CN110157621A - 一种高浓缩微藻活细胞长效保存剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高浓缩微藻活细胞长效保存剂的制备方法，通过将光合菌荚膜红假单胞菌Rhodopseudomonas capsulate与嗜盐菌嗜盐单胞菌Halomonas campisalis在谷氨酸盐培养基中发酵培养获得菌泥，然后将菌泥包埋在海藻酸钠载体颗粒里，继续将含有无机盐、维生素、有机碳源等营养基质粉末吸附于载体颗粒中，获得光合菌载体颗粒营养盐混合颗粒，经喷雾干燥与粉末均质后，制得高浓缩微藻活细胞长效保存剂。此保存剂使用上简单，只需要将一定量的保存剂粉末加入浓缩藻液中，菌在包埋颗粒中增值，产生的代谢物可维持藻浓缩液生态平衡。此法简单易行，春夏秋三季可维持浓缩藻活细胞10‑30天的活力而无腐败出现。

Description

一种高浓缩微藻活细胞长效保存剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种炎热季节大量微藻浓缩液长期保存与运输中细胞活力维持与提高的方法。

背景技术

水生微藻如小球藻、盐生杜氏藻、雨生红球藻等，由于微藻本身含有大量的营养物质和色素含量，是现在最佳的水产饵料。现在饵料藻主要有微藻活细胞和微藻细胞干粉。微藻活细胞营养丰富，但是在运输过程中容易死亡、腐败。现有的微藻浓缩液运输通常采用低温冷藏的运输方式，导致成本高，藻细胞活力低等问题。

现在饵料藻的运输主要有以下几种方法。

(1)微藻低温运输，低温通常指温度在0-4℃，在这种温度下，此种可运输每毫升2×10¹⁰细胞浓度，存在成本高的问题，藻活力降低显著，不适用于活藻调节养殖水体水质的情况。

(2)微藻常温运输，微藻在常温运输中分为光照和黑暗两种方式，但在光照情况下，藻细胞浓度低，一般每毫升10⁶个细胞以下，超过每毫升10⁷的藻细胞浓缩液24小时内即腐败，运输效率低，成本高。

(3)藻干粉运输，此方法的饵料藻类为死亡细胞，藻类中一部分营养物质已经丢失，失去了原来的生物价值，对于某些水产动物，活藻是其唯一摄食种类。不适用于活藻调节养殖水体水质的情况。

根据上述分析，目前饵料藻在春、夏、秋季节下运输过程中存在运输浓度低、运输距离短、成本高等问题。因此找到一种能够在炎热温度下保持高浓度微藻细胞生命活性的保存方法，具有很好的应用前景。

根据检索，发现以下几篇专利文献与本发明相关，分别是：

1、专利(201610330167.3)“一种小球藻的保存方法”，该方法通过将小球藻浓缩液与无菌水混合，然后添加甘油、茶叶提取物、山梨酸钾进行保存，方便少量小球藻藻种的贮藏与运输。而本方法主要强调高浓缩藻细胞的长期保存与运输，保持藻细胞的高活力，保存剂中含有光合菌，维持密封藻浓缩液的生态循环，成本低，对水体无污染。

2、专利(00107546.2)“一种鲜活微藻食品及其制备方法”，该方法通过将藻液浓缩，加入到保护液中，注入到特制的容器中，得到的藻类安全，可以制作成食品。但保持微藻活性时间短，且规模小、成本高。本方法主要是对大规模微藻饵料在运输过程中的保护，且直接将保存剂加入到浓缩液中，无需特质容器，操作简单；保存液为活体光合菌，成本低，对水体没有污染。

3、专利(200410036386.8)“单胞藻干制品的制备方法及其制品和应用”，该方法通过将藻类浓缩、干燥、真空或者充氮包装，方便运输，但该专利中藻细胞已经死亡，藻细胞中的部分营养物质损失。本方法是对大规模鲜活微藻的活力维持与提高，适用于水产行业对活体细胞的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用范围广，简单便捷，能在炎热条件下大量保存与运输微藻细胞浓缩液保存剂的制备方法。保存剂成分为天然水体原有盐分，维生素，氨基酸与自然水体中含有的光合细菌与嗜盐单胞菌，对水体没有污染且成本低。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种高浓缩微藻活细胞长效保存剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)混合菌泥的制作

