계통과 역교배)을 원래의 교배에서 생성된 F1 식물로부터 생성할 것이다. 이어서, 표 10, 표 11 및 표 12의 검정(또는 이들 동일한 게놈 영역으로부터의 다른 검정)을 이용하는 마커 보조 선택을 이용하여, matl, qhir8 HI 대립유전자 및 반수체 유도인자 계통으로부터의 R1-SCM2 대립유전자를 포함하는 F2 및/또는 BC1, BC2, F3 또는 이후의 세대의 식물, 및 선택적으로 9번 염색체 색상 저해인자 유전자좌에 대한 야생형 대립유전자를 식별하고 선택할 것이다. 유도인자 대립유전자의 고정 후, 이후의 세대(예를 들어, F4, F5 또는 BC1F3 또는 BC2F3 등)에서, 형질전환 비율 및 반수체 유도율을 시험할 것이며, 두 표현형 분석 평가 모두에서 성능이 좋은 계통을 식별할 것이다(예를 들어, 5% 초과의 형질전환 비율 및 12% 초과의 HIR을 갖는 것들). 이어서, 이들 계통을 Cas9 또는 Cas12 게놈 편집 카세트의 HI-Edit 형질전환을 위해 사용할 것이며; 다른 열대, 아열대 또는 온대(스티프 스토크 또는 논-스티프 스토크) 계통과 교배하기 위해, 생성된 T0, T1, T2 또는 이후의 세대 형질전환 계통을 사용하여, 실시예 2에 개략된 바와 같이 반수체 유도 및 동시 게놈 편집(HI-Edit)을 유도할 것이다(예를 들어, SYN-INBD45(논-스티프 스토크 이오덴트 계통), SYN-INBE56(논-스티프 스토크 계통), SYN-INBF67(스티프 스토크 계통), SYN-INBG78(논-스티프 스토크 이오덴트 계통), SYN-INBH89(논-스티프 스토크 이오덴트 계통, SYN-INBI90(논-스티프 스토크 이오덴트 계통), SYN-INBJ13(논-스티프 스토크 Mo17 - 유사 계통), SYN-INBK14(열대 계통). 이어서, 편집된 반수체 열대 또는 아열대 또는 기타 생식질 식물을 식별하고, 배가시키고, 자가수분을 위해 성숙기까지 성장시켜, 추가의 육종 및 종자 생산 과정을 위해 사용될 편집된 DH 종자(순종 근교 편집 계통)를 생성할 것이다.
실시예 5. R1-SCM2 또는 9번 염색체 색상 저해인자에 대한 선택 없이, HI-NA 계통의 육종
이 경우에, R1-SCM2 유전자(및 9번 염색체 색상 저해인자)를 마커 보조 선택을 사용하여 선택하지 않을 것을 제외하고, 실시예 1, 3 및 4에 개략된 것과 동일한 과정을 따를 것이며; 오직 matl 및 qhir8 HI 대립유전자 마커만을 선택할 것이다. F4, F5, F6 또는 BC3F2, BC4F2 또는 이후의 세대의 선택된 계통은 Cas9 또는 Cas12 또는 실시예 2에서와 같이 HI-Edit(형질 표적에 대해 설계된 가이드 RNA를 이용)를 위해 사용될 기타 게놈 편집 카세트를 이용하여 형질전환될 것이며, 종자 또는 배에서 발현되는 가시적인 또는 형광 마커를 코딩하는 카세트를 함유할 것이다: 이는 반수체를 식별하는 데 사용될 것이다. 마커 유전자의 일례는 예를 들어, Zein 프로모터(예를 들어, 문헌[Y. Wu and J. Messing, 2012, Rapid Divergence of Prolamin Gene Promoters of Maize After Gene Amplification and Dispersal, Genetics, Vol. 192, 507-519]에 기재된 바와 같이 종자에서 높은 및 특이적인 발현을 부여할 것임)의 제어 하의 녹색 형광 단백질 또는 임의의 다른 형광 단백질 또는 가시적인 마커(예컨대 GUS)이다.
안정적으로 형질전환된 편집 단백질 시스템의 발현을 구동하는 프로모터의 선택이 반수체에서 편집률에 큰 영향을 미칠 수 있음이 주목된다. 예를 들어, 약한 프로모터 또는 유도성 프로모터는 다른 환경 효과 없이 편집 시스템의 발현을 충분히 구동하지 않을 수 있으며, 이 시나리오에서는 그에 따라 반수체의 편집율이 낮을 수 있다. 구성적 사탕수수 프로모터(prSoUbi4)를 사용할 것이지만, 배낭에서, 화분에서 또는 정자 세포에서 높은 또는 특이적인 발현을 구동하는 다른 프로모터가 보다 효과적일 수 있다(상기 표 8 및 첨부된 설명 참조).
실시예 6. MATL 및 DMP의 직접적인 돌연변이 표적화를 통한 HI-NA 계통의 육종
이 경우에, 오직 R1-SCM2 유전자(및 선택적으로 9번 염색체 색상 저해인자)만을 마커 보조 선택을 사용하여 선택하고, 이어서, 선택된 계통을 더 높은(7% 초과의) HIR을 부여할 수 있는 MATL 및 DMP 유전자를 표적화하는 CRISPR 카세트를 사용하여 형질전환시키고 게놈 편집할 것을 제외하고, 실시예 1, 3 및 4에 개략된 것과 동일한 과정을 이용할 것이다. 따라서, 육종은 크게 단순화된다 - 육종의 목적은 간단히 색상 마커를 형질전환 가능한 백그라운드 내로 유전자이입시키는 것이며, 높은 형질전환 비율은 대부분의 유전자이입된 식물 물질에서 수득 가능할 수 있다. 이점은 이것이 훨씬 더 빠르고 더 저렴한 육종 과정이라는 점이다. BC3F2, BC4F2 또는 이후의 세대의 생성 후에, 선택된 계통을 Cas9 또는 Cas12 또는 표 30의 가이드 RNA(여기서 작용할 다른 가이드 RNA가 존재함) 중 하나를 사용하여 MATL 및 DMP 유전자에서 낙아웃 돌연변이를 유도하도록 설계된 가이드 RNA를 함유하는 기타 게놈 편집 카세트를 이용하여 형질전환시킨다. 표적 유전자 둘 모두에 편집을 갖는 T0 식물을 식별하고, 자가수분시킨다. Cas 전이유전자를 결여하지만, 편집된 matl 및 dmp 대립유전자에 대해 동형접합성인 T1 또는 T2 또는 이후의 세대의 자손을 식별하고, 이를 사용하여, 높은(7% 내지 25%) HIR을 확인한다(R1-SCM2 색상 변화를 이용하는 반수체 선택 마커를 이용). 이후에, 높은 유도율 및 고도로 형질전환 가능한 계통을 이어서, 실시예 2에서와 같이, HI-Edit(형질 표적에 대해 설계된 가이드 RNA를 이용)를 위해 사용될 새로운 CRISPR 게놈 편집 카세트로 형질전환시킨다.
[표 30]
DMP 및 MATL 유전자를 낙 아웃시키기 위해 설계된 가이드 RNA.
실시예 7. 육종 없이 HI-NA 계통의 생성
RWKS/Z21S//RWKS BC1 반수체 유도인자 또는 임의의 다른 고성능 반수체 유도인자 계통을 실시예 2에 개략된 바와 같은 BBM 또는 관련된 엘리트 계통 형질전환 기술을 사용하여 형질전환시켜, HI-Edit의 목적을 위해 CRISPR 전이유전자를 전달할 것이다. HI-Edit에서 모든 기타 단계를 실시예 2에서와 같이 수행할 것이다. 여기서 이점은 육종이 필요하지 않다는 것이다(그리고 성능이 가장 최상인 반수체 유도인자 계통(모든 유도인자 유전자 및 색상 마커를 가짐)을 HI-Edit를 위해 직접 사용할 수 있음). 이 실시예에서, 형질전환될 반수체 유도인자 계통은 정상 A 세포형을 갖지 않으며, 이들은 1% 미만의 기준선 형질전환 빈도를 갖는다. 이와 같이, BBM 기술 또는 또 다른 형질전환 부스팅 기술(실시예 2 참조)은 고성능 반수체 유도인자 계통의 충분한 형질전환을 달성하는 데 필요할 것이다.
실시예 8. R1-SCM2 또는 9번 염색체 색상 저해인자에 대한 선택 없이 MATL 및 DMP의 직접적인 돌연변이 표적화를 통한 HI-NA 계통의 생성
임의의 계통(반수체 유도인자 계통이 아니며, 색상 마커도 결여한 것)을 Cas9 또는 Cas12 게놈 편집 카세트, 및 매트리니얼 및 DMP 유전자를 표적화하도록 설계된 가이드 RNA 카세트를 포함하는 제1 구축물을 이용하여 형질전환시킬 것이다(실시예 6에서와 같음). 이어서, 그 계통을 새로운 HI-Edit 계통으로 사용할 것이다. 추가의 가이드를 HI-Edit를 위해 사용될 수 있는 제1 구축물에 포함시키거나, 바람직하게는, 새로운 형질전환을 CRISPR-부재 matl 및 dmp 돌연변이 T1 또는 T2 계통에서 수행하여(실시예 5에서와 같이), HI-Edit의 목적을 위해 새로운 게놈 편집 구축물을 도입할 것이다. 어느 쪽이든, HI-Edit 구축물은 종자 또는 배에서 발현되는 가시적인 또는 형광 마커를 코딩하는 카세트를 함유할 것이다: 이는 반수체를 식별하기 위해 사용될 것이다. 이 과정의 이점은 matl 및 dmp 편집이 이루어지는 한, 그리고 반수체가 용이하게 식별될 수 있도록 포함되는 전이유전자 마커가 존재하는 한, 임의의 형질전환 가능한 계통이 HI-Edit를 위해 사용될 수 있다는 것이다. 마커 유전자의 일례는 실시예 5에 기재된 바와 같이 Zein 프로모터(이는 종자에서 높은 및 특이적인 발현을 부여할 것임)의 제어 하의 녹색 형광 단백질이다.
본 개시내용에서 논의된 모든 특허, 특허 간행물, 특허 출원, 학술지 논문, 저서, 기술적 참고문헌 등은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 도면 및 설명은 본 개시내용의 분명한 이해와 관련이 있는 요소를 예시하기 위해 단순화되었다는 것이 이해되어야 한다. 도면은 해설도로서가 아니라 예시 목적으로 제공된 것임을 인식해야 한다. 생략된 세부사항 및 변형 또는 대안적인 실시형태는 당업자의 이해의 범위에 속한다.
본 개시내용의 특정 양태에서는, 요소 또는 구조를 제공하거나 주어진 기능 또는 기능들을 수행하기 위해, 단일 구성요소가 다수의 구성요소에 의해 대체될 수 있으며, 다수의 구성요소가 단일 구성요소에 의해 대체될 수 있음을 인식할 수 있다. 이러한 치환이 본 개시내용의 특정 실시형태를 실시하는 데 이용 불가능할 경우를 제외하면, 이러한 치환은 본 개시내용의 범주 내에 있는 것으로 간주된다.
본원에 제시된 예는 본 개시내용의 잠재적 및 구체적인 구현예를 예시하고자 하는 것이다. 예는 주로 당업자를 위해 본 개시내용을 예시하려는 목적을 위한 것임을 인식할 수 있다. 본 개시내용의 사상으로부터 벗어나지 않고, 본원에 기재된 이들 다이어그램 또는 작동에 대해 대한 변형이 있을 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에는, 방법 단계 또는 작동이 상이한 순서로 수행 또는 실행될 수 있거나, 작동이 부가, 삭제 또는 변형될 수 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 그 범위의 상한과 하한 사이에서 하한의 단위의 최소 분율(smallest fraction)까지, 각각의 중간 값도 구체적으로 개시된다는 점을 이해해야 한다. 언급된 범위의 임의의 언급된 값 또는 언급되지 않은 중간 값과, 그 언급된 범위의 임의의 다른 언급된 값 또는 중간 값 사이의 임의의 더 좁은 범위가 포함된다. 그러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 범위에 포함되거나 그 범위에서 제외될 수 있고, 더 작은 범위에 한계치 중 어느 한쪽이 포함되거나 양쪽 모두가 포함되지 않거나 양쪽 모두가 포함되는 각각의 범위는 또한, 언급된 범위의 임의의 구체적으로 제외된 한계치를 조건으로 하여 본 기술 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계치 중 어느 한쪽 또는 양쪽 모두를 포함하는 경우, 그러한 포함된 한계치 중 어느 한쪽 또는 양쪽 모두를 제외한 범위도 포함된다.
