CN112553122B - 一株解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)F028，该菌株于2020年4月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.19590。该菌株制备的生物防治制剂对由核桃黄极毛杆菌、胡萝卜软腐欧氏菌、青枯劳尔氏菌引起的细菌病害，对由灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、链格孢菌属、镰刀菌属、疫霉菌属、围小丛壳菌、刺盘孢菌和白缰病菌引起的真菌病害具有广谱的抑菌作用。本发明为使用微生物代替化学合成杀菌剂、利用生物防治方法防治植物病害提供了新的资源，可作为生物农药进行开发利用；而且，本发明提供的一株解淀粉芽孢杆菌对番茄、烟草的植物生长有促进作用，应用前景广阔。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

由核桃黄极毛杆菌(Xanthomonas campestris)引起的核桃细菌性黑斑病，是世界上核桃生产区主要的地上部病害之一，该病导致落果，落果率可高达60％以上，造成严重经济损失。目前，任何核桃品种(无性系)对黑斑病都不具有完全免疫；由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的姜瘟病，主要危害根部及姜块，染病姜块初呈水渍状、黄褐色、内部逐渐软化腐烂，姜瘟病流行期长，危害严重。由胡萝卜软腐欧氏菌(Erwiniacarotovora)引起的西瓜细菌性软腐病，是瓜类蔬菜、水果常见的一种疾病，引起全株软腐，这些细菌性病害，给种植者造成严重经济损失。

此外，由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是露地、保护地作物常见且比较难防治的一种真菌性病害，侵染所致，花、果、叶、茎均可发病。危害作物多，危害程度大。该病不仅在植株生长期间严重发生，而且在采后的储藏、运输过程中还可继续造成严重。由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的花生立枯病，由链格孢菌属(AlternariaNees)引起的烟草赤星病、番茄早疫病，由镰刀菌属(Fusarium)引起的烟草根腐病、西瓜枯萎病、小麦赤霉病、蚕豆枯萎病，由疫霉菌属引起的烟草黑胫病，由围小丛壳菌(Glomerellacingulata(Stonem.)Spauld et Schrenk)引起的葡萄炭疽病，由刺盘孢菌(Colletotrichum capsici)引起的辣椒炭疽病，由白缰病菌(Beauveria bassiana)引起的蚕白缰病，这些真菌病害也是生产上常见的病害，危害较大，已成为果蔬、花卉产业发展的主要障碍之一。

在生产中，人们主要使用化学农药对以上病害进行防治，但是化学药剂的长期使用，容易使病原菌产生抗药性，防治效果不理想；而且化学药剂不但对环境有一定的污染，还会在块茎等植物体内残留，威胁到食品安全。生物防治具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优点，越来越多的受到人们关注。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，能产生抗逆性很强的芽孢，具有较好的定殖性，并且产生的代谢产物对多种植物病害具有拮抗性，是绿色农业生产技术中最具应用前景的生防菌。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用。该菌对由核桃黄极毛杆菌、胡萝卜软腐欧氏菌或青枯劳尔氏菌引起的细菌性病害，由灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、链格孢菌属、镰刀菌属、疫霉菌属、围小丛壳菌、刺盘孢菌或白缰病菌引起的真菌性病害具有较好的抑制作用，为使用微生物代替化学合成杀菌剂、利用生物防治方法防治植物病害提供了新的资源，可作为生物农药进行开发利用；而且，该菌对番茄、烟草的植物生长有促进作用。

