CN110121646B

CN110121646B - 磁性免疫球蛋白-结合粒子

Info

Publication number: CN110121646B
Application number: CN201780081112.6A
Authority: CN
Inventors: O.林德; K.格鲍尔; E.法尔德; N.诺曼; R.帕尔姆格兰; J.黑伯格; N.荣内柳斯; K.A.J.林德瑞特; A.索布兰
Original assignee: Cytiva Sweden AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: ES2896939T3; US20190339261A1; EP3563154A1; US11686726B2; DK3563154T3; WO2018122246A1; WO2018122089A1; ES2886173T3; EP3563156B1; DK3563156T3; EP3563156A1; CN110121646A; CN110088626B; US20200087614A1; US11846635B2; EP3563154B1; SI3563156T1; CN110088626A; JP7072968B2; US20230333098A1

Abstract

本发明公开一种免疫球蛋白‑结合磁珠，其包含多孔基质和一个或多个嵌入所述基质的磁性粒子，其中所述基质包含多孔聚合物和共价偶联于所述多孔聚合物的至少10 mg/ml Fc‑结合蛋白配体。

Description

磁性免疫球蛋白-结合粒子

同时待审申请的参考

我们同时待审的申请(待审案件编号317996-2)通过引用以其整体并入本文。

本发明的技术领域

本发明涉及分离树脂，且更特别涉及用于分离免疫球蛋白的磁性分离树脂。本发明还涉及分离免疫球蛋白和其它目标生物分子的方法以及执行此类方法的设备。

发明背景

用于生物分子的磁性吸附珠早已为人们所熟知，且通常用于例如蛋白质的小规模实验室分离，特别是用于并行分离，其中磁格式可以通过机器人实现自动化。然而，由于缺乏合适的珠和工艺设计，磁珠通常不用于生物药物的大规模分离。

因此，需要磁性吸附珠，其适合用于生物药物的大规模处理，特别是用于大量的产品，如单克隆抗体。还需要使用磁性吸附珠的适当的大规模生物药物分离过程。

发明概述

本发明的一个方面是提供一种能够以高结合强度和高结合容量结合免疫球蛋白的磁珠。这用免疫球蛋白-结合磁珠实现，其包含多孔基质和一个或多个嵌入基质的磁性粒子，其中基质包含多孔聚合物和共价偶联于多孔聚合物的至少10 mg/ml Fc-结合蛋白配体。

一个优点是所述珠可以直接从具有高抗体滴度的未澄清的细胞培养物中选择性地结合大量免疫球蛋白。另一个优点是，所述珠对免疫球蛋白具有有利的吸附等温线，得到高收率的回收的免疫球蛋白。

本发明的第二个方面是提供一种从细胞培养物中捕获目标生物分子的有效方法，而无需事先澄清细胞培养物。这用一种从细胞培养物中分离目标生物分子的方法来实现，其包括以下步骤：

a) 提供多个能够结合目标生物分子的磁珠；

b) 使多个珠与包含目标生物分子的细胞培养物接触，以使目标生物分子与珠结合。步骤b)可在生物反应器容器中执行和/或细胞培养物可以是未澄清的或细胞-耗竭的；

c) 用磁场保留珠并用洗涤液洗涤珠；

d) 用洗脱剂洗脱珠，以从珠解吸目标生物分子，并回收洗脱液中的目标生物分子。

本发明的第三个方面是提供磁珠在分离免疫球蛋白中的用途。这是通过权利要求书中定义的用途来实现的。

本发明的第四个方面是提供一种在不需要事先澄清细胞培养物的情况下用于从细胞培养物中捕获目标生物分子的设备。这是通过包括与接触器流体连接的生物反应器的设备来实现的，其中接触器与高梯度磁场分离器(HGMS)流体连接。

附图

图1显示根据本发明的珠的示意图。该图还显示了磁性粒子是如何集中在珠的中心区域的。

图2显示根据本发明的磁性琼脂糖珠的显微照片。

图3显示本发明方法的流程图。

图4显示本发明的设备。

图5显示本发明的设备。

图6显示本发明的设备。

图7显示本发明的设备。

图8显示本发明的设备。

图9显示本发明的设备。

图10显示本发明的设备。

图11显示根据本发明的合并的接触器/分离器。

图12显示根据本发明的两个合并的接触器/分离器。

图13显示IgG单克隆抗体在本发明的磁珠上的吸附等温线。

图14显示IgG单克隆抗体在本发明的磁珠上的摄取作为孵育时间的函数。

图15显示在洗脱过程中来自本发明的磁珠的IgG单克隆抗体的收率。每个洗脱循环包括用三个连续部分的洗脱剂的洗脱(洗脱1-3)。

图16显示洗脱的IgG单克隆抗体的纯度，用尺寸排阻色谱法(SEC)进行分析。(A)整个色谱图；(B)主峰周围区域的放大图。

图17显示本发明的设备。

图18显示用于图17的设备的流体控制***。

图19 a)显示根据本发明的合并的接触器/分离器，图19 b)和c)显示用于接触器/分离器的柔性袋。

实施方案的详细描述

在一个方面，如图1所示，本发明公开了一种免疫球蛋白-结合磁珠50，或多个这样的珠，其包含多孔基质51和一个或多个嵌入基质的磁性粒子52，其中基质包含多孔聚合物和共价偶联于多孔聚合物的至少10 mg/ml Fc-结合蛋白配体。基质可适当地包含共价偶联于多孔聚合物的至少15，例如至少20或15-25 mg/ml的Fc-结合蛋白配体，以进一步增加免疫球蛋白结合容量。

珠的尺寸可适当地为使得在下文公开的方法中使用的多个珠具有8-300微米，例如20-200、20-100微米或20-80微米的体积-加权中值直径(d50,v)。与磁性纳米粒子或微米级粒子相比，这些尺寸的珠很容易用磁场保留。然而，质量传输速率足够快，以使珠子迅速摄取免疫球蛋白。这尤其适用于具有20-100微米和20-80微米区间的中值直径的珠。珠可以是球形的或基本上球形的，例如具有至少0.9的球度(与珠体积相同的球体表面积除以珠的表面积)。

配体

配体能够与免疫球蛋白的Fc链结合，即免疫球蛋白(抗体)的通用非可变区。适当地，配体能够结合于IgG，例如类型IgG1、IgG2和/或IgG4。配体适当地具有2000 pM或更低，例如1200 pM或更低的对IgG的解离常数k_off/k_on。这可以通过在表面等离子体共振(SPR)芯片上固定配体并在SPR设备例如Biacore (GE Healthcare)中测量结合速率k_on和解离速率k_off来测量。低的解离常数保证了免疫球蛋白能被珠有效地捕获，获得高的回收率。结合强度也可以通过吸附等温线来表示，其通过用不同免疫球蛋白负荷的珠的多批次摄取实验来测量。然后针对溶液中的平衡免疫球蛋白浓度绘制结合的免疫球蛋白的量，并将数据拟合至Langmuir方程q = q_m c/(K+c)，其中q是结合的量(mg/ml)，c是平衡溶液浓度(mg/ml)，K是解离常数(mg/ml)和q_m是最大结合容量(mg/ml)。低的K值表示有利的吸附等温线，和所述珠可适当地具有小于0.1的K值，例如对于免疫球蛋白(如IgG)为小于0.08。

合适的配体包括细菌Fc-结合剂像蛋白A和蛋白G，以及基于这些蛋白的Fc-结合结构域的重组Fc-结合剂。配体可例如包含葡萄球菌(Staphylococcus)蛋白A (SpA)的一个或多个Fc-结合结构域或所述结构域的一个或多个突变体，例如SpA Fc-结合结构域的一个或多个碱稳定的突变体。包含这样的突变体的配体描述于例如US8198404、US8674073、US20100221844、US9403883、US9040661、US9051375、US9290549、US8754196和US 15/282367，其通过引用以其整体并入本文。具体而言，配体可以包含由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的一个或多个结构域。配体可包含结构域的多聚体，任选地由1-15个氨基酸残基的接头序列连接，如在SEQ ID NO:2 (SEQ ID NO:1的四聚体，具有接头序列VDAKFD)中。配体可进一步包含在N-末端的前导序列和在C-末端的加尾序列。SEQ ID NO:2具有AQGTVDAKFD前导序列和作为加尾序列的单个半胱氨酸(C)。前导或加尾序列可适当地包含用于多孔聚合物(例如，当半胱氨酸用于偶联时具有硫醚键)上配体的共价端点偶联的偶联基团(如半胱氨酸的巯基)。

