CN115317401B - 护肤组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保护外泌体活性的组合物，所述组合物包含多糖‑多肽复合物；还涉及一种在常温下稳定的护肤组合物及其制备方法与应用。本发明提供的组合物能够在常温下保存外泌体并维持外泌体的高活性。本发明的组合物具有很好的促细胞修复作用、舒缓作用、抗皱紧致作用以及显著解决多种皮肤问题的能力。

Description

护肤组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物领域，更具体涉及一种保护外泌体活性的组合物；还 涉及一种在常温下稳定的护肤组合物及其制备方法与应用。

背景技术

皮肤的问题分为很多种，比如皮肤起皮，色斑，眼袋，黑眼圈，起痘， 黑头，过敏，皱纹等都属于皮肤问题。如果想要好的皮肤需要日常坚持的 护理，从洁面，护肤等角度，在从注意饮食和休息，从而让皮肤变好，所 以现在市面上出现了很多功效类产品，比如维生素类、胜肽类、A醇类等功效原料，这些功效原料也只能停留在皮肤的最外层，发挥功效的作用非 常小，所以需要一款能从根本起作用的功效原料，而皮肤所有的问题都能 归结于细胞出现了问题，皮肤中黑素细胞异常会出现比如：皮肤暗淡、色 素堆积；皮肤中成纤维细胞出现异常会出现皱纹等问题，角质层出现异常 会出现皮肤屏障受损等皮肤问题，所以解决皮肤问题旨在解决细胞问题。

外泌体(exosomes)是一种可由多种细胞分泌的直径约为30-100nm的 双层膜结构的杯状小囊泡。外泌体能在细胞间传递蛋白、mRNA、microRNA 等活性物质,参与许多重要的生理、病理过程,其独特作用受到越来越多关 注。细胞在正常的生理状况下都会分泌外泌体，由于质膜和多泡体之间融 合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡 被脂质双层分为内部和外部，由于其含有膜脂质、膜蛋白、遗传物质和细 胞质成分，间接地反映出细胞的性质和状态。同时，外泌体样囊泡通过与 其他细胞和组织的结合，并将膜成分、mRNA、miRNA、蛋白质(生长激素、细胞因子等)等转移至受体细胞，而作为介导细胞-细胞之间通讯的胞外运 输蛋白。目前的研究表明，外泌体可以通过修复损伤细胞发挥相应的皮肤 护理功效。

目前市面上已经存在添加外泌体的护肤品产品，但是外泌体添加的难 点在于活性的保存。本领域技术人员已知，外泌体在常温下很难保证其活 性。所以，目前本领域需要开发一种能够在常温下保持外泌体活性、充分 发挥其功效的功能性护肤组合物。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷和问题，本发明提供了一种用于保护外泌体 活性的组合物及其制备方法，解决了现有技术中外泌体常温保存的问题并 且生产工艺简单，可操作性强，易于实现。

本发明第一方面提供了一种用于保护外泌体活性的组合物，其特征在 于，所述组合物包含多糖-多肽复合物。

可选地，所述外泌体为间充质干细胞外泌体；优选地，所述间充质干细 胞外泌体选自骨髓间充质干细胞外泌体、脐带血间充质干细胞外泌体、脐带 组织间充质干细胞外泌体、胎盘组织间充质干细胞外泌体或脂肪组织间充质 干细胞外泌体。

可选地，所述多糖-多肽复合物为多肽修饰的改性多糖或多肽修饰的改 性多糖衍生物；优选地，所述多糖或多糖衍生物为透明质酸或其盐、海藻酸 或其盐、羟甲基纤维素或其盐、羟丙基纤维素或其盐、甲基纤维素或其盐和 壳聚糖或其盐中的至少一种；优选地，所述多肽为含RGD的3-10肽；更优 选地，所述多肽为含RGD的八肽。

可选地，所述多糖为透明质酸或其钠盐或钾盐，优选地，所述多肽的序 列为Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr。