本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌F028菌株。

本发明的另一目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌F028的培养方法。

本发明的另一目的在于提供包括解淀粉芽孢杆菌F028的生物防治制剂。

本发明的另一目的在于提供包括包括解淀粉芽孢杆菌F028的生物防治制剂对多种病原细菌和病原真菌的抑菌范围。

本发明的另一目的在于提供解淀粉芽孢杆菌F028在促进植物生长中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明筛选鉴定得到一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)F028，该菌株于2020年4月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.19590，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌的培养方法，将所述解淀粉芽孢杆菌在适宜其生长的培养基和培养条件下进行培养。优选的，所述适宜其生长的培养基为甘露醇0.7％，蛋白胨0.7％，氯化钙0.06％，玉米粉1.5％，黄豆粉1.5％；优选的，所述培养条件为：培养时间为72h，培养温度为27.5℃，培养转速120r/min，培养基的初始pH为6.5，培养基的接种量为2％～3％，培养基的装瓶量为20％。在优选的培养基和培养条件下，解淀粉芽孢杆菌F028能大量繁殖。培养基的接种量2％和3％时无显著差异。在上述优选的条件下，优化后相对于常规培养，菌体量分别提高了3.47～4.46倍，芽孢量分别提高3.55～4.55倍。此条件下生物量达1×10¹¹～5×10¹⁰cfu/mL，芽孢率大于85％。更优选的，培养基的接种量为2％，经济成本低。

本发明提供一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌F028。

优选的，所述生物防治制剂是由解淀粉芽孢杆菌F028的菌体、发酵上清液和/或其产生的挥发性物质制成。

本发明提供一种生物防治制剂的应用，所述生物防治制剂用于防治细菌病害和/或真菌病害。优选的，如上所述的生物防治制剂的应用，所述细菌病害包括：由核桃黄极毛杆菌、胡萝卜软腐欧氏菌或青枯劳尔氏菌引起的病害；所述真菌性病害包括：由灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、链格孢菌属、镰刀菌属、疫霉菌属、围小丛壳菌、刺盘孢菌或白缰病菌引起的病害。

本发明提供的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)挑取解淀粉芽孢杆菌F028的单菌落接种在装有10～30mL LB培养基的三角瓶中，在25～35℃温度下，120～200r/min振荡培养20～24h左右，培养至OD600值大于0.6，制成种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到发酵培养基中，25～35℃下恒温培养60～72h，pH6.0～7.0，芽孢率75～90％，生物量为10¹⁰～10¹¹cfu/mL，制备得到解淀粉芽孢杆菌F028发酵液；

(3)将步骤(2)培养的发酵液中添加负载剂，干燥得到解淀粉芽孢杆菌F028原粉；

(4)步骤(3)中得到的解淀粉芽孢杆菌F028原粉加入质量百分比为28～40％助剂制成可湿性粉剂，即为解淀粉芽孢杆菌F028。

优选的，如上所述的生物防治制剂的制备方法，所述步骤(2)中制备发酵培养基成分为按质量百分比计，玉米粉1.5％，黄豆粉1.5％，甘露醇0.7％，蛋白胨0.7％，氯化钙0.06％，蒸馏水1000mL，pH调至6.5。在此条件下，其生物量最大,芽孢率最高。

优选的，如上所述的生物防治制剂的制备方法，所述步骤(3)中的负载剂为白炭黑与硅藻土的混合物，所述白炭黑与硅藻土的质量比为3:7、4:6或者5:5。在此条件下，两者配比使用在悬浮性和湿润性方面好于单独使用，最佳配比为白炭黑与硅藻土质量比为3:7、4:6、5:5，吸附容量分别为1.8、2.0、2.2L/Kg。

优选的，如上所述的生物防治制剂的制备方法，所述步骤(4)中的助剂为亚甲基双萘磺酸钠和磺基丁二酸钠二辛酯的混合物，所述亚甲基双萘磺酸钠与磺基丁二酸钠二辛酯的质量比为1:9。在此条件下，其湿润时间最短，悬浮率最高。

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌F028的应用，所述解淀粉芽孢杆菌F028在促进植物生长中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明的解淀粉芽孢杆菌分离至番茄根际，具有生长速度快，产孢量高、作用广谱、稳定性好等特点，具有广谱拮抗植物病原活性。以该解淀粉芽孢杆菌为材料制成的可湿性粉剂具有经济、适用、高效、环保的特点，因此在防治灰霉病等植物病害方面具有良好的应用前景。对由核桃黄极毛杆菌、胡萝卜软腐欧氏菌或青枯劳尔氏菌引起的细菌性病害，由灰葡萄孢菌、立枯丝核菌、链格孢菌属、镰刀菌属、疫霉菌属、围小丛壳菌、刺盘孢菌或白缰病菌引起的真菌性病害具有高效防治效果。