SEQ ID NO:1

KEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK

SEQ ID NO:2

AQGT VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEQQNAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEQQ NAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPKC

多孔聚合物

多孔聚合物可适当地交联以提供化学和热稳定性。适当地，多孔聚合物可以是多糖，它提供高度的亲水性和低或零的非特异性吸附。多糖可例如是琼脂糖或琼脂，它通过热胶凝提供了高度多孔的凝胶结构。这些可以交联，例如通过与二环氧化物或表氯醇反应，生成化学稳定和亲水性的羟烷基醚交联。交联聚合物在多孔基质中的浓度可以例如是1-6wt. %，例如2-5或3-5 wt. % (如在湿状态下测量的)。如此低的浓度提供了高孔隙度，允许快速的质量传输，而且由于磁分离不像填充床色谱中那样涉及高的背压，所以没有必要通过增加浓度/固体含量来提供高刚度。多孔聚合物的浓度可通过以下方法来确定：a) 用蛋白酶除去任何蛋白质配体，b) 排出珠并测量湿重w_w，c) 干燥珠并测量干重w_d和c) 使干珠灰化并测量灰重w_a。然后多孔聚合物浓度将是100 * (w_d – w_a)/(w_w – w_a)。水凝胶例如多孔多糖的孔隙度/孔径最合适用反相尺寸排阻色谱法测量，其中探针物质被注入，并且该探针物质可到达的孔隙体积的分数从保留时间计算为K_av或K_d值。适当地，对于Mw 100 kDa的葡聚糖作为探针物质的K_av值，通过在填充有多个珠的柱上的反相尺寸排阻色谱法测定为0.5-0.9，例如0.5-0.8，0.5-0.7或0.5-0.6。例如，可根据在Gel Filtration Principles andMethods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, pp 6-13中所述的方法进行测定。Kav被测定为比率(V_e-V₀)/(V_t-V₀)，其中Ve是探针分子(例如葡聚糖100 kD)的洗脱体积，V₀是柱的空隙体积(例如高Mw空隙标记物，如粗葡聚糖的洗脱体积)，和V_t是柱的总体积。K_d可以测定为(V_e-V₀)/V_i，其中V_i是能够到达除基质体积(基质聚合物分子和磁性粒子所占体积)外的所有体积的盐(例如NaCl)的洗脱体积。根据定义，K_d和Kav值二者总是在0-1的范围内。

磁性粒子

磁性粒子可适当地是亚铁磁性的，或者可以是铁磁性的。适当地，磁性粒子可包括磁铁矿或磁赤铁矿，它们容易获得，在化学上稳定，并且具有合适的亚铁磁性能。磁铁矿可能是特别适合的。另外，可以使用磁性合金(通常包括铁、镍和/或钴)。在这种情况下，合金的耐蚀性应该优选地足够高，以防止金属离子在正常使用中泄漏。珠可例如包含5-15 wt.%的磁性粒子，使所述珠足够易于用磁场保留，但不增加密度太多和避免阻碍多孔基质中的质量传输。5-15 wt. %的具有5.2 g/ml密度的材料像磁铁矿仅相当于1-3体积%。适当地，珠可具有1.05-1.20 g/ml，例如1.07-1.15 g/ml的密度(平均值) (如在潮湿状态下测量的)。磁性粒子可例如具有1-5微米的体积-加权中值直径(d50,v)。这样的粒子在制造过程中很容易分散在多孔基体中，并且由于它们比优选的珠直径小得多，所以它们不会影响珠的形状。有利的是，珠的中心区域53中粒子的浓度为珠的表面区域54中浓度的至少200%，例如至少400%。中心区域在此被定义为与珠表面55的距离为>0.2个珠半径r，和表面区域被定义为与珠表面的距离为< 0.2个珠半径。将磁性粒子集中在中心区域有利于质量传输，并有利于免疫球蛋白被珠捕获。磁性粒子分布可以用光学显微镜检查来评估，如图2所示，和对于更高精度测量，可以使用共焦显微镜检查来测量三维分布。

在第二个方面，由图3所示，本发明公开一种从细胞培养物中分离目标生物分子的方法，其包括以下步骤：

a) 提供多个能够结合目标生物分子的磁珠70。目标生物分子可适当地是免疫球蛋白，例如IgG，磁珠可以适当地为依据上文公开的任何实施方案的磁珠。磁珠可适当地预灭菌，如通过高压灭菌或辐射灭菌，并且它们可在预灭菌珠容器中供应，该预灭菌珠容器通过预灭菌管和一个或多个无菌连接器适当地连接到生物反应器容器。预灭菌珠可例如在装备有输送管和气体入口的无菌容器中干燥供应。干珠随后可被空气推动输送到生物反应器容器中，如在WO2016188781 (US appl 15/573960)中公开的，其通过引用以其整体并入本文。干珠可以在缓冲液中，或者直接在细胞培养物中再膨胀。或者，预灭菌珠可以包含在生物反应器容器内的小袋中，其可以通过外部的动作打开，例如通过在小袋中裂开一条弱缝，使珠与细胞培养物接触。

b) 使多个珠与包含目标生物分子的未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物接触，以使目标生物分子结合于珠71。细胞培养物可以是未澄清的，例如直接从生物反应器中取出，而不需要任何后续的细胞/颗粒去除步骤。或者，它可以是细胞-耗竭的，例如，当一部分(但不是全部)的微粒(如细胞和/或细胞碎片)已被移除时。细胞-耗竭的细胞培养物的混浊度可以例如是至少100 NTU，例如至少200或至少500 NTU，而在微粒的任何去除之前，细胞培养物的混浊度可能是至少1000 NTU，例如至少2000 NTU或甚至完全不透明。在某些实施方案中，所述珠被直接添加到生物反应器容器中的细胞培养物中，其中细胞已被培养或正在进行培养。如果表达受到目标生物分子下调或其它负面影响，在所述珠的存在下进行培养可能是特别有利的，从而使培养物中的游离目标生物分子的浓度保留在低水平。未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物可例如包含至少1 mg/ml目标生物分子或免疫球蛋白，例如至少2或至少2.5 mg/ml目标生物分子或免疫球蛋白。与未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物接触的磁珠的量可根据目标生物分子/免疫球蛋白的浓度和所述珠的结合容量而优化。通常，每升细胞培养物50-200 ml珠可与未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物接触。所述珠可以是未使用的珠，或者例如它们可以从如下所述的步骤d)开始再循环。所述珠与细胞培养物接触可以直接在生物反应器中或例如在接触器中执行。接触器可以是细胞培养物和珠被传送到的容器，它可以在一定程度上被搅动，以提供快速的质量传输到珠中。生物反应器容器或接触器可以例如是带有一个或多个入口和出口的柔性袋，例如柔性塑料袋。这样一种袋子可以几种方式搅动，其中之一是将袋子放在摇动托盘上，例如在US6190913、US7195394和US20130316446中公开的，其通过引用以其整体并入本文。托盘通常可适应于围绕位于托盘下方的水平轴前后摇动，和摇动运动可由例如电动机和/或一个或多个气压缸驱动。使用摇动托盘搅动意味着不需要在容器中放置移动的搅拌器。这意味着既不需要轴封，也不需要磁力驱动的叶轮。从无菌的角度来看，轴封是敏感的结构，和磁力驱动的叶轮可能以不受欢迎的方式与磁珠相互作用。如在US20130316446中公开的那样，托盘还可以被布置成围绕着第二水平轴，绕轴转动到垂直位置。这允许将珠和细胞培养物从袋中方便地排出和转移到用于执行步骤c)和d)的另外装置中。绕轴转动可以是手动的，如在US20130316446中所示，但它也可以是自动化的，例如由一个或多个线性驱动器或液压缸驱动。