위의 설명에서, 본 발명의 더욱 철저한 이해를 제공하기 위해 다수의 특정 세부사항이 제시된다. 그러나 본 개시내용에 기재된 본 발명이 이들 특정 세부사항 중 하나 이상 없이도 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예에서, 당업자에게 잘 알려져 있는 절차 및 잘 알려져 있는 특징은 본 발명을 모호하게 하는 것을 피하기 위해 설명되지 않았다. 본 개시내용의 실시형태는 예시를 위해 기재되었으며 제한하려는 목적이 아니다. 본 발명이 주로 특정 실시형태를 참조하여 설명되지만, 다른 실시형태가 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이라는 점도 상정되며, 이러한 실시형태는 본 발명의 방법 내에 포함되는 것으로 하고자 한다. 따라서, 본 개시내용은 상기 기재되거나 도면에 도시된 실시형태에 제한되지 않으며, 다양한 실시형태 및 변형이 하기 청구범위의 범주로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Syngenta Crop Protection AG
Kelliher, Timothy
Delzer, Brent
Nichols, Jason
Skibbe, David
<120> INCREASED TRANSFORMABILITY AND HAPLOID INDUCTION IN PLANTS
<130> 82222-WO-REG-ORG-NAT-1
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<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
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<220>
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gagcactgcc gcgccgtgta gaggccctgc tcggacgtcg accccgtccc gatggacagc 840
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<222> (259)..(259)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (280)..(280)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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acttctctnt ngatataggc aacntgctgg tgcatgggta tatatnttta gttggcaacc 420
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<212> DNA
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<220>
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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aactctatgg aagcattaca ggctaaactg gacgagacaa acacaaagct cgctaaggag 660
cgagaagctg ctaagactat cgaagaagcg cctcctgtgg tgcaggaaac tcaggtcctc 720
gtccaagana ccgaaaagat cgantccttg acancagagg ttcaaganct taaggtncgn 780
ctgcctacag caactgtttg tccggaattt cctactcntt tttctaancc ntttttncga 840
cagcatgcat gannnnnncn nnnncccnna tcagacaaac ttttgaagtg cntcntgttt 900
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<220>
<221> misc_feature
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ctttctagta gtaccatcta attcaattat aactagtaat tattaccgtg ataagagatc 300
ccattaacaa cgtatgaatc aaacaacacc tttagttcca aagattaaat atcaatgcct 360
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<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(54)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(72)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (186)..(186)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (219)..(219)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (237)..(237)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (245)..(247)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (249)..(265)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (360)..(368)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (459)..(459)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (479)..(479)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (489)..(489)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (496)..(496)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (544)..(545)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (561)..(561)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (597)..(597)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (622)..(622)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (712)..(714)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (735)..(735)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (806)..(806)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (820)..(820)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (922)..(922)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (998)..(1001)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<400> 75
gcctctgcga ngaaatggac ctgcangnnn nnnccnctac cnctagagga nggntggacc 60
gtggacgcgt cnaatttcga ggtcccctgc tcttccccgc agccagcgcc gcctccggtg 120
gacagggcta ccgctaacgt cgccgccgac gcctcaaggg cacccgtcta cggctctcgc 180
gcgacnagtt tcatggcttg gacgaggtcc tcgcagcant cgtcgtgctc cgacgangcg 240
gcgcnnncng cagtagtgcc ggccntcgag gagccgcaga gattgctgaa gaaagtggtg 300
gccggcggcg gtgcttggga gagctgtggc ggcgcgacgg gagcagcaca ggaaatgagn 360
nnnnntgnca ccaagaacca cgtcatgtcg gagcgaaagc gacgagagaa gctcaacgag 420
atgttcctcg tcctcaagtc actgcttccg tccattcana gggtaatgaa caagatacnt 480
accatcgant tttcantttt tttaatcctt tcgtcgtgtt gatttgaaaa cttaattgga 540
gacnnatttt ttcccccaat ntggcaggtg aacaaagcgt cgatcctcgc cgaaacnata 600
gcctacctca aggagcttca gngaagggtg caagagctgg agtccagtag ggaacctgcg 660
tcgcgcccat ccgaaacgac gacaaggcta ataacaaggc cctcccgtgg cnnnaatgag 720
agtgtgagga aggangtctg cgcgggctcc aagaggaaga gcccagagct cggcagagac 780
gacgtggagc gccccccggt cctcancatg gacgccggcn ccagcaacgt caccgtcacc 840
gtctcggaca aggacgtgct cctggaggtg cagtgccggt gggaggagct cctgatgacg 900
cgagtgttcg acgccatcaa gngcctccat ttggacgtcc tctcggttca ggcttcagcg 960
ccagatggct tcatggggct taagatacga gctcaggnnn ntat 1004
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM0953BQ F primer
<400> 76
ggcttatagc ttagaggcac ttgaa 25
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM0953BQ R primer
<400> 77
cctctgcacc gccatcaa 18
<210> 78
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM0953BQ FAM
<400> 78
tcagcctcat cctc 14
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<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM0953BQ TET
<400> 79
ctcagcctta tcctc 15
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<211> 288
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 80
acgtagcaca tgataagaag gctgcrttga gacagtaaga cgaagaatgg cargcagaag 60
agcacgtcrg catgctcccc gcggcttata gcttagaggc acttgaatcc ggtgggcack 120
ctcttgccgc agtggttgag gatgaggctg aggtcgacsg gyaggttgag cttgattcck 180
aggacctctc ccttgatggc ggtgcagagg cacacggcgg cctcgaggtc gacgagtccc 240
ttcagcagcr ggcagcatgg ctccgtgggc ggcacgccca ccttggcc 288
<210> 81
<211> 288
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 81
acgtagcaca tgataagaag gctgcrttga gacagtaaga cgaagaatgg cargcagaag 60
agcacgtcrg catgctcccc gcggcttata gcttagaggc acttgaatcc ggtgggcack 120
ctcttgccgc agtggttgag gataaggctg aggtcgacsg gyaggttgag cttgattcck 180
aggacctctc ccttgatggc ggtgcagagg cacacggcgg cctcgaggtc gacgagtccc 240
ttcagcagcr ggcagcatgg ctccgtgggc ggcacgccca ccttggcc 288
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM6604 F primer
<400> 82
tgatcatcca gggcacgac 19
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM6604 R primer
<400> 83
gggcttaaga tacgagctca gg 22
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM6604 FAM
<400> 84
cagcaaactg catagaaat 19
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM6604 TET
<400> 85
cagcaaactg cataggaa 18
<210> 86
<211> 1004
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(113)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (144)..(147)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (149)..(152)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (161)..(161)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (178)..(178)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(182)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (196)..(196)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (202)..(202)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (246)..(246)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (252)..(252)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (258)..(258)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (294)..(294)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (301)..(301)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (319)..(319)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (322)..(322)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (326)..(326)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (334)..(334)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (359)..(359)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (383)..(383)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (390)..(390)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (508)..(508)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (516)..(517)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (529)..(529)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (567)..(567)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (598)..(598)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (623)..(626)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (702)..(702)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (804)..(804)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (818)..(818)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (889)..(889)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (910)..(912)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (1002)..(1002)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<400> 86
atgatattta gacaaaagtt agccatgtca taaaaacttn gngttggagt gtagtttcca 60
atattacaaa aatatcatng ntatctagaa tgctatgact ttgaaaatat agnttttatg 120
aatgcaacca aacaccttat gccnnnnann nncactctag nattcctata aaccatgnga 180
tngcttagaa actatnaaaa anaatttact tccaaatata ccttacgctt agtctttagc 240
ttcctntctt cntttttnga gtttctacgt gttaagggct ggagtctaag tatncatgcc 300
natataattg ttgatatana gntccnattc atgnctgtta tctaaagaaa caagaaatnc 360
atctttgctt cgatcccatg aanccttccn tgcccgtcga tgtccaaatt tccagctgcc 420
ccttcaccgc ttccctatag ctttgcgaag agcctcgctg atcatccagg gcacgacggc 480
accggagcca gcaaactgca tagaaatnga gcatannagt taaacaacng cgtcagtaaa 540
aaacaaactc tccaaccaaa gagtctnatt aaccagagca gtattgcaat cgccatgnat 600
gtctcttagt ttgctggtga tannnncctg agctcgtatc ttaagcccca tgaagccatc 660
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tcgcgtcatc aggagctcct cccaccggca ctgcacctcc aggagcacgt ccttgtccga 780
gacggtgacg gtgacgttgc tggngccggc gtccatgntg aggaccgggg ggcgctccac 840
gtcgtctctg ccgagctctg ggctcttcct cttggagccc gcgcagacnt ccttcctcac 900
actctcattn nngccacggg agggccttgt tattagcctt gtcgtcgttt cggatgggcg 960
cgacgcaggt tccctactgg actccagctc ttgcaccctt cnct 1004
<210> 87
<211> 1004
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(40)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(81)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (113)..(113)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (144)..(147)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (149)..(152)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (161)..(161)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (178)..(178)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(182)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (196)..(196)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (202)..(202)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (246)..(246)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (252)..(252)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (258)..(258)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (294)..(294)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (301)..(301)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (319)..(319)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (322)..(322)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (326)..(326)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (334)..(334)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (359)..(359)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (383)..(383)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (390)..(390)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (508)..(508)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (516)..(517)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (529)..(529)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (567)..(567)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (598)..(598)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (623)..(626)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (702)..(702)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (804)..(804)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (818)..(818)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (889)..(889)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (910)..(912)
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<220>
<221> misc_feature
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atgatattta gacaaaagtt agccatgtca taaaaacttn gngttggagt gtagtttcca 60
atattacaaa aatatcatng ntatctagaa tgctatgact ttgaaaatat agnttttatg 120
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tngcttagaa actatnaaaa anaatttact tccaaatata ccttacgctt agtctttagc 240
ttcctntctt cntttttnga gtttctacgt gttaagggct ggagtctaag tatncatgcc 300
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accggagcca gcaaactgca taggaatnga gcatannagt taaacaacng cgtcagtaaa 540
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gcatatcagn tagccctccc tcgtcngtcg atattattnt tctcngntgt tnttttgcag 300
gtcggggggg gggggggagt agttgaatgg tgctgatttt tttggtagaa agctaaaaaa 360
actgacgacc ctgcatatca actaaagtag cacgtagaaa tcttgggaag ccggtacagn 420
tcacaatttg gttccacacg cgaaaagcat cangacactt gcatgtgcct gcacgccgcc 480
agattattac gaccgtaacc atgtaacaaa atttcaaata ctaattgttg ccgtcagctg 540
acgtaagcta tagaggattt gggaatcctt cnttaacgca aatatgccta attttttttt 600
tgtagttggt ctttttttng aaacaaattc atgtttagac ctttgacgat ttaatgtcgt 660
ttttaggcct tttgctgggc gctataaatc atgacgacaa tataatatgt ctcggcgtca 720
tgacttataa tgtcgaggta atagatacac actggactac tcatgctacg atggcgtcta 780
tgcttagctt ggcgtcatag atcacggcgc cgagctcacn gctgacgatt gcaacgcttc 840
cngcggcgag aattgatgcc gcatccaacn tgcatgtctn nnnngcggtc tcatccttca 900
tgcatgagtt cttttctttg tcaaaaataa tggacgttga tggcagcaac tctagtccca 960
ccgcatccat agcacatcac cgtgatttat ttccgtacga ag 1002
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM2918 F primer
<400> 100
atggtgccaa ttcgtaattt aagtt 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM2918 R primer
<400> 101
acccctctgg ttgcctctct 20
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM2918 FAM
<400> 102