将光合菌荚膜红假单胞菌Rhodopseudomonas capsulate、嗜盐菌嗜盐单胞菌Halomonas campisalis分别以10％接种量接入谷氨酸盐培养基中，分别用发酵罐进行培养，温度22-32℃，培养时间为36-48小时。发酵液中总菌数达到2×10¹⁰cfu/ml，将两种菌的发酵液1∶1混合，然后高速离心得到光合菌菌泥。

(2)光合菌持水载体颗粒的制作

将菌泥包埋形成光合菌载体颗粒：将浓度为20g/L的海藻酸钠溶液与光合菌菌泥体积比 1∶1混合均匀，然后往混合液中加入10g/L的氯化钙溶液，同时进行搅拌，直至溶液浑浊不再加深，然后静置固化15-40分钟。采用1500目滤布进行过滤，获得光合菌持水载体颗粒。

(3)光合菌载体颗粒营养盐混合颗粒的制作

按以下质量比例进行混合：光合菌载体颗粒100份(毫升)，硝酸钠5份(克)，氯化铵10份(克)，维生素B12 0.01(克)，乙酸钠400份(克)，钼酸钠0.01份(克)，谷氨酸钠 5份(克)，碳酸氢钠5份(克)，柠檬酸铁0.4份(克)，硼酸2份(克)。混匀后静置30-60 分钟，获得光合菌载体颗粒营养盐混合颗粒。

(4)高浓缩微藻活细胞保存剂制作

干燥光合菌载体/营养盐混合颗粒细化：研磨机研磨破碎成10-20um粒径的干燥颗粒。制得高浓缩微藻活细胞保存剂。

(5)高浓缩微藻活细胞保存剂使用方法

按10g保存剂：1L藻细胞浓缩液的比例，将保存剂加入藻细胞浓度高于每毫升100亿以上的藻浓缩液，稍微混匀，室温，密封，避免暴晒运输或者保存。

谷氨酸盐培养基成分为：酵母提取物10g/L，谷氨酸钠5g/L，钼酸钠0.005g/L，碳酸氢钠 2g/L，葡萄糖10g/L。

所述的微藻包括发菜、盐生杜氏藻、雨生红球藻、海水小球藻、淡水小球藻、微拟球藻、扁藻、三角褐指藻、筒柱藻、角毛藻、球等鞭金藻、绿色巴夫藻、紫球藻中的任何一种

本发明与现有技术相比具有以下有益的技术效果：

能够在春夏秋三季常温下大量储存、运输浓缩微藻饵料，并可保持藻细胞的活力。

高密度保存的细胞为活细胞，可直接用作鱼虾饵料，可直接用于调节培养池塘的水质。

说明书附图

图1——海水小球藻保存20天与30天后的照片

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

菌种选用荚膜红假单胞菌Rhodopseudomonas capsulate与嗜盐菌嗜盐单胞菌Halomonas campisalis。

实施例1

步骤一、将细胞浓度2×10⁶/ml的荚膜红假单胞菌Rhodopseudomonas capsulate与嗜盐菌嗜盐单胞菌Halomonas campisalis菌分别接种到谷氨酸盐培养基中，30℃培养30L发酵罐中，培养液体积15L，通气培养48h，荚膜红假单胞菌为3×10¹⁰cfu/ml，Halomonascampisalis菌密度为2.8×10¹⁰cfu/ml，各取样10L，混合得20L混合菌液。5000g离心10分钟，得菌泥大约100mL。

步骤二、将100ml浓度为20g/L的海藻酸钠溶液与步骤一中收集的100ml菌泥混合，搅拌均匀，然后加入10g/L的氯化钙溶液，同时进行搅拌，加入大约400ml后，溶液浑浊程度不再加深，静置30分钟，然后倒入1500目滤布做成的袋子中，静置1h，袋内液体不再外渗，获得大约200ml的光合菌持水载体颗粒。

步骤三、往上一步获得的200ml的光合菌持水载体颗粒中加入如下成分：硝酸钠10克，氯化铵20克，维生素B12 0.02克，乙酸钠800克，钼酸钠0.02克，谷氨酸钠10克，碳酸氢钠10克，柠檬酸铁0.8克，硼酸4g克。混匀后静置40分钟，获得光合菌载体颗粒营养盐混合颗粒。

