CN113416695A - 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，它是在旋转的LED红光源，LED绿光源和LED黄光源下照射间充质干细胞30～60min；所述LED红光源波长620‑625nm，电压1.9～2.5V；所述LED绿光源波长510‑520nm，电压3.0～3.2V；所述LED黄光源波长585‑590nm，电压1.9～2.2V。本发明方法利用红、绿、黄3种特定波段LED光源组合辐射，高效率诱导细胞活化，促进细胞外泌体产生，其适用于人或动物富含间充质干细胞外泌体研究、再生转化，临床应用前景良好。

Description

一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。目前外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。但由于自然状态下细胞释放外泌体的量很低，使用传统饥饿方法——停止给细胞血清培养，虽然会释放多的外泌体，但很可能改变外泌体的属性。因此造成了目前外泌无法保持稳定的产量和质量，使外泌体的制备无法工业化生产。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于开发应用安全物理性光源刺激细胞产生高于正常水平的外泌体的释放平台。
本发明提供了一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，它是在旋转的LED红光源，LED绿光源和LED黄光源下照射间充质干细胞30～60min；所述LED红光源波长620-625nm，电压1.9～2.5V；所述LED绿光源波长510-520nm，电压3.0～3.2V；所述LED黄光源波长585-590nm，电压1.9～2.2V。
进一步地，所述旋转的速度为30～50转/min，优选30转/min。
进一步地，所述照射间充质干细胞的时间优选30min。
进一步地，所述LED红光源，LED绿光源和LED黄光源安装在细胞治疗转化仪中；所述细胞治疗转化仪包括底座、外罩(1)和位于外罩内部的LED灯筒(2)，所述外罩(1)一侧有针筒入口(3)，外罩表面设有液晶显示屏(4)和仪器启动键(10)，所述LED灯筒(2)内部有容纳针筒的通道(7)，所述通道(7)的一端开口与针筒入口(3)正对，所述通道(7)侧面有LED光源，所述外罩(1)内部有控制板，所述液晶显示屏(4)、LED光源和仪器启动键(10)与控制板电联接，所述外罩(1)与底座固定连接；所述LED灯筒(2)顶部设有灯座(6)，所述LED光源设于灯座(6)上，所述灯座(6)平行设有三排，分别安装LED红光源、LED绿光源和LED黄光源，每排等间距设有10个灯座(6)，所述灯座的排向与通道(7)的轴线平行。
更进一步地，所述细胞治疗转化仪中，外罩(1)与针筒入口(3)相对的另一侧有风扇(5)，所述风扇(5)与控制板电联接；所述通道(7)与LED灯筒(2)内壁之间有一层玻璃罩。
更进一步地，所述细胞治疗转化仪中，针筒入口(3)处安装有滚动轴承，所述滚动轴承的外环与针筒入口(3)的内壁配合，滚动轴承的内环伸出滚动轴承的两端，所述底座上有电机，所述电机通过皮带与内环的一端连接，内环另一端设有螺孔，有螺纹孔的一端位于外罩(1)外侧；所述外罩(1)上表面设有开启旋转控制键(11)和关闭旋转控制键(12)，所述电机、开启旋转控制键(11)和关闭旋转控制键(12)与控制板电联接。
更进一步地，所述细胞治疗转化仪中，外罩(1)上表面设有增加时间控制键(9)和减少时间控制键(8)，所述增加时间控制键(9)和减少时间控制键(8)与控制板电联接；和/或所述外罩(1)和LED灯筒(2)的材质为医用无铅不锈钢；和/或所述外罩(1)的外表面和内表面及LED灯筒(2)的外表面均喷涂有烤漆。
更进一步地，针筒放入通道(7)中后，LED光源与针筒的垂直距离为3-8cm。
更进一步地，所述针筒用于放置间充质干细胞。
更进一步地，所述间充质干细胞为脂肪源间充质干细胞。
本发明方法利用红、绿、黄3种特定波段LED光源组合辐射，高效率诱导刺激脂肪间充质干细胞，显著增加间充质干细胞外泌体的产生能力，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是本发明中外罩的结构示意图；
图2是本发明中LED灯筒的结构示意图；
图中：1-外罩、2-LED灯筒、3-针筒入口、4-液晶显示屏、5-风扇、6-灯座、7-通道、8-减少时间控制键、9-增加时间控制键、10-仪器启动键、11-开启旋转控制键、12-关闭旋转控制键。
图3外泌体透视电镜的对比图。
图4外泌体浓度测定：纳米粒子追踪分析(NTA)比较。
