CN110129291B

CN110129291B - 大麦耐湿调控基因HvACO1、蛋白及其在育种中的应用

Info

Publication number: CN110129291B
Application number: CN201910302541.2A
Authority: CN
Inventors: 栾海业; 许如根; 吕超; 郭宝健; 王菲菲
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-04-16
Filing date: 2019-04-16
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2039-04-16
Also published as: CN110129291A

Abstract

本发明公开了大麦耐湿调控基因HvACO1、蛋白及其在育种中的应用。大麦耐湿基因HvACO1的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。本发明首次从耐湿大麦中克隆得到耐湿基因HvACO1，并证明该基因与大麦耐湿性有关，采用基因工程的方法，将HvACO1基因过表达到拟南芥中，与对照组相比，转基因植株耐湿能力显著增强，说明HvACO1基因的过表达提高了植株的耐湿性。本发明中HvACO1基因的克隆与转化、转基因等技术为研究大麦耐湿的分子机理及育种应用奠定了基础，具有广阔的育种应用前景和一定的经济价值。

Description

大麦耐湿调控基因HvACO1、蛋白及其在育种中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一个大麦耐湿调控基因HvACO1及其育种应用。

背景技术

湿害是土壤水分饱和或过饱和时对作物正常生长发育所产生的危害。湿害在世界范围内均有发生，尤在北美、澳大利亚、中国、印度等国湿害时常发生。据***粮食及农业组织公布的数据显示，世界范围内约有10%的种植面积受到湿害的影响。大麦旱作物，湿害严重影响大麦产量和品质。湿害一般可使大麦减产20%-30%，严重甚至绝收。

湿害胁迫阻碍了植物根际组织内气体的自由流通，影响植株的光合作用和呼吸作用。植物可通过合成乙烯等生物激素来调控植物细胞程序性死亡及新生不定根与通气组织的形成，适应缺氧的逆境环境，与乙烯合成相关的基因对提高植物的耐湿性具有调节作用。乙烯合成酶（ACS）和乙烯氧化酶（ACO）是乙烯合成途径中的两个关键酶，已有研究表明，将棉花的GhACO基因转入拟南芥中，GhACO基因表达增强了拟南芥体内乙烯的生物合成，进而增强了拟南芥对非生物胁迫的耐受性。近年来，关于作物耐湿、耐盐、耐旱等抗逆相关基因的克隆及育种利用已有不少报道，为耐逆作物品种的选育提供了一种新的技术途径。目前，大麦耐湿相关的基因的研究主要集中在QTL定位层面，尚未见大麦耐湿基因克隆与育种应用研究报道。

发明内容

本发明目的是提供一个大麦耐湿调控基因HvACO1及其育种应用，克隆并构建HvACO1基因表达载体，利用转基因技术导入拟南芥中，对转基因拟南芥进行湿害胁迫处理，验证HvACO1的耐湿功能，为大麦耐湿品种改良提供基因资源及理论依据。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：一种大麦耐湿调控相关蛋白，所述的蛋白为如下（a）或（b）：

（a）由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；具体序列为MEIPVIDLQGLDGDASQRSQTMARLHEACKDWGFFWVDSHGVDAALMEEVKRFVYAHYDEHLKDRFYASDLAKDLLLPAEESKAVSGEVDWETAYFIRHRPANNVADFPEIPPATREMLDVYIGQMVSLAERLAECMSLNLGLDGGRVKDTFAPPFVGTKFAMYPACPRPDLLWGLRAHTDAGGIILLLQDDVVGGLEFFRGDREWVPVGPTKGSRIFVNLGDQLEVMSGGAYRSVLHRVAAVAEGRRLSVATFYNPGAEAVVAPAPTARQPAAQVYPGPYRFGDYLDYYQGTKFADKAARLQAVKELFGSRILPD；

（b）将SEQ ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与大麦耐湿调控相关的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。

