CN104480178A - 胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法，属水产养殖领域。以前，雨生红球藻采用环形跑道式水泥池或光生物反应器培养，虾青素产率低，易污染，工艺复杂，操作麻烦，基建投资大，成本高。本发明采用二阶段养殖法，第一阶段在三角烧瓶中培养，设置较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段采用白塑料桶充气培养，提高了温度和光照强度并延长了光照时间，有利于虾青素积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，营养更全面、均衡，成本低，操作灵活、方便，虾青素产量提高120％。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法。
背景技术
雨生红球藻又叫湖生红球藻或湖生血球藻，广泛存在于有机质丰富的淡水水体。隶属绿藻门，绿藻纲，团藻目，红球藻科，红球藻属。雨生红球藻中虾青素含量为1.5-3.0％，被看作是天然虾青素的浓缩品。虾青素是一种高效的纯天然抗氧化剂，主要功能是清除自由基，提高人体抗衰老能力。大量研究表明雨生红球藻积累虾青素的速率和产量高于其它生物，而且雨生红球藻所含虾青素及其酯类的配比(约70％单酯，25％双酯及5％单体)与水产养殖动物自身配比极相似，具有化学合成和利用红发夫酵母等提取的虾青素没有的优势。雨生红球藻中虾青素的结构以3S-3’S型为主，与鲑鱼等水产生物体内虾青素结构基本一致；而红发夫酵母中虾青素结构则为3R-3R型。雨生红球藻被公认为是自然界中生产天然虾青素的最好生物，培养雨生红球藻提取虾青素具有广阔的发展前景。另外，雨生红球藻提取物呈艳丽的红色，具有极强的色素沉积能力，作为一种功能性色素，可用作鲍鱼、鲟鱼、鲑鱼、虹鳟鱼、真鲷、甲壳类动物及观赏鱼类和各种禽类、生猪的饲料添加剂，作用是抗氧化、消除自由基，促进抗体的产生，增强动物免疫力，提高其观赏价值。雨生红球藻在有机质多，特别是氮、磷盐丰富的淡水中生长旺盛，最适生长温度25-30℃，最适光照强度4000-18000lux，适宜pH范围7.5-8.5。
我的研究表明，雨生红球藻生长阶段和虾青素积累阶段对光照、温度、盐度、营养盐等环境因子要求显著不同，高光强、高温度和培养液的老化有利于虾青素的合成。据此，本发明提出了雨生红球藻生产的二阶段养殖法，即先用较低的温度和光照及较高的氮盐条件使藻增殖至较理想的密度，再提高温度和光照胁迫虾青素的积累。
关于胁迫雨生红球藻大量积累虾青素的方法，过去，严小军公开了一种雨生红球藻生产虾青素的方法(申请号201310038104)，先将雨生红球藻在培养池池水中自然培养6-8天，让其增殖，再在池水中加入磷酸二氢钾和硝酸钠，并在池上覆有红色薄膜，波长为630-760nm光波照射下，让雨生红球藻藻细胞快速生长至转化态；转化态藻细胞在浓度为0.02-0.05克/升的磷酸二氢钾的池水中，并在池上覆有蓝色薄膜，波长为430-490nm光波照射下，让雨生红球藻藻细胞养至成熟，得到富含虾青素的雨生红球藻；磷酸二氢钾、硝酸钠和红光可以使藻细胞快速生长，较短时间达到转化态；磷酸二氢钾、蓝光可以使藻细胞快速生长成熟和累积虾青素；该方法投资少，培养简单，效益较高，但操作麻烦，易污染，难以在生产中推广应用。另外，徐青山也发明了一种培养雨生红球藻生产虾青素的转化方法(申请号201210561399)，包括固定化转化细胞的制备、固定化转化细胞与营养生长细胞相结合、相关的环境条件控制等，步骤如下：1)制备高密度的雨生红球藻转化细胞；2)制备固定化凝胶载体；3)制备固定化雨生红球藻转化细胞凝胶载体；4)根据需要的藻种浓度，加入步骤3制备的雨生红球藻转化细胞凝胶载体，固定化凝胶载体与需要转化的培养细胞；5)温度控制在24-26℃，控制光照在8000Lux，通过调节水位的方法，控制水位在0.5m，采用流水的方法，实现固定化转化细胞的诱导转化；本发明提供的方法诱导效果明显，运行稳定可靠，但工艺复杂，操作麻烦，基建投资大，成本高，效益差。
为了克服目前技术的不足，本发明采用二阶段养殖法，第一阶段在三角烧瓶中进行，提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段在微藻培养室中采用白塑料桶充气培养，提高了温度和光照强度并延长了光照时间，有利于虾青素的积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了Ca(NO3)2，NaH2PO4，MgSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，MnCl2·4H2O，FeSO4·7H2O，尿素，人尿，泛酸钙，麦饭石粉，α-萘乙酸，肌醇，叶酸，尼古丁酸，维生素H，EDTA，土壤浸出液等成分，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，虾青素产量提高120％。
发明内容
为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法，具体方法如下：
