CN110114368A - 靶向突变干扰素-γ及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明部分涉及包含突变干扰素‑γ的嵌合蛋白及其作为治疗剂的用途。

Description

靶向突变干扰素-γ及其用途

技术领域

本发明部分涉及包含突变干扰素-γ的嵌合蛋白及其作为治疗剂的用途。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年10月24日提交的美国临时申请号62/411,823的权益，其内容通过引用整体并入本文。

序列表

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背景技术

干扰素(IFN)是在哺乳动物细胞中响应于病毒、促***原和其他物质的刺激而合成的蛋白质家族。已显示干扰素具有抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。在人类中已鉴定了超过20种不同的干扰素，且其被分为I型、II型和III型干扰素。

在各种干扰素中，干扰素-γ(IFN-γ)是II型干扰素中唯一的成员。IFN-γ与I型干扰素(如干扰素-α和干扰素-β)相比具有更低的特异性抗病毒活性，但是比I型干扰素具有更多的免疫调节性质。IFN-γ通过与IFN-γ受体的特异性相互作用发挥其生物效应，IFN-γ受体是IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚基的复合物。IFN-γ结合至呈二聚体之IFN-γ受体，并且在结合后激活JAK-STAT途径。

已经开发了包含重组人野生型IFN-γ的药物组合物(例如，ACTIMMUNE)。然而，重组人IFN-γ的施用涉及频繁注射，这归因于短的血浆半衰期。此外，重组人IFN-γ的使用与包括以下的副作用有关：发热、寒战、出汗、头痛、肌痛、嗜睡、疼痛、红斑、肝酶升高、可逆性肉芽肿和血栓形成以及心脏毒性。

因此，仍需要改进的IFN-γ组合物，其可用于治疗疾病和病症，同时引起最小的毒性和副作用。

发明内容

在一些方面中，本发明涉及包含修饰的干扰素-γ(IFN-γ)作为信号传导剂的嵌合蛋白。在一个实施方案中，IFN-γ是人IFN-γ。在各种实施方案中，修饰的IFN-γ包含一个或多个降低其生物活性的突变。在各种实施方案中，修饰的IFN-γ包含一个或多个降低其对治疗性受体的亲和力和/或生物活性的突变。在一个实施方案中，治疗性受体是IFN-γ受体，其是由IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚基构成。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ包含一个或多个降低其对IFN-γ受体1亚基的亲和力和/或生物活性的突变。在另一个实施方案中，修饰的IFN-γ包含一个或多个降低IFN-γ受体2亚基活性的突变。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ包含一个或多个降低其对IFN-γ受体1亚基的亲和力和/或生物活性的突变，并且包含一个或多个降低IFN-γ受体2亚基活性的突变。在各种实施方案中，突变可以是氨基酸置换或蛋白质截短。在一些实施方案中，突变可涉及单链IFN-γ的形成。

在一些实施方案中，嵌合蛋白包含一种或多种另外的信号传导剂，例如但不限于：可被修饰的干扰素、白细胞介素和肿瘤坏死因子。在各种实施方案中，与未修饰的野生型IFN-γ相比，本发明的嵌合蛋白提供改善的安全性。

在各种实施方案中，嵌合蛋白包含一个或多个靶向部分，其具有识别结构域(例如，抗原识别结构域，包括但不限于各种抗体形式，包括单结构域抗体)，其特异性结合至目标靶标(例如，抗原、受体)。在各种实施方案中，靶向部分具有特异性结合至目标靶标(例如，抗原、受体)的识别结构域，包括见于一种或多种免疫细胞上的那些，所述免疫细胞可包括但不限于T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如M1巨噬细胞)、B细胞和树突细胞。在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至目标靶标(例如，抗原、受体)并有效地募集多种免疫细胞中的一种。在一些实施方案中，目标靶标(例如，抗原、受体)可见于一种或多种肿瘤细胞上。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白可将免疫细胞(例如，可以杀死和/或抑制肿瘤细胞的免疫细胞)募集到作用位点(例如，作为非限制性实例，肿瘤微环境)。在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至目标靶标(例如，抗原、受体)，其为非细胞结构的一部分。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白可用于治疗各种疾病或病症，如癌症、感染、免疫病症、自身免疫疾病、心血管疾病、伤口愈合、缺血相关疾病、神经变性疾病、代谢疾病、及许多其他疾病和病症，且本发明包括各种治疗方法。

本文公开的任何方面或实施方案可与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。

附图说明

已经概括地描述了本发明公开的主题，现在将参考附图，附图不一定按比例绘制，且其中：

图1示出了缺少N末端信号序列的野生型IFN-γ(P-522；SEQ ID NO:947)与修饰的IFN-γ(P-662至P-676，分别为SEQ ID NO:948至SEQ ID NO:962)的比对序列。

图2A至图2P是示出了用CD20质粒或空载体转染并用本发明的嵌合蛋白刺激的细胞中的pGAS报告基因活性的图。数据显示为平均值±标准偏差。

图3A至图3H是示出了用CD20质粒或空载体转染并用本发明的嵌合蛋白刺激的细胞的免疫荧光强度的图。将细胞用磷酸-STAT1抗体探测。数据显示为平均值±STDEV。

具体实施方式

本发明部分是基于以下惊人的发现：包含对一种或多种受体具有降低的亲和力和/或生物活性的修饰的IFN-γ的靶向嵌合蛋白显示出有益的治疗性质和减少的副作用。本发明提供了包含嵌合蛋白的药物组合物及其在治疗各种疾病中的用途。施用本发明的嵌合蛋白和药物组合物实现了显著减少的副作用。

修饰的干扰素-γ

一方面，本发明提供了一种包含信号传导剂的嵌合蛋白，所述信号传导剂是对一种或多种受体具有降低的亲和力和/或生物活性的干扰素-γ(IFN-γ)的修饰形式。干扰素(IFN)是由各种各样的真核细胞分泌的众所周知的细胞因子家族。干扰素具有多种生物活性，包括抗病毒、免疫调控、免疫调节和抗增殖性质，并且已用作治疗各种疾病的治疗剂。

在各种干扰素中，IFN-γ是II型干扰素中唯一的成员。IFN-γ主要由自然杀伤(NK)和自然杀伤T(NKT)细胞产生，作为先天免疫应答的一部分。IFN-γ也由CD4Th1和CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)效应T细胞、巨噬细胞、树突细胞和B细胞产生。活化的IFN-γ形成二聚体，其通过由IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚基构成的异二聚受体(即IFN-γ受体或IFN-γR)起作用。IFN-γ受体1是主要的配体结合亚基，而IFN-γ受体2是信号转导所必需，并且还提高IFN-γ受体1对其配体的亲和力。IFN-γ二聚体与受体的结合激活JAK-STAT信号传导途径以引发各种生物效应。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含修饰形式的IFN-γ作为信号传导剂。在各种实施方案中，IFN-γ包括IFN-γ的功能衍生物、类似物、前体、同种型、剪接变体或片段。在各种实施方案中，IFN-γ包括衍生自任何物种的IFN-γ。在一个实施方案中，嵌合蛋白包含修饰形式的小鼠IFN-γ。在另一个实施方案中，嵌合蛋白包含修饰形式的人IFN-γ。

人IFN-γ是包含166个氨基酸残基的多肽。在一个实施方案中，人IFN-γ具有SEQID NO：946的氨基酸序列，其中信号肽包含前23个氨基酸。

如本文所用，人IFN-γ还可指的是不含N末端信号肽的成熟人IFN-γ。在此实施方案中，成熟的人IFN-γ包含143个氨基酸并具有SEQ ID NO：947的氨基酸序列。

在一些实施方案中，人IFN-γ是糖基化形式的人IFN-γ。在一些实施方案中，人IFN-γ是非糖基化形式的人IFN-γ。

IFN-γ的序列是本领域中已知的。在各种实施方案中，修饰的IFN-γ包含与IFN-γ的已知野生型氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或在至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的序列同一性)。

在一些实施方案中，修饰的IFN-γ包含与具有SEQ ID NO：946的氨基酸序列的人IFN-γ具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或在至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的序列同一性)。

在一些实施方案中，修饰的IFN-γ包含与具有SEQ ID NO：947的氨基酸序列的人IFN-γ具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或在至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％序列同一性的氨基酸序列(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％的序列同一性)。

