CN107287125A - 一种蛋白核小球藻的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利于提高蛋白核小球藻生长速率、增大细胞密度，促进油脂积累的培养方法，是在培养蛋白核小球藻的培养基中添加了灭活的红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)细菌的混合发酵菌液。本发明的方法能够使藻细胞快速生长，培养出的蛋白核小球藻细胞密度大，特别是由于添加了混合菌液，从而促进藻细胞快速增殖，使得藻细胞浓度增大，油脂含量明显增加，适于大批量规模化培养生产。

Description

一种蛋白核小球藻的培养方法
技术领域
本发明属于藻类培养技术领域，具体涉及一种蛋白核小球藻的培养方法。
背景技术
蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)属于绿藻门、色球藻目、小球藻属，是该属植物中唯一具有蛋白核的种类。蛋白核小球藻细胞中含有丰富的蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、膳食纤维、维生素和微量元素等，具有很高的营养价值，是人类优良的保健食品和水产养殖饵料。已被中华人民共和国***批准为新资源食品。蛋白核小球藻作为一类可再生能源生物质可以在光自养和异养的培养条件下积累油脂，能有效利用太阳能和有机能进行快速生长和积累油脂，蛋白核小球藻的油脂可以作为再生能源，用于制作生物柴油，生物柴油在替代化石燃料柴油上具有非常大的潜力。但目前蛋白核小球藻规模化培养存在着生长缓慢，生物量低，油脂含量低的问题，不利于大规模培养。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利于提高蛋白核小球藻生长速率、增大细胞密度，促进油脂积累的培养方法，从而提高培养效率，特别适于规模化培养的蛋白核小球藻培养方法。
本发明所提供的蛋白核小球藻的培养方法，是在培养蛋白核小球藻的培养基中添加了灭活的红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)细菌的发酵菌液；
所述的红细菌属(Rhodobacter sp.)，其实施例的一种优选为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)；
所述的红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)细菌，其实施例的一种优选为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)；
所述的发酵菌液的培养基，具体组成如下：NH4Cl 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgCl20.2g/L、酵母粉0.5g/L、醋酸钠4g/L。发酵温度为30℃，24小时持续光照，强度为10000Lux，发酵时间为3天，每种细菌接种浓度1×107个/mL。
所使用的蛋白核小球藻培养基，具体的组成如下：蛋白胨300-500mg/L，K2HPO4 16-21mg/L，MgSO4·7H2O 60-90mg/L，CaCl2·2H2O 30-42mg/L，柠檬酸铁铵8-16mg/L，NaHCO310-30mg/L，微量元素溶液0.5-1.5ml/L。
上述的培养基中还可以添加植物生长素和维生素溶液。
所述的植物生长素为吲哚乙酸，维生素溶液为维生素B2溶液。
更具体的，所述的培养方法，其培养时选用的温度为30℃，24小时持续光照，强度为10000Lux。
本发明的方法能够使藻细胞快速生长，培养出的蛋白核小球藻细胞密度大，特别是由于添加了混合菌液，从而促进藻细胞快速增殖，使得藻细胞浓度增大，油脂含量明显增加，适于大批量规模化培养生产。
附图说明
图1不同培养基浓度及其菌群对蛋白核小球藻油脂含量的影响图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
下面对本发明所涉及的原料与方法描述如下：
本发明所使用的各种营养盐(除植物生长素和维生素溶液外)可先配成浓度较高的母液，一般情况下母液配置为浓缩1000倍，配制母液(1)-(7)号时，药品分别配制，分别存放；(8)号微量元素中的药品按量配制后混合存放。各种母液配完后，分别用棕色玻璃瓶加盖贮存，贴上标签，注明贮存液名称、配制倍数、日期等，保存在冰箱冷藏室中。配制工作液培养基时，先轻轻摇动贮存液，如果发现有沉淀、悬浮物或被微生物所污染，该贮存液需要重配。最后根据配制的培养基体积用移液枪从各种贮存液中分别取出所需的用量，加营养盐的过程中需不断加水并搅拌，而且各种营养盐按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应，加蒸馏水稀释至所需浓度。配好的培养基用pH计调节至7.0，分装，包扎后以0.103MPa，121℃，高压蒸气灭菌20min。