aataccctcc agtttc 16
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM2918 TET
<400> 103
tatgaagaag aataccatcc 20
<210> 104
<211> 424
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (268)..(268)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<400> 104
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
cctccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
<210> 105
<211> 424
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (268)..(268)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<400> 105
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
catccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4813 F primer
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ggctaatatg gtgccaattc gta 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4813 R primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4813 FAM
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 424
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (268)..(268)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<400> 110
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
cctccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
<210> 111
<211> 424
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (268)..(268)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<400> 111
atgatgatga tgactagatg gagttccact gatatgaaga gaagaaatag aatattggct 60
aatatggtgc caattcgtaa tttaagttta cctgattatt atgaatatga agaagaatac 120
catccagttt caagagaggc aaccagaggg gtctgtatac tcctacgaat agacagatat 180
ttatcttcaa ttggaaggag cattcaagac cgtgaggttc tacgcgattt ccgccaacgg 240
ttactctttc cccaacgcga ggctgggnac agcttttccg aaatatatga tgatatacga 300
gcgcatgggg tagaagcaag tcgattgggt cagcctctaa gagatctgta cgatgagatg 360
gaaaggaacg gcgagatagt aaataacggc tcaatcatta tccctggagg cggcggacca 420
gtaa 424
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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gtattcgcac ctactctgcc g 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM2914 R primer
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aaagcaaaaa taccattgca acc 23
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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atcgtaaatt ttttttgatg c 21
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<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (382)..(382)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (402)..(402)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
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gatgcctttt taaggaaccc tccccccgag tcggatttgt ctcaggaagt ggggccggtt 60
ccaccgccac cggtggcgtg ttgtcatggg gatgatcacc cccttctggc gaagggccag 120
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gtttatcgga agaaccccaa ctttctcctt gggtcatccc cagagtagca ctctgctccc 360
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gcgccagaaa gagttccgcg agatcaaaaa agcaaaaata ccattgcaac caacacgagg 480
caggaagcag aagcatcaaa caaaatttac gattcatgac aatccnattt ttgaagcgaa 540
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tcgctcctcg tgctcc 616
<210> 117
<211> 616
<212> DNA
<213> Zea mays
<220>
<221> misc_feature
<222> (382)..(382)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (402)..(402)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<220>
<221> misc_feature
<222> (526)..(526)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
<400> 117
gatgcctttt taaggaaccc tccccccgag tcggatttgt ctcaggaagt ggggccggtt 60
ccaccgccac cggtggcgtg ttgtcatggg gatgatcacc cccttctggc gaagggccag 120
tggttgggct caaccgttcg ccctccgtag ggctgagtgg cggatctata aaatctgggg 180
cggaccgaac ctccatttcg aattcaaaat ctaaaggagc ctttcctttg cgcccctctt 240
gggtggatcc ctcccccgct tccattagaa gcggtttttg cccccccacc tttgaaggca 300
gtttatcgga agaaccccaa ctttctcctt gggtcatccc cagagtagca ctctgctccc 360
ataggagctg gaatagaaaa cngagccaca ttacgagtgc gncaatgaga gccttccgga 420
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4812 F primer
<400> 118
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<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4812 R primer
<400> 119
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<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4812 FAM
<400> 120
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4812 TET
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cccgggacct gtgg 14
<210> 122
<211> 1005
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 122
tctcatatta agtcggaaga gtttaggtaa gactttcaaa gaaactctcg acgggagaat 60
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atccaatgaa caacaacgat tacttaatct acggatcagc ttgcgaattt gcagcaccgt 180
aaaagtagta gaatcattac cagcggcacg ctgtgcgcct aagtgcgaaa agacagtgca 240
agctttgtta tgccgaaacc taaatgtcaa gtcagcaaca cttctaaatg ccacttcttc 300
ccgtcgcatc cgtcttcagg acgatatagt cacaggtttt cacttttcag tgagtgaaag 360
attagtatcc gggtctacaa ctttggtaga agcttctacc gtagaacaaa ttcgagaggc 420
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taaaaagtca tatttcttgg tgtagggatg gatctcatag gaaaagagat accgaggccc 960
accaaccata tacttgattt atggtttggt ggggaaagaa gagtg 1005
<210> 123
<211> 999
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 123
tctcatatta agtcggaaga gtttaggtaa gactttcaaa gaaactctcg acgggagaat 60
cgagtctatt caggaatcat tgcagcaatt cttcaatcct aacgaagtca ttctggagga 120
atccaatgaa caacaacgat tacttaatct acggatcagc ttgcgaattt gcagcaccgt 180
aaaagtagta gaatcattac cagcggcacg ctgtgcgcct aagtgcgaaa agacagtgca 240
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ccgtcgcatc cgtcttcagg acgatatagt cacaggtttt cacttttcag tgagtgaaag 360
attagtatcc gggtctacaa ctttggtaga agcttctacc gtagaacaaa ttcgagaggc 420
cttcttatta gaacccagag acctaattcg agaaggcttt atagtcctca gaaaggtgag 480
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ctgtaatttg ctccttgagc gtttctaacg tcaataaagt cctccaactt atgatgccag 840
ttttccgaag ccgcggcttt tacccgcttt ataagcgatg agtagggcga tgcataaaaa 900
gtcatatttc ttggtgtagg gatggatctc ataggaaaag agataccgag gcccaccaac 960
catatacttg atttatggtt tggtggggaa agaagagtg 999
<210> 124
<211> 1371
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 124
agttcatcac taatcacact tattgttccc tcgacgagta tctagctagc tcattaatcg 60
atcaatcggg gtgtgcggtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120
aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180
cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240
atcctcgcct tcctcgaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300
gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360
gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420
gagaactgcc cgcgcatctt ccctcagaag agcaggcttg cggccgccat gtccgcgctg 480
aggaagccaa agtacaacgg caagtgcatg cgcagcctga ttaggagcat cctcggcgag 540
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tccgccgcgc cgacctacct cccggcgcac tacttccaga ctgaagacgc caacggcaag 660
gagcgcgaat acaacctcat cgacggcggt gtggcggcca acaacccgac gatggttgcg 720
atgacgcaga tcaccaaaaa gatgcttgcc agcaaggaca aggccgagga gctgtaccca 780
gtgaagccgt cgaactgccg caggttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcc 840
gagcagggcc tctacacggc gcggcagtgc tcccggtggg gtatctgccg gtggctccgc 900
aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctcgga cctggtggac 960
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catgcttgta aataagtaga ctttatttta ataaaacata aaaatatata t 1371
<210> 125
<211> 1375
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 125
agttcatcac taatcacact tattgttccc tcgacgagta tctagctagc tcattaatcg 60
atcaatcggg gtgtgcggtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120
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gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360
gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420
gagaactgcc cgcgcatctt ccctcagaag agcaggcttg cggccgccat gtccgcgctg 480
aggaagccaa agtacaacgg caagtgcatg cgcagcctga ttaggagcat cctcggcgag 540
acgagggcca agagcacgcc tctgaagaac gctctgctct cggacgtgtg cattggcacg 600
tccgccgcgc cgacctacct cccggcgcac tacttccaga ctgaagacgc caacggcaag 660
gagcgcgaat acaacctcat cgacggcggt gtggcggcca acaacccgac gatggttgcg 720
atgacgcaga tcaccaaaaa gatgcttgcc agcaaggaca aggccgagga gctgtaccca 780
gtgaagccgt cgaactgccg caggttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcc 840
gagcagggcc tctacacggc gcggcagtgc tcccggtggg gtatctgccg gtggctccgc 900
aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctcgga cctggtggac 960
atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020
gacaactcgc tccgtggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080
acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcacagaggg tgtccagggt caacgtggag 1140
acagggagcg aggtacgaac cggtgactgg cgaaggaagc aatgccgatg ccctcggtgg 1200
gctcgctagg cagctctccg aggagaggag aacaaggctc gcgcgccgcg tgtctgccat 1260
caacccaaga ggctctagat gtgcgtcgta cgatatctaa gacaagtggc tttactgtca 1320
gtcacatgct tgtaaataag tagactttat tttaataaaa cataaaaata tatat 1375
<210> 126
<211> 618
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 126
atggatcgca gcaacgccgg tgcggtgtcc gtcgaggtgc gcggcggcgg cggcggctcg 60
ccgccgggcg cgggaaggaa gcgccgcgcg gtggcgaggg gcgtgcagaa gacgctctcc 120
aagacgtcca tgctggccaa cttcctcccc acgggcacgc tgctaacctt cgagatgcta 180
ctcccggccg ccgcaggcga cggcacctgc tcggcggtca gcgccgcgat gctcagggcc 240
ctgctcgcgc tctgcgccgc ctcctgcttc ctcttccact tcaccgacag cttccgcgcc 300
ccggacggga aggtgtacta cggcttcgtc acgccgcggg gcctgtcgct gttcaggacc 360
gggctcggcg tcgaggtgcc cagggaggaa aggtaccggc tcgccttcgt cgacgtcgtg 420
cacgctgtca tgtccgtgct ggtctttgcg gccgtcacgc tcgccgacta ccgggtctcc 480
gggtgcctcg tcgccggcca ccgcaaggag atggacgagg tgatggagag cttcccgctc 540
atggtgggcg ccgtgtgcag cggcctcttc ctcttgttcc ccaacacccg ctacggcatc 600
ggttgtttgg ctccgtaa 618
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Waxy1 probe
<400> 127
ggtttcaggt ttggggaaag a 21
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Waxy1 gRNA target sequence
<400> 128
gggaaagacc gaggagaaga tct 23
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM3158 F primer
<400> 129
caaaccagga accaagctca ct 22
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM3158 R primer
<400> 130
ggaccacgac atcttgaagg a 21
<210> 131
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM3158 FAM
<400> 131
cggcctacac taggagt 17
<210> 132
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM3158 TET
<400> 132
cctacactgg gagtcc 16
<210> 133
<211> 1001
<212> DNA
<213> Zea mays
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cgcttctctg ccttggagga tgaattagca agggaagtcg ccaatacctt taatttctca 60
acctgcatca ttttagtcca ttatgttagt atatagctat attttcacca atgtccatgt 120
atataagcat agttcatcta gaatgattac tatcagcgtc cggggaagac cataccctcg 180
gatactgaca atatgcctat caaagatcac atcaacagag aaaagctcaa tcagggctcg 240
gcccaaccat gtgtccctaa ggccctgtgc ccaaaggggt cttgctcggc tccagataag 300
tcagacgccc tccacatcgg agaccaggtc ccgaggccct ctagccctcg aagctcttcc 360
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<212> DNA
<213> Zea mays
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<213> Zea mays
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<222> (896)..(896)
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<221> misc_feature
<222> (912)..(912)
<223> N = Adenine or Guanine or Cytosine or Thymine
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<222> (983)..(983)
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<211> 1001
<212> DNA
<213> Zea mays
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> SM3362 FAM
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<212> DNA
<213> Zea mays
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gttgtcaagt tatcccttaa aattaggcag cagtgattaa cactgccatc gattacagcg 960
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<210> 152
<211> 1001
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 152
gcaagatgac aaatatttgt ttttcatggc attgatgtag cctacaagat ggaactttga 60
ctagaaatat ctataaaaaa acattgtttc gaatataaag agttactcca tctgtcctgg 120
aatgagaagt gtattttgat caaagaaaag tcatacaaaa ttgatttgac cccttagttt 180
ctgttgcaat atgttatcat ttgccaaaca gtcaatacca tctctcagag gcaccttgaa 240
tgcacataca ttatggttct tttttcccat ccattgcaga tatgactaaa atgaagatcg 300
acggcgacaa taactttggg gagcagaaga gccatcaccg ctgcaggcgc aagaagcatg 360
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tctaagcatg tgttgtattg tagtgttcct tcactagcag cagctgttat ccgcgtcttt 480
gttgtagcat tcactgatag ggtaggcaac tagttaccag tgtttctgac tttttgtatg 540
ggcactgatg tttcctgata gtatagttcc ctagtttctg ggctagtttt tttttccatg 600
agtttatctg tgaaggcttc aagagtagcg aatgcgctaa gaacaaatgt gtcgcctttt 660
tagttgtttt ttacacttgt tagcactata taatggttgt ttgagttgga tgcgtgattg 720
atacagcagc atcagtcagc tgatccctaa aataaggttg tttggtttaa ggtcaggggt 780
tgggacatga ctatcctagt gttgtcccag ttatcactca aaattggatc ctagtgttgt 840
cccagttatc actcaaaatt ggagggacga gagaggacgc cagggaacgt ccctgtcctg 900
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> SM0634AQ R primer
<400> 154
gttttcgcaa gcaatgagaa tggt 24
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM0634AQ FAM
<400> 155
aaagtattcc atgtccttac 20
<210> 156
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM0634AQ TET
<400> 156
agaaagtatt ccatctcctt ac 22
<210> 157
<211> 171
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 157
ttgcatgata tcctccatgg tagggagaaa gtattccatc tccttacata agctcagtgt 60
ttttaccatt ctcattgctt gcgaaaacat ttatctactt ccataataag mtactwtttg 120
cagttgctcc catgctwact astatgaayy ggttgctgat gcctaattwa a 171
<210> 158
<211> 171
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 158
ttgcatgata tcctccatgg tagggagaaa gtattccatg tccttacata agctcagtgt 60
ttttaccatt ctcattgctt gcgaaaacat ttatctactt ccataataag mtactwtttg 120
cagttgctcc catgctwact astatgaayy ggttgctgat gcctaattwa a 171
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> SM4586 F primer
<400> 159
cagagccact cgtcaggaga t 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SM4586 R primer
<400> 160
ggtgtactcg ccggagtta 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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agatgcggtg gcgc 14