图5免疫印迹显示外泌体特异性标记物比较。
图6外泌体浓度比较：光照细胞后外泌体的产生量是非光照组的5-6倍多(单位：1x1010个外泌体/毫升培养液)。
具体实施方式
实施例1本发明提高脂肪间充质干细胞外泌体产量的方法
1)取脂肪间充质干细胞，置于针筒中，然后将针筒放入细胞治疗转化仪内；
2)启动细胞治疗转化仪，使脂肪间充质干细胞在转速为30转/min的LED红光源，LED绿光源和LED黄光源下照射30min，其中LED红光源波长620-625nm，电压1.9～2.5V；LED绿光源波长510-520nm，电压3.0～3.2V；LED黄光源波长585-590nm，电压1.9～2.2V；
本实施例采用的细胞治疗转化仪如图1、2所示，包括底座、外罩1和位于外罩内部的LED灯筒2，外罩1一侧有针筒入口3，外罩表面设有液晶显示屏4和仪器启动键10，LED灯筒2内部有容纳针筒的通道7，通道7的一端开口与针筒入口3正对，通道7侧面有LED光源，外罩1内部有控制板，液晶显示屏4、LED光源和仪器启动键10与控制板电联接，外罩1与底座固定连接；
进一步地，外罩1与针筒入口3相对的另一侧有风扇5，风扇5与控制板电联接；
进一步地，通道7与LED灯筒2内壁之间有一层玻璃罩；
进一步地，针筒入口3处安装有滚动轴承，滚动轴承的外环与针筒入口3的内壁配合，滚动轴承的内环伸出滚动轴承的两端，底座上有电机，电机通过皮带与内环的一端连接，内环另一端设有螺孔，螺孔设有三个，螺孔中有螺丝，有螺纹孔的一端位于外罩1外侧；外罩1上表面设有开启旋转控制键11和关闭旋转控制键12，所述电机、开启旋转控制键11和关闭旋转控制键12与控制板电联接，
进一步的，外罩1上表面设有增加时间控制键9和减少时间控制键8，所述增加时间控制键9和减少时间控制键8与控制板电联接；
进一步地，LED灯筒2顶部设有灯座6，LED光源设于灯座6上，所述灯座6平行设有三排，分别安装LED红光源、LED绿光源和LED黄光源，每排等间距设有10个灯座6，灯座的排向与通道7的轴线平行；
进一步地，外罩1和LED灯筒2的材质为医用无铅不锈钢；外罩1的外表面和内表面及LED灯筒2的外表面均喷涂烤漆，外罩1长17cm，宽14cm，高9.5cm；
使用如图1、2的细胞治疗转化仪的方法：
针筒通过针筒入口3进入通道7，旋紧螺孔中的螺丝，将针筒与滚动轴承的内环固定在一起，开启仪器启动键10，按下开启旋转控制键11，LED红光源、LED绿光源和LED黄光源组合对细胞进行刺激；内置的电机通过皮带带动滚动轴承的内环转动，进而带动针筒旋转，既可使得LED光照更均匀、充分，也可防止细胞的聚集现象，保证细胞生长活性。通过减少时间控制键8或增加时间控制键9可减少或增加照射时间，风扇5可散热，当温度达到25度，风扇会自动启动，保证细胞于LED灯照射下温稳定低于37度；通过液晶显示屏4可显示时间和温度，通道7与LED灯筒2内壁之间的玻璃罩隔绝LED灯与所检测样品并可平衡LED灯的照射强度，通过控制板自动温度、光照时间，以及控制电机和风扇5的启动和关闭。
以下用实验例的方式来说明本发明有益效果：
实验例1采用本发明方法处理脂肪干细胞
一、仪器
本发明实施例1记载的细胞治疗转化仪。
二、处理方法
1脂肪源间充质干细胞的分离
(1)脱臼法处死小鼠，在用70％的乙醇消毒动物5-10分钟。解剖腹部皮肤，暴露皮下脂肪组织，用无菌镊子和剪刀取出皮下脂肪组织。
(2)将提取的组织放在一个6厘米的预先称重的培养皿中，用分析天平称取组织(Ng)。
(3)加入室温1xNml(其中N是脂肪组织的重量，以克为单位)MSC分离培养基到含有脂肪组织的培养皿中。
(4)用无菌剪刀将脂肪组织切碎，直到形成精细的块状物，使用1毫升的带切断端过滤器，准确地将切碎的组织转移到15毫升离心管。
(5)向培养皿中加入2.5xN mlMSC分离培养基，清洗并转移将剩余的组织块放入相同的15毫升试管中。
(6)将制备好的胶原酶溶液0.5xNml加入到含有切碎组织的试管中，在37℃恒温摇瓶中匀速搅拌40分钟，每分钟200转。用10毫升移液管将产生的细胞悬浮液上下吹动20-30次，直到均匀。
(7)22℃,370g，离心10分钟，弃去上清液，加入1ml间充质干细胞分离培养基，重悬细胞。弃去上清液，加入1ml，用1ml滤液重悬细胞，加入9ml间充质干细胞分离培养基，混合，22℃离心10分钟。
(8)再次重复步骤(7)，最后用1毫升间充质干细胞生长培养基中重悬细胞。
(9)用血细胞计计数分离细胞的总数。(这一阶段分离细胞的平均数量是可变的，但通常在5-15个左右)
(10)每个10厘米培养皿中播入500-700万个细胞，每个培养皿中加入间充质干细胞生长培养基，最终体积为10ml，在低氧条件下于37℃CO2培养箱中培养。