在各种实施方案中，修饰的IFN-γ包含具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸突变可独立地选自置换、***、缺失和截短。

在一些实施方案中，氨基酸突变是氨基酸置换，并且可以包括保守和/或非保守置换。

例如，“保守置换”可基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。可将20种天然存在的氨基酸分为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

如本文所用，“保守置换”被定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组的同一组中列出的另一种氨基酸交换。例如，Asp被Glu交换在如此修饰的多肽中保留一个负电荷。另外，甘氨酸和脯氨酸可基于其破坏α-螺旋的能力而彼此置换。

如本文所用，“非保守置换”被定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)的不同组中列出的另一种氨基酸交换。

在各种实施方案中，置换还可包括非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、共同氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计者氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸及氨基酸类似物)。

在各种实施方案中，IFN-γ被修饰以具有一个或多个突变。在一些实施方案中，突变允许修饰的IFN-γ具有一种或多种相对于未突变体(例如，IFN-γ的野生型形式)的减弱的活性，如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性中的一种或多种。例如，一种或多种相对于未突变体(例如，IFN-γ的野生型形式)的减弱的活性如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性可针对治疗性受体，如IFN-γ受体。因此，在各种实施方案中，突变允许修饰的可溶性因子相对于未突变体(例如，IFN-γ的野生型形式)具有降低的全身毒性、减少的副作用和降低的脱靶效应。

在各种实施方案中，IFN-γ被修饰以具有降低其对治疗性受体(如包含IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚基的IFN-γ受体)的结合亲和力和/或活性的突变。在一些实施方案中，由野生型IFN-γ提供的活性是在治疗性受体处的激动作用(例如，在治疗部位处激活细胞效应)。例如，野生型IFN-γ可激活治疗性受体。在此类实施方案中，突变导致修饰的IFN-γ对治疗性受体具有降低的激活活性。

在一些实施方案中，对治疗性受体(例如，IFN-γ受体)的降低的亲和力和/或活性可通过与靶向部分连接而恢复。在其他实施方案中，对治疗性受体的降低的亲和力和/或活性不能通过与靶向部分连接而实质上恢复。在各种实施方案中，本发明的治疗性嵌合蛋白降低脱靶效应，因为IFN-γ具有削弱对治疗性受体的结合亲和力和/或活性的突变。在各种实施方案中，这减少在例如野生型IFN-γ下观察到的副作用。在各种实施方案中，修饰的IFN-γ在通向治疗活性位点的途中实质上无活性，并且实质上对特异性靶向细胞类型具有作用，这极大地减少了不希望有的副作用。

在各种实施方案中，修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，其导致IFN-γ具有减弱或降低的亲和力和/或活性，例如结合(例如，K_D)和/或激活(可测量为，例如，K_A和/或EC₅₀)一种或多种治疗性受体(例如，IFN-γ受体)。在各种实施方案中，对治疗性受体的降低的亲和力和/或活性允许减弱来自治疗性受体的活性和/或信号传导。

在各种实施方案中，修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述突变降低其与IFN-γ受体1亚基的结合或其对IFN-γ受体1亚基的亲和力和/或生物活性。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ对IFN-γ受体1亚基具有降低的亲和力和/或活性。在各种实施方案中，修饰的IFN-γ是人IFN-γ，其在涉及与IFN-γ受体1亚基结合的氨基酸残基处具有一个或多个突变。在一些实施方案中，修饰的IFN-γ是人IFN-γ，其在位于与IFN-γ受体1亚基的界面处的氨基酸处具有一个或多个突变。在各种实施方案中，一个或多个突变位于选自但不限于以下的氨基酸处：Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119和K125(各自相对于SEQ ID NO：947，其为野生型人IFN-γ并且缺少其N末端信号序列)。在一些实施方案中，一个或多个突变是选自以下的置换：V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G(各自相对于SEQ IDNO：947)。在实施方案中，一个或多个突变是选自以下的置换：V22A、A23G、D24G、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G；这些修饰的IFN-γ分别具有以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：953、SEQ ID NO：954、和SEQ ID NO：956至SEQ ID NO：961)。

在一个实施方案中，修饰的IFN-γ包含突变A23G和D24G，此修饰的IFN-γ具有SEQID NO：955的氨基酸序列。在另一实施方案中，修饰的IFN-γ包含突变I114A和A118G，此修饰的IFN-γ具有SEQ ID NO：962的氨基酸序列。在又一实施方案中，修饰的IFN-γ包含突变V5E、S20E、A23F和G26Q。

在各种实施方案中，修饰的IFN-γ具有以下突变中的一个或多个：缺失残基A23、缺失残基D24、S20I置换、A23V置换、D21K置换和D24A置换。

在一些实施方案中，修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述突变降低其与IFN-γ受体2亚基的结合或其对IFN-γ受体2亚基的亲和力和/或生物活性。

在一些实施方案中，修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述突变降低其与IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚基的结合或其对IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚基的亲和力和/或生物活性。

在一些实施方案中，修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述突变降低其与IFN-γ受体1的结合或其对IFN-γ受体1的亲和力和/或生物活性；和一个或多个突变，所述突变实质上降低或消除其与IFN-γ受体2的结合或其对IFN-γ受体2的亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，具有这种修饰的IFN-γ的嵌合蛋白可提供靶标选择性IFN-γ受体1活性(例如，IFN-γ受体1活性可通过经由靶向部分靶向而恢复)。

在一些实施方案中，修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述突变降低其与IFN-γ受体1的结合或其对IFN-γ受体1的亲和力和/或生物活性；和一个或多个突变，所述突变降低其与IFN-γ受体1的结合或其对IFN-γ受体1的亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，具有这种修饰的IFN-γ的嵌合蛋白可提供靶标选择性IFN-γ受体1和/或IFN-γ受体1活性(例如，IFN-γ受体1和IFN-γ受体2活性可通过经由靶向部分靶向而恢复)。

在各种实施方案中，修饰的IFN-γ在C末端处被截短。在一些实施方案中，修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，其包含缺失C末端的SEQ ID NO：947的氨基酸序列。在这类实施方案中，成熟IFN-γ可包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个氨基酸残基的C末端截短。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，其包含SEQ ID NO：947的氨基酸序列，其C末端缺失5个氨基酸，此修饰的IFN-γ具有SEQ ID NO：948的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，其包含SEQ ID NO：947的氨基酸序列，其C末端缺失7个氨基酸，此修饰的IFN-γ具有SEQ ID NO：949的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，其包含SEQ ID NO：947的氨基酸序列，其C末端缺失14个氨基酸，此修饰的IFN-γ具有SEQ ID NO：950的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，其包含SEQ ID NO：947的氨基酸序列，其C末端缺失15个氨基酸，此修饰的IFN-γ具有SEQ ID NO：951的氨基酸序列。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ是成熟IFN-γ，其包含SEQ ID NO：947的氨基酸序列，其C末端缺失16个氨基酸，此修饰的IFN-γ具有SEQ IDNO：952的氨基酸序列。可用于本发明中的另外的具有C末端截短的修饰的IFN-γ描述于Haelewyn等人,Biochem.J.(1997),324:591-595和Lundell等人,Protein Eng.(1991)4:335-341中，其全部内容通过引用并入本文。

在各种实施方案中，修饰的IFN-γ是单链IFN-γ，如例如Randal等人(2001)Structure 9:155-163和Randal等人(1998)Protein Sci.7:1057-1060中所述，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，单链IFN-γ包含在其C末端连接至第二IFN-γ链的N末端的第一IFN-γ链。在各种实施方案中，第一和第二IFN-γ链通过接头连接，如本文中别处所述。

在一些实施方案中，第一IFN-γ链包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个氨基酸残基的C末端截短。在一个实施方案中，第一IFN-γ链包含约24个氨基酸残基的C末端截短。在一些实施方案中，第二IFN-γ链包含至少约1、约2、约3、约4或约5个氨基酸残基的N末端截短。在一个实施方案中，第二IFN-γ链包含约3个氨基酸残基的N末端截短。在一些实施方案中，第二IFN-γ链包含至少约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24或约25个氨基酸残基的C末端截短。在各种实施方案中，第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含在Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119和K125处的一个或多个氨基酸突变，如本文中别处所述。在各种实施方案中，第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含选自V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G的一个或多个置换。在各种实施方案中，第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含选自V22A、A23G、D24G、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G的一个或多个置换。在各种实施方案中，第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含A23G和D24G置换。在各种实施方案中，第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含I114A和A118G置换。在另一实施方案中，突变是V5E、S20E、A23F和G26Q。