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<212> DNA
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<220>
<223> SM4586 TET
<400> 162
taagatgtgg tggcgc 16
<210> 163
<211> 1001
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 163
tgcatgactg tctgaggtcc ttaggacaag gacatatgta ggtgggccta ataccttggg 60
aggttcagtg acaccctaga tggcggtcat aaataccaaa gagcctaggg tcagtcagac 120
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agagccactc gtcaggagat caacggctgc ccaagctctt gctggccacc cagcgcagaa 480
catagtggct gtgcgccacc acatcttata actccggcga gtacaccaat caggtgccct 540
aatgccctac gcgcctacct aattgcattt acacgacgag agggcgacaa gaaatcaatg 600
gagatggccc atactgtggg aggggtgcga aggttcgtgt tcccggtgaa gggtggtgct 660
gcggtggaga actcgcgtcg gtgtgaaatt tacccagcag gttccacgac tctcgtggtc 720
aagccttggc atgcaccaga tgtgacggaa cctcccaagg gattaggccc acctacagtt 780
ctccttgtcc taaggacttt ggacaaccct gtagatgcac ataatcactc gacaagttcg 840
gtaactgtat ccttatcatt tcgcccaaga gcgcttcacc catcacgcag atattacatc 900
acatcggagg aaagaataag cggaagcaga ttacaataac ttaatttaca ttcatcaaat 960
atataaagag agtattatta ttataacaat accagggtat t 1001
<210> 164
<211> 1001
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 164
tgcatgactg tctgaggtcc ttaggacaag gacatatgta ggtgggccta ataccttggg 60
aggttcagtg acaccctaga tggcggtcat aaataccaaa gagcctaggg tcagtcagac 120
aaaattttag ggctaatttg taacattctt ttaatatatt tggacaatgg gtttatagta 180
acaaaaccga ggggatctta tgtcaaattg catgatgaaa gggtattgga tgattctagt 240
cacccgatct gaaacctggg atccatatta gatcacctct agccaaaccg gtgcgtgatc 300
caaatcatcc gatcgacaat cgatgatgag gatttaaaat accttgcttt gcctagagtc 360
gtccaacgag atccgagggc gcagatgcaa tagccaaagg ggtacgcatg gggccgcacc 420
agagccactc gtcaggagat caacggctgc ccaagctctt gctggccacc cagcgcagaa 480
catagtggct gtgcgccacc gcatcttata actccggcga gtacaccaat caggtgccct 540
aatgccctac gcgcctacct aattgcattt acacgacgag agggcgacaa gaaatcaatg 600
gagatggccc atactgtggg aggggtgcga aggttcgtgt tcccggtgaa gggtggtgct 660
gcggtggaga actcgcgtcg gtgtgaaatt tacccagcag gttccacgac tctcgtggtc 720
aagccttggc atgcaccaga tgtgacggaa cctcccaagg gattaggccc acctacagtt 780
ctccttgtcc taaggacttt ggacaaccct gtagatgcac ataatcactc gacaagttcg 840
gtaactgtat ccttatcatt tcgcccaaga gcgcttcacc catcacgcag atattacatc 900
acatcggagg aaagaataag cggaagcaga ttacaataac ttaatttaca ttcatcaaat 960
atataaagag agtattatta ttataacaat accagggtat t 1001
<210> 165
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA 1 (DMP)
<400> 165
ctccctgggc acctcgacgc cga 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA 2 (DMP)
<400> 166
ggccgggagt agcatctcga 20
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA 3 (DMP)
<400> 167
actacggctt cgtcacgccg 20
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA 4 (MATL)
<400> 168
catgcagaac tgcccgcgca tct 23
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA 5 (MATL)
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA 6 (MATL)
<400> 170
cttcctggag gccaggctgc 20
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<211> 17462
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Vector 26258
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<221> rep_origin
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<400> 171
attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactggcact agcctaacgg tgttgactaa ctaggccgct 180
tccctaatta gctaacccgg gggcgcgccg ggacccgaat tcattatgtg gtctaggtag 240
gttctatata taagaaaact tgaaatgttc taaaaaaaaa ttcaagccca tgcatgattg 300
aagcaaacgg tatagcaacg gtgttaacct gatctagtga tctcttgcaa tccttaacgg 360
ccacctaccg caggtagcaa acggcgtccc cctcctcgat atctccgcgg cgacctctgg 420
ctttttccgc ggaattgcgc ggtggggacg gattccacga gaccgcgacg caaccgcctc 480
tcgccgctgg gccccacacc gctcggtgcc gtagcctcac gggactcttt ctccctcctc 540
ccccgttata aattggcttc atcccctcct tgcctcatcc atccaaatcc cagtccccaa 600
tcccatccct tcgtaggaga aattcatcga agctaagcga atcctcgcga tcctctcaag 660
gtactgcgag ttttcgatcc ccctctcgac ccctcgtatg tttgtgtttg tcgtagcgtt 720
tgattaggta tgctttccct gtttgtgttc gtcgtagcgt ttgattaggt atgctttccc 780
tgttcgtgtt catcgtagtg tttgattagg tcgtgtgagg cgatggcctg ctcgcgtcct 840
tcgatctgta gtcgatttgc gggtcgtggt gtagatctgc gggctgtgat gaagttattt 900
ggtgtgatct gctcgcctga ttctgcgggt tggctcgagt agatatgatg gttggaccgg 960
ttggttcgtt taccgcgcta gggttgggct gggatgatgt tgcatgcgcc gttgcgcgtg 1020
atcccgcagc aggacttgcg tttgattgcc agatctcgtt acgattatgt gatttggttt 1080
ggacttttta gatctgtagc ttctgcttat gtgccagatg cgcctactgc tcatatgcct 1140
gatgataatc ataaatggct gtggaactaa ctagttgatt gcggagtcat gtatcagcta 1200
caggtgtagg gactagctac aggtgtaggg acttgcgtct aattgtttgg tcctttactc 1260
atgttgcaat tatgcaattt agtttagatt gtttgttcca ctcatctagg ctgtaaaagg 1320
gacactgctt agattgctgt ttaatctttt tagtagatta tattatattg gtaacttatt 1380
acccctatta catgccatac gtgacttctg ctcatgcctg atgataatca tagatcactg 1440
tggaattaat tagttgattg ttgaatcatg tttcatgtac ataccacggc acaattgctt 1500
agttccttaa caaatgcaaa ttttactgat ccatgtatga tttgcgtggt tctctaatgt 1560
gaaatactat agctacttgt tagtaagaat caggttcgta tgcttaatgc tgtatgtgcc 1620
ttctgctcat gcctgatgat aatcatatat cactggaatt aattagttga tcgtttaatc 1680
atatatcaag tacataccat gccacaattt ttagtcactt aacccatgca gattgaactg 1740
gtccctgcat gttttgctaa attgttctat tctgattaga ccatatatca tgtatttttt 1800
tttggtaatg gttctcttat tttaaatgct atatagttct ggtacttgtt agaaagatct 1860
gcttcatagt ttagttgcct atccctcgaa ttaggatgct gagcagctga tcctatagct 1920
ttgtttcatg tatcaattct tttgtgttca acagtcagtt tttgttagat tcattgtaac 1980
ttatggtcgc ttactcttct ggtcctcaat gcttgcaggg atcccctaaa tagaccatgc 2040
cgaagaagaa gcgcaaggtc gggggcgggg gctcaggcgg gggcgggagc ggcggcgggg 2100
gctctggggg cggcggcagc ggcgggggcg gcagcggggg cggcgggtcg atgagcaagc 2160
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ctgaggacta caagggcgtg aagaagctcc tggaccgcta ctacctgtcc ttcatcaacg 2340
acgtgctcca cagcatcaag ctcaagaacc tgaacaacta catcagcctc ttcaggaaga 2400
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aggaattctc gatctttatg gtgtataggc tctgggtttt ctgttttttg tatctcttag 2760
gattttgtaa attccagatc tttctatggc cacttagtag tatatttcaa aaattctcca 2820
atcgagttct tcattcgcat tttcagtcat tttctcttcg acgttgtttt taagcctggg 2880
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gatttctcta ggtaaccgat ctattgcatt catctgaatt tctgcatata tgtcttagat 3000
ttctgataag cttacgatac gttaggtgta attgaagttt atttttcaag agtgttattt 3060
tttgtttctg aatttttcag gtgcatcaac gagaacctca cccgctacat ctccaacatg 3120
gacatcttcg agaaggtcga cgcgatcttc gacaagcacg aggtgcagga gatcaaggag 3180
aagatcctga acagcgacta cgacgtcgag gacttcttcg agggcgagtt cttcaacttc 3240
gtcctcacgc aggagggcat cgacgtgtac aacgccatca tcggtggctt cgtgaccgag 3300
tccggcgaga agatcaaggg cctgaacgag tacatcaacc tctacaacca gaagaccaag 3360
cagaagctgc cgaagttcaa gcccctgtac aagcaggtgc tctccgacag ggagtccctc 3420
agcttctacg gcgagggcta cacgagcgac gaggaggtcc tggaggtgtt ccgcaacacc 3480
ctcaacaaga acagcgagat cttctccagc atcaagaagc tcgagaagct gttcaagaac 3540
ttcgacgagt actccagcgc cggcatcttc gtcaagaacg gcccggcgat ctccacgatc 3600
agcaaggaca tcttcggcga gtggaacgtg atccgcgaca agtggaacgc cgagtacgac 3660
gacatccacc tcaagaagaa ggcggtggtc accgagaagt acgaggacga caggcgcaag 3720
tccttcaaga agatcggctc cttcagcctc gagcagctgc aggagtacgc cgacgcggac 3780
ctgagcgtgg tcgagaagct caaggagatc atcatccaga aggtcgacga gatctacaag 3840
gtgtacggct ccagcgagaa gctcttcgac gcggacttcg tcctcgagaa gtccctgaag 3900
aagaacgacg ccgtggtcgc gatcatgaag gacctcctgg actccgtgaa gagcttcgag 3960
aattacatca aggccttctt cggcgagggc aaggagacga acagggacga gtccttctac 4020
ggcgacttcg tcctggccta cgacatcctc ctgaaggtgg accacatcta cgacgcgatc 4080
cgcaactacg tgacccagaa gccgtacagc aaggacaagt tcaagctcta cttccagaac 4140
ccccagttca tgggcggctg ggacaaggac aaggagacgg actacagggc gaccatcctg 4200
cgctacggca gcaagtacta cctcgccatc atggacaaga agtacgcgaa gtgcctgcag 4260
aagatcgaca aggacgacgt caacggcaac tacgagaaga tcaactacaa gctcctgccg 4320
ggccccaaca agatgctccc gaaggtgttc ttctccaaga agtggatggc ctactacaac 4380
cccagcgagg acatccagaa gatctacaag aacggcacgt tcaagaaggg cgacatgttc 4440
aacctgaacg actgccacaa gctcatcgac ttcttcaagg actccatcag ccgctacccg 4500
aagtggtcca acgcctacga cttcaacttc agcgagaccg agaagtacaa ggacatcgcg 4560
ggcttctacc gcgaggtcga ggagcagggc tacaaggtgt ccttcgagtc cgccagcaag 4620
aaggaggtcg acaagctggt ggaggagggc aagctctaca tgttccagat ctacaacaag 4680
gacttctccg acaagagcca cggcacgccc aacctgcaca ccatgtactt caagctcctg 4740
ttcgacgaga acaaccacgg ccagatcagg ctgtccggcg gcgccgagct cttcatgagg 4800
agggcgagcc tgaagaagga ggagctggtg gtccaccccg ctaacagccc aatcgcgaac 4860
aagaacccgg acaaccccaa gaagaccacg accctgtcct acgacgtgta caaggacaag 4920
aggttcagcg aggaccagta cgagctccac atcccgatcg cgatcaacaa gtgccccaag 4980
aacatcttca agatcaacac cgaggtccgc gtgctcctga agcacgacga caacccctac 5040
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atcaagacgg actaccacag cctcctggac aagaaggaga aggagaggtt cgaggcccgc 5220
cagaactgga cctccatcga gaacatcaag gagctgaagg cgggctacat cagccaggtc 5280
gtgcacaaga tctgcgagct cgtcgagaag tacgacgccg tgatcgccct cgaggacctg 5340
aactccggct tcaagaacag ccgcgtcaag gtggagaagc aggtctacca gaagttcgag 5400
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ggcggcgcgc tgaagggcta ccagatcacc aacaagttcg agagcttcaa gtccatgagc 5520
actcagaacg gcttcatctt ctacatcccg gcgtggctca cgtccaagat cgaccccagc 5580
accggcttcg tcaacctcct gaagacgaag tacacctcca tcgccgacag caagaagttc 5640
atctccagct tcgaccgcat catgtatgtg ccggaggagg acctgttcga gttcgccctc 5700
gactacaaga acttctcccg cacggacgcg gactacatca agaagtggaa gctgtacagc 5760
tacggcaacc gcatccgcat cttcaggaac cccaagaaga acaacgtctt cgactgggag 5820
gaggtgtgcc tgacctccgc gtacaaggag ctcttcaaca agtacggcat caactaccag 5880
cagggcgaca tcagggctct cctgtgcgag cagagcgaca aggccttcta ctccagcttc 5940
atggcgctga tgtccctcat gctgcagatg aggaactcga tcaccggcag gacggacgtg 6000
gacttcctca tctccccggt gaagaacagc gacggcatct tctacgactc caggaactac 6060
gaggcccagg agaacgcgat cctcccaaag aacgcggacg ccaacggcgc ctacaacatc 6120
gccaggaagg tcctctgggc tatcggccag ttcaagaagg cggaggacga gaagctggac 6180
aaggtgaaga tcgccatcag caacaaggag tggctcgagt acgcccagac ctcggtcaag 6240
cacggcagcc cgaagaagaa gcgcaaggtg tccggcggca gctccggcgg cagcccgaag 6300
aagaagcgca aagtgtgatt aattaagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 6360
gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta 6420
agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta 6480
gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 6540
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agatctgtat ctcgagcgtc tggctgataa tttctactaa gtgtagatct atcttatcct 7200
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ttttcctagg tttgtgaaag ttgaattacg gcatagccga aggaataaca gaatcgtttc 7320
acactttcgt aacaaaggtc ttcttatcat gtttcagacg atggaggcaa ggctgatcaa 7380
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tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc 8700
ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta 8760
ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac 8820
acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc 8880
tcgtcctccc cccccccccc tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt ccatagttag 8940
ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt 9000
gctgttagcg ttcgtacacg gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt 9060
gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga 9120
tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa 9180
tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg 9240
atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc 9300
tggtggattt attaattttg gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat 9360
tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac 9420
tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc 9480
ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat 9540
taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg 9600
gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg 9660
atggcatatg cagcatctat tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa 9720
caagtatgtt ttataattat tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc 9780
tatatgtgga tttttttagc cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct 9840
tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt tacttctgca gctaaaccat gcagaagctg 9900
atcaacagcg tgcagaacta cgcctggggc agcaagaccg ccctgaccga gctgtacggc 9960
atggagaacc ccagcagcca gccaatggcc gagctgtgga tgggcgccca ccccaaaagc 10020
tcaagccgcg tgcagaacgc cgccggcgat atcgttagcc tgcgcgacgt gatcgagagc 10080
gacaagagca ccctgctggg cgaggccgtg gccaagcgct tcggcgagct gcccttcctg 10140
ttcaaggtgc tgtgcgccgc tcagcccctg agcatccagg tgcaccctaa caagcacaac 10200
agcgagatcg gcttcgccaa ggagaacgcc gccggcatcc caatggacgc cgccgagcgc 10260
aactacaagg accccaacca caagcccgag ctggtgttcg ccctgacccc cttcctggcc 10320
atgaacgcct tccgcgagtt cagcgagatc gttagcctgc tgcagcccgt ggccggcgcc 10380
caccccgcta tcgcccactt ccttcagcag cccgacgccg agcgcctgag cgagctgttc 10440
gccagcctgc tgaacatgca gggtgaggag aagtcacgcg ccctggccat cctgaagagc 10500
gccctggaca gccagcaggg cgagccctgg cagacaatcc gcctgatcag cgagttctac 10560
cccgaggata gcggcctgtt cagccccctg ctgctgaacg tggtgaagct gaaccccggc 10620
gaggccatgt tcctgttcgc cgagactccc cacgcctacc tgcagggcgt ggccctggag 10680
gtgatggcca acagcgacaa cgtgctgcgc gccggcctga cccccaagta catcgacatc 10740
cccgagctgg tggccaacgt gaagttcgag gctaagcccg ccaaccagct gctgacccag 10800
cccgtgaagc agggcgccga gctggacttc cctatccccg ttgacgactt cgccttcagc 10860
ctgcacgacc tgagcgacaa ggagactact atcagccagc agagcgccgc gatcctgttc 10920
tgcgtggagg gcgacgccac cctgtggaag ggcagccagc agctgcagct gaagcccggc 10980
gagagcgcct ttatcgccgc caacgagagc cccgtgaccg tgaagggcca cggccgcctg 11040
gcccgcgtgt acaacaagct gtgataggat tacctagtca tgggtcgttt aagctgccga 11100
tgtgcctgcg tcgtctggtg ccctctctcc atatggaggt tgtcaaagta tctgctgttc 11160
gtgtcatgag tcgtgtcagt gttggtttaa taatggaccg gttgtgttgt gtgtgcgtac 11220
tacccagaac tatgacaaat catgaataag tttgatgttt gaaattaaag cctgtgctca 11280
