CN105543094B

CN105543094B - 一种液态光合细菌高活力保存方法

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Publication number: CN105543094B
Application number: CN201610122908.9A
Authority: CN
Inventors: 刘军义; 罗兆飞; 罗佳; 刘鹏扬; 吕春秋; 盘宝进; 陈立军
Original assignee: Nanning Customs Technology Center
Current assignee: Nanning Customs Technology Center
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2036-03-04
Also published as: CN105543094A

Abstract

本发明公开了一种液态光合细菌的高活力保存方法，过程包括：在待保存的液态光合细菌中添加胶原蛋白，然后采用磷酸缓冲液调节液态光合细菌的pH值至6.8～7.5，密封保存，即可。本发明方法操作简便，成本低，容易实施，对环境效益好，保存条件要求简单，放置于室内自然条件下保存即可，能够长期有效保存液态光合细菌的活力，保存6个月后有效活菌数达90%以上，保存12个月后有效活菌数达80%以上，且施用时无需进行活化，可即时发挥功效，是一种值得大力推广应用的液态光合细菌保存方法。

Description

一种液态光合细菌高活力保存方法

技术领域

本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种长期保存液态光合细菌高活力的方法。

背景技术

光合细菌（Photosynthetic Bacteria,简称PSB）是地球上出现最早、具有原始光能合成体系的原核生物，广泛分布于海洋、湖泊、江河、水田、污泥及土壤中，是一大类能利用有机小分子如氨氮、有机酸等作为生长因子进行不产氧光合作用的细菌，它在分类上属于细菌门，真细菌纲，红螺菌目，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版）可分为6个类群，27个属。6个类群即为着色菌科、外硫红螺菌科、紫色非硫细菌、绿硫细菌、多细胞绿丝菌、盐杆菌。

光合细菌的研究始于日本，已有五十多年历史，1965年，日本科学家发现光合细菌可以治疗鳗鱼贫血病，随后推广到海水养殖和淡水养殖中，均取得很大成功。近几十年来，经过全球科学家的进一步研究，发现光合细菌对鱼、虾、蟹、贝和鸡、鸭、猪、牛等养殖具有明显的提高存活率和促进生长的作用，同时在有机废水处理方面也十分有效。由于光合细菌菌体具有无毒无害并且营养丰富的特点，因而也被美国、日本等国用作保健食品的生产，效果良好。

我国自上世纪八十年代开始对光合细菌进行研究，在菌种分离、废水处理、水产畜牧、农业种植、清洁能源、保健食品等方面取得了许多重要成果，光合细菌的应用已深入到农业、环保、能源乃至食品等各个方面。

目前，光合细菌菌剂主要为液态产品，液态光合细菌最主要的问题是活力不易保存，如要保持活力，通常每隔15天左右需要活化一次，否则活力就要呈数量级下降，因此，农业部行业标准NY 527-2002《光合细菌菌剂》中虽然规定了光合细菌菌剂的有效期不得低于6个月，同时又注明“有效期仅在监督部门或仲裁双方认为有必要时才检验”，说明6个月的保存期都是一大难题。

光合细菌的保种方法研究目前仅限于菌种的保存，如半固体法，冷冻干燥法等，不适合光合细菌菌剂产品。

为推广应用光合细菌，专家学者们研究了多种固定化技术，如“光合细菌的固定化方法”（公开号CN1810966A），“一种固态状光合细菌的制备方法”（公开号 CN104293765A），“固态光合细菌技术”（公开号 CN1124293）等，但上述技术主要是为了解决运输问题，实际操作中不但增加了生产流程和生产成本，而且有的活力损失还很大，不适宜于大规模生产，另外，固定化过程中排出的发酵清液，还容易造成二次污染，这也是目前市场上仍以液态光合细菌为主体的重要原因。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种液态光合细菌的高活力保存方法，该方法操作简便，能够长期有效保存液态光合细菌的活力，保存6个月后有效活菌数达90%以上，保存12个月后有效活菌数达80%以上，且使用时无需再活化，可即时发挥功效，广泛应用于水产畜禽养殖领域。

具体的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种液态光合细菌高活力保存方法，过程包括：在待保存的液态光合细菌中添加胶原蛋白，密封保存，即可。