在各种实施方案中，第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含如本文所公开的一个或多个置换，并且第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含如本文所公开的C末端截短。

在各种实施方案中，第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含如本文所公开的一个或多个置换和如本文所公开的C末端截短。

人IFN-γ的晶体结构是已知的，并描述于例如Ealick等人,(1991)Science,252:698-702中。具体来说，已显示人IFN-γ的结构包括六个α-螺旋的核心和C末端区域中的延伸的未折叠序列。在各种实施方案中，修饰的IFN-γ在一个或多个螺旋中具有一个或多个突变，所述突变降低其对治疗性受体(例如，IFN-γ受体)的结合亲和力和/或生物活性。

在各种实施方案中，相对于野生型IFN-γ，修饰的IFN-γ对治疗性受体(例如，IFN-γ受体或其IFN-γ受体1和IFN-γ受体2亚基中的任一者)具有约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约10％-20％、约20％-40％、约50％、约40％-60％、约60％-80％、约80％-100％的亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，相对于野生型IFN-γ，结合亲和力和/或生物活性至少低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、约低6倍、约低7倍、低约8倍、低约9倍、低至少约10倍、低至少约15倍、低至少约20倍、低至少约25倍、低至少约30倍、低至少约35倍、低至少约40倍、低至少约45倍、低至少约50倍、低至少约100倍、低至少约150倍、或低约10-50倍、低约50-100倍、低约100-150倍、低约150-200倍、或低200倍以上。

在各种实施方案中，例如相对于野生型IFN-γ，修饰的IFN-γ包含一个或多个突变，所述突变将IFN-γ的内源活性降低至约75％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约25％、或约20％、或约10％、或约5％、或约3％、或约1％。

在一些实施方案中，修饰的IFN-γ包含一个或多个突变，所述突变导致修饰的IFN-γ对受体具有降低的亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，修饰的IFN-γ对受体的结合亲和力和/或生物活性低于靶向部分对其受体的结合亲和力和/或生物活性。在一些实施方案中，此结合亲和力和/或生物活性差异是在相同细胞上的修饰的IFN-γ/受体与靶向部分/受体之间。在一些实施方案中，此结合亲和力和/或生物活性差异允许修饰的IFN-γ具有局部中靶效应并且使作为在野生型IFN-γ下所观察到的副作用的基础的脱靶效应最小化。在一些实施方案中，此结合亲和力和/或生物活性低至少约2倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少约25倍、或至少约低50倍、或至少约100倍、或至少约150倍。

可使用本领域已知的方法测量受体结合活性。例如，亲和力和/或结合活性可通过Scatchard图分析和结合数据的计算机拟合(例如，Scatchard,1949)或通过在流动通过条件下的反射干扰分光光度法来评估，如Brecht等人(1993)所述，所有这些的全部内容通过引用并入本文。

在各种实施方案中，对治疗性受体的减弱的活性、对治疗性受体的弱化的亲和力和/或生物活性可通过与靶向部分连接而恢复，所述靶向部分对治疗活性位点处的抗原具有高亲和力(例如，抗体或本文所述的抗体形式)。靶向通过将修饰的IFN-γ与靶向部分连接来实现。在一个实施方案中，修饰的IFN-γ通过其氨基末端与靶向部分连接。在另一实施方案中，修饰的IFN-γ通过其羧基末端与靶向部分连接。以这种方式，在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白在治疗性受体处提供局部、中靶及受控的治疗作用。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含IFN-γ，其包含如本文所公开的一个或多个置换和/或如本文所公开的C末端截短。

包含本发明的修饰的干扰素-γ的治疗剂

靶向部分细胞募集

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白另外包含一个或多个具有识别结构域的靶向部分，所述识别结构域特异性结合至目标靶标(例如，抗原、受体)。在示例性实施方案中，嵌合蛋白可包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个靶向部分。在各种实施方案中，目标靶标(例如，抗原、受体)可见于包括但不限于以下的一种或多种免疫细胞上：T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如，M1巨噬细胞)、B细胞、树突细胞或其子集。在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至目标靶标(例如，抗原、受体)并且有效地直接或间接募集多种免疫细胞中的一种。在一些实施方案中，目标靶标(例如，抗原、受体)可见于一种或多种肿瘤细胞上。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含两个或更多个靶向部分。在此类实施方案中，嵌合蛋白可靶向两种不同的细胞(例如，以产生突触)或相同的细胞(例如，以获得更集中的信号传导剂效应)。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白可直接或间接地将免疫细胞(例如，在一些实施方案中)募集到治疗位点(例如，具有一种或多种疾病细胞或为了治疗效果而有待调控的细胞的基因座)。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白可直接或间接地将免疫细胞(例如，可杀死和/或抑制肿瘤细胞的免疫细胞)募集到作用位点(例如，作为非限制性实例，肿瘤微环境)。

在各种实施方案中，靶向部分可直接或间接募集细胞，如疾病细胞和/或效应细胞。在各种实施方案中，信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)可调控由靶向部分所靶向的一种或多种细胞(例如，募集的细胞，如疾病细胞和/或效应细胞)。例如，信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)可调控一种或两种靶向细胞(并且靶向细胞可以是效应细胞和/或疾病细胞)，这取决于靶向细胞是否表达信号传导剂的受体。

在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够或可用于涉及使免疫细胞平衡转变为有利于肿瘤免疫攻击的方法中。例如，本发明的嵌合蛋白可改变在临床上重要位点处的免疫细胞的比例，朝向有利于可杀死和/或抑制肿瘤的细胞(例如，T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如，M1巨噬细胞)、B细胞、树突细胞或其子集)并且不利于保护肿瘤的细胞(例如，骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、调节性T细胞(Treg)；肿瘤相关嗜中性粒细胞(TAN)、M2巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或其子集)。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增加效应T细胞与调节性T细胞的比例。

例如，在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与T细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接募集T细胞。在一个实施方案中，识别结构域特异性结合至效应T细胞。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接地将效应T细胞(例如，在一些实施方案中)募集到治疗位点(例如，具有一种或多种疾病细胞或为了治疗效果而有待调控的细胞的基因座)。示例性效应T细胞包括细胞毒性T细胞(例如，αβTCR、CD3⁺、CD8⁺、CD45RO⁺)；CD4⁺效应T细胞(例如，αβTCR、CD3⁺、CD4⁺、CCR7⁺、CD62L高、IL^-7R/CD127⁺)；CD8⁺效应T细胞(例如，αβTCR、CD3⁺、CD8⁺、CCR7⁺、CD62L高、IL^-7R/CD127⁺)；效应记忆T细胞(例如，CD62L低、CD44⁺、TCR、CD3⁺、IL^-7R/CD127⁺、IL-15R⁺、CCR7低)；中枢记忆T细胞(例如，CCR7⁺、CD62L⁺、CD27⁺；或CCR7高、CD44⁺、CD62L高、TCR、CD3⁺、IL-7R/CD127⁺、IL-15R⁺)；CD62L⁺效应T细胞；CD8⁺效应记忆T细胞(TEM)，包括早期效应记忆T细胞(CD27⁺CD62L^-)和晚期效应记忆T细胞(CD27^-CD62L^-)(分别为TemE和TemL)；CD127(⁺)CD25(低/-)效应T细胞；CD127(^-)CD25(^-)效应T细胞；CD8⁺干细胞记忆效应细胞(TSCM)(例如，CD44(低)CD62L(高)CD122(高)sca(⁺))；TH1效应T细胞(例如，CXCR3⁺、CXCR6⁺和CCR5⁺；或αβTCR、CD3⁺、CD4⁺、IL-12R⁺、IFNγR⁺、CXCR3⁺)、TH2效应T细胞(例如，CCR3⁺、CCR4⁺和CCR8⁺；或αβTCR、CD3⁺、CD4⁺、IL-4R⁺、IL-33R⁺、CCR4⁺、IL-17RB⁺、CRTH2⁺)；TH9效应T细胞(例如，αβTCR、CD3⁺、CD4⁺)；TH17效应T细胞(例如，αβTCR、CD3⁺、CD4⁺、IL-23R⁺、CCR6⁺、IL-1R⁺)；CD4⁺CD45RO⁺CCR7⁺效应T细胞、ICOS⁺效应T细胞；CD4⁺CD45RO⁺CCR7(^-)效应T细胞；以及分泌IL-2、IL-4和/或IFN-γ的效应T细胞。