ttatgttctg tctttcagtt gtctcctaat atttgcctcc aggtactggc tatctaccgt 11340
ttcttactta ggaggtgttt gaatgcacta aaactaatag ttagtggcta aaattagtta 11400
aaacatccaa acaccatagc taatagttga actattagct atttttggaa aattagttaa 11460
tagtgaggta gttatttgtt agctagctaa ttcaactaac aatttttagc caactaacaa 11520
ttagtttcag tgcattcaaa caccccctta atgttaacgt ggttctatct accgtctgct 11580
aatatatggt tgattgttcg gtttgttgct atgctattgg gttctgattg ctgctagttc 11640
ttgctgaatc cagaagttct cgtagtatag ctcagattca tattatttat ttgagtgata 11700
agtgatccag gttattacta tgttagctag gtttttttta caaggataaa ttatctgtga 11760
tcataattct tatgaaagct ttatgtttcc tggaggcagt ggcatgcaat gcatgacagc 11820
aacttgatca caccagctga ggtagatacg gtaacaaggt tcttaaatct gttcaccaaa 11880
tcattggaga acacacatac acattcttgc cagtcttggt tagagaaatt tcatgacaaa 11940
atgccaaagc tgtcttgact cttcactttt ggccatgagt cgtgacttag tttggtttaa 12000
tggaccggtt ctcctagctt gttctactca aaactgttgt tgatgcgaat aagttgtgat 12060
ggttgatctc tggattttgt tttgctctca atagtggacg agattagata gcctgcaggc 12120
ccgggggcgc gccctaatta gctaacggcc aggatcgccg cgtgagcctt tagcaactag 12180
ctagattaat taacgcaatc tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca 12240
atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca caaaatcacc 12300
actcgataca ggcagcccat cagaattaat tctcatgttt gacagcttat catcgactgc 12360
acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat ggctgtgcag 12420
gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg gataatgttt 12480
tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt gacaattaat 12540
catccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacaga 12600
ccatgaggga agcgttgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta gttggcgtca 12660
tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg 12720
gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg 12780
aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga 12840
gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc 12900
gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag 12960
gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca aaagcaagag 13020
aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac 13080
aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg cccgactggg 13140
ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg 13200
gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt 13260
atcagcccgt catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat cgcttggcct 13320
cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc accaaagtag 13380
tcggcaaata aagctctagt ggatctccgt acccggggat ctggctcgcg gcggacgcac 13440
gacgccgggg cgtgaccata ggcgatctcc taaatcaata gtagctgtaa cctcgaagcg 13500
tttcacttgt aacaacgatt gagaattttt gtcataaaat tgaaatactt ggttcgcatt 13560
tttgtcatcc gcggtcagcc gcaattctga cgaactgccg atttagctgg agatgattgt 13620
acatccttca cgtgaaaatt tctcaagcgc tgtgaacaag ggttcagatt ttagattgaa 13680
aggtgagccg ttgaaacacg ttcttcttgt cgatgacgac gtcgctatgc ggcatcttat 13740
tattgaatac cttacgatcc acgccttcaa agtgaccgcg gtagccgaca gcacccagtt 13800
cacaagagta ctctcttccg cgacggtcga tgtcgtggtt gttgatctag atttaggtcg 13860
tgaagatggg ctcgagatcg ttcgtaatct ggcggcaaag tctgatattc caatcataat 13920
tatcagtggc gaccgccttg aggaaacgga taaagttgtt gcactcgagc taggagcaag 13980
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ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg ttctatcgcg 14220
cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca ggagtataga 14280
tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc ctcaactgat 14340
aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt cgcacggggg 14400
gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag cggtcgcaaa 14460
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 14520
gcggcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 14580
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 14640
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 14700
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 14760
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 14820
tccgcagggc cggcgggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 14880
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 14940
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 15000
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 15060
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 15120
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 15180
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 15240
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 15300
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 15360
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cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 15540
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggactct ttcctgtgga tagcacgtac 15600
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 15660
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 15720
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catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata ccatattttt 16320
gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat aggatggcaa 16380
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attgggcgct gttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 16620
cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 16680
gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 16740
ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 16800
agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 16860
tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 16920
ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 16980
gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 17040
ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 17100
gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 17160
aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg 17220
aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 17280
ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 17340
gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 17400
gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt gatccggaat 17460
ta 17462
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Opaque2 gRNA target sequence
<400> 172
ctgtatctcg agcgtctggc tga 23
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Waxy1 gRNA target sequence
<400> 173
gggaaagacc gaggagaaga tct 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Yellow Endosperm1 gRNA target sequence
<400> 174
ctatcttatc ctaaagatgg tgg 23
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E3 ubiquitin ligase2 gRNA target sequence
<400> 175
ggagggaaaa ggtgtctgag gc 22
<210> 176
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> putatitive ubiquitin-protein ligase gRNA target sequence
<400> 176
ggaaggaaaa ggtatctgaa gg 22
<210> 177
<211> 19587
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 24288
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<220>
<221> Intron
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<220>
<221> gene
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<220>
<221> terminator
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<220>
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<221> promoter
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<223> prVirG-02
<220>
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<220>
<221> rep_origin
<222> (18769)..(19575)
<223> oCOLE-06
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attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactggcact agcctaacgg tgttgactaa ctaggccgct 180
tccctaatta gctaaattta aatctggcag acaaagtggc agacatactg tcccacaaat 240
gaagatggaa tctgtaaaag aaaacgcgtg aaataatgcg tctgacaaag gttaggtcgg 300
ctgcctttaa tcaataccaa agtggtccct accacgatgg aaaaactgtg cagtcggttt 360
ggctttttct gacgaacaaa taagattcgt ggccgacagg tgggggtcca ccatgtgaag 420
gcatcttcag actccaataa tggagcaatg acgtaagggc ttacgaaata agtaagggta 480
gtttgggaaa tgtccactca cccgtcagtc tataaatact tagcccctcc ctcattgtta 540
agggagcaaa atctcagaga gatagtccta gagagagaaa gagagcaagt agcctagaag 600
tagataactt cgtatagcat acattatacg aagttatatg gcctcctccg agaacgtcat 660
caccgagttc atgcgcttca aggtgcgcat ggagggcacc gtgaacggcc acgagttcga 720
gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggccac aacaccgtga agctgaaggt 780
gaccaagggc ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tccccccagt tccagtacgg 840
ctccaaggtg tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacaagaagc tgtccttccc 900
cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg cgaccgtgac 960
ccaggactcc tccctgcagg acggctgctt catctacaag gtgaagttca tcggcgtgaa 1020
cttcccctcc gacggccccg tgatgcagaa gaagacaatg ggctgggagg cctccaccga 1080
gcgcctgtac ccccgcgacg gcgtgctgaa gggcgagacc cacaaggccc tgaagctgaa 1140
ggacggcggc cactacctgg tggagttcaa gtccatctac atggccaaga agcccgtgca 1200
gctgcccggc tactactacg tggacgccaa gctggacatc acctcccaca acgaggacta 1260
caccatcgtg gagcagtacg agcgcaccga gggccgccac cacctgttcc tgagatctcg 1320
agctgatcca aaaaagaaga gaaaggtaga tccaaaaaag aagagaaagg tagatccaaa 1380
aaagaagaga aaggtaggct ccaccggatc tagataatcc ttcgcaagac ccttcctcta 1440
tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaaa tcaccagtct ctctctacaa 1500
atctatctct ctctattttc tccataataa tgtgtgagta gttcccagat aagggaatta 1560
gggttcttat agggtttcgc tcacgtgttg agcatataag aaacccttag tatgtatttg 1620
tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa tccagtacta 1680
aaatccacct aggctatagt attttaaaat tgcattaaca aacatgtcct aattggtact 1740
cctgagatac tataccctcc tgttttaaaa tagttggcat tatcgaatta tcattttact 1800
ttttaatgtt ttctcttctt ttaatatatt ttatgaattt taatgtattt taaaatgtta 1860
tgcagttcgc tctggacttt tctgctgcgc ctacacttgg gtgtactggg cctaaattca 1920
gcctgaccga ccgcctgcat tgaataatgg atgagcaccg gtaaaatccg cgtacccaac 1980
tttcgagaag aaccgagacg tggcgggccg ggccaccgac gcacggcacc agcgactgca 2040
cacgtcccgc cggcgtacgt gtacgtgctg ttccctcact ggccgcccaa tccactcatg 2100
catgcccacg tacacccctg ccgtggcgcg cccagatcct aatcctttcg ccgttctgca 2160
cttctgctgc ctataaatgg cggcatcgac cgtcacctgc ttcaccaccg gcgagccaca 2220
tcgagaacac gatcgagcac acaagcacga agactcgttt aggagaaacc acaaaccacc 2280
aagccgtgca agcatctgat cagcgatggc caatcttctt actgttcacc agaatttgcc 2340
agctctgcct gtcgacgcca cttcggacga ggttcgcaag aatctcatgg acatgttccg 2400
cgacaggcag gccttcagcg agcacacctg gaagatgctg ctgtcggtgt gcaggtcctg 2460
ggctgcgtgg tgcaagctga ataataggaa gtggttcccc gccgagccgg aggacgtgcg 2520
cgactacctc ctgtacctgc aggctcgcgg cctcgccgtc aagacgatcc agcagcactt 2580
gggccagctg aacatgctgc acaggcgcag cggcctgccg aggccaagcg acagcaacgc 2640
cgtgtccttg gtcatgcgca ggattcgcaa ggagaacgtg gacgcgggcg agcgcgccaa 2700
gcaggccctg gccttcgagc gcaccgactt cgaccaggtc aggagcctga tggagaacag 2760
cgacaggtgc caggacatca ggaacctggc cttcctcggc atcgcgtaca atacactcct 2820
gaggatcgcg gagatcgccc gcatcagggt caaggacatc tcacgcacgg acggtggcag 2880
gatgctgata catatcggca ggacgaagac cctcgtgagc acggcgggcg tggagaaggc 2940
gctctccctg ggcgtgacga agctggtcga gcggtggatc tccgtgagcg gcgtggcgga 3000
cgacccgaat aattacctct tctgccgcgt gaggaagaac ggcgtggcgg ccccatcggc 3060
caccagccag ctgtcgacca gggctctgga gggcatcttc gaggcgaccc acaggctgat 3120
ctacggcgct aaggacgact cgggccagcg ctacctcgct tggtcgggcc actcggccag 3180
ggtgggcgcg gcccgcgaca tggccagggc gggcgtctcc atcccggaga tcatgcaggc 3240
tggcggctgg acgaacgtga acatcgtcat gaactacatt aggaatctgg actcggagac 3300
tggggcgatg gttcggctgc tggaggacgg cgattaattc gaagacttgt ccatcttctg 3360
gattggccaa cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca cacatagtga catgctaatc 3420
actataatgt gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt gctagttatc tgaataaaag 3480
agaaagagat catccatatt tcttatccta aatgaatgtc acgtgtcttt ataattcttt 3540
gatgaaccag atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat ataaatatta atcatatata 3600
attaatatca attgggttag caaaacaaat ctagtctagg tgtgttttgc gaatgcggcc 3660
tcgagaccgg tacctttctg gagtttaatg agctaagcac atacgtcaga aaccattatt 3720
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tccactgacg ttccataaat tcccctcggt atccaattag agtctcatat tcactctcaa 3840
tccaaataat ctgcaccgga tctgatcaaa aatggaggcg ctgagcgggc gggtaggcgt 3900
caagtgcggg cggtggaacc ctacggcgga gcaggtgaag gtcctgacgg agctgttccg 3960
cgcggggctg cgcacgccca gcacggagca gatccagcgc atctccaccc acctcagcgc 4020
cttcggcaag gtggagagca agaacgtctt ctactggttc cagaaccaca aggcccgcga 4080
gcgccaccac cacaagaagc gccgccgcgg cgcgtcctcc cccgacagtg gcagcggctc 4140
cggcagcggc agcaacgagg aagacggcgg ccgtgctgct gccgcctcgc acgacgccga 4200
ggccgacgtc gacctcgtgc tgcagccgcc agagagcaag cgggaggcca gaagctacgc 4260
ccaccatcat caccggctgg ccgtgacatg ctacgtcagg gacgtggtgg agcagcagga 4320
ggccacgtgg gagcggccga cgcgcgaggt ggagacgctg gagctgttcc ctctcaagtc 4380
gtacgtggac ctggaggctg cggagaaggt ccggtatgtc aggggcagcg ccgccagcga 4440
gcagtgcagg gagttctcct tcttcgacgt ctccggcggc cgcgatccgc cacttgagct 4500
gaggctctgc agcttcggtc cctactaaga attctaagat cgttcaaaca tttggcaata 4560
aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt 4620
gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt 4680
ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg 4740
cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc ggtacctacg 4800
tacggacccc tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt 4860
gcatgtctaa gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca 4920
gtttatctat ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta 4980
ctacaataat atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag 5040
gacaattgag tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt 5100
ctcctttttt tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat 5160
ccatttaggg tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta 5220
ttctatttta gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata 5280
atttagatat aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga 5340
aattaaaaaa actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa 5400
cgccgccgac gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag 5460