本发明还提供编码前述蛋白的基因。所述基因是如下（a1）-（a3）中任何一种的DNA分子；

（a1）SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

（a2）在严格条件下与（a1）限定的DNA序列杂交且编码大麦耐湿调控相关蛋白的DNA分子；

（a3）与（a1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或者至少具有99%同源性且编码大麦耐湿调控相关蛋白的DNA分子。

本发明还提供含有前述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明的另一个目的是提供（b1）或（b2）或（b3）的应用：

（b1）所述蛋白，或，所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗大麦湿害胁迫中的应用；

（b2）所述蛋白，或，所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育大麦、拟南芥耐湿新品种中的应用；

（b3）所述蛋白，或，所述基因，或，含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗拟南芥湿害胁迫中的应用。

本发明还提供一种培育植物耐湿品种的方法，将所述的基因转入目的植物，或所述的表达盒、重组载体转化目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物的湿害胁迫抗性高于所述目的植物。所述目的植物为大麦、拟南芥。所述的转基因植物表达所述的大麦耐湿相关蛋白。

HvACO1基因所述DNA 片段如序列表SEQ ID NO.1所示，或者基本相当于SEQ IDNO.1所示的DNA 序列，或者其功能相当于SEQ ID NO.1所示序列的部分片段。对该基因进行序列分析表明HvACO1基因编码区全长为952 bp、编码317个氨基酸，分子量为35.02kDa、等电点为5.16，含有保守的D10x-N和20G-FelI-Oxy结构域。超表达序列表SEQ ID NO.1所示序列可增强拟南芥和大麦等植物对湿害的耐性。

上述基因可以应用于改良大麦耐湿能力，具体操作如下：

(1) 基因的获得：对大麦耐湿材料TF58的根系进行蛋白组学分析发现，湿害胁迫导致根系中HvACO1基因明显上调表达，提取TF58根系总RNA，利用RT-PCR扩增到HvACO1基因序列，将扩增产物连接到pGEM-Teasy载体上，经测序获得目的基因克隆。

(2)表达载体的构建与遗传转化：利用Invitrogen公司的Gateway技术构建大麦HvACO1基因超表达载体。利用BP Clonase™ enzyme，将目的基因与pDONR221载体连接，构建入门载体，再利用LR Clonase™ enzyme，将入门载体与pB2GW7载体连接，构建HvACO1基因超表达载体。通过液氮冻融法将HvACO1基因超表达载体导入农杆菌Gv3101中。利用农杆菌介导的遗传转化法，将HvACO1基因导入拟南芥中表达。通过抗生素筛选、RT-PCR等筛选阳性转基因拟南芥植株。

(3) 转基因植株耐湿性鉴定及HvACO1基因功能验证：将正常生长35天的转基因和野生型株系进行淹水处理。淹水处理2周后，观察到转基因植株的耐湿性显著好于野生型植株的表型，从而证明HvACO1基因可显著提高拟南芥的耐湿性。

本发明为改良植物对湿害的抗性提供了一种新的方法。通过基因工程手段培育耐湿植物，克服传统育种的不足，不仅育种周期短，而且操作简单、容易获得高抗材料。本发明首次克隆到大麦耐湿基因HvACO1，并通过农杆菌介导方法将该基因转入拟南芥中，经过湿害鉴定分析，证明转基因植株较野生型植株的耐湿能力有明显提高，证实本发明的基因在提高大麦耐湿性方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1 大麦HvACO1基因序列RT-PCR扩增产物，

Marker：DL2000DNA Marker (大连宝生物)，由2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp 以及100bp 六条DNA 片段组成；

图2 转HvACO1基因拟南芥株系及野生型株系RT-PCR检测分析；

图3 拟南芥转基因株系和野生型株系耐湿性表现及部分生长指标的变化，

(A) 转基因拟南芥与野生型在正常生长条件下和淹水2周后的表型；(B) 株高；(C) 茎叶鲜重；(D) 茎叶干重；(E) 根系长度；(F) 存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1 HvACO1基因的克隆