本发明方法利用了光合细菌具有微弱胞外蛋白酶活力的特点，以胶原蛋白作为能源缓释底物，从而可以长久保存光合细菌的活力。

作为本发明方法的进一步说明，在密封保存前，采用磷酸缓冲液调节液态光合细菌的pH值至6.8～7.5。

磷酸缓冲液即磷酸盐缓冲液，简称PB或PB缓冲液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，通常使用的有磷酸钠缓冲液（NaH₂PO₄&Na₂HPO₄）和磷酸钾缓冲液（K₂HPO₄&KH₂PO₄)，由于它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广。在本发明中，磷酸缓冲液可有效稳定液态光合细菌的pH值，光合细菌在稳定的pH值条件下可充分利用其蛋白酶缓慢分解胶原蛋白为小分子肽和氨基酸等物质，以维持其生命力与生物活性。

作为本发明方法的进一步说明，所述胶原蛋白的添加量为液态光合细菌重量的0.05～0.5%。

作为本发明方法的进一步说明，所述胶原蛋白未经过酶解，分子量在250～350kDa之间。

作为本发明方法的进一步说明，所述光合细菌选自沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulatus)、球形红假单胞菌（Rhodopseudomonas sphaeroides）。

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称PSB)是地球上出现最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成体系的原核生物，是在厌氧条件下进行不放氧光合作用的细菌的总称，是一类没有形成芽孢能力的革兰氏阴性菌，是一类以光作为能源、能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用自然界中的有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物。光合细菌广泛分布于自然界的土壤、水田、沼泽、湖泊、江海等处，主要分布于水生环境中光线能透射到的缺氧区。在水产养殖中，能够降解水体中的亚硝酸盐、硫化物等有毒物质，实现充当饵料、净化水质、预防疾病、作为饲料添加剂等功能。光合细菌适应性强，能忍耐高浓度的有机废水，对酚、氰等毒物有一定有忍受和分解能力，具有较强的分解转化能力。它的诸多特性，使其在无公害水产养殖中具有巨大的应用价值。

作为本发明方法的进一步说明，所述保存是在温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx的条件下静置保存。

作为本发明方法的进一步说明，所述液态光合细菌是将光合细菌经活化、种子培养、扩大培养后制备而得的。

作为本发明方法的进一步说明，所述活化是指将光合细菌接种于ATYP琼脂培养基上，在温度为28～32℃、光照强度为3000～5000Lx的条件下培养4～5d。

作为本发明方法的进一步说明，所述种子培养是指将经活化的光合细菌接种于种子培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养2～3d；所述种子培养液由包括以下重量份数比的组分：乙酸钠2～4份、碳酸氢钠0.5～1.5份、氯化铵0.5～1.5份、磷酸氢二钾0.4～0.6份、氯化镁0.15～0.25份、氯化亚铁-EDTA0.004～0.006份、氯化钠4～6份、水900～1100份，经调节pH值为7.2～7.6，蒸汽灭菌，即得。

作为本发明方法的进一步说明，所述扩大培养是指将经种子培养的光合细菌接种于扩大培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养5～10d；所述扩大培养液由包括以下重量份数比的组分：乙酸钠2～4份、碳酸氢钠0.5～1.5份、氯化铵0.5～1.5份、磷酸氢二钾0.4～0.6份、氯化镁0.15～0.25份、氯化亚铁-EDTA0.004～0.006份、氯化钠4～6份、水900～1100份，经调节pH值为7.2～7.6，蒸汽灭菌，即得。

本发明所用到的光合细菌菌种（可购自于中国典型培养物保藏中心、广东省微生物研究所菌种保藏管理中心、中国农业微生物菌种保藏管理中心、中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国工业微生物菌种保藏管理中心和菌种制备企业等）和其它原料均可从市场上购买得到，其规格符合国家行业标准。

相对于现有技术，本发明方法具有如下有益效果：

（1）本发明方法操作简便，容易实施，保存条件要求简单，放置于室内自然条件下保存即可，并且能够长期有效保存液态光合细菌的活力，保存6个月后有效活菌数达90%以上，保存12个月后有效活菌数达80%以上；

（2）本发明方法所用胶原蛋白无需酶解，且用量少，因此保存成本低，但活力保存效果佳，值得大力推广；

（3）通过本发明方法保存的液体光合细菌在施用时无需进行活化，可即时发挥功效，广泛应用于水产畜禽养殖领域；

（4）通过实施本发明方法，可将菌体连同发酵液一并保存，一并施用，排除了二次污染的风险，对环境效益好。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，本实施例仅是对本发明作更清楚的说明，而不是对本发明的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均落在本发明的保护范围之内。