cgaagcagac ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc 5520
caccgttgga cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg 5580
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ccaaatccac ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc 5820
ctctctacct tctctagatc ggcgttccgg tccatagtta gggcccggta gttctacttc 5880
tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgttagc gttcgtacac 5940
ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg 6000
gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt 6060
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tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg 6180
cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt 6240
ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa 6300
tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg 6360
ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag 6420
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gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata 6540
ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta 6600
ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta 6660
ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag 6720
ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg 6780
ttgtttggtg ttacttctgc agggatctaa ctagttaaaa tggctaataa ttggcttggt 6840
ttctctcttt caccatacga gcagaatcat catcggaagg acgtttactc atccaccact 6900
acgaccgtgg tcgacgtggc gggcgagtac tgctacgacc cgacggcggc ctcggacgag 6960
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agggacaaca actcccacag cagggactgg gacatcaacg gctgcgcctg caacaacatc 7080
cataacgacg agcaggacgg cccgaagctc gagaacttcc tgggccgcac cacgaccatc 7140
tacaatacta acgagaacgt gggcgacggc agcggcagcg ggtgctacgg tggtggcgac 7200
ggcagcggcg gctccctcgg cctgagcatg atcaagacgt ggctgcgcaa ccagcccgtg 7260
gacaacgtcg acaaccagga gaacggcaac gcggccaagg gcctctccct gagcatgaac 7320
tccagcacct cctgcgacaa caacaacgat tccaacaaca acgtggtcgc ccagggcaag 7380
acgatcgacg actccgtgga ggcgaccccg aagaagacga tcgagtcctt cggccagcgc 7440
acttctatct acaggggcgt cacccgccac aggtggaccg gccgctacga ggcgcacctc 7500
tgggataaca gctgcaagag ggagggccag acccgcaagg gcaggcaggt gtacctgggc 7560
ggctacgaca aggaggagaa ggcggccagg gcttacgacc tcgcggccct gaagtactgg 7620
ggcacgacca cgaccacgaa cttcccgatg tccgagtacg agaaggaggt ggaggagatg 7680
aagcacatga cccgccagga gtatgtggct agcctcagga ggaagtccag cggcttctcc 7740
aggggcgcga gcatctaccg cggcgtgacg aggcaccacc agcacggcag gtggcaggct 7800
cgcatcggca gggtcgcggg caacaaggac ctctacctgg gcaccttcgg cacgcaggag 7860
gaggctgccg aggcttacga catcgctgcg atcaagttcc gcggcctcac cgcggtgacg 7920
aacttcgaca tgaacaggta caacgtcaag gccatcctcg agagccccag cctgccaatc 7980
ggctccgctg ccaagaggct gaaggaggcc aacaggccgg tgccctccat gatgatgatc 8040
agcaacaacg tctccgagtc ggagaactcg gcttcgggct ggcagaacgc ggccgtgcag 8100
caccaccagg gcgtcgacct ctccctcctc caccagcacc aggagaggta caacggctac 8160
tactacaacg gcggcaacct gtccagcgag tcggctaggg cctgcttcaa gcaggaggac 8220
gaccagcacc acttcctctc caatacacag agcctgatga cgaacatcga ccaccagtcc 8280
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ggcttcgcgg ccccagtcaa ctgcgacgcc tacgccgcga gcgagttcga ctacaacgcc 8400
cgcaaccact actacttcgc gcagcagcag cagacccagc agtccccggg cggcgacttc 8460
ccggctgcga tgacgaacaa cgtgggcagc aacatgtact accacggcga gggcggcggc 8520
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ttaagctgcc gatgtgcctg cgtcgtctgg tgccctctct ccatatggag gttgtcaaag 8640
tatctgctgt tcgtgtcatg agtcgtgtca gtgttggttt aataatggac cggttgtgtt 8700
gtgtgtgcgt actacccaga actatgacaa atcatgaata agtttgatgt ttgaaattaa 8760
agcctgtgct cattatgttc tgtctttcag ttgtctccta atatttgcct ccaggtactg 8820
gctatctacc gtttcttact taggaggtgt ttgaatgcac taaaactaat agttagtggc 8880
taaaattagt taaaacatcc aaacaccata gctaatagtt gaactattag ctatttttgg 8940
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gccaactaac aattagtttc agtgcattca aacaccccct taatgttaac gtggttctat 9060
ctaccgtctc ctaatatatg gttgattgtt cggtttgttg ctatgctatt gggttctgat 9120
tgctgctagt tcttgctgaa tccagaagtt ctcgtagtat agctcagatt catattattt 9180
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tttcatgaca aaatgccaaa gctgtcttga ctcttcactt ttggccatga gtcgtgactt 9480
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tagctacgta tttataactt cgtatagcat acattatacg aagttattaa accatggccc 9660
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actacttcaa gcaggccttc cccgacggca tgtcctacga gagaaccttc acctacgagg 9960
acggcggcgt ggccaccgcc agctgggaga tcagcctgaa gggcaactgc ttcgagcaca 10020
agtccacctt ccacggcgtg aacttccccg ccgacggccc cgtgatggcc aagaagacca 10080
ccggctggga cccctccttc gagaagatga ccgtgtgcga cggcatcttg aagggcgacg 10140
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acaagaccaa gaagcccgtg accatgcccc ccaaccacgt ggtggagcac cgcatcgcca 10260
gaaccgacct ggacaagggc ggcaacagcg tgcagctgac cgagcacgcc gtggcccaca 10320
tcacctccgt ggtgcccttc tgattatata gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 10380
ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 10440
gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 10500
attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 10560
taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggaccct agcttgcatg 10620
cctgcagccc atccctcagc cgcctttcac tatctttttt gcccgagtca ttgtcatgtg 10680
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atacataatc atatgcatac aaatatttca ttacacttta tagaaatggt cagtaataaa 10860
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ttcaatattt aaggatcgtc aacggtgtgc agttactaaa ttctggtttg taggaactat 10980
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accctcaaat cttttttcca tctacatcca atttatcatg tcaaagaaat ggtctacata 11340
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cgccgcgtga gcctttagca actagctaga ttaattaacg caatctgtta ttaagttgtc 14340
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cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg 15360
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cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac 15480
gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct ctagtggatc tccgtacccg 15540
gggatctggc tcgcggcgga cgcacgacgc cggggcgtga ccataggcga tctcctaaat 15600
caatagtagc tgtaacctcg aagcgtttca cttgtaacaa cgattgagaa tttttgtcat 15660
aaaattgaaa tacttggttc gcatttttgt catccgcggt cagccgcaat tctgacgaac 15720
tgccgattta gctggagatg attgtacatc cttcacgtga aaatttctca agcgctgtga 15780
acaagggttc agattttaga ttgaaaggtg agccgttgaa acacgttctt cttgtcgatg 15840
acgacgtcgc tatgcggcat cttattattg aataccttac gatccacgcc ttcaaagtga 15900
ccgcggtagc cgacagcacc cagttcacaa gagtactctc ttccgcgacg gtcgatgtcg 15960
tggttgttga tctagattta ggtcgtgaag atgggctcga gatcgttcgt aatctggcgg 16020
caaagtctga tattccaatc ataattatca gtggcgaccg ccttgaggaa acggataaag 16080
ttgttgcact cgagctagga gcaagtgatt ttatcgctaa gccgttcagt atcagagagt 16140
ttctagcacg cattcgggtt gccttgcgcg tgcgccccaa cgttgtccgc tccaaagacc 16200
gacggtcttt ttgttttact gactggacac ttaatctcag gcaacgtcgc ttgatgtccg 16260
aagctggcgg tgaggtgaaa cttacggcag gtgagttcaa tcttctcctc gcgtttttag 16320
agaaaccccg cgacgttcta tcgcgcgagc aacttctcat tgccagtcga gtacgcgacg 16380
aggaggttta tgacaggagt atagatgttc tcattttgag gctgcgccgc aaacttgagg 16440
cagatccgtc aagccctcaa ctgataaaaa cagcaagagg tgccggttat ttctttgacg 16500
cggacgtgca ggtttcgcac ggggggacga tggcagcctg agccaattcc cagatccccg 16560
aggaatcggc gtgagcggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg 16620
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caagctgatc gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc 17580
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ctaatgtacg gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg 17700
tctctttcct gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa 17760
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agccgcgccg tcgccactcg accgccggcg ctgaggtctg cctcgtgaag aaggtgttgc 18120
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gatgagagct ttgttgtagg tggaccagtt ggtgattttg aacttttgct ttgccacgga 18240
acggtctgcg ttgtcgggaa gatgcgtgat ctgatccttc aactcagcaa aagttcgatt 18300
tattcaacaa agccgccgtc ccgtcaagtc agcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa 18360
ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata 18420
tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca 18480
ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca 18540
acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca 18600
ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagct ctgcattaat gaatcggcca 18660
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gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 18840
ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 18900
cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 18960
ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 19020
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ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 19200
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tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac 19320
agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 19380
ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 19440
tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 19500
tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 19560
cacctagatc cttttgatcc ggaatta 19587
<210> 178
<211> 657
<212> DNA
<213> Sorghum bicolor
<400> 178
atggaggcgc tgagcgggcg ggtaggcgtc aagtgcgggc ggtggaaccc tacggcggag 60
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cgtgctgctg ccgcctcgca cgacgccgag gccgacgtcg acctcgtgct gcagccgcca 360
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cggtatgtca ggggcagcgc cgccagcgag cagtgcaggg agttctcctt cttcgacgtc 600
tccggcggcc gcgatccgcc acttgagctg aggctctgca gcttcggtcc ctactaa 657
<210> 179
<211> 1740
<212> DNA
<213> Brassica napus
<400> 179
atggctaata attggcttgg tttctctctt tcaccatacg agcagaatca tcatcggaag 60
gacgtttact catccaccac tacgaccgtg gtcgacgtgg cgggcgagta ctgctacgac 120
ccgacggcgg cctcggacga gtccagcgcg atccagacgt ccttccccag cccattcggc 180
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ggctgcgcct gcaacaacat ccataacgac gagcaggacg gcccgaagct cgagaacttc 300
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gggtgctacg gtggtggcga cggcagcggc ggctccctcg gcctgagcat gatcaagacg 420
tggctgcgca accagcccgt ggacaacgtc gacaaccagg agaacggcaa cgcggccaag 480
ggcctctccc tgagcatgaa ctccagcacc tcctgcgaca acaacaacga ttccaacaac 540
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atcgagtcct tcggccagcg cacttctatc tacaggggcg tcacccgcca caggtggacc 660
ggccgctacg aggcgcacct ctgggataac agctgcaaga gggagggcca gacccgcaag 720
ggcaggcagg tgtacctggg cggctacgac aaggaggaga aggcggccag ggcttacgac 780
ctcgcggccc tgaagtactg gggcacgacc acgaccacga acttcccgat gtccgagtac 840
gagaaggagg tggaggagat gaagcacatg acccgccagg agtatgtggc tagcctcagg 900
aggaagtcca gcggcttctc caggggcgcg agcatctacc gcggcgtgac gaggcaccac 960
cagcacggca ggtggcaggc tcgcatcggc agggtcgcgg gcaacaagga cctctacctg 1020
ggcaccttcg gcacgcagga ggaggctgcc gaggcttacg acatcgctgc gatcaagttc 1080
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gagagcccca gcctgccaat cggctccgct gccaagaggc tgaaggaggc caacaggccg 1200
gtgccctcca tgatgatgat cagcaacaac gtctccgagt cggagaactc ggcttcgggc 1260
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caggagaggt acaacggcta ctactacaac ggcggcaacc tgtccagcga gtcggctagg 1380
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taccacggcg agggcggcgg cgaggttgct ccgactttca ctgtttggaa cgataattaa 1740
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<221> Intron
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<221> rep_origin
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attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt 60
taaatatccg attattctaa taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc 120
tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga 180
attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg 240
aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc 300
gcgccgaatt cgagctcagg gaccccggac cctaattagc taaggtacct gcagtgcagc 360
gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa 420
ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata 480
tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt 540
agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa 600
caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag 660
cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa 720
tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt 780
aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata 840
aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac 900
atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg 960
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cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg cggtcgttct agatcggagt 1740
agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca 1800
tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat 1860
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gcaaggtgga gagcaagaac gtcttctact ggttccagaa ccacaaggcc cgcgagcgcc 2580
accaccacaa gaagcgccgc cgcgtcgcct cctcctcctc cgacaacagc agcgccagca 2640
acaacaacga cgaagcagca gatcacggcc gcagtagtgc ccgcgaggac ctcctgctgc 2700
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taagtttgat gtttgaaatt aaagcctgtg ctcattatgt tctgtctttc agttgtctcc 3240
taatatttgc ctccaggtac tggctatcta ccgtttctta cttaggaggt gtttgaatgc 3300
actaaaacta atagttagtg gctaaaatta gttaaaacat ccaaacacca tagctaatag 3360
ttgaactatt agctattttt ggaaaattag ttaatagtga ggtagttatt tgttagctag 3420
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tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg gcaggcggcc 4860
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gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt 5700
caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata 5760
gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg 5820
ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga 5880
gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg 5940
gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt 6000
tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc 6060
agggatcccg atggaactct ccctcctccg cccgaccacc cagtccctcc tcccgtcctt 6120
ctccaagccg aacctccgcc tcaacgtgta caagccgctc cgcctccgct gctccgtggc 6180
cggcggcccg accgtgggct cctccaagat cgagggcggc ggcggcacca ccatcaccac 6240
cgactgcgtg atcgtgggcg gcggcatctc cggcctctgc atcgcccagg ccctcgccac 6300
caagcacccg gacgccgccc cgaacctcat cgtgaccgag gccaaggacc gcgtgggcgg 6360
caacatcatc acccgcgagg agaacggctt cctctgggag gagggcccga actccttcca 6420
gccgtccgac ccgatgctca ccatggtggt ggactccggc ctcaaggacg acctcgtgct 6480
cggcgacccg accgccccgc gcttcgtgct ctggaacggc aagctccgcc cggtgccgtc 6540
caagctcacc gacctcccgt tcttcgacct catgtccatc ggcggcaaga tccgcgccgg 6600
cttcggcgcc ctcggcatcc gcccgtcccc gccgggccgc gaggagtccg tggaggagtt 6660
cgtgcgccgc aacctcggcg acgaggtgtt cgagcgcctc atcgagccgt tctgctccgg 6720
cgtgtacgcc ggcgacccgt ccaagctctc catgaaggcc gccttcggca aggtgtggaa 6780
gctcgagcag aacggcggct ccatcatcgg cggcaccttc aaggccatcc aggagcgcaa 6840
gaacgccccg aaggccgagc gcgacccgcg cctcccgaag ccgcagggcc agaccgtggg 6900
ctccttccgc aagggcctcc gcatgctccc ggaggccatc tccgcccgcc tcggctccaa 6960
ggtgaagctc tcctggaagc tcctcggcat caccaagctc gagtccggcg gctacaacct 7020
cacctacgag accccggacg gcctcgtgtc cgtgcagtcc aagtccgtgg tgatgaccgt 7080
gccgtcccac gtggcctccg gcctcctccg cccgctctcc gagtccgccg ccaacgccct 7140
ctccaagctc tactacccgc cggtggccgc cgtgtccatc tcctacccga aggaggccat 7200
ccgcaccgag tgcctcatcg acggcgaact caagggcttc ggccagctcc acccgcgcac 7260
ccagggcgtg gagaccctcg gcaccatcta ctcctcctcc ctcttcccga accgcgcccc 7320
gccgggccgc atcctcctcc tcaacatgat cggcggctcc accaacaccg gcatcctctc 7380
caagtccgag ggcgaactcg tggaggccgt ggaccgcgac ctccgcaaga tgctcatcaa 7440
gccgaactcc accgacccgc tcaagctcgg cgtgcgcgtg tggccgcagg ccatcccgca 7500
gttcctcgtg ggccacttcg acatcctcga caccgccaag tcctccctca cctcctccgg 7560
ctacgagggc ctcttcctcg gcggcaacta cgtggccggc gtggccctcg gccgctgcgt 7620
ggagggcgcc tacgagaccg ccatcgaggt gaacaacttc atgtcccgct acgcctacaa 7680
gtaagcagag ctcgatccgt cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 7740
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 7800
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 7860
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 7920
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctgtagccc tgcaggaaat 7980
ttaccggtgc ccgggcggcc agcatggccg tatccgcaat gtgttattaa gttgtctaag 8040
cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg 8100
gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca tcagaattaa ttctcatgtt 8160
tgacagctta tcatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga 8220
agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca 8280
ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga 8340
aatgagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 8400
caatttcaca caggaaacag accatgaggg aagcgttgat cgccgaagta tcgactcaac 8460
tatcagaggt agttggcgtc atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt 8520
tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta 8580
cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa 8640
cttcggcttc ccctggagag agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc 8700
acgacgacat cattccgtgg cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc 8760
agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta 8820
tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac 8880
tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat 8940
ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca 9000
tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa 9060
tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg tcatacttga agctaggcag gcttatcttg 9120
gacaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtt cactacgtga 9180
aaggcgagat caccaaagta gtcggcaaat aaagctctag tggatctccg tacccgggga 9240
tctggctcgc ggcggacgca cgacgccggg gcgagaccat aggcgatctc ctaaatcaat 9300
agtagctgta acctcgaagc gtttcacttg taacaacgat tgagaatttt tgtcataaaa 9360
ttgaaatact tggttcgcat ttttgtcatc cgcggtcagc cgcaattctg acgaactgcc 9420
catttagctg gagatgattg tacatccttc acgtgaaaat ttctcaagcg ctgtgaacaa 9480
gggttcagat tttagattga aaggtgagcc gttgaaacac gttcttcttg tcgatgacga 9540
cgtcgctatg cggcatctta ttattgaata ccttacgatc cacgccttca aagtgaccgc 9600
ggtagccgac agcacccagt tcacaagagt actctcttcc gcgacggtcg atgtcgtggt 9660
tgttgatcta gatttaggtc gtgaagatgg gctcgagatc gttcgtaatc tggcggcaaa 9720
gtctgatatt ccaatcataa ttatcagtgg cgaccgcctt gaggagacgg ataaagttgt 9780
tgcactcgag ctaggagcaa gtgattttat cgctaagccg ttcagtatca gagagtttct 9840
agcacgcatt cgggttgcct tgcgcgtgcg ccccaacgtt gtccgctcca aagaccgacg 9900
gtctttttgt tttactgact ggacacttaa tctcaggcaa cgtcgcttga tgtccgaagc 9960
tggcggtgag gtgaaactta cggcaggtga gttcaatctt ctcctcgcgt ttttagagaa 10020
accccgcgac gttctatcgc gcgagcaact tctcattgcc agtcgagtac gcgacgagga 10080
ggtttatgac aggagtatag atgttctcat tttgaggctg cgccgcaaac ttgaggcaga 10140
tccgtcaagc cctcaactga taaaaacagc aagaggtgcc ggttatttct ttgacgcgga 10200
cgtgcaggtt tcgcacgggg ggacgatggc agcctgagcc aattcccaga tccccgagga 10260
atcggcgtga gcggtcgcaa accatccggc ccggtacaaa tcggcgcggc gctgggtgat 10320
gacctggtgg agaagttgaa ggccgcgcag gccgcccagc ggcaacgcat cgaggcagaa 10380
gcacgccccg gtgaatcgtg gcaagcggcc gctgatcgaa tccgcaaaga atcccggcaa 10440
ccgccggcag ccggtgcgcc gtcgattagg aagccgccca agggcgacga gcaaccagat 10500
tttttcgttc cgatgctcta tgacgtgggc acccgcgata gtcgcagcat catggacgtg 10560
gccgttttcc gtctgtcgaa gcgtgaccga cgagctggcg aggtgatccg ctacgagctt 10620
ccagacgggc acgtagaggt ttccgcaggg ccggccggca tggccagtgt gtgggattac 10680
gacctggtac tgatggcggt ttcccatcta accgaatcca tgaaccgata ccgggaaggg 10740
aagggagaca agcccggccg cgtgttccgt ccacacgttg cggacgtact caagttctgc 10800
cggcgagccg atggcggaaa gcagaaagac gacctggtag aaacctgcat tcggttaaac 10860
accacgcacg ttgccatgca gcgtacgaag aaggccaaga acggccgcct ggtgacggta 10920
tccgagggtg aagccttgat tagccgctac aagatcgtaa agagcgaaac cgggcggccg 10980
gagtacatcg agatcgagct agctgattgg atgtaccgcg agatcacaga aggcaagaac 11040
ccggacgtgc tgacggttca ccccgattac tttttgatcg atcccggcat cggccgtttt 11100
ctctaccgcc tggcacgccg cgccgcaggc aaggcagaag ccagatggtt gttcaagacg 11160
atctacgaac gcagtggcag cgccggagag ttcaagaagt tctgtttcac cgtgcgcaag 11220
ctgatcgggt caaatgacct gccggagtac gatttgaagg aggaggcggg gcaggctggc 11280
ccgatcctag tcatgcgcta ccgcaacctg atcgagggcg aagcatccgc cggttcctaa 11340
tgtacggagc agatgctagg gcaaattgcc ctagcagggg aaaaaggtcg aaaaggtctc 11400
tttcctgtgg atagcacgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggaacccg 11460
tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggtcac acatgtaagt gactgatata 11520
aaagagaaaa aaggcgattt ttccgcctaa aactctttaa aacttattaa aactcttaaa 11580
acccgcctgg cctgtgcata actgtctggc cagcgcacag ccgaagagct gcaaaaagcg 11640
cctacccttc ggtcgctgcg ctccctacgc cccgccgctt cgcgtcggcc tatcgcggcc 11700
gctggccgct caaaaatggc tggcctacgg ccaggcaatc taccagggcg cggacaagcc 11760
gcgccgtcgc cactcgaccg ccggcgctga ggtctgcctc gtgaagaagg tgttgctgac 11820
tcataccagg cctgaatcgc cccatcatcc agccagaaag tgagggagcc acggttgatg 11880
agagctttgt tgtaggtgga ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg 11940
tctgcgttgt cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt 12000
caacaaagcc gccgtcccgt caagtcagcg taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa 12060
ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag 12120
gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga 12180
ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat 12240
caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat 12300
gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagctctgc attaatgaat cggccaacgc 12360
gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg 12420
cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 12480
tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 12540
aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 12600
catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 12660
caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 12720
ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 12780
aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 12840
gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 12900
cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 12960
ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta 13020
tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 13080
tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 13140
cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 13200
tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc 13260
tagatccttt tgatccggaa tta 13283
<210> 181
<211> 636
<212> DNA
<213> Brachybacterium distachyon
<400> 181
atggaggtgc tgagcgggag ggtaggggtg aagtgcgggc ggtggaaccc gacggcggag 60
caggtgaagg tgctgacgga gcttttccgg gcggggctgc ggacgccgag cacggagcag 120
atccagcgga tctccaccca cctcggcgcc ttcggcaagg tggagagcaa gaacgtcttc 180
tactggttcc agaaccacaa ggcccgcgag cgccaccacc acaagaagcg ccgccgcgtc 240
gcctcctcct cctccgacaa cagcagcgcc agcaacaaca acgacgaagc agcagatcac 300
ggccgcagta gtgcccgcga ggacctcctg ctgcagcctc ccgagagcaa gcgcgaggcc 360
agaagctaca accaccaccg ccggccgatc atgacatatg taggctatgt gagggacgag 420
gtggagcagg aggtggtgat gtgggagcgg ccgacgaggg aggtggagac gctcgagctg 480
ttcccgctca aggcagccta cgacctcgag gcggcggaca ggctccggta cgtgaggggc 540
gccggcgagc agcagtgcag ggagatctcc ttcttcgacg tcgccaacgg acgggatccg 600
ccgctggagc tcaggctctg cagcttcgat atctag 636
<210> 182
<211> 1994
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 182
ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60
agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120
tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180
tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240
gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300
ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360
gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420
agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480
taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa 540
aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600
cgagtctaac ggacaccaac cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga 660
cggcacggca tctctgtcgc tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg 720
acttgctccg ctgtcggcat ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac 780
ggcaggcggc ctcctcctcc tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc 840
gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct 900
ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca 960
cccgtcggca cctccgcttc ctaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac 1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatagt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg 1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga 1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg 1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca 1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt 1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt 1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt 1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc 1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt 1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt 1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca 1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca 1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg 1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc 1860
ttgatatact tggatgatgg catatccagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct 1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg 1980
tgttacttct gcag 1994
<210> 183
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12949 forward primer
<400> 183
atcgatctgt cacttgattt taattagaa 29
<210> 184
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12950 reverse primer
<400> 184
gtgagcggct ttcctgtatc t 21
<210> 185
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12951 probe
<400> 185
tctggctgat tctctatt 18
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12703 forward primer
<400> 186
tgtagtccgt tccagcgaca 20
<210> 187
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12704 reverse primer
<400> 187
ggtttcaggt ttggggaaag a 21
<210> 188
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12705 probe
<400> 188
ccgtagatct tctcctc 17
<210> 189
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12958 forward primer
<400> 189
gctgactggt ctcaccatct cat 23
<210> 190
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12959 reverse primer
<400> 190
agtatgatgg ccatatattt gctatctta 29
<210> 191
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12960 probe
<400> 191
ctaaagatgg tggtggtg 18
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12952 forward primer
<400> 192
tgggacattt gggaaggaaa 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12953 reverse primer
<400> 193
gtctaagggc ctgctgacga 20
<210> 194
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12954 probe
<400> 194
ctgaaggaaa cctatctc 18
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12952 forward primer
<400> 195
tgggacattt gggaaggaaa 20
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12956 reverse primer
<400> 196
ctgactgcct gatgacgca 19
<210> 197
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FE12957 probe
<400> 197
ttggtatgtt tgcctcaga 19
Claims (45)
- 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL)의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 증가된 반수체 유도와 관련된 적어도 하나의 양적 형질 유전자좌(QTL)(HI-QTL)에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 옥수수 식물로서, 옥수수 식물이 정상 A("NA") 세포형을 갖는 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 옥수수 식물이 적어도 하나의 HI-QTL에서 HI 대립유전자에 대해 동형접합성인 옥수수 식물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 HI-QTL이 9번 염색체 상의 qhir8(HI-QTL qhir8)인 옥수수 식물.