步骤1培养液的准备培养液成分：Ca(NO3)20.4份，NaH2PO40.1份，MgSO4·7H2O 0.05份，CuSO4·5H2O 0.02份，MnCl2·4H2O 0.1份，FeSO4·7H2O 0.04份，尿素0.5份，人尿1份，泛酸钙0.03份，麦饭石粉0.04份，α-萘乙酸0.002份，肌醇0.001份，叶酸0.004份，尼古丁酸0.001份，维生素H 0.008份，EDTA 0.04份，土壤浸出液1.2份，冷开水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，摇匀，密封，置入4℃冰箱保存备用；
步骤2三角烧瓶培养取一3000毫升三角烧瓶，加入1500毫升步骤1所述培养液，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的雨生红球藻藻种接种，接种要在上午9-10点进行，接种密度4万个细胞/每毫升，轻轻摇匀，报纸和橡皮筋封口，放在微藻培养室中进行培养，空调控温，日光灯管提供光照，不充气，调节温度至26℃，光照强度至5000lux，光暗周期＝12h/L+12h/D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗，每天手动摇瓶3次，每次45秒钟，连续培养7天后，转入下一步骤；
步骤3白塑料桶培养取一65升带盖的大口白塑料桶(市场有售)，加入步骤1所述培养液40升，再加入步骤2所述藻液1800毫升，轻轻摇动3分钟，盖上盖子，进行培养。盖子上打上2个孔，每个孔直径10毫米，***2根管子，一根为塑料管，长3米，直径8毫米，一端连接空气压缩机，另一端***到藻液底部，用以充气，充入混合气体，气体成分＝空气98％+纯CO22％，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可；另一根较短，长30厘米，直径10毫米，为比较硬的料管，用以排气；将此塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，提供连续不间断光照，连续培养8天，前4天调节温度至28℃，光照强度18000lux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为12000lux)，后4天，调节温度至30℃，光照强度20000lux，后转入下一步骤；
步骤4藻细胞收集取步骤3所述藻液1000份，加入0.5份甲壳素，充分搅拌15分钟，再加入0.8份明矾，搅拌20分钟，静置、沉淀36小时，弃上清液，取底部红色藻泥，藻细胞收集完毕。
有益结果
以前，雨生红球藻采用环形跑道式水泥池或光生物反应器培养，缺点是虾青素产率低，易污染，工艺复杂，操作麻烦，基建投资大，成本高，经济效益差。为了克服目前技术的不足，本发明采用二阶段养殖法，第一阶段在三角烧瓶中进行，提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段在微藻培养室中采用白塑料桶充气培养，提高了温度和光照强度并延长了光照时间，有利于虾青素的积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了Ca(NO3)2，NaH2PO4，MgSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，MnCl2·4H2O，FeSO4·7H2O，尿素，人尿，泛酸钙，麦饭石粉，α-萘乙酸，肌醇，叶酸，尼古丁酸，维生素H，EDTA，土壤浸出液等成分，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，虾青素产量提高120％。
附图说明
图1为显微镜视野下大量积累虾青素的雨生红球藻形态；
图2为步骤3中培养雨生红球藻所用白塑料桶图；
图3为雨生红球藻的生长情况，其中横坐标为培养时间(天)，纵坐标为细胞密度，单位是万个细胞/每毫升藻液。
具体实施方式
步骤1中所述土壤浸出液制备方法：取树林中松散、富含有机质的上层土壤1千克，加自来水5升，煮沸20分钟，将泥浆倒入烧杯中，静置24小时，后吸取上清液，倒入三角烧瓶中，加棉花塞，煮沸15分钟，冷却，静置沉淀12小时，取上清液即得土壤浸出液，装入磨口塞试剂瓶，密封，贴上标签，置于4℃冰箱备用；
步骤1中所述人尿制备方法：取一3000毫升三角烧瓶，装入人尿1500毫升，静置，自然发酵48小时，放在电炉上加热，煮沸3分钟，冷却，装入磨口塞棕色试剂瓶，密封，置于4℃冰箱冷藏备用；
接种用的雨生红球藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例如高氏
提取法)，以确保接种时藻种为纯种且处于生长旺盛的指数生长期；
步骤1中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；
步骤1中各种无机营养盐和维生素可预先配成母液且置于4℃冰箱冷藏保存备用，放置时间不要超过30天；
步骤1和2中所用三角烧瓶等玻璃仪器均需洗刷干净放在85℃烘箱中烘干后使用；
步骤2所述接种过程需在上午9-10点且在无菌操作台上进行；
步骤3中所用塑料桶要选用透光性好且韧性强度高，以提高光能利用率和塑料桶使用寿命；
步骤1中所用化学药品纯度均需化学纯级别。
一种胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法，具体方法如下：