以下实施例所用到的光合细菌菌种和其它原料均从市场购买，其规格符合国家行业标准。

一、液态光合细菌的制备

实施例1

液态光合细菌的制备，包括如下步骤：

（1）种子培养液的配制：称取以下重量份数比的组分：乙酸钠3份、碳酸氢钠1份、氯化铵1份、磷酸氢二钾0.5份、氯化镁0.2份、氯化亚铁-EDTA 0.005份、氯化钠5份、蒸馏水1000份，混匀，调节pH值为7.4±0.2，于121℃蒸汽灭菌15min，冷却至30℃，备用；

（2）扩大培养液的配制：称取以下重量份数比的组分：乙酸钠4份、碳酸氢钠1.5份、氯化铵1.5份、磷酸氢二钾0.6份、氯化镁0.25份、氯化亚铁-EDTA 0.006份、氯化钠6份、生活饮用水1100份，混匀，调节pH值为7.4±0.2，于121℃蒸汽灭菌15min，冷却至30℃，备用；

（3）菌种活化：取沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）活菌作为发酵菌种，用无菌吸管吸取0.5mL菌体悬浮液划线接种于ATYP琼脂培养基上，在温度为28～32℃、光照强度为3000～5000Lx的条件下培养4d；

（4）种子培养：用金属接种环取1～2环经活化的光合细菌接种于1L种子培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养3d；

（5）扩大培养：将经种子培养的光合细菌按15%的接种量接种于10L扩大培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养培养8d；经三级放大培养后，得到呈***的高活力液体光合细菌。

实施例2

液态光合细菌的制备，包括如下步骤：

（1）种子培养液的配制：称取以下重量份数比的组分：乙酸钠2份、碳酸氢钠1.5份、氯化铵0.5份、磷酸氢二钾0.6份、氯化镁0.25份、氯化亚铁-EDTA 0.004份、氯化钠5份、蒸馏水900份，混匀，调节pH值为7.4±0.2，于121℃蒸汽灭菌15min，冷却至30℃，备用；

（2）扩大培养液的配制：称取以下重量份数比的组分：乙酸钠3份、碳酸氢钠1份、氯化铵1份、磷酸氢二钾0.6份、氯化镁0.15份、氯化亚铁-EDTA 0.005份、氯化钠4份、生活饮用水950份，混匀，调节pH值为7.4±0.2，于121℃蒸汽灭菌15min，冷却至30℃，备用；

（3）菌种活化：取荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomonas capsulatus）活菌作为发酵菌种，用无菌吸管吸取0.3mL菌体悬浮液划线接种于ATYP琼脂培养基上，在温度为28～32℃、光照强度为3000～5000Lx的条件下培养5d；

（5）扩大培养：将经种子培养的光合细菌按15%的接种量接种于10L扩大培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养培养5d；经三级放大培养后，得到呈***的高活力液体光合细菌。

实施例3

液态光合细菌的制备，包括如下步骤：

（1）种子培养液的配制：称取以下重量份数比的组分：乙酸钠4份、碳酸氢钠0.5份、氯化铵1.5份、磷酸氢二钾0.4份、氯化镁0.2份、氯化亚铁-EDTA 0.006份、氯化钠4份、蒸馏水1000份，混匀，调节pH值为7.4±0.2，于121℃蒸汽灭菌15min，冷却至30℃，备用；

（2）扩大培养液的配制：称取以下重量份数比的组分：乙酸钠3份、碳酸氢钠1份、氯化铵1份、磷酸氢二钾0.5份、氯化镁0.2份、氯化亚铁-EDTA 0.005份、氯化钠5份、生活饮用水1000份，混匀，调节pH值为7.4±0.2，于121℃蒸汽灭菌15min，冷却至30℃，备用；

（3）菌种活化：取沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas sphaeroides）活菌作为发酵菌种，用无菌吸管吸取0.4mL菌体悬浮液划线接种于ATYP琼脂培养基上，在温度为28～32℃、光照强度为3000～5000Lx的条件下培养4.5d；

（4）种子培养：用金属接种环取1～2环经活化的光合细菌接种于1L种子培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养2.5d；

（5）扩大培养：将经种子培养的光合细菌按15%的接种量接种于10L扩大培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养培养10d；经三级放大培养后，得到呈***的高活力液体光合细菌。