生物活性分子RGD肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)作为天然ECM重要 组成，是目前应用最广、最有效的促进细胞粘附的多肽。用含RGD序列对 多糖类材料表面进行修饰，可以引入细胞识别位点，模拟生物体的细胞外基 质环境，从而较好地改善材料的细胞亲和性。本发明所使用的多糖-多肽复合 物名称为HA-RGD(水解透明质酸钠-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr)。 本发明的发明人出乎预料地发现，这种RGD肽修饰的多糖材料还具有能够 在常温下保护外泌体活性的功能，其与外泌体的组合物以协同作用方式发挥 细胞修复功能，并通过多个效果验证实验验证了这种新颖且有效的组合物在 护肤品应用中的显著技术优势。

可选地，所述改性多糖的改性百分比为35％～90％；优选地，改性百分 比为55％～90％。

可选地，所述组合物还包含保湿剂、防腐剂和水；优选地，所述保湿剂 选自丙二醇、丁二醇、1.2-己二醇、戊二醇、β-葡聚糖、甘油聚醚、甘油、 透明质酸或其衍生物中的一种或多种；所述防腐剂选自苯氧乙醇、对羟基苯 乙酮、辛甘醇中的一种或多种。

另一方面，本发明还提供了一种护肤组合物，其特征在于，所述组合物 包含上述多糖-多肽复合物、外泌体、保湿剂、防腐剂和水；优选地，所述外 泌体为间充质干细胞外泌体；优选地，所述保湿剂选自丙二醇、丁二醇、1.2- 己二醇、戊二醇、β-葡聚糖、甘油聚醚、甘油、透明质酸或其衍生物中的一 种或多种；所述防腐剂选自苯氧乙醇、对羟基苯乙酮、辛甘醇中的一种或多 种。

可选地，所述组合物由以下重量份数的组分制成：

保湿剂：1.0-10.0份；多糖-多肽复合物：0.001-0.5份；外泌体：10-50.0 份；防腐剂：0.1-0.3份；纯化水80-120份；

优选地，所述组合物由以下重量份数的组分制成：

保湿剂：1.5-5.0份；多糖-多肽复合物：0.005-0.1份；外泌体：10-35.0 份；防腐剂：0.1-0.3份；纯化水90-100份。

另一方面，本发明还提供了一种上述组合物的制备方法，其特征在于， 所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、分别按重量份数称取如下原料：

保湿剂：1.0-10.0份；多糖-多肽复合物：0.001-0.5份；外泌体：10-50.0 份；防腐剂：0.1-0.3份；纯化水80-120份；

步骤2、将步骤1称取的纯化水、保湿剂加入反应器皿中混合，加热至 75-95℃，搅拌均匀，得到A相；

步骤3、将A相降温至30-35℃，将步骤1称取的多糖-多肽复合物、外 泌体、防腐剂加入步骤2所得A相，搅拌20-40分钟，即得。

本发明另一方面还提供了本发明护肤组合物的在护肤品或化妆品中 的应用。所述护肤品或化妆品为该领域常用产品，包括但不限于冻干粉、 面膜、柔肤水、精华、乳液、面霜、洁面乳、沐浴露。

有益效果：

本发明提供的护肤组合物能够在常温下保存外泌体并维持外泌体的 高活性。通过实验验证，证明了本发明的组合物具有很好的促细胞修复作 用、舒缓作用、抗皱紧致作用以及显著解决多种皮肤问题的能力。本发明 的制备工艺简单，成本较低，适于大规模工业生产。本发明在化妆品领域 的应用前景广阔。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对 实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明组合物1-5的72小时前后蛋白含量对比图。

图2为本发明组合物1-5的细胞增殖能力数据图。

图3为本发明组合物1-5的细胞迁移能力数据图。

图4和图5为本发明组合物1-5的舒缓作用测试数据图。

图6为本发明组合物1-5的抗皱紧致测试数据图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步 说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术术语和科学术语与本领域内的技 术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间 所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。 在相冲突的情况下，以本说明书包括其中的定义为准。另外，材料、方法 和例子仅供说明，而不具限制性。

实施例1

本实施例提供了本发明护肤组合物的制备方法，其原料包括纯化水、 甘油、丙二醇、外泌体、HA-RGD(水解透明质酸钠-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg- Gly-Asp-Tyr)、水解透明质酸钠、苯氧乙醇。