利用大麦品系TF58进行蛋白组分析结果，设计HvACO1基因的特异引物P₁正向引物: 5’-ATGGACATGGAGATCCCGGT-3’（SEQ ID NO.3）和P₂反向引物:5’-TCAATCGGGCAGAATCCGTG-3’ （SEQ ID NO.4），采用CTAB法提取耐湿大麦品系TF58根系总RNA，并反转录成cDNA，再以cDNA为模板，利用引物P₁和P₂扩增出如SEQ ID NO:1所示大麦耐湿基因的CDS序列，基因HvACO1的CDS序列全长952bp (图1)。

具体步骤如下：

(1) 向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液[2％(W/V)CTAB，NaCl 1 .4mol/L，EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris·HCl 100mmol/L，2％(W/V)PVP]和10％β-巯基乙醇，在水浴锅中预热；

(2) 将大麦根系液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴10分钟；

(3) 加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)混合液，颠倒混匀，静置10min，4℃12000g离心10min；

(4) 取上清，重复步骤(3)；

(5) 取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，11000rpm，4℃离心15min，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用；

(6) 从大麦品种TF58中提取根系总RNA为模板，利用反转录酶(购自ThermoFisher Scientific公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65℃5min，42℃50min，70℃10min；

(7) 利用上述引物P1和P2从RNA反转录得到的cDNA中扩增出大麦乙烯氧化酶基因HvACO1的CDS序列；

反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，33个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。从阳性克隆中提取携带有HvACO1基因CDS序列的质粒。

实施例2 HvACO1基因过表达载体的构建与遗传转化

为了能更好地分析基因HvACO1的生物学功能，将该基因在拟南芥中过表达，利用Invitrogen公司的Gateway技术构建大麦HvACO1基因超表达载体。利用BP Clonase™enzyme，将目的基因与pDONR221载体连接，构建入门载体，然后利用LR Clonase™ enzyme，将入门载体与pB2GW7载体连接，构建含有目的基因的超表达载体。通过液氮冻融法将含有HvACO1基因的超表达载体导入农杆菌Gv3101中。利用农杆菌介导的遗传转化法，将HvACO1编码序列导入拟南芥等植物中表达。通过抗生素筛选和RT-PCR等筛选阳性转基因植株。

本试验实用的遗传转化方法如下：

(1) 农杆菌的培养

在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan 100mg/L、琼脂1.5g/L)上预培养携带有目的基因HvACO1的农杆菌48小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan 100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD600值约为0 .8～1 .0。

(2) 花序法侵染拟南芥

采用改良的花序浸染法转化拟南芥。挑取含有目的基因质粒的农杆菌单菌落，转入100mL LB液体培养基中，置入28℃摇床中200r/min过夜培养，使农杆菌菌液浓度达到OD600在0 .8～1 .0时，4000r/min离心10min，弃上清后，用100mL含有蔗糖5g、SilwetL-7750μL的LB液体培养基重新悬浮农杆菌菌液。将拟南芥花盆倒扣于含有菌悬液的烧杯中，将拟南芥的花序浸在菌液中10～20s，黑暗下培养24h后，置于温度25℃、湿度为60％、光照强度3000～4000lx和16h/8h光周期的光照培养箱中培养，隔天浇水和培养植株，待开花后收获种子。将收获的拟南芥种子用8％NaClO酒精溶液(95％酒精配制)中消毒5min后，在选择培养基(MS+50mg/L卡那霉素+7g/L琼脂+30g/L蔗糖)上进行筛选。

实施例3 HvACO1基因转基因T3代苗RT-PCR检测

为了验证转基因拟南芥T3代株系耐湿能力的改变是否与转入的HvACO1基因有关，采用RT-PCR方法对部分转基因拟南芥植株中HvACO1基因表达进行了检测，结果见图2，可知转基因拟南芥T3代株系耐湿能力的改变与转入的HvACO1基因的过表达有关。