2.本发明的实施例实验结果表明，尤其是对番茄灰霉病和核桃黑斑病防治效果更佳。对番茄灰霉病的抑菌性最高为89.05％；解淀粉芽孢杆菌F028发酵上清液稀释1000倍，对核桃黑斑病的相对抑菌率仍然高达80.00％。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌F028的菌落特征图；

图2为解淀粉芽孢杆菌F028的16srDNA***发育树；

图3为解淀粉芽孢杆菌F028的gyrB***发育树；

图4为解淀粉芽孢杆菌F028对部分真菌病害的拮抗性效果；

图5为解淀粉芽孢杆菌F028对部分细菌病害的拮抗性效果；

图6为解淀粉芽孢杆菌F028的不同成份对番茄灰霉病的拮抗性，其中，图中A、B分别为F028对番茄灰霉病的拮抗效果及菌落直径；C、D分别为F028所产挥发性物质对番茄灰霉病的拮抗效果及菌落直径；E、F分别为F028发酵上清液对番茄灰霉病的拮抗效果及菌落直径；

图7为菌株F028上清液最佳发酵时间筛选，其中，A为不同发酵时间F028上清液对核桃黑斑病病原菌抑制效果，B为不同发酵时间F028上清液抑菌圈直径量化；

图8为菌株F028上清液最佳发酵时间筛选，其中，A为不同发酵时间F028上清液对番茄灰霉病病原菌抑制效果，B为不同发酵时间F028上清液抑菌率；

图9为菌株F028发酵上清液对细菌拮抗性能，其中，A为不同稀释倍数F028发酵上清液对核桃黑斑病病原菌抑制效果，B为不同稀释倍数F028发酵上清液抑菌圈直径量化；

图10为菌株F028发酵上清液对真菌拮抗性能，其中，A为不同稀释倍数F028发酵上清液对番茄灰霉病病原菌抑制效果，B为不同稀释倍数F028发酵上清液抑菌率；

图11为菌株F028对烟草的促生作用效果；

图12为菌株F028对番茄的促生作用效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本发明中，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)F028或被简称为F028。

实施例1菌株F028的分离筛选

在山东省潍坊市番茄种植地，铲去表层土，取5-10cm深的土壤500g左右，放于灭菌的自封袋中，带回实验室。采用常规稀释平板法进行菌株分离，以烟草赤星病病原为指示菌，筛选拮抗菌株，结果得到1株拮抗性较强的菌株，命名为F028。

实施例2菌株F028的鉴定

1.形态学鉴定

将菌株接种在NA平板上，30℃恒温培养12-48h，观察菌落特征。挑取培养12h的菌株，进行革兰氏染色，挑取培养48h的菌株进行芽孢染色。结果表明，菌落初期无色透明，表面光滑、湿润、粘稠、边缘不整齐，后期为乳白色，表面有明显凸起、褶皱。菌体杆状，产芽孢，革兰氏阳性。如图1所示。

2.生理生化鉴定

参阅《伯杰氏细菌鉴定手册》和东秀珠、蔡妙英编著的《常见细菌***鉴定手册》对筛选出的菌株进行生理生化测定。结果见表1，结合形态学观察，初步将F028鉴定为芽孢杆菌属菌株。

表1F028生理生化反应特性鉴定

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

3.分子生物学鉴定

利用购自生物工程(上海)股份有限公司的细菌基因组提取试剂盒提取菌株F028的基因组DNA，采用通用引物进行16SrDNA基因序列和gyrB基因序列扩增。反应条件见表2。