HA-RGD：购自陕西未来多肽生物科技有限公司，CAS号：120022-92- 6，批号为：220401。改性百分比为55％～90％。

外泌体：为动物脐带提取物，购自广东芙金干细胞再生医学有限公司， 批号为：220203。

水解透明质酸钠：购自山东安华，批号211001。

苯氧乙醇：购自德国舒美，批号为：210501。

甘油、丙二醇均为分析纯。

组合物1-5的制备：

步骤1、按照下表分别称取原料(单位：g)：

步骤2、将步骤1称取的纯化水、甘油、丙二醇加入锅中混合，加热 至85℃，搅拌均匀，得到A相；

步骤3、降温至30-35℃，将步骤1称取的HA-RGD、外泌体、苯氧乙 醇加入步骤2所得A相，搅拌30min，即得组合物1-5。

实施例2

蛋白含量测试：

将实施例1制备的组合物1-5在常温下放置72小时，测定组合物1-5 的蛋白含量。所使用方法为：BCA蛋白浓度检测，所采用试剂盒为赛默飞 采购。若蛋白含量和配制时的蛋白含量基本一致，说明蛋白含量损失率最小，那么证明外泌体的活性保存度好；若蛋白含量损失率最大，说明外泌 体的活性没有很好的保存，从而相应的功效发挥将大打折扣。实验结果如 图1所示。

从图1可以看出，组合物1-5中，72小时后，组合物2中的蛋白含量 损失率最高，原因是无保护剂，而蛋白含量损失率依次为：组合物3>组合 物4>组合物5，说明增加HA-RGD后，蛋白含量损失率有所降低，说明该 物质有保护外泌体活性的能力，随着HA-RGD的增高，组合物3和组合物 4的蛋白含量损失率显著降低，说明在外泌体组合物中随着HA-RGD的增加，蛋白含量损失率显著降低，说明HA-RGD能保留更多的外泌体的蛋白， 有保护外泌体的完整性和活性的功能。

实施例3

细胞增殖能力测试：

皮肤的生长发育、代谢周期与皮肤细胞活性具有一定相关性，促进角 质形成细胞活性可达到稳定皮肤屏障，促进肌肤更新的目的。成纤维细胞 的细胞活性是指样本群体中健康细胞所占的比例，增强角质形成细胞的细 胞活性，可达到稳定皮肤屏障，促进肌肤更新的目的。所以通过成纤维细 胞的细胞活性可表征细胞增殖能力，细胞增殖能力强可说明有很好的细胞修复作用。

实验分组如下：利用陕西博溪通用检测科技有限公司的检测模型：成 纤维细胞模型进行检测：

测试结果如图2所示。

以上数据可以看出，组合物1-5中,成纤维细胞活力依次为：组合物 1<2<3<4<5，组合物2>1说明组合物2外泌体有增加成纤维细胞活力的作 用；加了HA-RGD的组合物3比未加HA-RGD的组合物2的成纤维细胞 活力更强，说明HA-RGD和外泌体的组合物有更强的促细胞增殖的效果。 随着HA-RGD含量的增高，组合物3-组合物4的成纤维细胞活性显著增 加，说明随着HA-RGD的增加，外泌体的活性也在增加，说明HA-RGD的 量影响外泌体的活性。组合物5>组合物4，说明随着外泌体的含量增加， 细胞活性显著增加，且在组合物5的时候和阳性很接近，考虑成本的因素， 外泌体的加量最大到25％，既能满足细胞增殖的效果，导致细胞修复的功 效，又节省了成本。本实验证明本发明组合物具有显著促细胞修复功能。

实施例4

细胞迁移能力测试：

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的刺激后而 产生的移动。细胞迁移能力增加，表明具有促进创伤修复作用。皮肤受到 损伤后，皮肤内的各种细胞主要通过细胞迁移到达损伤部位来进行修复活 动，角质形成细胞的迁移能力对表皮损伤修复具有重要作用。

实验分组如下：利用陕西博溪通用检测科技有限公司的检测模型：成 纤维细胞模型进行检测：

测试结果如图3所示。

以上数据可以看出，组合物1-5中,成纤维细胞迁移依次为：组合物 1<2<3<4<5，组合物2>1说明组合物2外泌体有增加成纤维细胞迁移的作 用；加了HA-RGD的组合物3比未加HA-RGD的组合物2的成纤维细胞 迁移更强，说明HA-RGD和外泌体的组合物有更强的促细胞修复的效果。 随着HA-RGD含量的增高，组合物3-组合物4的成纤维细胞迁移显著增 加，说明随着HA-RGD的增加，外泌体的活性也在增加，说明HA-RGD的 量影响外泌体的活性。组合物5>组合物4，说明随着外泌体的含量增加， 细胞迁移显著增加，且在组合物5的时候和阳性很接近，考虑成本的因素， 外泌体的加量最大到25％，既能满足促细胞修复的效果，又节省了成本。 本实验证明本发明组合物具有显著促细胞修复功能。