具体步骤如下：

采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因拟南芥T3代3个株系中提取植株的总RNA(提取方法参照TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自ThermoFisher Scientific公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为65℃5min，42℃50min，70℃10min。先用报道的内参基因Actin对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，进行PCR检测，确保内参基因均能在对照野生型拟南芥和转基因拟南芥植株中均能扩出。然后，根据HvACO1基因的序列，利用引物P1和P2，进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1 .5min，33个循环；72℃延伸10min。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明(图2)，3个转基因株系内均检测到HvACO1基因的表达。

实施例4 转HvACO1拟南芥植株耐湿性的测定

从筛选获得的HvACO1基因转化拟南芥T3代阳性转基因株系中随机挑选各3个株系种子，以野生型拟南芥种子对照(WT)，在1/2MS培养基上培养至4叶期，将幼苗移栽到装有营养土的盆钵中，在人工气候室中培养35天。将转基因株系和野生型放入水箱中，进行淹水处理，淹水2周后，观察转基因材料与野生型材料耐湿性的差异，并测定不同材料的苗高、叶绿素含量、植株鲜重、干重、根系长度、存活率等性状。野生型株高下降了49.09%，而3个转基因株系分别下降了11.70%，11.40%，10.28%；野生型叶绿素含量下降了61.56%，而3个转基因株系分别下降了20.45%，31.82%，34.23%；野生型茎叶鲜重下降了65.8%，3个转基因株系分别下降了36.11%，42.25%，44.03%；野生型茎叶干重下降了51.01%，3个转基因株系分别下降了17.98%，36.48%，31.10%；野生型根长下降了74.87%，3个转基因株系分别下降了49.62%，40.59%，38.39%；野生型材料的存活率仅为27.61%，而转基因材料的存活率明显要高于非转基因材料，分别为68.85%，68.79%和71.82%。结果表明，在拟南芥中通过过表达HvACO1基因明显增强了转基因材料对湿害的抗性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 大麦耐湿调控基因HvACO1、蛋白及其在育种中的应用

<130> xhx2019041601

<141> 2019-04-16

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 952

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare L.

<400> 1

atggagatcc cggtcatcga cctccagggg ctcgacggcg acgcctccca gcggtcgcaa 60

accatggcgc ggctccacga agcctgcaag gactggggct tcttctgggt ggacagccat 120

ggcgtcgacg ccgcgctgat ggaggaggtg aagcgcttcg tgtatgccca ctacgacgag 180

catctcaagg ataggttcta cgcctcggac ctcgccaaag acctgctgct gccggcggag 240

gaatccaaag ccgtctccgg tgaggtagac tgggagaccg cctacttcat ccggcaccgt 300

cccgccaaca acgtcgccga cttcccggag atcccgccgg ccacacgaga gatgctcgac 360

gtgtacatcg gacagatggt gtcgctcgca gagcggctgg ccgagtgcat gagcctgaac 420

ctgggcctgg acggcggccg cgtcaaagac accttcgcgc cgccgttcgt cgggaccaag 480

ttcgccatgt acccggcctg cccgcggccg gacctcctgt ggggcctccg cgcccacacc 540

gacgccggcg gcatcatcct gctcctgcag gacgacgtgg tcggcgggct ggagttcttc 600

aggggcgacc gggagtgggt ccccgtgggc cccaccaagg gcagcagaat cttcgtcaac 660

ctcggggacc agctggaggt gatgagcggc ggcgcctaca ggagcgtgct gcaccgcgtc 720

gccgccgtcg cggaggggcg gcggctgtcg gtggcgacgt tctacaaccc cggggcggaa 780

gccgtcgtgg cgccggcgcc cacggcgagg cagccggcgg cgcaggtgta ccccgggccg 840

tacaggttcg gcgactacct ggactactac cagggcacca agtttgccga caaggcggcg 900

aggttgcagg ccgtcaagga gctgttcggc tcacggattc tgcccgatat ga 952

<210> 2

<211> 316

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare L.