油脂提取及含量测定：称取干藻粉M1，加入一定体积比为1：2的氯仿：甲醇溶液，振荡混匀，以超声波破碎机进行萃取，时间为20-30min；再以3000r/min离心5min，取氯仿层溶液于预先称重M2的玻璃离心管中，重复提取油脂3次后，将收集的氯仿层在氮气中吹干并在真空干燥器中干燥，称量至恒重M3，进行称量计算
总脂含量计算如下：总脂(％)＝100×(M3-M2)/M1。
尼罗红染色法：取一定体积对数生长期中后期的藻液，8 000r/min离心5min，去除上清，藻细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗两次，采用体积分数为20％的二甲基亚砜水溶液重悬藻细胞，使藻液OD540值0.8，40℃水浴20min，按1mL藻液加15μL尼罗红染料(质量浓度为0.1mg/mL丙酮溶液)，混匀染色5min，激发波长480nm，测定其在575nm波长的荧光强度来筛查藻种总脂含量的大小。
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1：蛋白核小球藻与混合菌群共生***的筛选及群落结构鉴定
从哈尔滨市政污水厂生化池活性污泥中提取的水样，装入无菌取样袋带回实验室，显微镜检观察发现样品微生物及藻类细胞较多，对相应微藻以及微藻伴生菌群进行富集、分离筛选。将原水样投放模拟生化池反应器中连续培养，将反应器置于自然光照下，与预先制备好的模拟城市污水混匀，长时间曝气处理，含氧量保持在6-8mg/L，32℃培养，pH7.5COD保持在400mg/L左右，TN 50mg/L左右，TP 10mg/L左右。通过改良的BG11培养基模拟城市污水，其模拟污水组成如下(mg/L)：蛋白胨400，磷酸二氢钾18.5，七水硫酸镁75.0，二水氯化钙36，柠檬酸铁铵12，碳酸氢钠20，最后添加微量元素1mL。其中微量元素配方为(mg/L)：H3BO3 1660，MnCl2·4H2O 1860，ZnSO4·7H2O 220，Na2MoO4·2H2O 21，CuSO4·5H2O 80，Co(NO3)2·6H2O 50，NiCl2 50，KI 30。
根据检测结果，当培养体系中的COD降低至300mg/L时，添加100mg/L葡萄糖作为补充碳源。曝气池中设置循环装置，1.5L/min，折合5h可以循环一次水样以利于水体回流和混匀，连续曝气池培养超过20d后，得到一个活性稳定，可以耐受一定有机浓度的活性菌藻共生***(如下所述)，活菌数量维持在109个/mL以上，微藻数量维持在107个/mL。在废水的处理过程中，水样起始COD为100mg/L，生化处理采用逐步提高废水比例的方法，使功能菌群逐步适应高浓度市政污水环境。第一代驯化体系添加1/4的模拟废水，补充3/4的蒸馏水，接种菌群，接种量20％(v/v)，30℃摇床，160rpm振荡培养。2d后COD降解率为40.25％，继续培养COD保持稳定不再下降。转接至第二代驯化培养基中，提高废水比例。50％体积的模拟废水加入50％体积的蒸馏水，接种量20％，30℃摇床培养。2d后检测COD从初始的210.5mg/L降低至68.75mg/L，降解率为67.34％，如此往复，到***驯化体系中，培养基全部为模拟市政污水，活性微藻共生菌群对废水的生化处理效果如表1所示。污水中COD降至37.53mg/L左右且保持活性稳定，COD去除率为91.00％，与原污水厂生化池出水水质相近，说明得到了一组稳定菌藻共生***，其在降低体系中的COD方面具有显著效果。
表1菌藻共生***驯化处理污水效果表
采用菌体部分回流法对富集得到的混合微藻菌群进行筛选、鉴定和分离，并利用形态及分子手段对该菌藻共生***进行群落结构分析，发现细菌菌群中主要存在以下成员：红细菌属(Rhodobacter sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、肠杆菌(Enterobacter sp.)、色盐杆菌(Chromohalobacter sp.)、金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)，总数到80％以上。其中红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)比例最高，分别达到21％和19％，其次是类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)和肠杆菌(Enterobacter sp.)比例均为11％，色盐杆菌(Chromohalobacter sp.)和金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)分别占10％和9％。活性细菌微生物群落中，红细菌属(Rhodobacter sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)广泛存在于自然界及各大污水处理厂生化池中，自养或者异氧条件下均可生长，参与碳、氮及磷元素等物质转化及循环。肠杆菌(Enterobacter)以及色盐杆菌(Chromohalobacter)具有一定嗜盐性，具有一定降解有机物功能，在各类污水中广泛存在的微生物。金黄杆菌(Chryseobacterium)存在市政及化工废水处理的功能菌群中，同时可以降解芳烃类及苯类等有机物。