表2基因序列扩增反应条件

将PCR扩增产物送至生物工程(上海)股份有限工程公司检测，得到拮抗菌F028的16S rDNA片段为1426bp，gyrB基因片段1143bp。

测序得到的16SrDNA基因序列具体见序列表1。

测序得到的gyrB基因序列具体见序列表2。

将16SrDNA、gyrB基因序列提交NCBI进行在线比对，F028与解淀粉芽孢杆菌相似度分别为100％和98.78％，利用MEGA 6.0软件构建***发育树，如图2、图3所示，F028均与解淀粉芽孢杆菌聚类一起。结合菌株的形态学特征、生理生化鉴定，确定菌株F028为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

实施例3解淀粉芽孢杆菌F028的培养

(1)培养基的选择

在基础培养基葡萄糖0.8％、玉米粉1.5％、黄豆粉1.5％、蒸馏水1000mL的基础上，采用单因素试验对碳源、氮源和无机盐进行优化筛选。

碳源，分别用蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、甘油、柠檬酸和糊精代替葡萄糖，筛选结果显示，以甘露醇为碳源的培养基培养的菌株生物量最高，菌体含量为1.1×10⁹CFU·mL^-1，芽孢含量为8.9×10⁸CFU·mL^-1。因此最终确定甘露醇为F028最适生长碳源。

氮源，向基础培养基中分别加入蛋白胨、胰蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、氯化铵和牛肉膏，筛选结果显示，以蛋白胨为氮源的培养基培养的菌株生物量最高，菌体含量为9.1×10⁸CFU·mL^-1，芽孢含量为8.1×10⁸CFU·mL^-1。因此最终确定蛋白胨为F028最适生长氮源。

无机盐，向基础培养基中分别加入硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸锰、氯化钠、氯化钙、氯化铁、碳酸钙、碳酸钠、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，优化结果表明，添加Ca²⁺显著提高了菌株生物量，菌体含量为1.44×10⁹CFU·mL^-1，芽孢含量为1.24×10⁹CFU·mL^-1。因此，氯化钙为F028最适生长无机盐。

在确定培养基中碳源、氮源和无机盐的种类之后，对培养基中甘露醇(质量百分数为0.6％、0.7％、0.8％、0.9％和1.0％)、蛋白胨(质量百分数为0.6％、0.7％、0.8％、0.9％和1.0％)、氯化钙(质量百分数为0.03％、0.04％、0.05％、0.06％和0.07％)不同含量进行了单因素筛选，最佳甘露醇含量为0.7％，最佳蛋白胨含量为0.7％，最佳氯化钙含量为0.04％。进一步正交优化，确定了拮抗菌F028的最佳培养基配方为甘露醇0.7％，蛋白胨0.7％，氯化钙0.06％，玉米粉1.5％，黄豆粉1.5％。

(2)培养条件的优化

优化后解淀粉芽孢杆菌F028最适培养条件为培养时间为72h，培养温度为27.5℃，培养转速120r/min，培养基的初始pH为6.5，培养基的接种量为2％～3％，培养基的装瓶量为20％。在此条件下，解淀粉芽孢杆菌F028能大量繁殖。培养基的接种量2％和3％时无显著差异，更优选的，培养基的接种量为2％，经济成本低。

实施例4解淀粉芽孢杆菌F028的抑菌广谱性

(1)病原菌活化

将真菌病原菌接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上进行活化，28℃恒温培养3～5d。制成φ＝5mm的菌饼待用；将细菌病原菌用LB发酵培养20h后待用。

(2)对峙培养

将上述真菌病原菌菌饼接于PDA平板中央，在其相等距离十字交叉线的四端接种FO28，对照只接种病原菌，每处理三次重复。28℃恒温培养4d左右，待对照长满平皿，观察测量菌落直径，如图4所示，计算抑菌率。

抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径*100

将培养好的细菌病原菌，按照2％的量加入到NA培养基中，制成平板。将F028点接在平板上，观察拮抗圈的大小。

结果显示，F028对不同植物的12种真菌病原均有拮抗性，如图图4所示；其中，对9种病原菌抑菌率在70％以上，对番茄灰霉病的抑菌率最高，抑菌率达89.05％，如表3所示；F028还能够对多种细菌病原有拮抗性，如图5、表4所示。因此，F028具有抑菌广谱性。

表3菌株F028对病原菌的抑制效果

表4拮抗菌F028拮抗病原细菌

注：“+”为阳性，“—”为阴性。

实施例5解淀粉芽孢杆菌F028菌株、上清液和挥发性物质的抑菌性

为了探究菌株F028不同拮抗成份的拮抗效果，以番茄灰霉病为指示菌，采用对峙平板法进行菌株的拮抗性检测；采用10％含毒平板法进行发酵上清液的拮抗性检测；采用倒扣平板法检测菌株F028所产挥发性物质对病原菌菌生长的抑制效果。结果表明：菌株、上清液和挥发性物质均对番茄灰霉病有较强的拮抗性，见图6所示。

实施例6菌株F028最佳发酵时间的筛选

1.不同发酵时间拮抗菌F028发酵上清液对细菌病原(核桃黑斑病)的拮抗性

将菌株F028的种子液按照1％的接种量接种于LB液体培养基中，分别于24h、48h、72h和96h取2mL，5000r/min离心10min，取上清，用0.22微米滤头过滤除菌，制成无菌发酵上清液；分别取上清液20μL接于无菌滤纸片上(滤纸片置于含有核桃黑斑病病原菌的LB平板中央)。对照接种无菌水，每处理3次重复。28℃恒温培养，24h后观察并测量抑菌圈直径。抑菌圈直径＝(透明圈直径-滤纸片直径)

结果表明，发酵培养0～72h，其发酵上清液的拮抗性随着培养时间的增加，拮抗性增强，说明发酵液中拮抗物质的量随着培养时间的增加而增加。72h达到最大，其透明圈直径为6.16mm。发酵96h的拮抗性低于72h。比较不同时间段上清液抑菌效果，选择72h作为F028上清液抑制核桃黑斑病最佳培养时间。如图7所示。

2.不同发酵时间拮抗菌F028发酵上清液对真菌病原(番茄灰霉病)的拮抗性

将菌株F028按照1％的接种量接种于LB液体培养基中，分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h取2mL保存于离心管中，5000r/min离心10min，取上清，用0.22微米滤头过滤除菌，制成无菌发酵上清液，备用。分别取不同时间段发酵上清液各100μL，均匀涂布于含PDA平板上，在平板中央接种7mm番茄灰霉病菌饼，对照涂布等量的无菌水，28℃培养5d后，采用十字法检测菌落直径并计算抑菌率。

结果表明，随着发酵时间延长，发酵上清液抑菌活性整体呈先上升后先下降趋势，如图8A所示，并在72h达到最大值，抑菌率达59.19％，如图8B所示，因此，72h为最佳发酵时间。

实施例7菌株F028发酵上清液的拮抗性能

1、不同浓度的F028发酵上清液对细菌病害(核桃黑斑病)拮抗性

将发酵72h的菌液5000r/min离心10min，取上清，用0.22微米滤头过滤除菌，制成无菌发酵上清液，稀释成不同浓度。分别为：原液、10倍稀释液、100倍稀释液、500倍稀释液，备用。分别取不同浓度F028发酵上清液20μL接于无菌滤纸片上(滤纸片置于含有核桃黑斑病病原菌的LB平板中央)。对照接种无菌水，每处理3次重复。28℃恒温培养，24h后观察并测量抑菌圈直径，结果如图9所示。