c) 用磁场保留珠并用洗涤液洗涤珠72。这个步骤可例如包含以下顺序：

i) 移除磁场；

ii) 再悬浮珠；

iii) 使珠与一部分洗涤液接触；

iv) 用磁场保留珠；和

v) 从保留的珠除去洗涤液。

步骤c)可在高梯度磁场分离器(HGMS)中执行。HGMS是本领域已知的，见例如US7506765、US6180005、US20120132593、US6688473和US7223345，其通过引用以其整体并入本文。它们通常包括一个带有入口和出口的分离室，以及室内的可磁化元件，例如盘、丝或管。当在室上磁场施加时(例如用电磁铁)，磁场被可磁化元件放大，和任何磁性粒子被保留在元件上。当移除磁场时，保留的磁性粒子将从元件释放，并可被再分散，任选地由分离室内的可移动元件/搅拌器辅助。在步骤c)的典型顺序中，带有细胞培养物的磁珠被从步骤b)的接触器或生物反应器传送(例如，泵送，被液体流所夹带，或由重力进料)到HGMS的分离室，并且施加磁场来保留这些磁珠，而细胞培养物则从室中排出。然后，应用如上公开的子步骤i)-v)以执行洗涤操作。然后，为了提高洗涤效率，可以重复子步骤i)-v)一次或多次。所述珠的反复再悬浮意指与珠纠缠在一起或粘在珠上的任何微粒(细胞和/或细胞碎片)会被有效地去除。洗涤液可以是水性缓冲液，并可被选择以使目标生物分子/免疫球蛋白保留与配体的强结合，而杂质、污染物和微粒则容易被清洗掉。对于作为目标生物分子的免疫球蛋白和蛋白A-衍生配体的情况，洗涤液的pH值可为例如5-8。洗涤液可任选地包含用于提高洗涤效率的添加剂，例如提高宿主细胞蛋白清除率。这样的添加剂在蛋白A填充床色谱领域中是已知的，它可以包括洗涤剂、可与水混溶的有机溶剂、离液剂、精氨酸或精氨酸衍生物、钙离子和四烷基铵离子的一种或多种。下列说明适当添加剂的文件通过引用以其整体并入本文：US6127526、US6870034、US7820799、US7834162、US8263750、US7714111、US9284347、US20120283416、US20130197197、WO2014186350、WO2014192877、US20140094593、US20160108084和US20160024147。

在备选的实施方案中，步骤b)和c)在合并的生物反应器容器/接触器和磁分离器中执行。这可以适当地为一个搅拌的容器，以提供快速的质量输送到珠中。它也可以是一个搅拌的容器，细胞培养物和珠被传送到那里。容器可以例如是柔性袋，例如，柔性塑料袋，其合适具有一个或多个入口和出口。这样一种袋子可以几种方式搅动，其中之一是将袋子放在摇动托盘上，如在上文步骤b)下讨论和在图11和12中进一步说明的。为了起到磁分离器的作用，可以使磁珠被磁场保留和细胞培养物的非-结合组分可被洗掉的方式向容器/袋子施加磁场。可以简单地将永磁体或电磁铁放置在容器/袋子的所需部分附近来施加磁场，但设计容器/袋子使得达到特别高的保留度和高效洗涤可能是有利的。图11示出了这样的布置的一个例子，在摇动平台410上有一个柔性袋405，其中来自一个或多个磁铁450的磁场被施加在柔性袋的第一末端部分415上，以使珠保留在该末端部分。当第一末端部分处于摇动周期的低位时，如果施加磁场，则珠455将被磁场吸引并保留。然后，袋可以倾斜，直到第一末端部分处于高位，细胞培养物可以从与相对的第二末端部分420相邻的端口445排出，该第二末端部分现在处于低位。然后可加入洗涤液，释放磁场(通过移除永磁体或切换电磁铁)，通过振摇搅动袋，然后珠可被保留，洗涤液以与细胞培养物相同的方式排出。这样，可以实现上面在步骤c)下讨论的相同的洗涤顺序i)-v)，并在需要时重复多次。如果需要高梯度磁场来完全保留磁珠，则可以例如通过在袋的第一末端部分***可磁化元件425来实现这一点，如图12 a)所示。例如，这些元件可以是磁性不锈钢材质的薄板。或者，可以将一个或多个磁铁430与袋的底部表面435接触放置，以将磁珠保留在袋的整个底部440之上的薄层中(图12 b))。这具有减少在洗涤过程中颗粒捕获在磁珠之间的优点，而且它还有利于珠的再分散。磁铁430可例如是一个或多个电磁铁，其可以打开以保留磁珠，和关闭以释放磁珠。

d) 用洗脱剂洗脱所述珠以从珠解吸所述目标生物分子并回收洗脱液中的所述目标生物分子73。在这一步骤中，可以适当地用磁场保留所述珠，例如使用上面所述的HGMS，或者使用上面讨论的合并的生物反应器容器和磁分离器，但它们也可以通过其它方法保留，如网或多孔玻璃料，因为颗粒将在步骤c)中被除去，而且现在进行填充床洗脱也是有可能的。如果HGMS用于步骤d)，这可以是与用于步骤c)的相同HGMS，但它也可以是步骤c)之后传送所述珠的第二个HGMS。后一种布置允许对HDMS设计进行优化，使得步骤c)可以在特定的洗涤器HGMS中进行，和步骤d)可以在特定的洗脱HGMS中进行。洗涤器HGMS需要设计，以便有效地去除微粒，而在洗脱HGMS中则不需要这样做。对于洗脱HGMS，更重要的是在小的体积内保留所述珠，使得目标生物分子/免疫球蛋白在尽可能小的洗脱液体积内被回收。具有分开的洗涤器和洗脱HGMS的另一优点是，可以在连续回收过程中同时洗涤和洗脱两个单独的珠部分。在这样一个过程中，第一珠部分与接触器中的第一细胞培养物部分一起孵育，传送到洗涤器HGMS并清洗，同时第二细胞培养物部分与第二珠部分一起孵育。接下来，第一珠部分在洗脱HGMS中被洗脱，同时第二珠部分在洗涤器HGMS中被洗涤，和第三珠部分与接触器中的第三细胞培养物部分一起孵育。在完成步骤d)之后，所述珠可以被丢弃，或者最好被再循环利用。在这种情况下，它们被适当地清洗，例如用通常用于填充床色谱中碱稳定蛋白A介质的就地清洗(CIP)的碱性清洗剂(如0.1 M NaOH)清洗，然后用适合于接触细胞培养物的水性缓冲液重新平衡74。通常，这可以是具有接近生理pH和电导率的缓冲液，例如PBS(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液。清洗和再平衡可以在洗脱HGMS中进行，但是如果对于连续回收过程的时机来说是理想的话，也可以在单独的再生HGMS或其它保留装置中进行。经清洗和再平衡后，可将珠传送(例如，泵送，被液体流所夹带，或由重力进料)到生物反应器容器中，以供重复使用。如果需要的话，它们也可以在重复使用前进行消毒步骤。这可例如通过高压灭菌来进行。

如果步骤b)和c)在如上公开的合并的接触器和磁分离器中执行，也可以在同一组合装置中执行步骤d)。

由于来自细胞培养物的微粒在回收过程中被有效去除，所获得的洗脱液可直接应用于例如后续的色谱柱(例如离子交换柱或多模式柱，用于精制)，而无需在过滤器中的任何进一步澄清等等。用于随后精制的离子交换树脂的例子包括Capto^TM Q和Capto S ImpAct(GE Healthcare)，多模式树脂的例子包括Capto adhere和Capto MMC (GE Healthcare)。洗脱液也可以不经预处理直接应用于病毒去除过滤器，或者它可应用于化学病毒灭活步骤。