(11)培养传代，细胞大概生长5-7天，达到70-80％融合，间充质干细胞第一天和之后每3天更换一次。(这个阶段的细胞有一个稍微拉长的成纤维细胞样的形状)。
(12)倾斜培养皿，小心地从附着的塑料中吸取培养基用1xPBS清洗一次，在每个10厘米的培养皿中加入1毫升胰蛋白酶溶液，在37℃下分离细胞5-10分钟。
(13)将细胞转移到15毫升离心管中，加入5毫升间充质干细胞生长培养基，轻轻混合。在室温下370g离心7分钟。将细胞悬浮于1-2毫升间充质干细胞生长培养基中。
2实验分组为：正常脂肪间充质干细胞未进行LED光辐射的对照组(不做处理)、仪器LED光辐射组(按实施例1处理)。分别取出各组高浓缩富含干细胞的培养基，用培养基混悬置入直径10cm细胞培养皿，培养48小时。
3.超速离心法提取外泌体
(1)在37℃中速融样本。
(2)将样本移动至一个新的离心管内，2000×g，4℃，30min离心。
(3)小心的将上清液移至新的离心管中，10,000×g，4℃，45min再次离心，以去除较大的囊泡。
(4)取上清，经0.45μm滤膜过滤，收集过滤液。
(5)将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4℃，100,000×g离心70min。
(6)去除上清，用10mL预冷的1×PBS重悬后，选择超速转子，再次4℃，100,000×g，超速离心70min。
(7)去除上清，用250μL预冷的1×PBS重悬，取20μL电镜检查，10μL粒径，30-70μL提蛋白。剩余外泌体于-80℃保存。
4.外泌体样品透射电镜观察
(1)将外泌体取出10μL。
(2)吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。
(3)醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液。
(4)常温干燥数分钟。
(5)100kv进行电镜检测成像。
(6)获得透射电镜成像结果。
5.外泌体样品粒径分析
(1)将外泌体取出10μL稀释到30μL。
(2)先用标准品进行仪器性能测试合格后方可将外泌体样品上样于外泌体粒径分析仪，注意需进行梯度稀释避免样本堵塞进样针。
(3)待样本完成检测即可获得仪器检测外泌体的粒径和浓度信息。
6.外泌体样品蛋白提取及浓度测定
(1)在37℃中速融外泌体，并迅速加入6×的RIPA裂解液。
(2)混匀后在冰上裂解30min，期间混匀。
(3)配制BCA法测蛋白浓度的标准样品，并取5μL样品加入到BCA混合液中，混匀。
(4)37℃孵育30min，酶标仪上在OD562 nm处检测吸光值并记录。
(5)根据标准曲线算出待测样品蛋白浓度。
7.泌体样品WB蛋白指标检测
(1)根据待检测样品蛋白大小配制浓度为10％或15％的SDS PAGE电泳胶；将电泳装置装好后，加入适量Running Buffer。
(2)取出蛋白样品，恒温金属浴上煮3～5min，离心甩下；将蛋白样品以及蛋白Maker按所需顺序用移液器或上样针加入到电泳胶上的孔内。
(3)盖上槽盖，打开电源，80V跑胶至样品跑出浓缩胶，转100V跑胶至溴酚蓝至胶底部。
(4)电泳完毕后取出电泳胶，修整胶的大小，切去边缘与多余的部分，左下角切角标记；根据修整后胶的尺寸，裁剪相应大小的PVDF膜，在左下角剪角做标记，在适量甲醇中活化20s，然后浸泡于预冷的转膜缓冲液中。
(5)取8张滤纸切成8cm×10cm的尺寸，同样浸泡在预冷的转膜缓冲液中；按照海绵-滤纸-电泳胶-膜-滤纸-海绵的顺序制作转膜“三明治”。
(6)将转膜缓冲液加入槽中，组装好转膜装置，加入浮冰，将装置埋于冰浴或置于冰箱，打开电源，300mA转膜，转膜时间依据需检测蛋白的大小确定，一般规则为1kd＝1min。
(7)转膜完毕后取出PVDF膜，将膜按蛋白面朝上浸泡于5％脱脂牛奶TBST中，封闭1h。
(8)一抗封闭：牛奶封闭后的膜按需裁剪，将膜浸泡于配制好的一抗溶液(抗体稀释比例均为1：1000)中，4℃孵育过夜。
(9)回收一抗，用20mL TBST在室温下洗膜10min，重复三次。
(10)根据一抗选择二抗，将二抗按1:5000配在5％脱脂牛奶TBST溶液中，将膜浸泡在二抗溶液中，室温孵育1h左右。
(11)回收二抗，用20mL TBST在室温下洗膜10min，重复三次。
(12)取出PVDF膜，沥干水分，蛋白面朝上平铺于保鲜膜上，将等体积混合的ECL A/B液混合液滴加到膜上避光反应5min；将膜夹起移入塑封膜中，蛋白面始终朝上。
(13)将膜放在成像仪中，设置好参数，开始曝光；调整好亮度和对比度，保存图片。
三、结果：
1.外泌体电镜图见图3，外泌体粒径分析结果见图4，从图3～4可见：外泌体粒径大小分布在50-120nm范围内；平均外泌体粒径：未处理的71.8±0.99nm，光处理的72.9±0.38nm。二者粒径大小均分布在正常范围。