- 제3항에 있어서, HI-QTL qhir8에서의 HI 대립유전자가 DUF679 도메인 막 단백질 7(DMP) 유전자의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 옥수수 식물이 증가된 형질전환 빈도와 관련된 적어도 하나의 QTL(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 옥수수 식물.
- 제5항에 있어서, 옥수수 식물이 적어도 하나의 TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 동형접합성인 옥수수 식물.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 적어도 하나의 TF-QTL이 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)인 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 옥수수 식물이 선택 가능한 마커를 포함하는 옥수수 식물.
- 제8항에 있어서, 옥수수 식물이 선택 가능한 마커에 대해 동형접합성인 옥수수 식물.
- 제9항에 있어서, 선택 가능한 마커가 GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, CI, NPTII, HPT, ACC3, AADA, 고 오일 함량, R-나바조(R-navajo, R-nj), R1-배반(R1-SCM2) 및/또는 안토시아닌 안료 중 임의의 하나인 옥수수 식물.
- 제10항에 있어서, 옥수수 식물이 10번 염색체 상의 R1 유전자좌에서 R1-배반(R1-SCM2) 대립유전자에 대해 동형접합성인 옥수수 식물.
- 제11항에 있어서, 옥수수 식물이 B73v5 기준 게놈 내의 위치 8 Mb와 10 Mb 사이의 9번 염색체 상에 위치한 색상 저해인자 유전자좌에 상응하는 옥수수 식물에서의 색상 저해인자 유전자좌에서, 야생형 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 옥수수 식물이 DNA 변형 효소 및 선택적으로 적어도 하나의 가이드 핵산을 발현할 수 있는 옥수수 식물.
- 제13항에 있어서, DNA 변형 효소가 Cas9 뉴클레아제, Cas12a 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(MN), 아연-핑거 뉴클레아제, (ZFN), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), dCas9-Fokl, dCas12a-FokI, 키메라 Cas9-시티딘 데아미나제, 키메라 Cas9-아데닌 데아미나제, 키메라 FENl-FokI, MegaTAL, 닉카제 Cas9(nCas9), 키메라 dCas9 비-Fokl 뉴클레아제, dCas12a 비-Fokl 뉴클레아제, 키메라 Cas12a-시티딘 데아미나제 및 Cas12a-아데닌 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위-지정 뉴클레아제인 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 옥수수 식물이 논-스티프 스토크(Non-Stiff Stalk) 생식질, 스티프 스토크(Stiff Stalk) 생식질, 논-스티프 스토크 이오덴트(Non-Stiff Stalk Iodent) 생식질, 논-스티프 스토크(Non-Stiff Stalk) Mo17-유사 생식질, 열대(Tropical) 생식질 또는 아열대(Subtropical) 생식질 중 하나 이상을 포함하는 옥수수 식물.
- 제1항에 있어서, 옥수수 식물이 계통 스톡(Stock) 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222, SYN-INBE56, SYN-INBB23, SYN-INBF67, SYN-INBC34, SYN-INBD45, SYN-INBG78, SYN-INBH89, SYN-INBI90, SYN-INBJ13 및/또는 SYN-INBK14 중 임의의 것으로부터 유래되는 옥수수 식물.
- 증가된 형질전환 빈도와 관련된 적어도 하나의 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 옥수수 식물.
- 제17항에 있어서, 옥수수 식물이 적어도 하나의 TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 동형접합성인 옥수수 식물.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 적어도 하나의 TF-QTL이 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)인 옥수수 식물.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 옥수수 식물이 정상 A("NA") 세포형을 갖는 옥수수 식물.
- 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 생산하는 방법으로서,
a. 제1 옥수수 식물로부터의 화분을 제공하는 단계로서, 제1 옥수수 식물이 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL) 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, 형질전환 저항성(transformation recalcitrant)인 반수체 유도인자 식물 계통인 단계;
b. 제2 옥수수 식물을 제공하는 단계로서, 제2 옥수수 식물이 정상 A("NA") 세포질을 포함하고, 선택적으로, 제2 옥수수 식물이 증가된 형질전환 빈도와 관련된 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계;
c. 제2 옥수수 식물을 제1 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키고, 이로부터 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 수득하는 단계;
d. 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 자가생식시키고/시키거나 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 적어도 한 세대 동안 제1 옥수수 식물 또는 제2 옥수수 식물과 역교배하는 단계; 및
e. 단계 d의 교배로부터 자손을 선택하는 단계로서, 선택된 자손이 NA 세포형을 포함하고, MATL 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, 선택적으로, TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계를 포함하는 방법. - 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 생산하는 방법으로서,
a. 제1 옥수수 식물로부터의 화분을 제공하는 단계로서, 제1 옥수수 식물이 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL) 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, 형질전환 저항성인 반수체 유도인자 식물 계통인 단계;
b. 제2 옥수수 식물을 제공하는 단계로서, 제2 옥수수 식물이 증가된 형질전환 빈도와 관련된 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계;
c. 제2 옥수수 식물을 제1 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키고, 이로부터 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 수득하는 단계;
d. 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 자가생식시키고/시키거나 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 적어도 한 세대 동안 제1 옥수수 식물 또는 제2 옥수수 식물과 역교배하는 단계; 및
e. 단계 d의 교배로부터 자손을 선택하는 단계로서, 선택된 자손이 MATL 유전자의 기능 상실 돌연변이에 대해 동형접합성이고, 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성이고, TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계를 포함하는 방법. - 제21항 또는 제22항에 있어서, 제1 옥수수 식물이 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 선택된 자손이 제2 유전자좌에서 HI 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
- 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유전자좌가 증가된 반수체 유도와 관련된 QTL(HI-QTL)이며, HI-QTL이 9번 염색체 상에 위치한 qhir8(HI-QTL qhir8)인 방법.
- 제25항에 있어서, HI-QTL qhir8에서의 HI 대립유전자가 DUF679 도메인 막 단백질 7(DMP) 유전자의 기능 상실 돌연변이를 포함하는 방법.
- 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 생산하는 방법으로서,
a. 제1 옥수수 식물로부터의 화분을 제공하는 단계로서, 제1 옥수수 식물이 파타틴-유사 포스포리파제 A2α 유전자(MATL) 유전자의 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성이고, DUF679 도메인 막 단백질 7(DMP) 유전자의 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 단계;
b. 제2 옥수수 식물을 제공하는 단계로서, 제2 옥수수 식물이 정상 A("NA") 세포질을 포함하고, 선택적으로, 제2 옥수수 식물이 증가된 형질전환 빈도와 관련된 양적 형질 유전자좌(QTL)(TF-QTL)에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계;
c. 제2 옥수수 식물을 제1 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키고, 이로부터 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 수득하는 단계;
d. 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 자가생식시키고/시키거나 적어도 하나의 이배체 자손 식물을 적어도 한 세대 동안 제1 옥수수 식물 또는 제2 옥수수 식물과 역교배하는 단계;
e. 단계 d의 교배로부터 자손을 선택하는 단계로서, 선택된 자손이 NA 세포형을 포함하고, 선택적으로, TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 적어도 이형접합성인 단계; 및
f. 적어도 하나의 자손 식물을 편집하여, 야생형 MATL 유전자 및/또는 DMP 유전자에 기능 상실 돌연변이를 유발함으로써, 형질전환 가능한 반수체 유도인자 옥수수 식물을 수득하는 단계를 포함하는 방법. - 제21항, 제22항 또는 제27항에 있어서, 제2 옥수수 식물이 TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
- 제21항, 제22항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 선택된 자손이 TF-QTL에서 TF 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
- 제21항, 제22항, 제27항, 제28항 또는 제29항에 있어서, TF-QTL이 3번 염색체 상의 qCYTO-A_TF3.1(TF-QTL qCYTO-A_TF3.1)인 방법.
- 제21항, 제22항 또는 제27항에 있어서, 제1 옥수수 식물 및/또는 제2 옥수수 식물이 논-스티프 스토크 생식질, 스티프 스토크 생식질, 논-스티프 스토크 이오덴트 생식질, 논-스티프 스토크 Mo17-유사 생식질, 열대 생식질 또는 아열대 생식질 중 하나 이상을 포함하는 방법.
- 제21항, 제22항 또는 제27항에 있어서, 제1 옥수수 식물이 제2 옥수수 식물과 상이한 이형잡종 군(heterotic group)에 속하는 방법.
- 제21항, 제22항 또는 제27항에 있어서, 제1 옥수수 식물 및/또는 제2 옥수수 식물이 계통 스톡 6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222, SYN-INBE56, SYN-INBB23, SYN-INBF67, SYN-INBC34, SYN-INBD45, SYN-INBG78, SYN-INBH89, SYN-INBI90, SYN-INBJ13 및/또는 SYN-INBK14 중 임의의 것을 포함하는 방법.
- 제21항, 제22항 또는 제27항에 있어서, 제1 옥수수 식물이 선택 가능한 마커를 포함하는 방법.
- 제34항에 있어서, 제1 옥수수 식물이 선택 가능한 마커에 대해 동형접합성인 방법.
- 제35항에 있어서, 단계 e의 선택된 자손이 선택 가능한 마커에 대해 동형접합성인 방법.
- 제36항에 있어서, 선택 가능한 마커가 GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, CI, NPTII, HPT, ACC3, AADA, 고 오일 함량, R-나바조(R-nj), R1-배반(R1-SCM2) 및/또는 안토시아닌 안료 중 임의의 하나인 방법.
- 제37항에 있어서, 선택 가능한 마커가 10번 염색체 상의 R1 유전자좌에서의 R1-배반(R1-SCM2) 대립유전자인 방법.
- 제38항에 있어서, 단계 e의 선택된 자손이 B73v5 기준 게놈 내의 위치 8 Mb와 10 Mb 사이의 9번 염색체 상에 위치한 색상 저해인자 유전자좌에 상응하는 선택된 자손에서의 색상 저해인자 유전자좌에서, 야생형 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
- 형질전환된 옥수수 식물을 수득하는 방법으로서, 관심 서열을 인코딩하는 이종 DNA 분자를 제1항의 옥수수 식물로 형질전환시키는 단계를 포함하는 방법.
- 제40항에 있어서, 이종 DNA 분자를 옥수수 식물로 형질전환시키는 단계가 바이오리스틱 입자 충격(biolistic particle bombardment), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환, 세포-투과 펩티드(CPP)-매개된 형질전환 또는 글리콜 매개된 형질전환에 의해 행해지는 방법.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 하나 이상의 형태형성 인자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나가 베이비 붐(BABY BOOM, BBM), BBM-유사(BBM-like), 엠브리오메이커(EMBRYOMAKER, EMK), 아인테구멘타(AINTEGUMENTA, ANT), 아인테구멘타-유사(AINTEGUMENTA-LIKE, AIL), 플레쏘라(PLETHORA, PLT), 우쉘(WUSCHEL, WUS) 또는 WUS 호메오박스(WUS homeobox, Wox), GRF(성장 조절 인자), 슈트 메리스템리스(SHOOT MERISTEMLESS, STM), 아가모스-유사(AGAMOUS-Like, AGL), MYB115, MYB118, 체세포 배발생 수용체-유사 키나제(SERK), 체세포 배 관련 인자(SOMATIC EMBRYO RELATED FACTOR, SERF), 밑씨 발달 단백질(OVULE DEVELOPMENT PROTEIN, ODP) 및 국소화된 핵을 함유하는 AT-후크 모티프(AT-HOOK MOTIF CONTAINING NUCLEAR LOCALIZED, AHL)의 군으로부터 선택되는 방법.
- 제40항에 있어서, 이종 DNA 분자가 DNA 변형 효소 및 선택적으로 적어도 하나의 가이드 핵산을 인코딩하는 방법.
- 제43항에 있어서, DNA 변형 효소가 Cas9 뉴클레아제, Cas12a 뉴클레아제, 메가뉴클레아제(MN), 아연-핑거 뉴클레아제, (ZFN), 전사-활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), dCas9-Fokl, dCas12a-FokI, 키메라 Cas9-시티딘 데아미나제, 키메라 Cas9-아데닌 데아미나제, 키메라 FENl-FokI, MegaTAL, 닉카제 Cas9(nCas9), 키메라 dCas9 비-Fokl 뉴클레아제, dCas12a 비-Fokl 뉴클레아제, 키메라 Cas12a-시티딘 데아미나제 및 Cas12a-아데닌 데아미나제로 이루어진 군으로부터 선택되는 부위-지정 뉴클레아제인 방법.
- 식물 게놈 DNA를 편집하는 방법으로서,
a. 표적 식물을 제공하는 단계로서, 표적 식물이 편집될 식물 게놈 DNA를 포함하는 단계;
b. 표적 식물을 제1항의 옥수수 식물로부터의 화분으로 수분시키는 단계로서, 옥수수 식물이 DNA 변형 효소 및 선택적으로 적어도 하나의 가이드 핵산을 발현할 수 있는 단계; 및
c. 단계 c에 의해 생산된 적어도 하나의 반수체 자손을 선택하는 단계로서, 반수체 자손이 표적 식물의 게놈을 포함하고, 옥수수 식물의 게놈을 포함하지 않고, 반수체 자손의 게놈이 옥수수 식물에 의해 전달되는 DNA 변형 효소 및 선택적인 가이드 핵산에 의해 변형되는 단계를 포함하는 방법.
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