在生物反应器的体积大于接触器/分离器体积的情况下，该过程可以循环进行，其中使用所述细胞培养物的几个等分试样，例如5-20个等分试样，例如5-10个等分试样重复步骤b)、c)和d)。如下文进一步讨论的，有多个接触器或合并的接触器-磁分离器也可能是有利的，允许并行处理数个等分试样。通常，步骤b)、c)和d)之一可以在一个接触器或接触器-磁分离器中与步骤b)、c)和d)的另一个在另一个接触器或接触器-磁分离器中同时执行。如果目标生物分子与磁珠的结合等温线较浅，则可能还需要在步骤b)之后将细胞培养物转移到第二接触器或合并的接触器-磁分离器以回收未结合的目标生物分子。这也可以在带有几个单独可寻址的接触器或合并的接触器-磁分离器的设备中方便地操作。

还可以在连续灌注培养过程中使用磁珠来回收目标生物分子/免疫球蛋白。这样进行的一种方法是将细胞培养物流从生物反应器传送到细胞分离装置，用于至少部分回收细胞，并将细胞再循环回到生物反应器，并用新鲜培养基补充生物反应器。细胞分离装置将细胞培养物分离成用于再循环的细胞流和细胞耗竭的细胞培养物，该细胞培养物可以如上所述用磁珠进行回收处理。由于磁珠回收过程非常适合于处理含有微粒的混浊进料，因此可以使用不提供完全澄清的细胞分离装置。这样的分离装置的例子包括倾斜沉淀床，例如在US5817505 (通过引用以其整体并入本文)中公开的，以及声学分离装置，例如在US9512395、US9458450、US9422328和US5626767 (通过引用以其整体并入本文)中公开的。这样的装置可以方便地处理高细胞浓度的细胞培养物，而不会产生堵塞问题，但它们不完全去除微粒，这意味着在不需要完全澄清的情况下用磁珠回收目标生物分子/免疫球蛋白是非常有吸引力的。

另一个选择是利用磁珠在恒化培养过程中回收目标生物分子/免疫球蛋白。在此，生物反应器中的部分细胞培养物被不断地流出，并被新鲜的培养基所替代，使得培养条件保持不变。可以方便地在接触器中收集培养流出物，并用磁珠分离目标生物分子或免疫球蛋白，如上述方法中所讨论的。

结合上述方法，还可以向细胞培养物进一步添加吸附剂或沉淀剂，例如用于结合不需要的污染物。这样的吸附剂/沉淀剂可适当地是非磁性的，使得它们或形成的沉淀物可以在步骤b)中与剩余的细胞培养物一起丢弃。这样的吸附剂的例子包括添加尿囊素或尿酸，以去除内毒素和病毒(US20150184132，通过引用以其整体并入本文)和添加混合带电粒子以去除抗体中的聚集体(US20150183879，通过引用以其整体并入本文)，而沉淀剂的例子是添加C7-C10脂肪酸来去除染色质等(US20160009762和US20160115194，通过引用以其整体并入本文)。吸附剂或沉淀剂可在步骤b)之前或期间加入。

在第三方面，本发明公开了如上讨论的多个珠在从未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物分离免疫球蛋白中的用途。该用途可以是如上讨论的任何方法所述的，用途的目的可以是直接从未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物提供至少90%、例如至少95%纯度的免疫球蛋白。在这种情况下，未澄清或细胞-耗竭的细胞培养物的混浊度可以是至少100 NTU，例如至少200或至少500 NTU。

在第四方面，本发明公开一种包含流体连接于接触器的生物反应器的设备(其也可以被称为***)，其中接触器与高梯度磁场分离器(HGMS)流体连接。接触器和HGMS可如上所述。接触器也可与洗涤器HGMS流体连接，和所述洗涤器HGMS与洗脱HGMS流体连接，二者都如上所述。此外，生物反应器可通过细胞分离装置与接触器流体连接，所述细胞分离装置被配置成将细胞-耗竭的细胞培养物传递给接触器，并将再循环的细胞传递回生物反应器。细胞分离装置可如上所述。

所述设备的不同的实施方案在图4-10中说明：

图4示出了设备300，包含生物反应器302和磁分离器304，其中磁珠306可加入到生物反应器中用于与细胞培养物一起孵育(步骤b))。然后，带有珠的细胞培养物可传送到磁分离器304，以执行该方法的步骤c)和d)。在步骤c)中，洗涤液308被传送到分离器，和在步骤d)中洗脱剂310被传送到分离器。在步骤d)中回收洗脱液312，并在步骤c)中将废细胞培养物和洗涤液传送到废物出口314。如果在步骤d)中清洗和再生所述珠，它们可以被任选地再循环到生物反应器(未示出)。

图5示出设备320，包含生物反应器302、接触器322和磁分离器304，其中磁珠306可加入到接触器322用于与从生物反应器传送的一部分细胞培养物一起孵育(步骤b))。在步骤c)中，洗涤液308被传送到分离器，和在步骤d)中洗脱剂310被传送到分离器。在步骤d)中回收洗脱液312，并在步骤c)中将废细胞培养物和洗涤液传送到废物出口314。如果在步骤d)中清洗和再生所述珠，它们可以被任选地再循环到生物反应器。

图6显示了设备340，包含生物反应器302、接触器322、洗涤器分离器342和洗脱分离器344，其中磁珠306可加入到接触器322中用于与从生物反应器传送的一部分细胞培养物一起孵育(步骤b))。洗涤步骤c)在洗涤器分离器342中执行，和洗脱步骤d)在洗脱分离器344中执行。在步骤c)中洗涤液308被传送到洗涤器分离器342，和在步骤d)中洗脱剂310被传送到洗脱分离器344。在步骤d)中回收洗脱液312，并在步骤c)中将废细胞培养物和洗涤液传送到废物出口314。如果在步骤d)中清洗和再生所述珠，它们可以被任选地再循环到生物反应器。

图7显示灌注设备360，包含生物反应器302、细胞分离装置362、接触器322和磁分离器304，其中磁珠306可加入到接触器322中用于与从细胞分离装置传送的一部分细胞-耗竭的细胞培养物364一起孵育(步骤b))。细胞分离装置可如上所述为例如倾斜沉淀床或声学分离装置362，其能够分离从生物反应器传送的细胞培养物为细胞-耗竭的细胞培养物364和用于再循环至生物反应器的细胞浓缩物366。在步骤c)中洗涤液308被传送到分离器，和在步骤d)中洗脱剂310被传送到分离器。在步骤d)中回收洗脱液312，并在步骤c)中将废细胞培养物和洗涤液传送到废物出口314。在步骤d)中可适当地清洗和再生所述珠，然后再循环至生物反应器。虽然图7显示了单个磁分离器304，但同样可能有两个单独的洗涤器342和洗脱344分离器，如上所讨论的。