通过上述方法及手段，发现微藻主要种类包括两种微藻：小球藻(Chlorella sp.)及栅藻(Scenedesmus sp.)，其中小球藻占到总数的90％。通过尼罗红染色法对两株微藻进行油脂含量测定，发现小球藻油脂含量达到21.25％，总脂产率达到113.8mg/(L·d)，栅藻油脂含量达到18.76％，总脂产率达到87.8mg/(L·d)。本发明通过16S rRNA等分子生物学手段进行鉴定，确定本发明方法中的富油微藻小球藻(Chlorella sp.)为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
实施例2：复配菌群及活性验证
模拟实施例1中光合细菌微生物群落红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)的组成比例，和蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)进行复配。其中红细菌属(Rhodobacter sp.)选用具体种荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)选用具体种为泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。其中单菌(藻)分别用LB培养基活化，活化后调节细胞浓度，而蛋白核小球藻添加浓度大于两种光合细菌浓度两个数量级，复配得到的微生物菌藻***按照具体实施方式所述油脂含量检测方法，分析复配菌群对蛋白核小球藻油脂含量的影响。培养结束后蛋白核小球藻油脂含量为35.43％，且生长稳定，藻细胞密度达到5×107个/mL，总脂产率达到133.9mg/(L·d)。上述结果表明配制的复合菌群验证了实施例1中功能菌群对蛋白核小球藻产油脂的促进作用，同时说明两种单菌复配得到的菌群对于藻生长密度以及油脂含量以及污水COD去除效率的影响优于实施例1中筛选的菌藻共生***，分别提高了400％，66.73％和7.79％。
实施例3：不同培养基浓度及其菌群浓度对蛋白核小球藻生长及油脂含量的优化
用无菌水配置如下配方的蛋白核小球藻优化后培养基：蛋白胨300mg/L，KH2PO416mg/L，MgSO4·7H2O 60mg/L，CaCl2·2H2O 30mg/L，柠檬酸铁铵8mg/L，NaHCO3 10mg/L，微量元素溶液0.5ml/L；还包括植物生长素吲哚乙酸1.0mg/L和维生素B2溶液0.5mg/L。包括荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、红泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的混合菌群发酵液10mL，其中两种菌种接种配比为1:1。其混合菌群发酵液具体组成如下：NH4Cl1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgCl2 0.2g/L、酵母粉0.5g/L、醋酸钠4g/L。发酵温度为30℃，24小时持续光照，强度为10000Lux，发酵时间为3天，接种比例1：1，每种细菌接种浓度1×107个/mL。取对数生长期的蛋白核小球藻接种到该培养基中进行培养，24小时持续光照，强度约为10000Lux，培养温度控制30摄氏度左右，每天手动摇动两次，防止沉淀贴壁，定期记录培养基中蛋白核小球藻的细胞浓度。另外使用BG-11培养基作为对照培养基，不外加混合菌群发酵液以及特殊营养物质作为对照实验组。在对数生长期中后期测量各实验组藻密度值，详见表2；同时对蛋白核小球藻油脂含量进行测定，详见图1。
表2不同菌群配比浓度及营养浓度对蛋白核小球藻生长影响对比表
实施例4：不同培养基浓度及其菌群浓度对蛋白核小球藻生长及油脂含量的优化
用无菌水配置如下配方的蛋白核小球藻优化后培养基：蛋白胨300mg/L，KH2PO416mg/L，MgSO4·7H2O 60mg/L，CaCl2·2H2O 30mg/L，柠檬酸铁铵8mg/L，NaHCO3 10mg/L，微量元素溶液0.5ml/L；还包括植物生长素吲哚乙酸1.0mg/L和维生素B2溶液0.5mg/L。包括红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)混合菌群发酵液30mL，混合菌群发酵液组成、发酵条件及菌藻接种比例同实施例3。取对数生长期的蛋白核小球藻接种到该培养基中进行培养，24小时持续光照，强度约为10000Lux，培养温度控制30摄氏度左右，每天手动摇动两次，防止沉淀贴壁，定期记录培养基中蛋白核小球藻的细胞浓度。另外使用BG-11培养基作为对照培养基，不外加混合菌群发酵液以及特殊营养物质作为对照实验组。在对数生长期中后期测量各实验组藻密度值，详见表3；同时对蛋白核小球藻油脂含量进行测定，详见图1。
表3不同菌群配比浓度及营养浓度对蛋白核小球藻生长影响对比表
实施例5：不同培养基浓度及其菌群浓度对蛋白核小球藻生长及油脂含量的优化