示例性目标T细胞抗原包括例如(并且包括细胞外结构域，适用时)：CD8、CD3、SLAMF4、IL-2Rα、4-1BB/TNFRSF9、IL-2Rβ、ALCAM、B7-1、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMFS、CEACAM1、IL-6R、CCR3、IL-7Rα、CCR4、CXCRl/IL-S RA、CCR5、CCR6、IL-10Rα、CCR 7、IL-l 0Rβ、CCRS、IL-12Rβ1、CCR9、IL-12Rβ2、CD2、IL-13Rα1、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CDS5j、ILT3/CDS5k、ILT4/CDS5d、ILT5/CDS5a、lutegrinα4/CD49d、CDS、整联蛋白αE/CD103、CD6,整联蛋白αM/CD 11b、CDS、整联蛋白αX/CD11c、整联蛋白β2/CDlS、KIR/CD15S、CD27/TNFRSF7、KIR2DL1、CD2S、KIR2DL3、CD30/TNFRSFS、KIR2DL4/CD15Sd、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、CD40配体/TNFSF5、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CDS3、白三烯B4-R1、CDS4/SLAMF5、NCAM-L1、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SLAMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、共同γ链/IL-2Rγ、骨桥蛋白、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRTAM、PSGL-1、CTLA-4、RANK/TNFRSF11A、CX3CR1、CX3CL1、L-选择蛋白、CXCR3、SIRPβ1、CXCR4、SLAM、CXCR6、TCCR/WSX-1、DNAM-1、胸腺生成素、EMMPRIN/CD147、TIM-1、EphB6、TIM-2、Fas/TNFRSF6、TIM-3、Fas配体/TNFSF6、TIM-4、FcγRIII/CD16、TIM-6、TNFR1/TNFRSF1A、颗粒溶素、TNF RIII/TNFRSF1B、TRAIL Rl/TNFRSFlOA、ICAM-1/CD54、TRAIL R2/TNFRSF10B、ICAM-2/CD102、TRAILR3/TNFRSF10C、IFN-γR1、TRAILR4/TNFRSF10D、IFN-γR2、TSLP、IL-1R1和TSLP R。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些示例性T细胞抗原中的一种或多种。

作为非限制性实例，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对在T细胞上表达的检查点标记物的靶向部分，例如PD-1、CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、CD27、CD40L、TIM3和A2aR中的一种或多种。

例如，在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与B细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接地将B细胞(例如，在一些实施方案中)募集到治疗位点(例如，具有一种或多种疾病细胞或为了治疗效果而有待调控的细胞的基因座)。示例性目标B细胞抗原包括，例如，CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD70、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDw130、CD138、CDw150和B细胞成熟抗原(BCMA)。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些示例性B细胞抗原中的一种或多种。

作为另一实例，在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与自然杀伤细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接地将自然杀伤细胞(例如，在一些实施方案中)募集到治疗位点(例如，具有一种或多种疾病细胞或为了治疗效果而有待调控的细胞的基因座)。示例性目标自然杀伤细胞抗原包括例如TIGIT、2B4/SLAMF4、KIR2DS4、CD155/PVR、KIR3DL1、CD94、LMIR1/CD300A、CD69、LMIR2/CD300c、CRACC/SLAMF7、LMIR3/CD300LF、DNAM-1、LMIR5/CD300LB、Fc-εRII、LMIR6/CD300LE、Fc-γRl/CD64、MICA、Fc-γRIIB/CD32b、MICB、Fc-γRIIC/CD32c、MULT-1、Fc-γRIIA/CD32a、结合素-2/CD112、Fc-γRIII/CD16、NKG2A、FcRH1/IRTA5、NKG2C、FcRH2/IRTA4、NKG2D、FcRH4/IRTA1、NKp30、FcRH5/IRTA2、NKp44、Fc-受体样3/CD16-2、NKp46/NCR1、NKp80/KLRF1、NTB-A/SLAMF6、Rae-1、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1δ、H60、Rae-1ε、ILT2/CD85j、Rae-1γ、ILT3/CD85k、TREM-1、ILT4/CD85d、TREM-2、ILT5/CD85a、TREM-3、KIR/CD158、TREML1/TLT-1、KIR2DL1、ULBP-1、KIR2DL3、ULBP-2、KIR2DL4/CD158d和ULBP-3。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些示例性NK细胞抗原中的一种或多种。

而且，在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与巨噬细胞/单核细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接地将巨噬细胞/单核细胞(例如，在一些实施方案中)募集到治疗位点(例如，具有一种或多种疾病细胞或为了治疗效果而有待调控的细胞的基因座)。示例性目标巨噬细胞/单核细胞抗原包括例如SIRP1a、B7-1/CD80、ILT4/CD85d、B7-H1、ILT5/CD85a、共同的β链、整联蛋白α4/CD49d、BLAME/SLAMF8、整联蛋白αX/CDllc、CCL6/C10、整联蛋白β2/CD18、CD155/PVR、整联蛋白β3/CD61、CD31/PECAM-1、Latexin、CD36/SR-B3、白三烯B4R1、CD40/TNFRSF5、LIMPIIISR-B2、CD43、LMIR1/CD300A、CD45、LMIR2/CD300c、CD68、LMIR3/CD300LF、CD84/SLAMF5、LMIR5/CD300LB、CD97、LMIR6/CD300LE、CD163、LRP-1、CD2F-10/SLAMF9、MARCO、CRACC/SLAMF7、MD-1、ECF-L、MD-2、EMMPRIN/CD147、MGL2、内皮糖蛋白/CD105、骨激活素/GPNMB、Fc-γRI/CD64、骨桥蛋白、Fc-γRIIB/CD32b、PD-L2、Fc-γRIIC/CD32c、Siglec-3/CD33、Fc-γRIIA/CD32a、SIGNR1/CD209、Fc-γRIII/CD16、SLAM、GM-CSF Rα、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TLR3、IFN-γRl、TLR4、IFN-gannna R2、TREM-l、IL-l RII、TREM-2、ILT2/CD85j、TREM-3、ILT3/CD85k、TREML1/TLT-1、2B4/SLAMF4、IL-10Rα、ALCAM、IL-10Rβ、氨肽酶N/ANPEP、ILT2/CD85j、共同的β链、ILT3/CD85k、Clq R1/CD93、ILT4/CD85d、CCR1、ILT5/CD85a、CCR2、整联蛋白α4/CD49d、CCR5、整联蛋白αM/CDll b、CCR8、整联蛋白αX/CDllc、CD155/PVR、整联蛋白β2/CD18、CD14、整联蛋白β3/CD61、CD36/SR-B3、LAIR1、CD43、LAIR2、CD45、白三烯B4-R1、CD68、LIMPIIISR-B2、CD84/SLAMF5、LMIR1/CD300A、CD97、LMIR2/CD300c、LMIR3/CD300LF、凝血因子III/组织因子、LMIR5/CD300LB、CX3CR1、CX3CL1、LMIR6/CD300LE、CXCR4、LRP-1、CXCR6、M-CSF R、DEP-1/CD148、MD-1、DNAM-1、MD-2、EMMPRIN/CD147、MMR、内皮糖蛋白/CD105、NCAM-L1、Fc-γRI/CD64、PSGL-1、Fc-γRIIIICD16、RP105、G-CSF R、L-选择蛋白、GM-CSF Rα、Siglec-3/CD33、HVEM/TNFRSF14、SLAM、ICAM-1/CD54、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TREM-l、IL-6R、TREM-2、CXCRl/IL-8RA、TREM-3和TREMLl/TLT-1。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些示例性巨噬细胞/单核细胞抗原中的一种或多种。