图8、9和10示意地显示了根据本发明的三种可能的不同设备(也称为分离***)1、101、201。某些特征是相同的，并且只描述一次，和***之一的一些特征也可以在其它***之一中使用。三个显示的***1、101、201的共同之处是它们包含磁分离器5、105、205。例如，这可能是上文或US 7506765中描述的高梯度磁分离器。磁分离器(其可以是如上文所讨论的洗涤器分离器)将磁性粒子从流体中分离出来。磁分离器5、105、205包括入口5a、105a、205a，用于接收来自例如生物反应器3、103、203的包含目标生物分子的细胞培养物(也称为来自细胞培养物的进料)，以及用于接收含有能够与该生物分子结合的配体的磁珠。磁分离器5、105、205被配置用于将具有结合的生物分子的所述磁珠与细胞培养物/进料的其余部分分离。磁分离器5、105、205包括在磁分离器内的磁性材料的部件/元件，当施加磁场时所述部件吸引磁珠。磁分离器被配置为当磁珠被传递到洗脱分离器/洗脱单元7、107、207时释放磁场，所述洗脱分离器/洗脱单元在磁分离器外提供并连接到磁分离器。磁分离器还包括洗涤装置13、113、213，其被配置为从磁分离器5、105、205清洗出除了磁结合到磁性材料部件上的那些之外的其它组分。洗涤装置13、113、213可包括至少一个提供洗涤缓冲液的装置15、115、215，其可能通过接触器(也称为捕获单元) 9、109、209连接于泵和连接于磁分离器的入口5a、105a、205a；和连接于磁分离器的出口5b、105b、205b的洗涤缓冲液收集装置17、117、217。洗涤装置13、113、213被配置为使洗涤缓冲液流过磁分离器5、105; 205，以清洗出进料中除了结合于磁性部件的那些之外的其它组分。

全部3种设备/分离***1、101、201还包括包含洗脱单元7、107、207的洗脱分离器(也称为洗脱装置) 8、108、208。洗脱单元包含与磁分离器5、105、205的出口5b; 105b;205b连接的洗脱单元入口7a; 107a; 207a，用于接受来自磁分离器的作为含缓冲液的浆液的所述分离的磁珠。当磁珠从磁分离器5、105、205传送到洗脱装置时，缓冲液被适当地添加到磁分离器，以使磁珠流向洗脱装置8、108、208。

洗脱装置8、108、208被配置为从磁珠洗脱生物分子。据此，洗脱装置8、108、208包括连接于洗脱单元入口7a、107a’、207a’的提供缓冲液的装置8a、108a、208a和连接于洗脱单元出口7b、107b’、207b’的收集装置8b、108b、208b。洗脱装置被配置为通过以下来执行洗脱：从提供缓冲液的装置提供洗脱缓冲液和在收集装置中收集洗脱液，以及还可能通过在收集装置中提供来自提供缓冲液的装置的清洗缓冲液并收集废物进行汽提和就地清洗CIP，和还可能通过从提供缓冲液的装置提供平衡缓冲液来实现洗脱单元中的磁珠的平衡。

在某些实施方案，洗脱单元107、207包括两个入口107a、107a’；207a、207a’和两个出口107b、107b’；207b、207b’。实际上，图8所示的分离***中的洗脱单元7也可具有两个入口和两个出口，而不是只有一个入口和一个出口，以及指引流体的阀门。相应地，图9和图10所示的分离***的洗脱单元可只具有一个入口和一个出口，如图8所示。

在图9所示的实施方案中，洗脱单元107包含用于传送磁珠以便在磁分离器105中重复使用的洗脱单元第一个出口107b和用于在收集装置108b中收集洗脱液和废物的洗脱单元第二个出口107b’。

在图10所示的实施方案中，洗脱单元207包含用于将磁珠传送到贮存容器215的洗脱单元第一个出口207b和用于在收集装置208b中收集洗脱液和废物的洗脱单元第二个出口207b’。图10所示的分离***201是一个没有磁珠的循环和重新使用的***。在该***中，细胞培养物203可提供有磁珠并连接到分离***201。可能的是，可以将细胞培养物203的全部内容物提供给磁分离器205。在洗脱单元207中洗脱生物分子后，在贮存容器215中回收磁珠。

在图9和10所示的实施方案中，洗脱单元107、207包含洗脱单元第一个入口107a;207a，用于接受来自磁分离器105; 205的磁珠，以及洗脱单元第二个入口107a’; 207a’，用于接受来自提供缓冲液的装置108a; 208a的洗脱缓冲液、就地清洗CIP缓冲液和平衡缓冲液。

洗脱单元7、107、207可包括用于将磁珠保留在洗脱单元内并允许多余的缓冲液从洗脱单元中逸出的保留装置502a-e。在图8和9所示的实施方案中，洗脱单元出口7b、107b被配置为将磁珠从洗脱单元传送到磁分离器5、105、205以供重新使用。

图8和9所示的设备/分离***1、101包括连接于洗涤器分离器/磁分离器5、105的入口5a、105a的接触器/捕获单元9、109。如果磁珠被加入到细胞培养物203中，则图10所示的实施方案中的细胞培养物203也可称为接触器/捕获单元209。另一种选择是代之以将磁珠直接添加到磁分离器5、105、205中。对于所有的实施方案来说，在磁分离器中分别直接加入细胞培养物和磁珠是可能的，应被本发明所涵盖。

图8和9所示的捕获单元9、109可包括细胞培养物入口9a、109a (用于接受来自细胞培养物3、103的细胞培养物/进料)和至少一个磁珠入口9b; 109b; 109c (用于接受磁珠)。捕获单元9、109被配置为混合来自细胞培养物的进料和磁珠，因而允许特定生物分子结合于磁珠，然后将其传送到磁分离器5、105。

在根据本发明的分离***1、101、201中，一部分新的来自细胞培养物3、103、203的进料和磁珠可被提供到磁分离器5、105、205中，而先前的部分在洗脱单元7、107、207中。因此，至少两部分磁珠可以同时应用于分离***中，使分离生物分子的过程可能更加有效地进行。

在图8和9所示的实施方案中，磁珠在分离***1、101中循环，并且仍然来自细胞培养物3、103的一部分新进料和磁珠可以被提供到磁分离器5、105中，而前一部分在洗脱单元7、107中，和前一部分在捕获单元9、109中。在此，三部分磁珠在分离***1、101、201中循环。

对于图8-10中所示的所有实施方案，细胞培养物3、103、203，磁分离器5、105、205和洗脱装置8、108、208可通过预灭菌的、柔性管和无菌连接器连接。此外，洗脱单元可预灭菌和一次性使用。由此可提供一次使用的封闭无菌分离***。

图9所示的分离***101还包括连接于洗脱单元出口107b并配置为接受来自洗脱单元的磁珠的中间单元111。中间单元111被配置为传送磁珠，以便在磁分离器5、105、205中进行可能的重新使用。在一个实施方案中，中间单元111包括用于从中间单元111中移除多余缓冲液的排干装置。这样一种排干装置也可以或替代地提供给图8和9中的***的捕获单元9、109。

本发明的方法也可在如图17所示的分离设备500中进行。在此，生物反应器502经由供给管线525与在图18中详细地说明的流体控制***501流体连接。流体控制***还与第一个磁分离器或合并的接触器-磁分离器505流体连接，例如通过第一分离器输入管线530和第一分离器输出管线540。第二个磁分离器或合并的接触器-磁分离器507也可与流体控制***流体连接，例如通过第二分离器输入管线535和第二分离器输出管线545。此外，第一个510、第二个515和第三个520缓冲液容器可与流体控制***通过第一个550、第二个555和第三个560缓冲液管线流体连接。来自流体控制***的输出可经由产品管线565和/或经由废物管线570引导。流体控制***501适当地包含一个或多个歧管582、至少一个泵586、阀584和管592，被配置以通过进料管线525将细胞培养物从生物反应器502输送至第一个磁分离器505 (通过第一分离器输入管线530)或输送至第二个磁分离器507 (通过第二分离器输入管线535)。流体控制***还被配置成将液体从第一个505或第二个507磁分离器通过第一个/第二个输出管线540、545输送至废物管线570或者产品管线565。通过第一/第二/第三缓冲液管线550、555、560，可将来自第一个510、第二个515和/或第三个529缓冲液容器的一或多种缓冲液经由第一个/第二个分离器输入管线530、535输送至第一个505或第二个507磁分离器。流体控制***可包括一个或多个传感器588，其被配置以测量通过管592输送的液体的性质，例如流速、压力、pH、电导率、温度、光传输等。控制单元590被信号连接(连接未示出)到泵、阀和传感器，并且被配置以通过流体控制***控制液体流动。控制单元也可通过信号连接器575、580信号连接至第一和第二磁分离器，并被配置为控制磁分离器中的搅拌和/或磁场。单流道的色谱***，例如ÄKTA ready (GE Healthcare)可以用作流体控制***501，并增加一些功能来控制磁分离器。

