CN108359609A - 高生存性小球藻cv-6、其筛选方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高生存性小球藻CV‑6，它是从我国河北省水源分离筛选出来的藻类，该小球藻CV‑6的叶绿素含量高，对营养物质具有高效的转化能力，在沼液废水中具有高效的净化处理能力；本发明还提供了高生存性小球藻CV‑6的筛选方法，包括富集、分离纯化和筛选步骤，筛选方法简单，过程易于控制，筛选的小球藻纯度较高。本发明适用于筛选高生存性小球藻CV‑6，进一步地应用于牛养殖场发酵池废水处理中。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程领域，涉及一种高生存性小球藻CV-6、其筛选方法及其应用。
背景技术
微藻属于光能自养单细胞生物，其资源丰富、种类多、光合效率高及适应性强。它没有根茎叶等植物所特有的特征结构，但通常含有叶绿素a作为其主要的光合色素，因此微藻具有光合植物以及微生物的双重特色，微藻的光合效率是普通绿色植物的很多倍，每年固定的CO2超过全球净固定量的40%。利用微藻处理养殖废水，可以在处理污水的同时获得高价值的藻株，有助于养殖业的长期发展。而且微藻的培养不占用耕地，在自然界分布广泛，因此可以利用我国广阔的非耕种用地进行养殖，微藻产业非常适合在我国发展。
近年来，奶牛养殖业的工业***越来越集约化、专业化和规模化，但是随之而来的是大量***物引发的一系列环境问题。奶牛场的废水主要由牛粪、牛奶和牛尿组成，此类养殖废水COD、BOD、NH3-N和SS指标浓度高。虽然微藻可以处理养殖废水，但不同藻种的处理效率不同，针对不同养殖废水的处理效率也不同，因此需要根据不同的养殖废水筛选特异性的藻株，以提高处理效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种高生存性小球藻CV-6，它是从我国河北省水源分离筛选出来的藻类，该小球藻CV-6的叶绿素含量高，对营养物质具有高效的转化能力，在沼液废水中具有高效的净化处理能力；
本发明的另外一个目的，是提供了一种高生存性小球藻CV-6的筛选方法，依次经由富集、分离纯化及筛选得到，筛选方法简单，过程易于控制，筛选的小球藻纯度较高；
本发明还有一个目的，是提供了一种高生存性小球藻CV-6在沼液废水净化处理中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种高生存性小球藻CV-6（Chlorella ellipsoidea），它是从我国河北省水源分离筛选出来的藻类，该株藻已于2018年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，生物学命名为椭圆小球藻（Chlorella ellipsoidea），该生物材料为存活状态，保藏编号为：CGMCC No.15207。
作为本发明高生存性小球藻CV-6的一种限定，其18SrDNA的基因序列如下：
TCAAGTTTTTTTCCCTATCAGCTTTCGATGGTAGGATAGAGAGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACTGGGCCTTTTCAGGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAACCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGGCTTGCCGGTCCGCCGTTTCGGTGTGCACTGGCAGGGCCCACCTTGTTGCCGGGGACGGGCTCCTGGGCTTCGCTGTCCGGGACTCGGAGTCGGCGCTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTACGCTCTGAATACATTAGCATGGAATAACACGATAGGACTCTGGCCTATCCTGTTGGTCTGTAGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTCGGG。
本发明还提供了高生存性小球藻CV-6的筛选方法，它按照如下的步骤顺序依次进行：
（1）富集
将本地污水稀释10倍，经过16层纱布过滤，于3000r/min离心15min，取上清加入到BG11液体培养基中，于25-29℃、光照强度2000-4000Lux、全光照条件下培养10-15天，每天摇动2-3次；
（2）分离纯化
取富集的藻液在BG11固体培养基中划线，倒置，于25-29℃、光照强度2000-4000 Lux，全光照条件下培养至单菌落出现；
将获得的单克隆藻种分别接到100mL BG11液体培养基中，于25-29℃，光照强度2000-4000Lux，全光照条件下培养7-15d后，分别取样测其生物量，选取生物量大、不贴壁生长的藻株接入新的BG11液体培养基中进行培养，用于筛选；
（3）筛选
在3-5倍稀释的奶牛养殖场沼液中接入步骤（2）经BG11液体培养基培养的用于筛选的藻液，置于25℃、光照强度8000-10000 Lux、光照时间12-24h的条件下培养，每天取样测其生物量，选择能在废水中较好生长的微藻，获得目的小球藻。
作为本发明高生存性小球藻CV-6的筛选方法的一种限定，所述步骤（1）中，BG11液体培养基包括如下组分：
每升培养基中含有NaNO3 1.5g、Na2NO3 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl20.028g、EDTA-Na2 0.001g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵 0.006g、微量元素溶液1mL；
所述微量元素溶液每升溶液中含有，H3BO3 2.86g、MnCl2·4H2O 1.86g、ZnSO4·7H2O0.22g、Na2MoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g、Co(NO3)2·6H2O 0.05g，该培养基调节PH至7.1。