而且，在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与树突细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接地将树突细胞(例如，在一些实施方案中)募集到治疗位点(例如，具有一种或多种疾病细胞或为了治疗效果而有待调控的细胞的基因座)。示例性目标树突细胞抗原包括例如CLEC9A、XCR1、RANK、CD36/SRB3、LOX-1/SR-E1、CD68、MARCO、CD163、SR-A1/MSR、CD5L、SREC-1、CL-Pl/COLEC12、SREC-II、LIMPIIISRB2、RP105、TLR4、TLR1、TLR5、TLR2、TLR6、TLR3、TLR9、4-IBB配体/TNFSF9、IL-12/IL-23p40、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、ILT2/CD85j、CCL21/6Ckine、ILT3/CD85k、8-氧代-dG、ILT4/CD85d、8D6A、ILT5/CD85a、A2B5、lutegrinα4/CD49d、Aag、整联蛋白β2/CD18、AMICA、Langerin、B7-2/CD86、白三烯B4Rl、B7-H3、LMIR1/CD300A、BLAME/SLAMF8,LMIR2/CD300c、Clq R1/CD93、LMIR3/CD300LF、CCR6、LMIR5/CD300LB CCR7、LMIR6/CD300LE、CD40/TNFRSF5、MAG/Siglec-4-a、CD43、MCAM、CD45、MD-1、CD68、MD-2、CD83、MDL-1/CLEC5A、CD84/SLAMF5、MMR、CD97、NCAMLl、CD2F-10/SLAMF9、骨激活素GPNMB、Chern 23、PD-L2、CLEC-1、RP105、CLEC-2、CLEC-8、Siglec-2/CD22、CRACC/SLAMF7、Siglec-3/CD33、DC-SIGN、Siglec-5、DC-SIGNR/CD299、Siglec-6、DCAR、Siglec-7、DCIR/CLEC4A、Siglec-9、DEC-205、Siglec-10、Dectin-1/CLEC7A、Siglec-F、Dectin-2/CLEC6A、SIGNR1/CD209、DEP-1/CD148、SIGNR4、DLEC、SLAM、EMMPRIN/CD147、TCCR/WSX-1、Fc-γR1/CD64、TLR3、Fc-γRIIB/CD32b、TREM-1、Fc-γRIIC/CD32c、TREM-2、Fc-γRIIA/CD32a、TREM-3、Fc-γRIII/CD16、TREML1/TLT-1、ICAM-2/CD102和香草素R1。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些示例性DC抗原中的一种或多种。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至免疫细胞上的靶标(例如抗原、受体)，所述免疫细胞选自但不限于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其子集。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接地将巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其子集(例如，在一些实施方案中)募集到治疗位点(例如，具有一种或多种疾病细胞或为了治疗效果而有待调控的细胞的基因座)。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与巨核细胞和/或血小板相关的靶标(例如，抗原、受体)。示例性目标巨核细胞和/或血小板抗原包括例如GP IIb/IIIa、GPIb、vWF、PF4和TSP。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些示例性巨核细胞和/或血小板抗原中的一种或多种。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与红细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。示例性目标红细胞抗原包括例如CD34、CD36、CD38、CD41a(血小板糖蛋白IIb/IIIa)、CD41b(GPIIb)、CD71(转铁蛋白受体)、CD105、血型糖蛋白A、血型糖蛋白C、c-kit、HLA-DR、H2(MHC-II)和恒河猴抗原。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些示例性红细胞抗原中的一种或多种。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与肥大细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。示例性目标肥大细胞抗原包括例如SCFR/CD117、Fc_εRI、CD2、CD25、CD35、CD88、CD203c、C5R1、CMAl、FCERlA、FCER2、TPSABl。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些肥大细胞抗原中的一种或多种。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与嗜碱性粒细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。示例性目标嗜碱性粒细胞抗原包括例如Fc_εRI、CD203c、CD123、CD13、CD107a、CD107b和CD164。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些嗜碱性粒细胞抗原中的一种或多种。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与嗜中性粒细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。示例性目标嗜中性粒细胞抗原包括例如7D5、CD10/CALLA、CD13、CD16(FcRIII)、CD18蛋白(LFA-1、CR3和p150、95)、CD45、CD67和CD177。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些嗜中性粒细胞抗原中的一种或多种。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与嗜酸性粒细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。示例性目标嗜酸性粒细胞抗原包括例如CD35、CD44和CD69。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些嗜酸性粒细胞抗原中的一种或多种。

在各种实施方案中，识别结构域可结合至熟练技术人员已知的任何合适的靶标、抗原、受体或细胞表面标记物。在一些实施方案中，抗原或细胞表面标记物是组织特异性标记物。示例性组织特异性标记物包括但不限于内皮细胞表面标记物，如ACE、CD14、CD34、CDH5、ENG、ICAM2、MCAM、NOS3、PECAMl、PROCR、SELE、SELP、TEK、THBD、VCAMl、VWF；平滑肌细胞表面标记物，如ACTA2、MYHlO、MYHl 1、MYH9、MYOCD；成纤维细胞(基质)细胞表面标记物，如ALCAM、CD34、COLlAl、COL1A2、COL3A1、FAP、PH-4；上皮细胞表面标记物，如CDlD、K6IRS2、KRTlO、KRT13、KRT17、KRT18、KRT19、KRT4、KRT5、KRT8、MUCl、TACSTDl；新生血管标记物，如CD13、TFNA、α-vβ-3(α_Vβ₃))、E-选择蛋白；以及脂肪细胞表面标记物，如ADIPOQ、FABP4和RETN。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些抗原中的一种或多种。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合一种或多种具有这些抗原的细胞。

在一些实施方案中，识别结构域特异性结合至与肿瘤细胞相关的靶标(例如，抗原、受体)。在一些实施方案中，识别结构域直接或间接募集肿瘤细胞。例如，在一些实施方案中，将肿瘤细胞直接或间接募集到可以杀死和/或抑制肿瘤细胞的一种或多种效应细胞(例如，如本文所述的免疫细胞)。

肿瘤细胞或癌细胞是指细胞或组织的不受控生长和/或细胞存活的异常增加和/或细胞凋亡的抑制，其干扰身体器官和***的正常功能。例如，肿瘤细胞包括良性和恶性癌症、息肉、增生、以及休眠肿瘤或微转移。示例性肿瘤细胞包括但不限于以下各病的细胞：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经***癌症；乳腺癌；腹膜癌；***；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；***癌；消化***癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内瘤变、肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；***癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸***癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿***癌；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏和非何杰金氏淋巴瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小型非***细胞NHL；大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌和肉瘤；及移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)、以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征。

肿瘤细胞或癌细胞还包括但不限于癌，例如各种亚型，包括例如腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、肉瘤(包括例如骨和软组织)、白血病(包括例如急性髓细胞性、急性淋巴细胞性、慢性髓细胞性、慢性淋巴细胞性和毛细胞)、淋巴瘤和骨髓瘤(包括例如何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、轻链、非分泌型、MGUS和浆细胞瘤)及中枢神经***癌(包括例如脑(例如，神经胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和室管膜瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经瘤、以及脊髓肿瘤(例如脑膜瘤和神经纤维瘤)。

示例性肿瘤抗原包括但不限于MART-1/Melan-A、gp100、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-0017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、***特异性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、***特异性膜抗原(PSMA)、T细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原的MAGE家族(例如，MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、肿瘤抗原的GAGE家族(例如，GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、酪氨酸酶、p53、MUC家族、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α-甲胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉蛋白(APC)、胞影蛋白、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人***瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的Smad家族、lmp-1、NA、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1CT-7、c-erbB-2、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD56、CD70、CD74、CD138、AGS16、MUC1、GPNMB、Ep-CAM、PD-L1、PD-L2和PMSA。在各种实施方案中，嵌合蛋白的靶向部分结合这些肿瘤抗原中的一种或多种。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有靶向部分，所述靶向部分具有特异性结合至靶标(例如抗原、受体)的识别结构域，所述靶标是非细胞结构的一部分。在一些实施方案中，抗原或受体不是完整细胞或细胞结构的组成部分。在一些实施方案中，抗原或受体是细胞外抗原或受体。在一些实施方案中，靶标是非蛋白质的非细胞标记物，包括但不限于核酸，包括DNA或RNA，例如，从坏死的肿瘤细胞释放的DNA或细胞外沉积物如胆固醇。