在分离设备500中，来自生物反应器502的细胞培养物可以被进料到包含如上所述的磁珠的磁分离器或合并的接触器-磁分离器505、507中的一个中，允许目标生物分子，例如免疫球蛋白结合到珠上。然后珠被磁场保留，而现在耗竭的细胞培养物被传送到废物管线570。洗涤缓冲液被从例如第一个缓冲液容器510输送到磁分离器中，并且在关闭磁场时与磁珠一起孵育。在打开磁场并将洗涤缓冲液输送到废物管线570后，将洗脱缓冲液从例如第二个缓冲液容器515输送到分离器，并且在关闭磁场时与磁珠一起孵育以洗脱目标生物分子/免疫球蛋白。含有洗脱的目标生物分子/免疫球蛋白的洗脱缓冲液经打开磁场与珠分离并被输送到产品管线565以供一步处理或中间贮存。以两个磁分离器，有可能在一个分离器中处理进料，同时在另一个磁分离器中洗涤和/或洗脱，允许当从大型生物反应器中收获时有效地循环分离步骤(需要例如在袋中进行5-10次负荷循环)。洗脱后，磁珠可通过与来自例如第三缓冲容器520的再生缓冲液一起孵育而适当地再生。所述珠在再生后也可以用平衡缓冲液来平衡，平衡缓冲液可以是来自例如第一个缓冲液容器510的洗涤缓冲液。适当地，在分离器之一中进行进料孵育、洗涤、洗脱、再生或平衡，同时在其它分离器中进行这些步骤中的另一个，以允许更高生产量。还设想，可使用3个(或甚至4个)独立可操作的磁分离器或合并的接触器-磁分离器(未示出第三/第四分离器)来同时执行不同的步骤，以进一步增加生产量。在这些应用中，流体控制***可以包括两个或更多的泵和更复杂的歧管/阀门***，以允许液体同时被输送进出不同的分离器。使用多个分离器，在含磁珠的第一个分离器中耗尽后，也有可能将细胞培养物进料传送到带有磁珠的第二个分离器中，以结合在第一个分离器中没有结合的任何目标生物分子/免疫球蛋白。这将改善目标生物分子的回收，特别是在其中配体-目标吸附等温线比较浅的情况下。

磁分离器/合并的接触器-磁分离器可适当地为在摇动平台410上的柔性袋405，如在图11和12中示出和上文讨论的。在图19 a)中示出的在袋底表面436下面带有电磁铁431(其信号连接575到控制单元590)的分离器可能是特别适合的。摇动平台还可配备负载单元448，其信号连接575到控制单元590，以允许反馈控制袋中液体的量。袋还可包括一个或多个传感器(未显示)，用于感测例如温度、pH、电导率、目标生物分子浓度等。此外，袋的出口可配备空气传感器(未显示)，以检测袋子何时已清空，并防止空气吸入泵内。袋可在袋内配备有适当数量的磁珠，或在过程开始前，可将珠导入袋内，例如经由袋中的无菌孔。袋可如图19 b)和c)所示有利地构造，其中顶部膜601和底部膜603熔接至间隔框架607以形成袋605。如果顶部和底部膜彼此直接熔接，如像在标准枕头式袋中一样，在焊缝附近形成一个狭窄的楔形空间，珠可被俘获在其中。使用间隔框架607可避免这种情况，例如，其可具有2-20 mm的厚度。间隔框架由可与顶部和底部膜熔接的材料适当地制成，例如聚乙烯(当使用聚乙烯膜时)。如图19 b)和c)所示，入口和出口609也可在间隔框架607中形成，特别是如果它具有5-20 mm的厚度，并且它们可任选地配备有筛子613，以防止任何零散的珠与输出流一起离开袋子。筛子应该优选被设计为保留珠，但让细胞通过。或者，筛子可以用小磁分离器代替。

分离设备500可适当地配置有单次使用弄湿组件。柔性袋405可以是单次使用袋、管线525、530、535、540、545、550、555、560、565、570，以及管592可以是单次使用塑料或弹性管，阀584可以是例如夹紧阀，泵586可以是蠕动泵，例如膜或离心泵，具有单次使用泵头，以及传感器588可以具有信号/物理连接到可重复使用部件的单次使用弄湿部件。缓冲液容器510、515、520可以例如是单次使用柔性袋和/或生物反应器502可包括单次使用柔性袋生物反应器容器。弄湿组件可作为一个或多个预先组装的流式套件提供，其包括管、连接器、袋、传感器的弄湿部件和/或单次使用泵头。这样的流式套件可有利地被预先消毒，例如用伽马射线。流式套件可以包括无菌连接器，用于不同的流式套件彼此之间的无菌连接和/或与其它组件的无菌连接。

实施例

实施例1

磁性琼脂糖珠

在恒温圆柱形玻璃容器中使用上置搅拌器，将80 g磁铁矿颗粒在836 g琼脂糖水溶液(800 g水和36 g琼脂糖)中的热(74℃)分散液在50 g乙基纤维素乳化剂/1120 ml甲苯的热(60℃)溶液中乳化。在乳化过程中取出样品，使用Malvern Mastersizer激光衍射仪进行粒度测量。搅拌继续进行，直到达到62微米的目标体积-加权中值液滴直径。此时，降低搅拌器rpm，将乳液冷却至22℃，以获得具有包埋的磁铁矿颗粒的固体琼脂糖凝胶珠。然后用95%乙醇沉淀洗涤珠5次，和用蒸馏水沉淀洗涤5次。所用的磁铁矿粉末得自Aldrich(article # 31,006-9)并具有1.5微米的体积-加权中值粒径(d50,v)，具有d10,v = 0.7微米和d90,v = 4.0微米的10%和90%分位数。

通过以下程序将1.0升沉淀的珠与表氯醇交联：加水至1.2升的总体积并在该混合物中溶解149 g硫酸钠、10.5 ml 50% NaOH和1.0 g硼氢化钠。升高温度至47℃并在6 h内在搅拌下加入124 ml表氯醇和85 ml 50% NaOH。冷却至室温并用乙酸中和。用6 x 1升蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤。将珠在37微米和100微米之间的筛布上过筛。

在Malvern Mastersizer激光衍射仪上测定交联珠的粒径分布，发现体积-加权中值粒径(d50,v)为65微米。所述珠的照片如图2所示并显示磁铁矿颗粒(黑色)主要或甚至完全位于每粒珠的中心区域。

所述珠可被描述为具有含4.3 wt. %的琼脂糖浓度的多孔琼脂糖凝胶相和包埋在琼脂糖凝胶相中的固体磁铁矿颗粒。所述珠中的平均磁铁矿含量为9.6 wt. % (1.8 vol%)和珠的密度为1.1 g/cm³ (磁铁矿密度为5.2 g/cm³)。

配体与珠的偶联

配体是具有C-末端半胱氨酸的蛋白Z的四聚体碱稳定变体(SEQ ID NO: 2)，已知具有对于IgG的700 pM的亲合常数k_off/k_on。

用10凝胶体积的蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤50 ml磁珠。使所述珠与15 ml蒸馏水和4 g NaOH (0.1 mol)在配有搅拌器的250 ml烧瓶中混合。在水浴中将温度调节至27 +/-2℃。在90 +/- 10分钟的剧烈搅拌(约250 rpm)下加入8 ml表氯醇(0.1 mol)。使反应继续另外80 +/- 10分钟，然后用>10凝胶体积的蒸馏水在玻璃过滤器上洗涤珠，直至达到中性pH。这些活化的珠被直接用于如下的偶联。

