CN110144296A - 一种用于培养产虾青素微藻的培养基、一种经济型产虾青素微藻的培养方法及其应用 - Google Patents

一种用于培养产虾青素微藻的培养基、一种经济型产虾青素微藻的培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于培养产虾青素微藻的培养基、一种经济型产虾青素微藻的培养方法及其应用，涉及环境科学技术领域，本发明所述培养基由体积比1:99～199的尿液污水和水组成。尿液污水为生活污水中的黄水，可为培养产虾青素微藻提供所需的氮磷钾等营养成分，无需额外添加，有效降低了生产成本。本发明还提供了一种经济型产虾青素微藻的培养方法，将产虾青素微藻接种在上述技术方案所述的培养基后，通过改变光照时间的方式对产虾青素微藻进行胁迫，培养完成后可提取得到虾青素，同时还可同步净化水质，对解决雨生红球藻产虾青素的市场缺口问题以及黄水处理面临的困难都有积极的意义。

Description

一种用于培养产虾青素微藻的培养基、一种经济型产虾青素 微藻的培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及环境科学技术领域，尤其涉及一种用于培养产虾青素微藻的培养基、一种经济型产虾青素微藻的培养方法及其应用。
背景技术
近几年，水资源污染问题特别严重，其中城市生活污水是重要的水资源污染来源之一。随着中国经济不断发展，城市化进程的继续推进，城镇生活污水成为中国废水排放量不断增加的主要来源。根据生活污水的来源分类，可将生活污水分为黑水(指厕所粪便污水)和灰水(指来源于家庭厨房、洗衣、沐浴和盥洗等污水)，其中黑水又可分为黄水(尿液污水)和褐水(粪便污水)。黄水的处理面临着许多困难，即使是集中在夜间排放，也给人们造成了很大影响。在飞机、船舶、火车等移动运输工具上，更是面临着点源污染难以集中化处理回收的问题。
黄水具有低碳高氮磷的特点，在城市生活污水中，黄水约贡献了80％的氮、50％的磷和90％的钾，适宜进行营养物质的资源回收和再利用。黄水具有低碳高氮磷的特点，有利于藻类的生长。微藻净化污水，自20世纪50年代就被Oswald等提出，它能克服传统污水处理方法易引起的二次污染、潜在营养物质丢失、资源不能完全利用等弊端，同时能够有效去除造成水体富营养化的氮、磷等营养物质，并且能作为一种新的能源生产油脂，微藻生物质还可用于制作肥料、养殖饲料等。目前多种微藻已被用作生产饲料及其他促进健康的化合物的来源。
虾青素是一种橘红色的类胡萝卜素，一种脂溶性色素，存在于许多的微生物和水下动物内，被认为是“超级抗氧化剂”，目前被广泛应用于食品、医疗和保健行业。部分微藻可产生虾青素，是虾青素的合成来源之一，但是目前培养微藻进行虾青素生产的培养基成本高，需要添加各种碳、氮、磷以及微量元素等营养物质，使得虾青素生产成本较高。
发明内容
本发明为了克服现有微藻产虾青素的培养基成本较高的缺陷，提供了一种用于培养产虾青素微藻的培养基，该培养基的成分来源于生活污水中的黄水，成本低，用于培养产虾青素微藻后，可显著降低虾青素制备成本，同时也可以利用产虾青素微藻净化尿液污水。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于培养产虾青素微藻的培养基，由体积比1:99～199的尿液污水和水组成。
优选的，所述的水为曝气自来水。
优选的，所述尿液污水与水的体积比为1:140～160。
优选的，将尿液污水与水分别进行微孔滤膜过滤后，按照体积比混合，得到所述培养基。
本发明提供了一种经济型产虾青素微藻的培养方法，包括以下步骤：
(1)将产虾青素微藻接种于上述技术方案所述培养基，使培养基中的产虾青素微藻密度不低于4×104cells/mL，得到接种培养基；
(2)将接种培养基在光照时间为10～14h/d的条件下进行第一培养，得到第一培养物；
(3)将第一培养物在光照时间24h/d的条件下进行第二培养。
优选的，所述产虾青素微藻为雨生红球藻。
优选的，所述第一培养和第二培养的培养温度独立的为18～22℃，所述第一培养和第二培养的光照强度独立的为4000～4800lux。
优选的，所述第一培养的培养时间为5～7d。
优选的，所述第二培养的时间为8～12d。
本发明还提供了上述技术方案所述的培养方法在净化尿液污水中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提供了一种用于培养产虾青素微藻的培养基，由体积比1:99～199的尿液污水和水组成。尿液污水为生活污水中的黄水，可为培养产虾青素微藻提供所需的氮磷钾等营养成分，无需额外添加，有效降低了生产成本。
本发明还提供了一种经济型产虾青素微藻的培养方法，将产虾青素微藻接种在上述技术方案所述的培养基后，以含尿液污水的培养基为胁迫源的情况下、结合改变光照时间的方式对产虾青素微藻进行胁迫，培养完成后可提取得到虾青素，同时还可同步净化水质，对解决雨生红球藻产虾青素的市场缺口问题以及黄水处理面临的困难都有积极的意义。