<400> 2

Met Glu Ile Pro Val Ile Asp Leu Gln Gly Leu Asp Gly Asp Ala Ser

1 5 10 15

Gln Arg Ser Gln Thr Met Ala Arg Leu His Glu Ala Cys Lys Asp Trp

20 25 30

Gly Phe Phe Trp Val Asp Ser His Gly Val Asp Ala Ala Leu Met Glu

35 40 45

Glu Val Lys Arg Phe Val Tyr Ala His Tyr Asp Glu His Leu Lys Asp

50 55 60

Arg Phe Tyr Ala Ser Asp Leu Ala Lys Asp Leu Leu Leu Pro Ala Glu

65 70 75 80

Glu Ser Lys Ala Val Ser Gly Glu Val Asp Trp Glu Thr Ala Tyr Phe

85 90 95

Ile Arg His Arg Pro Ala Asn Asn Val Ala Asp Phe Pro Glu Ile Pro

100 105 110

Pro Ala Thr Arg Glu Met Leu Asp Val Tyr Ile Gly Gln Met Val Ser

115 120 125

Leu Ala Glu Arg Leu Ala Glu Cys Met Ser Leu Asn Leu Gly Leu Asp

130 135 140

Gly Gly Arg Val Lys Asp Thr Phe Ala Pro Pro Phe Val Gly Thr Lys

145 150 155 160

Phe Ala Met Tyr Pro Ala Cys Pro Arg Pro Asp Leu Leu Trp Gly Leu

165 170 175

Arg Ala His Thr Asp Ala Gly Gly Ile Ile Leu Leu Leu Gln Asp Asp

180 185 190

Val Val Gly Gly Leu Glu Phe Phe Arg Gly Asp Arg Glu Trp Val Pro

195 200 205

Val Gly Pro Thr Lys Gly Ser Arg Ile Phe Val Asn Leu Gly Asp Gln

210 215 220

Leu Glu Val Met Ser Gly Gly Ala Tyr Arg Ser Val Leu His Arg Val

225 230 235 240

Ala Ala Val Ala Glu Gly Arg Arg Leu Ser Val Ala Thr Phe Tyr Asn

245 250 255

Pro Gly Ala Glu Ala Val Val Ala Pro Ala Pro Thr Ala Arg Gln Pro

260 265 270

Ala Ala Gln Val Tyr Pro Gly Pro Tyr Arg Phe Gly Asp Tyr Leu Asp

275 280 285

Tyr Tyr Gln Gly Thr Lys Phe Ala Asp Lys Ala Ala Arg Leu Gln Ala

290 295 300

Val Lys Glu Leu Phe Gly Ser Arg Ile Leu Pro Asp

305 310 315

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggacatgg agatcccggt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaatcgggc agaatccgtg 20

Claims

1.一种大麦耐湿调控相关蛋白，其特征在于，所述的蛋白为由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为SEQ ID NO:1所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物。

5.（b1）或（b2）或（b3）的应用：

（b1）权利要求1所述蛋白，或，权利要求2或3所述基因，或，含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗大麦湿害胁迫中的应用；

（b2）权利要求1所述蛋白，或，权利要求2或3所述基因，或，含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育大麦、拟南芥耐湿新品种中的应用；

（b3）权利要求1所述蛋白，或，权利要求2或3所述基因，或，含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗拟南芥湿害胁迫中的应用。

6.一种培育植物耐湿品种的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入目的植物，或权利要求4所述的表达盒、重组载体转化目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物的湿害胁迫抗性高于所述目的植物；所述植物为大麦或拟南芥。

7.根据权利要求6所述的一种培育植物耐湿品种的方法，其特征在于，其特征在于，所述的转基因植物表达权利要求1所述的大麦耐湿调控相关蛋白。