向在50 ml Falcon管中的20 mL配体溶液(50 mg/mL)中，加入169 mg NaHCO₃、21mg Na₂CO₃、175 mg NaCl和7 mg EDTA。将Falcon管置于辊式摇床上5-10 min，然后加入77mg DTE。还原进行>45 min。然后使配体溶液在填充有Sephadex G-25的PD10柱上脱盐。脱盐溶液中的配体含量通过测量276 nm处的UV吸收来测定。

活化的珠用3-5 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 8.6}洗涤，然后根据US6399750中所述的方法(通过引用以其整体并入本文)偶联配体，但每mL珠添加20 mg配体。该实验所用的全部缓冲液用氮气脱气至少5-10 min。

固定后，珠用蒸馏水洗涤3xGV。混合珠+ 1 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA/10%硫代甘油pH 8.6}并于室温下放置在摇床上过夜。然后，用3xGV {0.1 M TRIS/0.15 M NaCl pH8.6}和0.5 M HA交替洗涤珠，再用蒸馏水洗涤8-10xGV。

带有配体的珠的特征鉴定

配体含量

将珠样品送到外部实验室进行氨基酸分析，由氨基酸总量计算出配体含量为21.3mg/ml珠。

动态结合容量

将2 ml树脂填充到TRICORN™ 5 100柱中。以6分钟的停留时间(0.33ml/min流速)，用ÄKTAExplorer 10***确定穿透容量。平衡缓冲液通过旁路柱运行，直到获得稳定的基线。这是在自动归零之前完成的。将样品施加到柱上，直到获得100% UV信号。然后，再次施加平衡缓冲液，直到获得稳定的基线。

样品被加载到柱上，直到达到最大吸光度的85%的UV信号。然后用5个柱体积(CV)平衡缓冲液(流速为0.5 ml/min)清洗柱。用5 CV洗脱缓冲液(流速为0.5 ml/min)洗脱蛋白。然后用0.5M NaOH (流速为0.2 ml/min)清洗柱，和用平衡缓冲液进行再平衡。

为计算10%的穿透容量，采用了以下方程式。即加载到柱上直到柱流出液中的IgG浓度是进料中IgG浓度的10%的IgG的量。

A_100% = 100% UV信号；

A_sub = 来自非结合IgG亚类的吸光度贡献；

A(V) = 给定施加体积的吸光度；

V_c = 柱体积；

V_app = 直至10%穿透而施加的体积；

V_sys =***死体积；

C₀ = 进料浓度。

对5、10和80%穿透计算了动态结合容量(DBC)，发现为：Qb 5% = 69 mg/ml，Qb 10%= 72 mg/ml和Qb 80% = 100 mg/ml。

吸附等温线

在1.5 mL试管中使用20-200微升珠等分试样的分批吸附，以1h的孵育时间，测定直接来自细胞培养物的IgG抗体在珠上的吸附等温线。测定上清液中的抗体浓度，并从孵育前后的差异浓度计算吸附量。吸附量对比平衡上清液浓度作为吸附等温线作图(图13)，并将Langmuir方程q = q_m c/(K+c)对数据进行拟合，其中q是结合的量(mg/ml)，c是平衡溶液浓度(mg/ml)，K是解离常数(mg/ml)和q_m是最大结合容量(mg/ml)。计算的参数为q_m (最大结合容量) = 87 mg/ml和K (解离常数) = 0.06 mg/ml。这表明，等温线是非常有利的，抗体与珠的结合非常强。

细胞培养

用表达IgG单克隆抗体的CHO细胞培养物进行评估。评估样本在连续两天中从培养物中取回。第一天，抗体滴度为2.2 mg IgG/ml和细胞密度为1.2 x 10⁷个细胞/ml。第二天，滴度为2.6 mg IgG/ml，细胞密度为1.8 x 10⁷个细胞/ml。在两种情况下，细胞存活率为>90%。

高梯度磁场分离器(HGMS)

具有转子-定子设计的Andritz高梯度磁分离器(Andritz Separation, Germany,http://www.andritz.com/de/no-index/se-high-gradient-magnetic-separator.htm)被用于在评估试验中洗涤和洗脱。分离器设计公开于US7506765 (通过引用以其整体并入本文)并包括具有平行穿孔可磁化圆盘的定子和带有穿孔旋转盘的转子，转子盘中散布有定子盘。当盘用电磁铁磁化时，磁珠将附着在盘上，而当磁场移除时，珠可通过转子盘的旋转而重新分散。盘被封闭在一个980 ml体积的通流室中，该室连接到一个能输送2.7升/分钟流速的蠕动泵。至多600 ml磁珠可被保留在室中。

评估

使约2-3升细胞培养物与约200 ml磁珠在一个3 L塑料烧杯中混合并孵育60分钟。然后将细胞培养物和珠传送到HGMS室，并施加磁场以保留珠。然后用PBS缓冲液进行三次洗涤循环和用蒸馏水进行一次洗涤循环，每一次循环包括用液体灌满所述室，通过去除磁场和旋转转子盘再分散珠，和再施加磁场并排干所述室。在最后一次洗涤循环后，以与洗涤循环相同的方式进行三次洗脱循环，但用100 mM醋酸钠(pH 2.9)作为洗脱缓冲液。合并三种洗脱液并分析，同时用0.1 M NaOH作为清洁液，用三次清洁循环清洁珠。最后，用三个循环的PBS缓冲液对珠进行再平衡，然后将珠泵回柔性塑料袋中，用细胞培养物的新的等分试样重复实验。洗涤、洗脱、清洁和再平衡步骤的总时间为60 min。

评估结果

使用表1的条件，用相同的珠样品进行了五个评价循环。

表1. 评价循环

在细胞与珠一起孵育的过程中对细胞染色以进行存活率测试，未能观察到对存活率的影响。孵育30和60 min前后的存活率为稳定的93.5-93.7%。这意味着有可能在磁珠的存在下培养细胞，在正在进行培养的过程中捕获免疫球蛋白。

作为孵育时间的函数，测定了珠对IgG的摄取，如图14所示。在大约20 min之后达到了平衡。

三种洗脱液流分的抗体收率如图15所示。表2显示了洗脱液池中的总收率和抗体纯度，如通过尺寸排阻色谱法(SEC)测定的。洗脱液的一个实例SEC色谱显示于图16中。

表2. 评估结果

生产率

表3显示了基于实验的生产率评估的概览。

表3. 生产率评估

本书面描述采用实施例以公开本发明，包括最佳模式，并且还能够使本领域技术人员实践本发明，包括制造和使用任何装置或***并执行任何结合的方法。本发明的可专利范围由权利要求书限定，并且可包括本领域技术人员想到的其它实施例。如果这样的其它实施例具有不同于权利要求书的文字语言的结构要素，或如果它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等同结构要素，则它们意欲落入权利要求书的范围内。本文提及的所有专利或专利申请通过引用以其整体结合到本文中，如同它们各自结合到本文中一样。

Claims

1.一种从细胞培养物中分离目标生物分子的方法，其包括以下步骤：

a)提供多个能够结合所述目标生物分子的磁珠；

b)使多个所述磁珠与包含目标生物分子的细胞培养物接触，以使所述目标生物分子与所述磁珠结合，其中步骤b)在安装在适合围绕水平轴摇动的托盘上的柔性袋中执行；

c)用磁场保留所述磁珠并用洗涤液洗涤所述磁珠；

d)用洗脱剂洗脱所述磁珠以从所述磁珠解吸所述目标生物分子并回收洗脱液中的所述目标生物分子，

其中在步骤b)中，所述细胞培养物是未澄清的细胞培养物或细胞-耗竭的细胞培养物，其中所述细胞-耗竭的细胞培养物是其中一部分、但不是全部的细胞和/或细胞碎片已被移除的细胞培养物。

2.权利要求1的方法，其中在步骤c)之前，所述磁珠被传送到高梯度磁场分离器并在所述高梯度磁场分离器中执行步骤c)。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤d)在高梯度磁场分离器中执行。