在一些实施方案中，目标靶标(例如，抗原、受体)是基质的非细胞组分的一部分或细胞外基质(ECM)或与其相关的标记物。如本文所用，基质是指组织或器官的结缔和支撑框架。基质可包括细胞的编译，如成纤维细胞/肌成纤维细胞、神经胶质、上皮细胞、脂肪、免疫、血管、平滑肌和免疫细胞以及细胞外基质(ECM)和细胞外分子。在各种实施方案中，目标靶标(例如，抗原、受体)是基质的非细胞组分的一部分，如细胞外基质和细胞外分子。如本文所用，ECM是指存在于所有组织和器官内的非细胞组分。ECM是由大量生物化学上不同的组分构成，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、蛋白多糖和多糖。ECM的这些组分通常是由相邻细胞产生并通过胞吐作用分泌到ECM中。一旦分泌，ECM组分通常聚集形成复杂的大分子网络。在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含靶向部分，其识别位于ECM的任何组分上的靶标(例如，抗原或受体或非蛋白质分子)。ECM的示例性组分包括但不限于蛋白多糖、非蛋白多糖、纤维及其他ECM蛋白或ECM非蛋白，例如多糖和/或脂质、或ECM相关分子(例如，蛋白质或非蛋白质，例如多糖、核酸和/或脂质)。

在一些实施方案中，靶向部分识别ECM蛋白多糖上的靶标(例如，抗原、受体)。蛋白多糖是糖基化蛋白。基本蛋白多糖单元包括具有一个或多个共价连接的糖胺聚糖(GAG)链的核心蛋白。蛋白多糖具有吸引带正电的钠离子(Na+)的净负电荷，其经由渗透吸引水分子，保持ECM和驻留细胞水合。蛋白多糖还可以帮助捕获并储存ECM内的生长因子。可被本发明的嵌合蛋白靶向的示例性蛋白多糖包括但不限于硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素。在一个实施方案中，靶向部分识别非蛋白多糖如透明质酸上的靶标(例如抗原、受体)。

在一些实施方案中，靶向部分识别ECM纤维上的靶标(例如，抗原、受体)。ECM纤维包括胶原纤维和弹性蛋白纤维。在一些实施方案中，靶向部分识别胶原蛋白或胶原纤维上的一个或多个表位。胶原蛋白是ECM中最丰富的蛋白质。胶原蛋白作为纤维状蛋白存在于ECM中，并为驻留细胞提供结构支撑。在一个或多个实施方案中，靶向部分识别并结合至ECM内存在的各种类型的胶原蛋白，包括但不限于纤维状胶原蛋白(I、II、III、V、XI型)、facit胶原蛋白(IX、XII、XIV型)、短链胶原蛋白(VIII、X型)、基底膜胶原蛋白(IV型)和/或VI、VII或XIII型胶原蛋白。弹性蛋白纤维为组织提供弹性，允许它们在需要时拉伸，然后恢复到其原始状态。在一些实施方案中，靶向部分识别弹性蛋白或弹性蛋白纤维上的一个或多个表位。

在一些实施方案中，靶向部分识别一种或多种ECM蛋白，包括但不限于腱生蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白、层粘连蛋白或触觉蛋白/巢蛋白。

在一个实施方案中，靶向部分识别并结合至腱生蛋白。糖蛋白的腱生蛋白(TN)家族包括至少四个成员，即腱生蛋白-C、腱生蛋白-R、腱生蛋白-X和腱生蛋白W。腱生蛋白的一级结构包括以相同的连续序列排序的几个常见基序：氨基末端七肽重复、表皮生长因子(EGF)样重复、纤连蛋白III型结构域重复、和羧基末端纤维蛋白原样球状结构域。每个蛋白质成员与EGF样和纤连蛋白III型重复的数量和性质的典型变化相关。特别是对于腱生蛋白-C，还存在同种型变体。腱生蛋白-C的超过27种剪接变体和/或同种型是已知的。在一个具体实施方案中，靶向部分识别并结合至腱生蛋白-CA1。类似地，腱生蛋白-R也具有各种剪接变体和同种型。腱生蛋白-R通常以二聚体或三聚体存在。腱生蛋白-X是腱生蛋白家族中最大的成员，并且已知以三聚体存在。腱生蛋白-W以三聚体存在。在一些实施方案中，靶向部分识别腱生蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，靶向部分识别腱生蛋白的单体和/或二聚体和/或三聚体和/或六聚体形式。

在一个实施方案中，靶向部分识别并结合至纤连蛋白。纤连蛋白是糖蛋白，其将细胞与ECM中的胶原纤维相连，允许细胞移动穿过ECM。在与整联蛋白结合后，纤连蛋白展开形成功能性二聚体。在一些实施方案中，靶向部分识别纤连蛋白的单体和/或二聚体形式。在一些实施方案中，靶向部分识别纤连蛋白上的一个或多个表位。在说明性实施方案中，靶向部分识别纤连蛋白细胞外结构域A(EDA)或纤连蛋白细胞外结构域B(EDB)。EDA的水平升高与各种疾病和病症有关，包括牛皮癣、类风湿性关节炎、糖尿病和癌症。在一些实施方案中，靶向部分识别含有EDA同种型的纤连蛋白，并且可用于将嵌合蛋白靶向包括癌细胞的患病细胞。在一些实施方案中，靶向部分识别含有EDB同种型的纤连蛋白。在各种实施方案中，此类靶向部分可用于将嵌合蛋白靶向包括肿瘤新血管***的肿瘤细胞。

在一个实施方案中，靶向部分识别并结合至纤维蛋白。纤维蛋白是常见于ECM的基质网络中的另一种蛋白质物质。纤维蛋白通过蛋白酶凝血酶对纤维蛋白原的作用，导致纤维蛋白聚合而形成。在一些实施方案中，靶向部分识别纤维蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，靶向部分识别纤维蛋白的单体形式和聚合形式。

在一个实施方案中，靶向部分识别并结合至层粘连蛋白。层粘连蛋白是基底层的主要组分，所述基底层是细胞和器官的蛋白质网络基础。层粘连蛋白是含有α-链、β-链和γ-链的异三聚体蛋白。在一些实施方案中，靶向部分识别层粘连蛋白上的一个或多个表位。在一些实施方案中，靶向部分识别层粘连蛋白的单体形式、二聚体形式和三聚体形式。

在一个实施方案中，靶向部分识别并结合至触觉蛋白或巢蛋白。触觉蛋白/巢蛋白是高度保守的硫酸化糖蛋白家族。其构成基底膜的主要结构组分，并起到将基底膜中的层粘连蛋白和胶原蛋白IV网络连接起来的作用。此家族的成员包括触觉蛋白-1和触觉蛋白-2。在各种实施方案中，靶向部分识别触觉蛋白-1和/或触觉蛋白-2上的表位。

在各种实施方案中，靶向部分包含抗原识别结构域，其识别本文所述的任何靶标(例如，ECM蛋白)上存在的表位。在一个实施方案中，抗原识别结构域识别蛋白质上存在的一个或多个线性表位。如本文所用，线性表位是指蛋白质上存在的氨基酸的任何连续序列。在另一实施方案中，抗原识别结构域识别蛋白质上存在的一个或多个构象表位。如本文所用，构象表位是指氨基酸的一个或多个部分(其可以是不连续的)，其形成具有能够被抗原识别结构域所识别的特征和/或形状和/或三级结构的三维表面。

在各种实施方案中，靶向部分可结合至本文描述的任何靶标(例如，ECM蛋白)的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其他天然存在的或合成的类似物、变体或突变体。在各种实施方案中，靶向部分可结合至本文所述蛋白质的任何形式，包括单体、二聚体、三聚体、四聚体、异二聚体、多聚体及相关形式。在各种实施方案中，靶向部分可结合至本文所述蛋白质的任何翻译后修饰形式，如糖基化和/或磷酸化形式。

在各种实施方案中，靶向部分包含识别细胞外分子如DNA的抗原识别结构域。在一些实施方案中，靶向部分包含识别DNA的抗原识别结构域。在一个实施方案中，DNA从坏死或凋亡的肿瘤细胞或其他患病细胞上脱落到细胞外空间中。