作为高生存性小球藻CV-6的筛选方法的另一种限定，所述步骤（2）中，BG11固体培养基包括如下组分：
每升培养基中含有NaNO3 1.5g、Na2NO3 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl20.028g、EDTA-Na2 0.001g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵 0.006g、琼脂粉20g、微量元素溶液1mL；
所述微量元素溶液每升溶液中含有，H3BO3 2.86g、MnCl2·4H2O 1.86g、ZnSO4·7H2O0.22g、Na2MoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g、Co(NO3)2·6H2O 0.05g，该培养基调节PH至7.1。
本发明还提供了高生存性小球藻CV-6的应用，所述高生存性小球藻CV-6应用于奶牛养殖场沼液污水处理中。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的一种高生存性小球藻CV-6，叶绿素含量高，对营养物质具有高效的转化能力，在沼液废水中具有高效的净化处理能力；
本发明提供的小球藻CV-6筛选方法简单、耗能少、时间短，且筛出的小球藻处理奶牛养殖场沼液的效率高，且生物量增长快。
本发明提供的小球藻CV-6能利用奶牛养殖场的发酵池的废水营养物质进行生长，无需再外来添加营养成分，在降低废水中的COD、TN、TP净化水质的同时，提高了微藻的生物量，又进一步降低了成本，且操作简单、效果明显。
本发明适用于筛选高生存性小球藻CV-6，进一步地应用于牛养殖场发酵池废水处理中。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1 实施例5中COD随小球藻CV-6生长的变化曲线图；
图2为实施例5中废水TN含量随小球藻CV-6生长的变化曲线图；
图3为实施例5废水TP含量随小球藻CV-6生长的变化曲线图；
图4为实施例6中6株微藻在5倍稀释沼液中的生长情况曲线图（其中生物量为稀释10倍后的结果）。
具体实施方式
下述实施例中所述的方法如无特殊说明均采用现有的方法，下述实施例中所述的试剂如无特殊说明均采用市售试剂。
实施例1 一种高生存性小球藻CV-6及其筛选方法
本实施例为一种高生存性小球藻CV-6（Chlorella ellipsoidea），它是从我国河北省水源分离筛选出来的藻类，该株藻已于2018年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，生物学命名为椭圆小球藻，保藏编号为：CGMCC No.15207。
该高生存性小球藻CV-6的18SrDNA的基因序列如下：
TCAAGTTTTTTTCCCTATCAGCTTTCGATGGTAGGATAGAGAGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACTGGGCCTTTTCAGGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAACCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGGCTTGCCGGTCCGCCGTTTCGGTGTGCACTGGCAGGGCCCACCTTGTTGCCGGGGACGGGCTCCTGGGCTTCGCTGTCCGGGACTCGGAGTCGGCGCTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTACGCTCTGAATACATTAGCATGGAATAACACGATAGGACTCTGGCCTATCCTGTTGGTCTGTAGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTCGGG。
上述高生存性小球藻CV-6（Chlorella ellipsoidea）的筛选方法按照如下的步骤顺序依次进行：
（11）富集
将本地污水稀释10倍，经过16层纱布过滤，于3000r/min离心15min，取上清加入到BG11液体培养基中，于25℃、光照强度3000Lux、全光照条件下培养10天，每天摇动2-3次；
（12）分离纯化
取富集的藻液在BG11固体培养基中划线，倒置，于25℃、光照强度2000 Lux，全光照条件下培养至单菌落出现；
将获得的单克隆藻种分别接到100mL BG11液体培养基中，于27℃，光照强度4000Lux，全光照条件下培养10d后，分别取样测其生物量，选取生物量大、不贴壁生长的藻株接入新的BG11液体培养基中进行培养，用于筛选；
（13）筛选
在3-5倍稀释的奶牛养殖场沼液中接入步骤（2）经BG11液体培养基培养的藻液，置于25℃、光照强度10000 Lux、光照时间12h条件下培养，每天取样测其生物量，选择能在废水中较好生长的微藻，获得目的小球藻；
上述步骤中BG11液体培养基（该培养基调节PH至7.1）包括如下组分：
每升培养基中含有NaNO3 1.5g、Na2NO3 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl20.028g、EDTA-Na2 0.001g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵 0.006g、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液每升溶液中含有，H3BO3 2.86g、MnCl2·4H2O 1.86 g、ZnSO4·7H2O0.22g、Na2MoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g、Co(NO3)2·6H2O 0.05 g。