2.外泌体蛋白质westernblotting分析
具体分析结果见图5，从结果可见：未处理的外泌体标记物(TSG101，CD9)表达较低,光处理后的TSG101，CD9显著增强。二者阴性标记物calnexin均无显示。二者外泌体标记物(TSG101，CD9)比较，显示光处理后显著增加。
3.光激活增加脂肪间充质干细胞外泌体产量
通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)获得未处理和光处理的数量浓度。如图6所示，光处理外泌体浓度明显高于未处理组5倍多(*p<0.05显示统计学意义)。
四、结论：
脂肪间充质干细胞，使用红、绿、黄三色光照处理后，其外泌体产生能力增强；显著增强细胞外泌体的产生。
综上，本发明的方法可以显著增加间充质干细胞外泌体的产生能力；将能制备出对正常能力的间充质干细胞外泌体，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法，其特征在于：它是在旋转的LED红光源，LED绿光源和LED黄光源下照射间充质干细胞30～60min；所述LED红光源波长620-625nm，电压1.9～2.5V；所述LED绿光源波长510-520nm，电压3.0～3.2V；所述LED黄光源波长585-590nm，电压1.9～2.2V。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述旋转的速度为30～50转/min，优选30转/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述照射间充质干细胞的时间优选30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述LED红光源，LED绿光源和LED黄光源安装在细胞治疗转化仪中；所述细胞治疗转化仪包括底座、外罩(1)和位于外罩内部的LED灯筒(2)，所述外罩(1)一侧有针筒入口(3)，外罩表面设有液晶显示屏(4)和仪器启动键(10)，所述LED灯筒(2)内部有容纳针筒的通道(7)，所述通道(7)的一端开口与针筒入口(3)正对，所述通道(7)侧面有LED光源，所述外罩(1)内部有控制板，所述液晶显示屏(4)、LED光源和仪器启动键(10)与控制板电联接，所述外罩(1)与底座固定连接；所述LED灯筒(2)顶部设有灯座(6)，所述LED光源设于灯座(6)上，所述灯座(6)平行设有三排，分别安装LED红光源、LED绿光源和LED黄光源，每排等间距设有10个灯座(6)，所述灯座的排向与通道(7)的轴线平行。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述细胞治疗转化仪中，外罩(1)与针筒入口(3)相对的另一侧有风扇(5)，所述风扇(5)与控制板电联接；所述通道(7)与LED灯筒(2)内壁之间有一层玻璃罩。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述细胞治疗转化仪中，针筒入口(3)处安装有滚动轴承，所述滚动轴承的外环与针筒入口(3)的内壁配合，滚动轴承的内环伸出滚动轴承的两端，所述底座上有电机，所述电机通过皮带与内环的一端连接，内环另一端设有螺孔，有螺纹孔的一端位于外罩(1)外侧；所述外罩(1)上表面设有开启旋转控制键(11)和关闭旋转控制键(12)，所述电机、开启旋转控制键(11)和关闭旋转控制键(12)与控制板电联接。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述细胞治疗转化仪中，外罩(1)上表面设有增加时间控制键(9)和减少时间控制键(8)，所述增加时间控制键(9)和减少时间控制键(8)与控制板电联接；和/或所述外罩(1)和LED灯筒(2)的材质为医用无铅不锈钢；和/或所述外罩(1)的外表面和内表面及LED灯筒(2)的外表面均喷涂有烤漆。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：针筒放入通道(7)中后，LED光源与针筒的垂直距离为3-8cm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述针筒用于放置间充质干细胞。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于：所述间充质干细胞为脂肪源间充质干细胞。
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