在各种实施方案中，靶向部分包含识别与动脉粥样硬化斑块相关的一种或多种非细胞结构的抗原识别结构域。两种类型的动脉粥样硬化斑块是已知的。纤维脂质(纤维-脂肪)斑块的特征是负载脂质的细胞积聚在动脉内膜下面。在内皮下面有覆盖斑块粥样核心的纤维帽。核心包括负载脂质的细胞(巨噬细胞和平滑肌细胞)，其具有升高的组织胆固醇和胆固醇酯含量、纤维蛋白、蛋白多糖、胶原蛋白、弹性蛋白和细胞碎片。在晚期斑块中，斑块的中部核心通常含有细胞外胆固醇沉积物(从死细胞中释放)，其形成具有空的针状裂缝的胆固醇晶体区域。在斑块的周边是较年轻的泡沫细胞和毛细血管。纤维斑块也位于内膜下，在动脉壁内，导致壁的增厚和扩张，并且有时导致内腔的点状局部变窄，其中肌层有一些萎缩。纤维斑块含有胶原纤维(嗜酸性)、钙沉淀物(亲苏木精性)和负载脂质的细胞。在一些实施方案中，靶向部分识别并结合至这些斑块的一种或多种非细胞组分，如纤维蛋白、蛋白多糖、胶原、弹性蛋白、细胞碎片和钙或其他矿物质沉积物或沉淀物。在一些实施方案中，细胞碎片是从死细胞中释放的核酸，例如DNA或RNA。

在各种实施方案中，靶向部分包含抗原识别结构域，其识别见于与神经变性疾病相关的脑部斑块中的一个或多个非细胞结构。在一些实施方案中，靶向部分识别并结合至位于见于阿尔茨海默氏病患者脑中的淀粉样蛋白斑块中的一个或多个非细胞结构。例如，靶向部分可以识别并结合至肽淀粉样蛋白β，其是淀粉样蛋白斑块的主要组分。在一些实施方案中，靶向部分识别并结合至位于见于亨廷顿氏病患者中的脑部斑块中的一个或多个非细胞结构。在各种实施方案中，靶向部分识别并结合至见于与其他神经变性或肌肉骨骼疾病(如路易体痴呆和包涵体肌炎)相关的斑块中的一个或多个非细胞结构。

在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含两个或更多个靶向部分。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对选自T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、NK细胞或其子集的免疫细胞的一个或多个靶向部分，和(ii)针对肿瘤细胞的一个或多个靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对T细胞的靶向部分(包括但不限于效应T细胞)和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对B细胞的靶向部分和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对树突细胞的靶向部分和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对巨噬细胞的靶向部分和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对NK细胞的靶向部分和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

作为非限制性实例，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对T细胞的靶向部分，例如，通过靶向以下各物所介导：CD8、SLAMF4、IL-2Rα、4-1BB/TNFRSF9、IL-2Rβ、ALCAM、B7-1、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMFS、CEACAM1、IL-6R、CCR3、IL-7Rα、CCR4、CXCRl/IL-SRA、CCR5、CCR6、IL-10Rα、CCR 7、IL-l0Rβ、CCRS、IL-12Rβ1、CCR9、IL-12Rβ2、CD2、IL-13Rα1、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CDS5j、ILT3/CDS5k、ILT4/CDS5d、ILT5/CDS5a、lutegrinα4/CD49d、CDS、整联蛋白αE/CD103、CD6、整联蛋白αM/CD 11b、CDS、整联蛋白αX/CD11c、整联蛋白β2/CDlS、KIR/CD15S、CD27/TNFRSF7、KIR2DL1、CD2S、KIR2DL3、CD30/TNFRSFS、KIR2DL4/CD15Sd、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、CD40配体/TNFSF5、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CDS3、白三烯B4-R1、CDS4/SLAMF5、NCAM-L1、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SLAMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、共同的γ链/IL-2Rγ、骨桥蛋白、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRTAM、PSGL-1、CTLA-4、RANK/TNFRSF11A、CX3CR1、CX3CL1、L-选择蛋白、CXCR3、SIRPβ1、CXCR4、SLAM、CXCR6、TCCR/WSX-1、DNAM-1、胸腺生成素、EMMPRIN/CD147、TIM-1、EphB6、TIM-2、Fas/TNFRSF6、TIM-3、Fas配体/TNFSF6、TIM-4、FcγRIII/CD16、TIM-6、TNFR1/TNFRSF1A、颗粒溶素、TNF RIII/TNFRSF1B、TRAIL Rl/TNFRSFlOA、ICAM-1/CD54、TRAIL R2/TNFRSF10B、ICAM-2/CD102、TRAILR3/TNFRSF10C、IFN-γR1、TRAILR4/TNFRSF10D、IFN-γR2、TSLP、IL-1R1或TSLP R；和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

作为非限制性实例，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对(i)在T细胞上表达的检查点标记物的靶向部分，例如PD-1、CD28、CTLA4、ICOS、BTLA、KIR、LAG3、CD137、OX40、Cd27、CD40L、TIM3和A2aR中的一种或多种和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对PD-1的一个或多个靶向部分。在一些实施方案中，嵌合蛋白具有选择性结合PD-1多肽的一个或多个靶向部分。在一些实施方案中，嵌合蛋白包含一种或多种抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽、或选择性结合PD-1多肽的融合蛋白。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-1抗体的衍生物派姆单抗(又称为MK-3475、KEYTRUDA)或其片段。派姆单抗及其他人源化抗PD-1抗体公开于Hamid等人(2013)NewEngland Journal of Medicine 369(2):134-44、US 8,354,509和WO 2009/114335中，其全部公开内容通过引用并入文中。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的派姆单抗或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链；和/或含有SEQ ID NO：64的氨基酸序列的轻链。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-1抗体的衍生物纳武单抗(又称为BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、OPDIVO)或其片段。纳武单抗(克隆5C4)及特异性结合至PD-1的其他人单克隆抗体公开于US 8,008,449和WO 2006/121168中，其全部公开内容通过引用并入文中。在说明性实施方案中，纳武单抗或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链；和/或含有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-1抗体的衍生物pidilizumab(又称为CT-011、hBAT或hBAT-1)或其片段。Pidilizumab及其他人源化抗PD-l单克隆抗体公开于US2008/0025980和WO 2009/101611中，其全部公开内容通过引用并入文中。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其含有选自US 2008/0025980的SEQ ID NO：15-18的氨基酸序列：US 2008/0025980的SEQ ID NO：15(SEQ ID NO：67)；US 2008/0025980的SEQ ID NO：16(SEQ ID NO：68)；US 2008/0025980的SEQ ID NO：17(SEQ ID NO：69)；US 2008/0025980的SEQ ID NO：18(SEQ ID NO：70)；和/或重链，其含有选自US 2008/0025980的SEQ ID NO：20-24的氨基酸序列：US 2008/0025980的SEQ ID NO：20(SEQ ID NO：71)；US 2008/0025980的SEQ ID NO：21(SEQ ID NO：72)；US2008/0025980的SEQ ID NO：22(SEQ ID NO：73)；US 2008/0025980的SEQ ID NO：23(SEQ IDNO：74)；US 2008/0025980的SEQ ID NO：24(SEQ ID NO：75)。

在一个实施方案中，靶向部分包含轻链的衍生物，其包含US 2008/0025980的SEQID NO：18；和重链的衍生物，其包含US 2008/0025980的SEQ ID NO：22。

在一个实施方案中，靶向部分包含AMP-514的衍生物(又称为MEDI-0680)。

在一个实施方案中，靶向部分包含PD-L2-Fc融合蛋白AMP-224的衍生物，其公开于WO2010/027827和WO 2011/066342中，其全部公开内容通过引用并入本文。在此类实施方案中，靶向部分可包括靶向结构域，其包含WO2010/027827的SEQ ID NO：4(SEQ ID NO：76)和/或包含WO2010/027827的SEQ ID NO：83的B7-DC融合蛋白的衍生物(SEQ ID NO：77)。