步骤1培养液的准备培养液成分：Ca(NO3)20.4份，NaH2PO40.1份，MgSO4·7H2O 0.05份，CuSO4·5H2O 0.02份，MnCl2·4H2O 0.1份，FeSO4·7H2O 0.04份，尿素0.5份，人尿1份，泛酸钙0.03份，麦饭石粉0.04份，α-萘乙酸0.002份，肌醇0.001份，叶酸0.004份，尼古丁酸0.001份，维生素H 0.008份，EDTA 0.04份，土壤浸出液1.2份，冷开水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，摇匀，密封，置入4℃冰箱保存备用；
步骤2三角烧瓶培养取一3000毫升三角烧瓶，加入1500毫升步骤1所述培养液，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的雨生红球藻藻种接种，接种要在上午9-10点进行，接种密度4万个细胞/每毫升，轻轻摇匀，报纸和橡皮筋封口，放在微藻培养室中进行培养，空调控温，日光灯管提供光照，不充气，调节温度至26℃，光照强度至5000lux，光暗周期＝12h/L+12h/D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗，每天手动摇瓶3次，每次45秒钟，连续培养7天后，转入下一步骤；
步骤3白塑料桶培养取一65升带盖的大口白塑料桶(市场有售)，加入步骤1所述培养液40升，再加入步骤2所述藻液1800毫升，轻轻摇动3分钟，盖上盖子，进行培养。盖子上打上2个孔，每个孔直径10毫米，***2根管子，一根为塑料管，长3米，直径8毫米，一端连接空气压缩机，另一端***到藻液底部，用以充气，充入混合气体，气体成分＝空气98％+纯CO22％，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可；另一根较短，长30厘米，直径10毫米，为比较硬的料管，用以排气；将此塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，提供连续不间断光照，连续培养8天，前4天调节温度至28℃，光照强度18000lux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为12000lux)，后4天，调节温度至30℃，光照强度20000lux，后转入下一步骤；
步骤4藻细胞收集取步骤3所述藻液1000份，加入0.5份甲壳素，充分搅拌15分钟，再加入0.8份明矾，搅拌20分钟，静置、沉淀36小时，弃上清液，取底部红色藻泥，藻细胞收集完毕。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种胁迫雨生红球藻快速积累虾青素的方法，其特征在于具体步骤如下：
步骤(1)培养液的准备
培养液成分：Ca(NO3)2 0.4份，NaH2PO4 0.1份，MgSO4·7H2O 0.05份，CuSO4·5H2O 0.02份，MnCl2·4H2O 0.1份，FeSO4·7H2O 0.04份，尿素0.5份，人尿1份，泛酸钙0.03份，麦饭石粉0.04份，α-萘乙酸0.002份，肌醇0.001份，叶酸0.004份，尼古丁酸0.001份，维生素H 0.008份，EDTA 0.04份，土壤浸出液1.2份，冷开水1000份；装入棕色磨口塞试剂瓶中，摇匀，密封，置入4℃冰箱保存备用；
步骤(2)三角烧瓶培养
取一3000毫升三角烧瓶，加入1500毫升步骤1所述培养液，选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的雨生红球藻藻种接种，接种要在上午9-10点进行，接种密度4万个细胞/每毫升，轻轻摇匀，报纸和橡皮筋封口，放在微藻培养室中进行培养，空调控温，日光灯管提供光照，不充气，调节温度至26℃，光照强度至5000lux，光暗周期＝12h/L+12h/D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗，每天手动摇瓶3次，每次45秒钟，连续培养7天，转入下一步骤；
步骤(3)白塑料桶培养
取一65升带盖的大口白塑料桶(市场有售)，加入步骤1所述培养液40升，再加入步骤2所述藻液1800毫升，轻轻摇动3分钟，盖上盖子，进行培养。盖子上打上2个孔，每个孔直径10毫米，***2根管子，一根为塑料管，长3米，直径8毫米，一端连接空气压缩机，另一端***到藻液底部，用以充气，充入混合气体，气体成分＝空气98％+纯CO22％，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻细胞浮起不下沉即可；另一根较短，长30厘米，直径10毫米，为比较硬的料管，用以排气；将此塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，提供连续不间断光照，连续培养8天，前4天调节温度至28℃，光照强度18000lux(因塑料桶壁的阻挡和吸收作用，到达藻液的实际光照强度约为12000lux)，后4天，调节温度至30℃，光照强度20000lux，后转入下一步骤；
步骤(4)藻细胞收集
取步骤3所述藻液1000份，加入0.5份甲壳素，充分搅拌15分钟，再加入0.8份明矾，搅拌20分钟，静置、沉淀36小时，弃上清液，取底部红色藻泥，藻细胞收集完毕。
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