实施例5

舒缓作用测试：

脂多糖LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和 多糖构成的物质(糖脂质)，致病菌的致病机制主要是LPS与Toll样受体 结合，激活下游的炎症信号通路，从而激活炎症反应，炎症反应产生红斑 以及疼痛等临床现象。本实验以巨噬细胞为研究模型，采用LPS刺激建立 体外炎症模型，通过检测炎症相关指标(TNFα/IL-1α)来分析待测物的舒缓作用。TNFα/IL6为两种促炎因子，主要由典型的信号通路NF-κB 信号通路介导合成，诱发炎症级联反应，其含量降低，说明样品具有舒缓 的作用。白细胞介素1α(IL-1α)也称为白细胞热源，白细胞内源性介 质，单核细胞因子，淋巴细胞活化因子，IL1α是由炎症小体介导成熟的，成熟后分泌到细胞外进一步与受体结合介导炎症反应的级联放大。样品作 用后含量降低，说明具有舒缓的作用。

实验分组如下：利用陕西博溪通用检测科技有限公司的检测模型：进行检测：

检测结果如图4和图5所示。

以上数据可以看出，组合物1-5中,TNFα、IL-1α含量依次为：组合 物1>2>3>4>5，组合物2＜1说明组合物2外泌体对TNFα、IL-1α都有降 低作用，具有舒缓的作用；加了HA-RGD的组合物3比未加HA-RGD的 组合物2的舒缓效果更强，说明HA-RGD和外泌体的组合物有更强的舒缓 效果。随着HA-RGD含量的增高，组合物3-组合物4的舒缓效果显著增 加，说明随着HA-RGD的增加，外泌体的活性也在增加，说明HA-RGD的 量影响外泌体的活性。组合物5＜组合物4，说明随着外泌体的含量增加， 舒缓效果增加，且在组合物5的时候和阳性很接近，考虑成本的因素，外 泌体的加量最大到25％，既能满足舒缓的效果，又节省了成本。本实验证 明本发明组合物具有显著舒缓功能。

实施例6

抗皱紧致测试：

本试验以成纤维细胞为研究对象，采用UVA照射建立体外光老化模 型，待测物处理后通过Collagen I含量的变化来分析待测物的紧致抗皱功 效。Collagen I为胶原I，胶原蛋白约占皮肤真皮层80％的比重,使得皮肤 饱满充盈，促进Collagen I含量的增加，可以达到一定抵抗皱纹产生的作用。

实验分组如下：利用陕西博溪通用检测科技有限公司的检测模型： Fibroblast进行检测：

检测结果如图6所示。

以上数据可以看出，组合物1-5中,Collagen I含量依次为：组合物 1<2<3<4<5，组合物2>1说明组合物2外泌体对Collagen I有增加作用，具 有抗皱紧致的作用；加了HA-RGD的组合物3比未加HA-RGD的组合物 2的抗皱紧致效果更强，说明HA-RGD和外泌体的组合物有更强的抗皱紧 致效果。随着HA-RGD含量的增高，组合物3-组合物4的抗皱紧致效果显 著增加，说明随着HA-RGD的增加，外泌体的活性也在增加，说明HA- RGD的量影响外泌体的活性。组合物5>组合物4，说明随着外泌体的含量 增加，抗皱紧致效果显著增加，且在组合物5的时候和阳性很接近，考虑 成本的因素，外泌体的加量最大到25％，既能满足抗皱紧致的效果，又节 省了成本。本实验证明本发明组合物具有显著抗皱紧致功能。