BG11固体培养基（该培养基调节PH至7.1）包括如下组分：
每升培养基中含有NaNO3 1.5g、Na2NO3 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl20.028g、EDTA-Na2 0.001g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵 0.006g、琼脂粉20g、微量元素溶液1mL；
微量元素溶液每升溶液中含有，H3BO3 2.86g、MnCl2·4H2O 1.86 g、ZnSO4·7H2O0.22g、Na2MoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g、Co(NO3)2·6H2O 0.05 g。
本实施例提供的小球藻CV-6筛选方法简单、耗能少、时间短，且筛出的小球藻处理奶牛养殖场沼液的效率高，且生物量增长快。
实施例2-4 高生存性小球藻CV-6的筛选方法
实施例2-4分别为一种高生存性小球藻CV-6，它的18SrDNA的基因序列与实施例1相同，筛选步骤与实施例1相似，不同之处仅在于：相应的技术参数不同。
实施例2-4所筛选的小球藻为高生存性小球藻CV-6，筛选方法简单、耗能少、时间短，且筛出的小球藻处理奶牛养殖场沼液的效率高，且生物量增长快。
实施例5 高生存性小球藻CV-6在牛养殖场发酵池废水处理中的应用
将实施例1-4所筛选的高生存性小球藻CV-6应用于牛养殖场发酵池废水中，在废水中生长状态好，可达到生物量17.75g/L,选取CV-6藻株作为目的藻株进行污水处理。
取奶牛养殖场沼液五倍稀释，接入10%（v/v）预培养的CV-6藻液，设3个平行样，置于27℃、9000Lux，光照时间为16h的条件下培养。每天取样，然后于3000r/min，离心15min，取上清。测定COD、TN、TP值。结果如下:
1、 COD随藻株CV-6生长的变化
奶牛养殖场沼液废水中COD随小球藻CV-6生长的变化曲线如图1所示，从图中可以看出，体系的COD值随着培养时间的延长逐渐减少，在20天后变化较小，在24天时达到最低值，约为264.04mg/L，降低率为44.45%。
2 、TN随藻株CV-6生长的变化
藻株CV-6生长对TN含量的影响如图2所示。从图中可以看出，随着藻株CV-6的快速生长，体系中的氮含量也逐渐降低，在第16天下降到较低水平，此后平稳降低，此时TN值也达到最低值44.56mg/L，体系中的TN含量降低了58.26%。实验结果表明藻株CV-6具有降低水体中TN含量的潜力。
3、TP随藻株CV-6生长的变化
CV-6生长对体系TP含量的影响如图3所示。接入藻株CV-6后，随着藻株的快速生长，水体中的TP含量快速降低；第20天后，TP的下降趋势慢慢平缓，到第24天时，其TP含量达到最低约为16.95mg/L，与初始相比下降了约63.98%。
实施例6 不同种类的小球藻在牛养殖场发酵池废水中的生长状况探究
将本地水源样品稀释10倍，经过16层纱布过滤，再用离心机离心（3000r/min，15min）取上清加入到BG11液体培养基（PH7.1）中，于27℃、光照强度4000Lux、全光照条件下培养15天，每天摇动2-3次。
取富集的藻液在BG11固体培养基（含2%的琼脂粉）分离得到纯藻种。将获得的单克隆藻种分别接到100mL BG11液体培养基中，在27℃，光照强度4000Lux，全光照条件下培养7d后，分别取样测其生物量，选取生物量大、不贴壁生长的藻株接入新的BG11液体培养基中进行培养，进行形态特征观察。保留形态不同、生物量较大的6株微藻继续进一步筛选。
BG11液体培养基分离的优势藻种
将生长至对数生长期的6株微藻接种到稀释五倍的沼液中，在光照强度为9000 LUX，温度27 ℃，全光照的条件下，通过废水的选择性筛选出适合在废水中生长的藻种，每天取样测其生物量，选择能在废水中较好生长的微藻，获得目的小球藻。6株微藻在五稀释废水中生长情况如图4所示。
由图可知，6株藻种在5倍稀释废水中生长情况彼此差异很大，因沼液环境的恶劣，生长前期，6株微藻均受到不同程度的抑制，第6天后，藻种才适应废水的恶劣环境开始生长，藻种HT-1、HT-2因废水恶劣环境的抑制，生长状态不好，其中藻种CV-6在废水中生长状态最好，可达到生物量17.75g/L,选取CV-6藻株作为目的藻株进行污水处理。
实施例1-5，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。
序列表
<110> 石家庄君乐宝乳业有限公司
河北乐源牧业有限公司
<120> 高生存性小球藻CV-6、其筛选方法及其应用
<130> 2018.03.14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 643
<212> DNA
<213> Chlorella ellipsoidea
<400> 1
tcaagttttt ttccctatca gctttcgatg gtaggataga gagcctacca tggtggtaac 60
gggtgacgga ggattagggt tcgattccgg agagggagcc tgagaaacgg ctaccacatc 120
caaggaaggc agcaggcgcg caaattaccc aatcctgaca cagggaggta gtgacaataa 180
ataacaatac tgggcctttt caggtctggt aattggaatg agtacaatct aaacccctta 240
acgaggatca attggagggc aagtctggtg ccagcagccg cggtaattcc agctccaata 300
gcgtatattt aagttgctgc agttaaaaag ctcgtagttg gatttcgggt ggggcttgcc 360