结果显示，发酵上清液拮抗性较好，各处理没有显著性差异，稀释1000倍液的相对抑菌率任然高达80.00％。

2、不同浓度的拮抗菌F028发酵上清液对真菌病害(番茄灰霉病)拮抗性

将发酵72h的发酵上清液配成原液、10倍稀释液、100倍稀释液、500倍稀释液，按体积比为10：1混入PDA培养基，制成采用含毒平板，将番茄灰霉病原菌饼放置在中间，对照未加上清液的。28℃培养5d后，测菌落直径并计算抑菌率。结果显示，随着稀释倍数的增加，发酵上清液的抑菌活性随之降低，但稀释500倍液仍具有51.7％的抑菌率；原液及100倍稀释液的抑菌率分别为83.45％和67.51％，如图10所示。

实施例8解淀粉芽孢杆菌F028可湿性粉剂制作

1.菌株发酵工艺

利用实施例3筛选的最适生长的培养基配方为：甘露醇0.7％、蛋白胨0.7％、玉米粉1.5％、黄豆粉1.5％、氯化钙0.06％；最适培养条件为：培养温度27.5℃，pH值6.5，接种量2％，发酵转速120r/min，装瓶量20％、培养时间为72h。结果显示，优化后，相对于常规的培养方法，菌体量分别提高了3.47～4.46倍，芽孢量分别提高3.55～4.55倍。此条件下生物量达1×10¹¹～5×10¹⁰cfu/mL，芽孢率大于85％。

2.负载体的筛选

通过单因素试验，筛选对F028安全、吸附容量较大、湿润时间较短、悬浮性好的负载体。结果表明，白炭黑和硅藻土表现较好，并且两者配比使用好于单独使用，最佳配比为白炭黑与硅藻土质量比为3:7、4:6、5:5，吸附容量分别为1.8、2.0、2.2L/Kg。

3.助剂的筛选

筛选出最佳湿润剂为磺基丁二酸钠二辛酯，以下简称OT，最佳分散剂为亚甲基双萘磺酸钠，以下简称NNO；当分散剂NNO与湿润剂OT的质量配比为1：9时，母粉的湿润时间显著降低，为20s左右；母粉的悬浮率也显著高于其它配比，为90％左右；各配比的对F028芽孢量的影响无显著性差异。综上所述，选择分散剂与湿润剂的最佳质量配比为1:9。

4.载体与助剂的配比

将助剂分别按照22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％的量加入到母粉中去，检测了各个含量制剂的湿润时间和悬浮率。结果显示，当助剂含量为母粉的28～36％时，其湿润时间和悬浮率都达到最优值，且无显著性差异。

该可湿性粉剂芽孢含量≥100亿活菌/克，悬浮率为80～90％，湿润时间为100～20s。

实施例9菌株F028对烟草和番茄的促生作用

选取4周龄烟草(品种：K326)和番茄(品种：特大)幼苗。

处理：F028菌株提前24h活化，发酵液稀释3倍后按质量的25％与泥炭土充分混合，对照用稀释3倍后LB液体培养基按照质量的25％与泥炭土充分混合。每盆泥炭土1kg。选取长势一样的烟草或番茄幼苗移栽。每一处理组重复3盆。移栽20d后，观察结果表明烟草和番茄的株高、叶片数均高于对照，促生性明显。菌株F028对烟草的促生作用效果见图11，菌株F028对番茄的促生作用效果见图12。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌、菌剂及其制备方法和应用

<141> 2020-12-18

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1426

<212> DNA

<213> gene16S rDNA of Bacillus amyloliquefaciens

<400> 1

cttcggcggc tggctccata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60

gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120

attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180

gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240

cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300

tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360

tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420

cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa 480

gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540

gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600

atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660

ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720

agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780

ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840

cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900

acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960

gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga acggcacttg 1020

ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080

ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140

ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt 1200

ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc 1260

gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcaaacaac catccggtat tagccccggt 1320

ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380

ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactg catgta 1426

<210> 2

<211> 1143

<212> DNA

<213> gene GyrB of Bacillus amyloliquefaciens

<400> 2

ggcggtcttc cggtgtaggg gcgtctgtcg taacgccttg tcgaccactc ttgacgttac 60

cttgacgtta cggttcatcg tgacggaaaa atccactatc aggcgtacga gcgcggtgta 120

cctgtggccg atcttgaagt gatcggtgat actgataaga ccggaacgat tacgcacttc 180

gttccggatc cggaaatttt caaagaaaca actgtatatg actatgatct gctttcaaac 240

cgtgtccggg aattggcctt cctgacaaaa ggcgtaaaca tcacgataga agacaaacgt 300

gaaggacaag aacggaaaaa cgagtaccac tacgaaggcg gaatcaaaag ctatgttgag 360

tacttaaacc gttccaaaga agtcgttcat gaagagccga tttatatcga aggcgagaaa 420

gacggcataa cggttgaagt tgcattgcaa tacaacgaca gctatacaag caatatttat 480

tctttcacaa ataatatcaa cacatacgaa ggcggcacgc acgaggccgg atttaaaacc 540

ggtctgaccc gtgtcataaa cgactatgca agaagaaaag ggattttcaa agaaaatgat 600

ccgaatttaa gcggggatga tgtgagagaa gggctgactg ccattatttc aattaagcac 660

cctgatccgc aattcgaagg gcagacgaaa acgaagctcg gcaactccga agcgagaacg 720

atcactgata cgctgttttc ttctgcgctg gaaacattcc ttcttgaaaa tccggactca 780

gcccgcaaaa tcgttgaaaa aggactaatg gccgcaagag cgcggatggc agcgaaaaaa 840

gcccgggaat tgacccggcg caaaagtgcg cttgagattt ccaatctgcc gggcaaactg 900

gcggactgtt cttctaaaga tccgagcatt tccgagctgt atatcgtaga gggtgactct 960

gcgggcggat cagcgaaaca gggacgggac cgtcatttcc aagccattct gccgctgcgc 1020

ggtaagattc tgaacgttga gaaagccaga cttgataaga ttctctcaaa caatgaggtc 1080

agatcaatga tcacggccct cggaacagga atcggagaag attttaatct tgaaaaagcg 1140

cgt 1143

Claims (8)

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）F028，其特征在于，该菌株于2020年4月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号：CGMCC No.19590。

2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，将所述解淀粉芽孢杆菌在适宜其生长的培养基和培养条件下进行培养。

3.一种生物防治制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌F028。

4.根据权利要求3所述的生物防治制剂，其特征在于，所述生物防治制剂是由解淀粉芽孢杆菌F028的菌体制成。

5.根据权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）挑取解淀粉芽孢杆菌F028的单菌落接种在装有10～30mL LB培养基的三角瓶中，在25～35℃温度下，120～200r/min振荡培养20～24h左右，培养至OD600值大于0.6，制成种子液；

（2）将步骤（1）制备的种子液接种到发酵培养基中，25～35℃下恒温培养60～72h，pH6.0～7.0，芽孢率75～90%，生物量为10¹⁰～10¹¹cfu/mL，制备得到解淀粉芽孢杆菌F028发酵液；

（3）将步骤（2）培养的发酵液中添加负载剂，干燥得到解淀粉芽孢杆菌F028原粉；

（4）步骤（3）中得到的解淀粉芽孢杆菌F028原粉加入质量百分比为28～40%助剂制成可湿性粉剂，即为解淀粉芽孢杆菌F028可湿性粉剂。

6.根据权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中制备发酵培养基成分为按质量百分比计，玉米粉1.5%，黄豆粉1.5%，甘露醇0.7%，蛋白胨0.7%，氯化钙0.06%，蒸馏水1000mL，pH调至6.0～7.0。

7.根据权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中的负载剂为白炭黑与硅藻土的混合物，所述白炭黑与硅藻土的质量比为3:7、4:6或者5:5。

8.根据权利要求5所述的生物防治制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中的助剂为亚甲基双萘磺酸钠和磺基丁二酸钠二辛酯的混合物，所述亚甲基双萘磺酸钠与磺基丁二酸钠二辛酯的质量比为1:9。

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