实施例7

人体功效测试：

召集75个志愿者，年龄分布在28-55岁之间，15人一组，分别使用组 合物1-5，对其进行安全性和有效性测试。安全性主要是通过人体下发测 试来完成，若志愿者试用，无不良反馈，则为安全性通过；有效性通过仪 器测试，主要是主要指标包括：水分含量、弹性、皱纹、黑素含量、红色 素含量、TEWL(经皮水分散失)。通过德国CK仪进行测试，进行长效功 效验证，将使用4周后效果数据进行平均值处理，计算护理后改善程度， 从而得出改善人数比例和未改善人数的比例。结果如下：安全性测试无不 良反馈占比>90％，为安全。功效类验证具体指标判断依据为：使用后比使 用前仪器数值>3,则为显效，显效人数比例>50％为有效。

从以上结果可以看出，通过四周的长期测试，发现在使用组合物3和 组合物2之后，通过检测受试者水分含量、弹性、皱纹、黑素含量、红色 素含量、TEWL的指标，发现都有长期的抗皱紧致、提亮肤色、修护皮肤 屏障的效果，且组合物3长期的抗皱紧致、提亮肤色、修护皮肤屏障的效 果更显著，说明添加HA-RGD后，该组合物对皮肤问题解决有很显著的改善；随着HA-RGD含量的增高，组合物3和组合物4解决皮肤问题的能力有所增加，说明随着组合物中HA-RGD的增加，解决皮肤问题的能力也在 增加，说明HA-RGD有保护外泌体的活性，使解决皮肤问题的能力更强。 组合物5>组合物4随着外泌体的含量增加，解决皮肤问题的能力显著增 加，且在组合物5的时候功效验证显效比例接近100％，说明本发明组合 物能够显著解决皮肤问题。

应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质， 因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施 方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于 所附的权利要求。

本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验， 在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包 含在所附的权利要求中。

Claims (10)

1.包含多糖-多肽复合物的组合物用于保护外泌体活性的用途；所述多糖-多肽复合物为多肽修饰的改性多糖；所述多糖为透明质酸或其钠盐或钾盐；所述外泌体为间充质干细胞外泌体；所述多肽的序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr；所述改性多糖的改性百分比为35%～90%。

2.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体选自骨髓间充质干细胞外泌体、脐带血间充质干细胞外泌体、脐带组织间充质干细胞外泌体、胎盘组织间充质干细胞外泌体或脂肪组织间充质干细胞外泌体。

3.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述改性多糖的改性百分比为55%～90%。

4.权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还包含保湿剂、防腐剂和水。

5.权利要求4所述的用途，其特征在于，所述保湿剂选自丙二醇、丁二醇、1,2-己二醇、戊二醇、β-葡聚糖、甘油聚醚、甘油、透明质酸或其衍生物中的一种或多种；所述防腐剂选自苯氧乙醇、对羟基苯乙酮、辛甘醇中的一种或多种。

6.一种护肤组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1-3任一项中所述的多糖-多肽复合物、外泌体、保湿剂、防腐剂和水；所述组合物由以下重量份数的组分制成：保湿剂：1.0-10.0份；多糖-多肽复合物：0.05-0.5份；外泌体：10-50.0份；防腐剂：0.1-0.3份；纯化水80-120份；所述外泌体为间充质干细胞外泌体。

7.权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述保湿剂选自丙二醇、丁二醇、1,2-己二醇、戊二醇、β-葡聚糖、甘油聚醚、甘油、透明质酸或其衍生物中的一种或多种；所述防腐剂选自苯氧乙醇、对羟基苯乙酮、辛甘醇中的一种或多种。

8.权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下重量份数的组分制成：保湿剂：1.5-5.0份；多糖-多肽复合物：0.05-0.1份；外泌体：10-35.0份；防腐剂：0.1-0.3份；纯化水90-100份。

9.权利要求6所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤1、分别按重量份数称取如下原料：保湿剂：1.0-10.0份；多糖-多肽复合物：0.05-0.5份；外泌体：10-50.0份；防腐剂：0.1-0.3份；纯化水80-120份；步骤2、将步骤1称取的纯化水、保湿剂加入反应器皿中混合，加热至75-95℃，搅拌均匀，得到A相；步骤3、将A相降温至30-35℃，将步骤1称取的多糖-多肽复合物、外泌体、防腐剂加入步骤2所得A相，搅拌20-40分钟，即得。

10.权利要求6所述的组合物在制备护肤品或化妆品中的用途。