ggtccgccgt ttcggtgtgc actggcaggg cccaccttgt tgccggggac gggctcctgg 420
gcttcgctgt ccgggactcg gagtcggcgc tgttactttg agtaaattag agtgttcaaa 480
gcaggcctac gctctgaata cattagcatg gaataacacg ataggactct ggcctatcct 540
gttggtctgt aggaccggag taatgattaa gagggacagt cgggggcatt cgtatttcat 600
tgtcagaggt gaaattcttg gatttatgaa agacgaactc ggg 643
Claims (6)
1.一种高生存性小球藻CV-6，其特征在于：它是从我国河北省水源分离筛选出来的藻类，该株藻已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.15207。
2.根据权利要求1所述的高生存性小球藻CV-6，其特征在于：其18SrDNA的基因序列如下：
TCAAGTTTTTTTCCCTATCAGCTTTCGATGGTAGGATAGAGAGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACTGGGCCTTTTCAGGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAACCCCTTAACGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTAAGTTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGGCTTGCCGGTCCGCCGTTTCGGTGTGCACTGGCAGGGCCCACCTTGTTGCCGGGGACGGGCTCCTGGGCTTCGCTGTCCGGGACTCGGAGTCGGCGCTGTTACTTTGAGTAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTACGCTCTGAATACATTAGCATGGAATAACACGATAGGACTCTGGCCTATCCTGTTGGTCTGTAGGACCGGAGTAATGATTAAGAGGGACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTCGGG。
3.一种如权利要求1或2所述的高生存性小球藻CV-6的筛选方法，其特征在于，按照如下的步骤顺序依次进行：
（1）富集
将本地污水稀释10倍，经过16层纱布过滤，于3000r/min离心15min，取上清加入到BG11液体培养基中，于25-29℃、光照强度2000-4000Lux、全光照条件下培养10-15天，每天摇动2-3次；
（2）分离纯化
取富集的藻液在BG11固体培养基中划线，倒置，于25-29℃、光照强度2000-4000 Lux，全光照条件下培养至单菌落出现；
将获得的单克隆藻种分别接到100mL BG11液体培养基中，于25-29℃，光照强度2000-4000Lux，全光照条件下培养7-15d后，分别取样测其生物量，选取生物量大、不贴壁生长的藻株接入新的BG11液体培养基中进行培养，用于筛选；
（3）筛选
在3-5倍稀释的奶牛养殖场沼液中接入步骤（2）经BG11液体培养基培养的藻液，置于25℃、光照强度8000-10000 Lux、光照时间12-24h的条件下培养，每天取样测其生物量，选择能在废水中较好生长的微藻，获得目的小球藻。
4.根据权利要求3所述的高生存性小球藻CV-6的筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）中，BG11液体培养基包括如下组分：
每升培养基中含有NaNO3 1.5g、Na2NO3 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl2 0.028g、EDTA-Na2 0.001g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵 0.006g、 微量元素溶液1mL；
所述微量元素溶液每升溶液中含有，H3BO3 2.86g、MnCl2·4H2O 1.86g、ZnSO4·7H2O0.22g、Na2MoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g、Co(NO3)2·6H2O 0.05g，该培养基调节PH至7.1。
5.根据权利要求3所述的高生存性小球藻CV-6的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中，BG11固体培养基包括如下组分：
每升培养基中含有NaNO3 1.5g、Na2NO3 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.04g、MgSO4·7H2O0.075g、CaCl20.028g、EDTA-Na2 0.001g、柠檬酸 0.006g、柠檬酸铁铵 0.006g、琼脂粉20g、微量元素溶液 1mL；
所述微量元素溶液每升溶液中含有，H3BO3 2.86g、MnCl2·4H2O 1.86g、ZnSO4·7H2O0.22g、Na2MoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g、Co(NO3)2·6H2O 0.05g，该培养基调节PH至7.1。
6.一种如权利1或2所述的高生存性小球藻CV-6的应用，其特征在于：所述高生存性小球藻CV-6应用于奶牛养殖场沼液污水处理中。
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