用无菌水配置如下配方的蛋白核小球藻优化后培养基：蛋白胨500mg/L，KH2PO421mg/L，MgSO4·7H2O 90mg/L，CaCl2·2H2O 42mg/L，柠檬酸铁铵16mg/L，NaHCO3 30mg/L，微量元素溶液1.5ml/L；还包括植物生长素吲哚乙酸5.0mg/L和维生素B2溶液1.0mg/L。包括红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)混合菌群发酵液10mL，混合菌群发酵液组成、发酵条件及菌藻接种比例同实施例3。取对数生长期的蛋白核小球藻接种到该培养基中进行培养，24小时持续光照，强度约为10000Lux，培养温度控制30摄氏度左右，每天手动摇动两次，防止沉淀贴壁，定期记录培养基中蛋白核小球藻的细胞浓度。另外使用BG-11培养基作为对照培养基，不外加混合菌群发酵液以及特殊营养物质。在对数生长期中后期测量各实验组藻密度值，详见表4；同时对蛋白核小球藻油脂含量进行测定，详见图1。
表4不同菌群配比浓度及营养浓度对蛋白核小球藻生长影响对比表
实施例6：不同培养基浓度及其菌群浓度对蛋白核小球藻生长及油脂含量的优化
用无菌水配置如下配方的蛋白核小球藻优化后培养基：蛋白胨500mg/L，KH2PO421mg/L，MgSO4·7H2O 90mg/L，CaCl2·2H2O 42mg/L，柠檬酸铁铵16mg/L，NaHCO3 30mg/L，微量元素溶液1.5ml/L；还包括植物生长素吲哚乙酸5.0mg/L和维生素B2溶液1.0mg/L。包括红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)混合菌群发酵液30mL，混合菌群发酵液组成、发酵条件及菌藻接种比例同实施例3。取对数生长期的蛋白核小球藻接种到该培养基中进行培养，24小时持续光照，强度约为10000Lux，培养温度控制30摄氏度左右，每天手动摇动两次，防止沉淀贴壁，定期记录培养基中蛋白核小球藻的细胞浓度。另外使用BG-11培养基作为对照培养基，不外加混合菌群发酵液以及特殊营养物质。在对数生长期中后期测量各实验组藻密度值，详见表5；同时对蛋白核小球藻油脂含量进行测定，详见图1。
表5不同菌群配比浓度及营养浓度对蛋白核小球藻生长影响对比表
从以上结果看出，使用本发明所提供的培养方法及培养基比使用单独BG-11培养基可以快速地使蛋白核小球藻增殖，使蛋白核小球藻提前进入对数增长期，缩短其培养时间。从图1可以看出，各实施例最优培养条件下蛋白核小球藻油脂含量对比对照培养基BG-11有显著性的提高，由此说明本发明提供的蛋白核小球藻培养方法具有明显的培养优势，更利于藻细胞的快速生长，同时促进油脂含量提高。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种蛋白核小球藻的培养方法，其特征在于，所述的培养方法是在培养蛋白核小球藻的培养基中添加了灭活的红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)细菌的发酵菌液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的红细菌属(Rhodobacter sp.)细菌为为荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的红假单胞菌属(Rhodopseudomonassp.)细菌，为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵菌液，其发酵使用的培养基的配比如下：NH4Cl 1g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgCl2 0.2g/L、酵母粉0.5g/L、醋酸钠4g/L。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基，其配比如下：蛋白胨300-500mg/L，K2HPO4 16-21mg/L，MgSO4·7H2O 60-90mg/L，CaCl2·2H2O 30-42mg/L，柠檬酸铁铵8-16mg/L，NaHCO3 10-30mg/L，微量元素溶液0.5-1.5ml/L。
6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述的培养基中添加有植物生长素和/或维生素溶液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的植物生长素为吲哚乙酸，维生素溶液为维生素B2溶液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养时的培养温度为30℃，24小时持续光照，强度为10000Lux。
9.一种用于培养蛋白核小球藻的培养基，其特征在于，所述的培养基中添加了灭活的红细菌属(Rhodobacter sp.)和红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)细菌的发酵菌液。
10.如权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述的培养基中还添加有植物生长素和/或维生素溶液。
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