二、液体光合细菌的保存

实施例4：在通过实施例1方法制备而得的液态光合细菌中添加未经酶解、分子量约为300kDa的胶原蛋白，添加量为液态光合细菌重量的0.2%，接着采用磷酸钠缓冲液调节液态光合细菌的pH值至7.2，直接密封，然后放置于室内，在自然条件下（温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx）贮存，即可。

实施例5：在通过实施例2方法制备而得的液态光合细菌中添加未经酶解、分子量约为300kDa的胶原蛋白，添加量为液态光合细菌重量的0.3%，接着采用磷酸钠缓冲液调节液态光合细菌的pH值至6.8，直接密封，然后放置于室内，在自然条件下（温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx）贮存，即可。

实施例6：在通过实施例3方法制备而得的液态光合细菌中添加未经酶解、分子量约为300kDa的胶原蛋白，添加量为液态光合细菌重量的0.05%，接着采用磷酸氨缓冲液调节液态光合细菌的pH值至7.5，直接密封，然后放置于室内，在自然条件下（温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx）贮存，即可。

实施例7：在通过实施例1方法制备而得的液态光合细菌中添加未经酶解、分子量约为300kDa的胶原蛋白，添加量为液态光合细菌重量的0.5%，接着采用磷酸钾缓冲液调节液态光合细菌的pH值至7.0，直接密封，然后放置于室内，在自然条件下（温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx）贮存，即可。

实施例8：在通过实施例2方法制备而得的液态光合细菌中添加未经酶解、分子量约为300kDa的胶原蛋白，添加量为液态光合细菌重量的0.4%，接着采用磷酸钾缓冲液调节液态光合细菌的pH值至7.2，直接密封，然后放置于室内，在自然条件下（温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx）贮存，即可。

实施例9：在通过实施例3方法制备而得的液态光合细菌中添加未经酶解、分子量约为300kDa的胶原蛋白，添加量为液态光合细菌重量的0.15%，接着采用磷酸氨缓冲液调节液态光合细菌的pH值至7.4，直接密封，然后放置于室内，在自然条件下（温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx）贮存，即可。

三、液体光合细菌保存效果测定

以下通过对液体光合细菌保存效果的测定试验来更好地说明本发明达到的有益效果。

测定方法：采用R培养基半固体试管法，分别测定初始液态光合细菌和已保存6个月、12个月的液态光合细菌的有效活菌数。

结果见表1。

表1 液体光合细菌保存效果的测定试验

从上表可知，通过本发明方法能够长期有效保存液态光合细菌的活力，保存6个月后有效活菌数均达90%以上，保存12个月后有效活菌数均达80%以上，是一种值得大力推广应用的液态光合细菌保存方法。

Claims

1.一种液态光合细菌高活力保存方法，其特征在于，过程包括：在待保存的液态光合细菌中添加胶原蛋白，密封保存，即可；

在密封保存前，采用磷酸缓冲液调节液态光合细菌的pH值至6.8～7.5；

所述胶原蛋白的添加量为液态光合细菌重量的0.05～0.5%；

所述胶原蛋白未经过酶解，分子量在250～350kDa之间；

所述保存是在温度为35℃以下、光照强度为100～1000Lx的条件下静置保存；

所述光合细菌选自沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌、球形红假单胞菌；

所述液态光合细菌是将光合细菌经活化、种子培养、扩大培养后制备而得的；

所述活化是指将光合细菌接种于ATYP琼脂培养基上，在温度为28～32℃、光照强度为3000～5000Lx的条件下培养4～5d；

所述种子培养是指将经活化的光合细菌接种于种子培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养2～3d；所述种子培养液由包括以下重量份数比的组分：乙酸钠2～4份、碳酸氢钠0.5～1.5份、氯化铵0.5～1.5份、磷酸氢二钾0.4～0.6份、氯化镁0.15～0.25份、氯化亚铁-EDTA0.004～0.006份、氯化钠4～6份、水900～1100份，经调节pH值为7.2～7.6，蒸汽灭菌，即得；

所述扩大培养是指将经种子培养的光合细菌接种于扩大培养液中，在温度为25～30℃、光照强度为2000～5000Lx的条件下培养5～10d；所述扩大培养液由包括以下重量份数比的组分：乙酸钠2～4份、碳酸氢钠0.5～1.5份、氯化铵0.5～1.5份、磷酸氢二钾0.4～0.6份、氯化镁0.15～0.25份、氯化亚铁-EDTA0.004～0.006份、氯化钠4～6份、水900～1100份，经调节pH值为7.2～7.6，蒸汽灭菌，即得。