本发明还提供了上述技术方案所述的培养方法在净化尿液污水中的应用，操作方便，成本低廉，经济环保，具备良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1-4、对比例1-4中不同尿液污水添加比培养基下雨生红球藻生长曲线图。
图2为锥形瓶培养微藻时的照片；
图3为培养第15天后产虾青素微藻镜检形态；
图4为实施例和对比例培养微藻所提取出的虾青素；其中，图4-1为实施例7所示方法培养后得到的虾青素，图4-2为对比例5所示方法培养后得到的虾青素，图4-3为对比例6所示方法培养后得到的虾青素，图4-4为实施例8所示方法培养后得到的虾青素，图4-5为对比例7所示方法培养后得到的虾青素。
具体实施方式
本发明提供了一种用于培养产虾青素微藻的培养基，由体积比1:99～199的尿液污水和水组成。本发明提供的培养基无需额外添加碳、氮、磷以及其他微量元素即可实现对产虾青素微藻的培养，获得虾青素。本发明提供的培养基仅由水和尿液污水组成，水的成本低，而尿液污水是生活污水中的黄水，来源广泛，成本同样低廉，因而本发明所述培养基可显著降低虾青素的生产成本，同时还可实现对尿液污水的处理，实现废物循环利用。
在本发明中，所述的水优选为曝气自来水。自来水在阳光下充分曝气以去除余氯、增加溶解氧，利于微藻的生长。在本发明中，所述曝气的自来水制备方法优选的包括以下步骤：取一定量自来水置于阳光下，并使用小型曝气机曝气。在本发明中，每1L自来水曝气的时间优选为1～3h，更优选为2h。
本发明所述的尿液污水是指直接收集得到的尿液污水，由于采集的人群个体差异，尿液污水中的营养元素含量存在一定的区别。本发明所述尿液污水是指健康人体(无肾功能障碍、糖尿病等)产生的尿液污水，多次实验中尿液污水的主要元素的平均含量为：TN:6730～9326mg/L，TP:417～845mg/L，Na:3016～4268mg/L，K:1853～2539mg/L。
但是，如本发明的具体实施例所示，在尿液污水和水体积比1:99～199的范围内，均可实现产虾青素微藻的快速增殖。在本发明中，所述尿液污水和水的比例优选为1:140～160，在该比例下的培养基可使产虾青素微藻有最大的比生长速率。
在本发明中，所述培养基的制备方法优选的包括以下步骤：将尿液污水和水分别以微孔滤膜过滤后，按照体积比混合，即得所述培养产虾青素微藻的培养基。在本发明中，所述微孔滤膜的孔径优选为0.22μm。
本发明还提供了一种经济型产虾青素微藻的培养方法，包括以下步骤：
(1)将产虾青素微藻接种于上述技术方案所述培养基，使培养基中的产虾青素微藻密度不低于4×104cells/mL，得到接种培养基；
(2)将接种培养基在光照时间为10～14h/d的条件下进行第一培养，得到第一培养物；
(3)将第一培养物在光照时间24h/d的条件下进行第二培养。
本发明将产虾青素微藻接种于上述技术方案所述培养基，使培养基中的产虾青素微藻密度不低于4×104cells/mL，得到接种培养基。
在本发明中，所述产虾青素微藻的种类包括但不限于雨生红球藻。在本发明中，所述产虾青素微藻优选的可采用BG11液体培养基进行先期培养，提高微藻密度后再进行接种。本发明对所述产虾青素微藻接种前的培养过程无特殊限定，采用本领域常规方法即可。
接种培养基中的产虾青素微藻密度不宜过低，应在4×104cells/mL以上，更优选为6×104～10×104cells/mL，密度过低易造成单个藻细胞受光辐射过强，不利于雨生红球藻的增殖。
得到接种培养基后，本发明将接种培养基在光照时间为10～14h/d的条件下进行第一培养，得到第一培养物。本发明进行第一培养的目标是获得高密度和高生物量的藻，为第二阶段培养藻细胞积累虾青素提供物质基础。
在本发明中，所述第一培养的培养温度优选为18～22℃，更优选为19℃；所述第一培养的光照强度优选为4000～4800lux，更优选为4500lux；所述第一培养的光照时间优选为12h/d；所述第一培养的培养时间优选为5～7d，更优选为6d。
得到第一培养物后，本发明将第一培养物在光照时间24h/d的条件下进行第二培养。通过改变光照时间对产虾青素微藻进行胁迫，通过不间断光照可以促使雨生红球藻尽快从营养型细胞生长期尽快进入胞囊形成期，积累包括虾青素在内的多种色素颗粒。
在本发明中，所述第二培养的培养温度优选为18～22℃，更优选为19℃；所述第二培养的光照强度优选为4000～4800lux，更优选为4500lux；所述第二培养的培养时间优选为8～12d，更优选为9d。
本发明所述产虾青素微藻的培养方法能够成功获得虾青素，产量可达到59.55mg/L，使用的培养基成本低，操作简便，从而有效降低了对产虾青素微藻的培养成本。