步骤四、将光合菌载体颗粒营养盐混合颗粒进行喷雾干燥：120℃进风温度，60℃出风温度。得大约800g干燥光合菌载体/营养盐混合颗粒。经家用25000转/分小型研磨机研磨5 分钟，得到颗粒大小为10微米左右的高浓缩微藻活细胞长效保存剂。

步骤五、将12g保存剂加入1升细胞浓度为200亿细胞/毫升的海水小球藻液中，置于塑料桶中，密封后放置在昼夜温差15-30℃的厂房无阳光直射台面上放置保存。

在保存后2天，8天，1个月，2个月分别取样，观察浓缩藻液气味变化与PI-FDA染色法进行存活率测定。

结果如下：

表一、不同保存时间海水小球藻检测结果

取样时间	气味	存活率
			0天	藻自然土腥味	98％
2天	藻自然土腥味	98％
			8天	藻自然土腥味	97％
1个月	藻自然土腥味	96％
			2个月	腐败臭味	40％

小球藻在保存过程中，其细胞存活率虽随着保藏时间的延长逐渐降低，一个月内存活率为 96％以上。

实施例2

步骤一到四同实例1，

步骤五、将混合后的藻液放置在15-30℃、黑暗条件下保存。

在保存后2天，8天，1个月，2个月，观察气味，用PI-FDA染色法进行存活率测定。

表2、不同保存时间淡水小球藻检测结果

取样时间	气味	存活率
			0天	藻自然土腥味	98％
2天后	藻自然土腥味	96％
			8天后	藻自然土腥味	95％
1个月后	稍有异味的土腥味藻	92％
			2个月后	腐败臭味	12％

淡水小球藻保鲜过程中，其细胞存活率虽随着保藏时间的延长逐渐降低。保存1个月后，其成活率仍然有92％；两个月内时已经腐败变质，仅有12％左右的藻细胞存活状态。

Claims (3)

1.一种高浓缩微藻活细胞长效保存剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将光合菌荚膜红假单胞菌Rhodopseudomonas capsulate与嗜盐菌嗜盐单胞菌Halomonas campisalis分别以10％接种量接入谷氨酸盐培养基中，分别用发酵罐进行培养，培养时间为36-48小时，发酵液中总菌数达到2×1010cfu/ml以上，将两种菌的发酵液1∶1混合，然后高速离心得到光合菌菌泥。

(2)将菌泥包埋形成光合菌载体颗粒：将浓度为20g/L的海藻酸钠溶液与光合菌菌泥体积比1∶1混合均匀，然后往混合液中加入10g/L的氯化钙溶液，同时进行搅拌，直至溶液浑浊不再加深，然后静置固化15-40分钟；采用1500目滤布进行过滤，获得光合菌持水载体颗粒。

(3)按以下比例进行混合：光合菌载体颗粒100份(毫升)，硝酸钠5份(克)，氯化铵10份(克)，维生素B12 0.01份(克)，乙酸钠400份(克)，钼酸钠0.01份(克)，谷氨酸钠5份(克)，碳酸氢钠5份(克)，柠檬酸铁0.4份(克)，硼酸2份(克)，混匀后静置30-60分钟，获得光合菌载体颗粒营养盐混合颗粒。

(4)将光合菌载体颗粒营养盐混合颗粒进行喷雾干燥：100-160℃进风温度，50-80℃出风温度，得干燥光合菌载体/营养盐混合颗粒。

(5)干燥光合菌载体/营养盐混合颗粒细化：研磨机研磨破碎成10-20um粒径的干燥颗粒。

2.如权利要求1所述的一种高浓缩微藻活细胞长效保存剂的制备方法，其特征在于，所述的谷氨酸盐培养基成分为酵母提取物10g/L，谷氨酸钠5g/L，钼酸钠0.005g/L，碳酸氢钠2g/L，葡萄糖10g/L。

3.如权利要求1所述的一种高浓缩微藻活细胞长效保存剂的制备方法，其特征在于，所述的微藻包括发菜、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻、微绿球藻、扁藻、三角褐指藻、筒柱藻、角毛藻、球等鞭金藻、绿色巴夫藻、紫球藻中的任何一种。