4.权利要求3的方法，其中步骤c)和d)都在相同的高梯度磁场分离器中执行。

5.权利要求3的方法，其中步骤c)在洗涤器高梯度磁场分离器(342)中执行和步骤d)在洗脱高梯度磁场分离器(8；108；208；344)中执行。

6.权利要求1或2的方法，其中在步骤d)之后，所述磁珠在生物反应器容器中被清洗、再平衡并重复使用。

7.权利要求1或2的方法，其中所述细胞培养物包含至少1mg/ml目标生物分子。

8.权利要求1或2的方法，其中每升细胞培养物50-200ml所述磁珠与所述细胞培养物接触。

9.权利要求1或2的方法，其还包括向所述细胞培养物添加吸附剂或沉淀剂。

10.权利要求1或2的方法，其中所述洗脱液被直接应用于色谱柱。

11.权利要求1或2的方法，其中所述洗脱液被直接应用于病毒过滤器。

12.权利要求1或2的方法，其中步骤c)包括以下顺序：

i)移除所述磁场；

ii)再悬浮所述磁珠；

iii)使所述磁珠与一部分洗涤液接触；

iv)用磁场保留所述磁珠；和

v)从所述保留的磁珠除去洗涤液。

13.权利要求1或2的方法，其中在步骤d)中，所述磁珠用磁场保留。

14.权利要求1的方法，其中所述托盘被布置成绕轴转动至垂直的位置，用来排空所述柔性袋。

15.权利要求1的方法，其中步骤c)在所述柔性袋中执行。

16.权利要求1的方法，其中步骤d)在所述柔性袋中执行。

17.权利要求15或16的方法，其中所述柔性袋的一部分被配置用于所述磁珠的磁性保留。

18.权利要求1的方法，其中可移动托盘包括至少一个磁铁或磁铁支架。

19.权利要求1的方法，其中所述磁珠是预灭菌的。

20.权利要求19的方法，其中所述磁珠是干燥供应的。

21.权利要求19或20的方法，其中所述磁珠通过预灭菌管和一个或多个无菌连接器从预灭菌珠容器传送到所述柔性袋、磁分离器或接触器。

22.权利要求1或2的方法，其中在步骤d)之后，所述磁珠被再生并再循环到所述柔性袋中并重复步骤b)-d)。

23.权利要求22的方法，其中所述磁珠经灭菌后再循环到所述柔性袋中。

24.权利要求1或2的方法，其中细胞在所述柔性袋中，在所述磁珠的存在下培养。

25.权利要求1的方法，其中步骤a)包括提供多个免疫球蛋白-结合磁珠(50)，所述磁珠包含多孔基质(51)和一个或多个嵌入所述基质的磁性粒子(52)，其中所述基质包含多孔聚合物和共价偶联于所述多孔聚合物的至少10mg/ml Fc-结合蛋白配体。

26.权利要求1的方法，其中在步骤b)中，磁珠加入到接触器用于与从柔性袋传送的一部分细胞培养物一起孵育。

27.权利要求26的方法，其中所述接触器是柔性袋。

28.权利要求27的方法，其中所述柔性袋(405)安装在适合围绕水平轴摇动的托盘上。

29.权利要求28的方法，其中所述托盘被布置成绕轴转动至垂直的位置，用来排空所述柔性袋。

30.权利要求1的方法，其中步骤b)和c)都在合并的接触器和磁分离器中执行。

31.权利要求30的方法，其中所述合并的接触器和磁分离器是具有磁铁(450；430)的柔性袋(405)，所述磁铁与所述柔性袋接触或相邻。

32.权利要求31的方法，其中所述柔性袋由适合围绕水平轴摇动的托盘支撑。

33.权利要求32的方法，其中所述托盘包含磁铁(430)。

34.权利要求26-33的任一项的方法，其中步骤b)、c)和d)用所述细胞培养物的等分试样重复。

35.权利要求34的方法，其中使用多个接触器或合并的接触器-磁分离器。

36.权利要求35的方法，其中步骤b)、c)和d)之一在一个接触器或接触器-磁分离器中与步骤b)、c)和d)中的另一个在另一个接触器或接触器-磁分离器中同时执行。

37.权利要求35或36的方法，其中步骤b)在第一个接触器或合并的接触器-磁分离器中执行，然后将细胞培养物传送到具有磁珠和细胞培养物的第二个接触器或合并的接触器-磁分离器中，用于捕获步骤b)中未与磁珠结合的任何目标生物分子。

38.权利要求1的方法，其中步骤b)在接触器(322)中执行，和其中在步骤d)之后，所述磁珠被再循环至所述接触器。

39.权利要求1的方法，其中步骤b)用来自细胞分离装置(362)的细胞-耗竭的细胞培养物执行。

40.权利要求39的方法，其中所述细胞分离装置是沉淀器。

41.权利要求39的方法，其中所述细胞分离装置是声学分离器。

42.权利要求1的方法，其中所述细胞培养物是灌注培养物。

43.权利要求1的方法，其中所述细胞培养物是恒化培养物。

44.权利要求1或2的方法，其中所述目标生物分子是免疫球蛋白。

45.权利要求44的方法，其中所述磁珠包含多孔基质和一个或多个嵌入所述基质的磁性粒子，其中所述基质包含多孔聚合物和共价偶联于所述多孔聚合物的至少10mg/ml Fc-结合蛋白配体。

46.权利要求45的方法，其中所述配体对免疫球蛋白具有2000pM或更低的亲合常数k_off/k_on。

47.权利要求45或46的方法，其中所述多孔聚合物是交联的。

48.权利要求45或46的方法，其中所述多孔聚合物是多糖。

49.权利要求45或46的方法，其中所述多孔聚合物是交联的琼脂糖或琼脂，或包含交联的琼脂糖或琼脂。

50.权利要求45或46的方法，其中所述磁性粒子是亚铁磁性的。

51.权利要求45或46的方法，其中所述磁性粒子包含磁铁矿或磁赤铁矿。

52.权利要求45或46的方法，其中所述磁珠包含5-15wt.％的所述磁性粒子。

53.权利要求45或46的方法，其中所述磁性粒子的体积-加权中值直径(d50,v)为1-5微米。

54.权利要求45或46的方法，其中在所述磁珠中，所述磁性粒子在每个磁珠的中心区域的浓度为在所述磁珠的表面区域的浓度的至少200％，其中中心区域被定义为具有离磁珠表面>0.2个磁珠半径的距离，和表面区域被定义为具有离磁珠表面<0.2个磁珠半径的距离。

55.权利要求45或46的方法，其中对所述磁珠用反相尺寸排阻色谱法测定时，Mw100kDa的葡聚糖的K_av值是0.5-0.9。

56.权利要求47的方法，其中交联聚合物在多孔基质中的浓度为1-5wt.％。

57.权利要求56的任一项的方法，其中所述交联聚合物在多孔基质中的浓度为2-5wt.％。

58.权利要求56的任一项的方法，其中所述交联聚合物在多孔基质中的浓度为3-5wt.％。

59.权利要求45或46的方法，其中所述磁珠的平均密度为1.05-1.20g/ml。

60.权利要求45或46的方法，其中所述配体包含细菌Fc-结合剂。

61.权利要求45或46的方法，其中所述配体包含葡萄球菌蛋白A的一个或多个Fc-结合结构域或所述结构域的一个或多个突变体。

62.权利要求45或46的方法，其中所述配体包含葡萄球菌蛋白A Fc-结合结构域的一个或多个碱稳定的突变体。

63.权利要求45或46的方法，其中所述磁珠的体积-加权中值直径(d50,v)为8-300微米。

64.权利要求1或2的方法，其在用于从生物培养物分离目标生物分子的分离设备(500)上执行，所述设备包括：

至少一个包含磁珠的磁分离器(505,507)；

流体控制***(501)，其被流体和信号连接到所述至少一个磁分离器，被流体连接到生物反应器(502)和至少一个缓冲剂容器(510,515,520)，并被配置成将细胞培养物从所述生物反应器传送到所述至少一个磁分离器和从所述至少一个磁分离器传送。