本发明还提供了上述技术方案所述的培养方法在净化尿液污水中的应用。利用本发明提供的培养方法可以有效利用尿液污水中的氮磷等营养成分。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述试验使用的雨生红球藻藻种购自青岛，用BG11培养基在20℃，1500lux条件下扩大培养至104cells/mL。
下述试验使用的尿液污水为三个不同的来源，对三个来源的尿液污水检测后，其主要元素的平均含量在：
来源A：北京城市文教区厕所，夏季收集(TN:7500mg/L，TP:742mg/L，Na:4123mg/L，K:2345mg/L)；
来源B：北京城市文教区厕所，冬季收集(TN:8823mg/L，TP:645mg/L，Na:3567mg/L，K:2430mg/L)；
来源C：北京城市文教区厕所，春季收集(TN:7200mg/L，TP:703mg/L，Na:3234mg/L，K:2120mg/L)。
实施例1
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:99混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
实施例2
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:124混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
实施例3
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:149混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
实施例4
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:199混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
对比例1
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:24混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
对比例2
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:49混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
对比例3
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:74混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
对比例4
取200mL自来水，曝气1小时后过0.22μm滤膜，备用；取10mL健康人体产生的尿液污水(来源于A)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:224混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
实施例5本发明所述培养基中尿液污水与水的体积比对产虾青素微藻的影响
分别将实施例1～4、对比例1～4制备的培养基按照5mL/孔各放入一个六孔板中，每个孔板中分别接种初始藻密度为5×104cells/mL的雨生红球藻，在光照强度4500lux、温度20℃、光照时间12h/d的条件下培养10d，培养期间每日摇动六孔板2次。
培养过程中隔天取样，采用0.1mL浮游植物计数框在双筒显微镜下进行细胞计数。每个样本平行计数3次。
结果如图1所示，在对比例1、对比例2、对比例3中藻细胞难以生长，藻密度迅速下降。在实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和对比例4中，藻细胞迅速增殖，并在6天内基本上达到最大生物量。其中，实施例3的藻在对数生长期具有最大的比生长速率，可达到0.31d-1。实施例1接种后藻类细胞初始滞后的其他实验组更明显；对比例4由于培养基中的盐离子浓度低，藻类细胞的最大生物量相对较低。
实施例6
取1500mL自来水，曝气6小时后过0.22μm滤膜，备用；取50mL健康人体尿液污水(来源B)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:149混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
实施例7
将实施例6制备的培养基100mL放入一个250mL锥形瓶中，每瓶中分别接种初始藻密度为8.05×104cells/mL的雨生红球藻，在温度19℃、光照强度3500lux、光照时间12h/d的条件下培养6d，光照时间24h/d的条件下培养9天。培养期间每日摇动六孔板2次。锥形瓶培养的微藻如图2所示。培养的7～10天采用改变光周期的方式对雨生红球藻进行胁迫，快速增长期(Day0-6)12L:12D，胁迫期24L:0D。实验时长为15天。
培养过程中隔天取样，采用0.1mL浮游植物计数框在双筒显微镜下进行细胞计数。每个样本平行计数3次。第10天和第15天分别测定虾青素产量。在锥形瓶中各移取30mL藻液置于50mL离心管中，用超速离心机在10000r/min的条件下离心15min，弃去上清液，在下部沉淀中加入5mL、4mol/L的H2SO4溶液，在80℃水浴中放置5min以使藻细胞破壁。
破壁后用超速离心机在10000r/min的条件下离心15min，弃去上清液，在下部沉淀中加入3mL DMSO溶液，置于45℃水浴中提取1h。用超速离心机在10000r/min的条件下离心15min，取上清液，若下部仍有沉淀则继续用3mL DMSO溶液于45℃水浴中加热1h进行提取，反复操作，直至无法离心出沉淀。
对比例5
除雨生红球藻的接种初始密度为1×104cells/mL外，其他步骤均与实施例7相同。
对比例6
除雨生红球藻的培养温度为31℃外，其他步骤均与实施例7相同。
实施例8
除雨生红球藻的温度25℃、光照强度4500lux外，其他步骤均与实施例7相同。
对比例7
除雨生红球藻的光照强度为2500lux外，其他步骤均与实施例8相同。
试验结果如表1所示，由可以看出：实施例7与对比例5、对比例6比较可知，较低温度(19℃)利于微藻生长和增殖，较高初始密度利于虾青素生产；实施例8和对比例7比较可知，较高的光照强度(4500lux)利于虾青素的积累和生产，但影响并不十分显著。
表1不同处理条件下的藻比生长速率和虾青素产量
实施例9
取1500mL自来水，曝气6小时后过0.22μm滤膜，备用；取50mL健康人体尿液污水(来源C)过0.22μm滤膜，备用；将过滤后的尿液污水和曝气自来水按照体积比1:149混合，得到用于产虾青素微藻的培养基。
实施例10
将实施例9制备的培养基100mL放入一个250mL锥形瓶中，每瓶中分别接种初始藻密度为8.05×104cells/mL的雨生红球藻，在温度19℃、光照强度4500lux、光照时间12h/d的条件下培养6d，光照时间24h/d的条件下培养9天。培养期间每日摇动六孔板2次。
培养过程中隔天取样，采用0.1mL浮游植物计数框在双筒显微镜下进行细胞计数。每个样本平行计数3次。第10天和第15天分别测定虾青素产量。
综上所述，尿液污水添加比为1：149最适宜雨生红球藻的生长，藻细胞增殖快，营养盐消耗迅速，生长周期短；经响应面优化得到最优条件组合，分析得到最优的温度、光强和初始接种藻密度组合条件。尿液污水添加比为1：149最适宜雨生红球藻的生长，藻细胞增殖快，营养盐消耗迅速，生长周期短；实施例10的培养条件最优(初始密度8.05×104cells/mL，培养温度19℃，光照强度4500lux)，响应值比生长速率可达到0.102d-1，虾青素产量可达59.55mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于培养产虾青素微藻的培养基，其特征在于，由体积比1:99～199的尿液污水和水组成。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的水为曝气自来水。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述尿液污水与水的体积比为1:140～160。
4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，将尿液污水与水分别进行微孔滤膜过滤后，按照体积比混合，得到所述培养基。
5.一种经济型产虾青素微藻的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将产虾青素微藻接种于权利要求1～4任意一项所述培养基，使培养基中的产虾青素微藻密度不低于4×104cells/mL，得到接种培养基；
(2)将接种培养基在光照时间为10～14h/d的条件下进行第一培养，得到第一培养物；
(3)将第一培养物在光照时间24h/d的条件下进行第二培养。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述产虾青素微藻为雨生红球藻。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述第一培养和第二培养的培养温度独立的为18～22℃，所述第一培养和第二培养的光照强度独立的为4000～4500lux。
8.根据权利要求5或7所述的培养方法，其特征在于，所述第一培养的培养时间为5～7d。
9.根据权利要求5或7所述的培养方法，其特征在于，所述第二培养的时间为8～12d。
10.权利要求5～9任意一项所述的培养方法在净化尿液污水中的应用。
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