在一个实施方案中，靶向部分包含肽AUNP 12的衍生物或US2011/0318373或8,907,053中公开的任何其他肽。例如，靶向部分可包含AUNP12的衍生物(即化合物8或US2011/0318373的SEQ ID NO：49)，其具有SEQ ID NO：78的序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗-PD-1抗体1E3的衍生物或其片段，如US2014/0044738中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1E3或其抗原结合片段包含重链可变区，其含有SEQ ID NO：79的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：80的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗-PD-1抗体1E8的衍生物或其片段，如US2014/0044738中所公开，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1E8或其抗原结合片段包含重链可变区，其含有SEQ ID NO：81的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：82的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗-PD-1抗体1H3的衍生物或其片段，如US2014/0044738中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1H3或其抗原结合片段包含重链可变区，其含有SEQ ID NO：83的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含针对PD-1的VHH衍生物，例如，如US 8,907,065和WO 2008/071447中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，针对PD-1的VHH包含US 8,907,065的SEQ ID NO：347-351：US 8,907,065的SEQ ID NO：347(SEQ ID NO：85)；US 8,907,065的SEQ ID NO：348(SEQ ID NO：86)；US 8,907,065的SEQ IDNO：349(SEQ ID NO：87)；US8,907,065的SEQ ID NO：350(SEQ ID NO：88)；US 8,907,065的SEQ ID NO：351(SEQ ID NO：89)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-1抗体中任一种的衍生物或其片段，如US2011/0271358和WO2010/036959中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含：重链衍生物，其含有选自US2011/0271358的SEQ ID NO：25-29的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID NO：25(SEQID NO：90)；US2011/0271358的SEQ ID NO：26(SEQ ID NO：91)；US2011/0271358的SEQ IDNO：27(SEQ ID NO：92)；US2011/0271358的SEQ ID NO：28(SEQ ID NO：93)；US2011/0271358的SEQ ID NO：29(SEQ ID NO：94)；和/或轻链衍生物，其含有选自US2011/0271358的SEQ IDNO：30-33的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID NO：30(SEQ ID NO：95)；US2011/0271358的SEQ ID NO：31(SEQ ID NO：96)；US2011/0271358的SEQ ID NO：32(SEQ ID NO：97)；US2011/0271358的SEQ ID NO：33(SEQ ID NO：98)。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一种或多种针对PD-1的抗体的衍生物或其抗体片段，选自TSR-042(Tesaro,Inc.)、REGN2810(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和BGB-A317(BeiGene Ltd.)。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有一个或多个针对PD-L1的靶向部分。在一些实施方案中，嵌合蛋白具有一个或多个选择性结合PD-L1多肽的靶向部分。在一些实施方案中，嵌合蛋白包含一种或多种选择性结合PD-L1多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽、或融合蛋白。在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含以低亲和力结合至PD-L1的第一靶向部分。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物MEDI4736(又称为durvalumab)或其片段。MEDI4736对PD-L1有选择性并阻断PD-L1与PD-1和CD80受体的结合。用于本文提供的方法中的MEDI4736及其抗原结合片段包含重链和轻链或重链可变区和轻链可变区。MEDI4736的序列公开于WO/2016/06272中，其全部内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的MEDI4736或其抗原结合片段包含：含有SEQ IDNO：99的氨基酸序列的重链；和/或含有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链。

在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的MEDI4736或其抗原结合片段包含重链可变区，其包含WO/2016/06272的SEQ ID NO：4的氨基酸序列(SEQ ID NO：101)和/或轻链可变区，其包含WO/2016/06272的SEQ ID NO：3的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物阿特珠单抗(又称为MPDL3280A、RG7446)或其片段。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的阿特珠单抗或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO：103的氨基酸序列的重链；和/或含有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的轻链。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物阿利库单抗(又称为MSB0010718C)或其片段。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的阿利库单抗或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链；和/或含有SEQ ID NO：106的氨基酸序列的轻链。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物BMS-936559(又称为12A4、MDX-1105)或其片段，如US 2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的BMS-936559或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：107的氨基酸序列；；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：108的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物3G10或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3G10或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：109的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：110的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物10A5或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法的10A5或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQID NO：111的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：112的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物5F8或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的5F8或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQID NO：113的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：114的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物10H10或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的10H10或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：115的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：112的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物1B12或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1B12或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：116的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：108的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物7H1或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的7H1或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQID NO：117的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：108的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物11E6或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的11E6或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：118的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：119的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物12B7或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的12B7或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：120的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：121的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物13G4或其片段，如US2013/0309250和WO2007/005874中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的13G4或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：122的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：123的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物1E12或其片段，如US2014/0044738中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1E12或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：124的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：125的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物1F4或其片段，如US2014/0044738中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的1F4或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：126的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：127的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物2G11或其片段，如US2014/0044738中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2G11或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：128的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：129的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物3B6或其片段，如US2014/0044738中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3B6或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：130的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：131的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物3D10或其片段，如US2014/0044738和WO2012/145493中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3D10或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有SEQ ID NO：132的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其含有SEQ ID NO：133的氨基酸序列。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体中任一种的衍生物，如US2011/0271358和WO2010/036959中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含：重链，所述重链含有选自US2011/0271358的SEQ ID NO：34-38的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID NO：34(SEQID NO：134)；US2011/0271358的SEQ ID NO：35(SEQ ID NO：135)；US2011/0271358的SEQ IDNO：36(SEQ ID NO：136)；US2011/0271358的SEQ ID NO：37(SEQ ID NO：137)；US2011/0271358的SEQ ID NO：38(SEQ ID NO：138)；和/或轻链，所述轻链含有选自US2011/0271358的SEQ ID NO：39-42的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID NO：39(SEQ ID NO：139)；US2011/0271358的SEQ ID NO：40(SEQ ID NO：140)；US2011/0271358的SEQ ID NO：41(SEQID NO：141)；US2011/0271358的SEQ ID NO：42(SEQ ID NO：142)：。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物2.7A4或其片段，如WO2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.7A4或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：2的氨基酸序列(SEQ ID NO：143)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：7的氨基酸序列(SEQ ID NO：144)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物2.9D10或其片段，如WO2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.9D10或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：12的氨基酸序列(SEQ ID NO：145)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：17的氨基酸序列(SEQ ID NO：146)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物2.14H9或其片段，如WO2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.14H9或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：22的氨基酸序列(SEQ ID NO：101)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：27的氨基酸序列(SEQ ID NO：147)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物2.20A8或其片段，如WO2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.20A8或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：32的氨基酸序列(SEQ ID NO：148)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：37的氨基酸序列(SEQ ID NO：149)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物3.15G8或其片段，如WO2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3.15G8或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：42的氨基酸序列(SEQ ID NO：908)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：47的氨基酸序列(SEQ ID NO：150)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物3.18G1或其片段，如WO2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的3.18G1或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：52的氨基酸序列(SEQ ID NO：151)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：57的氨基酸序列(SEQ ID NO：152)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物2.7A4OPT或其片段，如WO2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.7A4OPT或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：62的氨基酸序列(SEQID NO：153)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：67的氨基酸序列(SEQID NO：154)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体的衍生物2.14H9OPT或其片段，如WO 2011/066389、US8,779,108和US2014/0356353中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的2.14H9OPT或其抗原结合片段包含：重链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：72的氨基酸序列(SEQ ID NO：101)；和/或轻链可变区，其含有WO 2011/066389的SEQ ID NO：77的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体中任一种的衍生物，如WO2016/061142中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含：重链衍生物，其含有选自WO2016/061142的SEQ IDNO:18、30、38、46、50、54、62、70和78的氨基酸序列：WO2016/061142的SEQ ID NO:18(SEQ IDNO：155)；WO2016/061142的SEQ ID NO:30(SEQ ID NO：156)；WO2016/061142的SEQ ID NO:38(SEQ ID NO：157)；WO2016/061142的SEQ ID NO:46(SEQ ID NO：158)；WO2016/061142的SEQ ID NO:50(SEQ ID NO：159)；WO2016/061142的SEQ ID NO:54(SEQ ID NO：160)；WO2016/061142的SEQ ID NO:62(SEQ ID NO：161)；WO2016/061142的SEQ ID NO:70(SEQ IDNO：162)；WO2016/061142的SEQ ID NO:78(SEQ ID NO：163)；和/或轻链衍生物，其含有选自WO2016/061142的SEQ ID NO:22、26、34、42、58、66、74、82和86的氨基酸序列：WO2016/061142的SEQ ID NO:22(SEQ ID NO：164)；WO2016/061142的SEQ ID NO:26(SEQ ID NO：165)；WO2016/061142的SEQ ID NO:34(SEQ ID NO：166)；WO2016/061142的SEQ ID NO:42(SEQ ID NO：167)；WO2016/061142的SEQ ID NO:58(SEQ ID NO：168)；WO2016/061142的SEQID NO:66(SEQ ID NO：169)；WO2016/061142的SEQ ID NO:74(SEQ ID NO：170)；WO2016/061142的SEQ ID NO:82(SEQ ID NO：171)；WO2016/061142的SEQ ID NO:86(SEQ ID NO：172)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体中任一种的衍生物，如WO2016/022630中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含：重链衍生物，其含有选自WO2016/022630的SEQ IDNO:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42和46的氨基酸序列：WO2016/022630的SEQ ID NO:2(SEQ ID NO：173)；WO2016/022630的SEQ ID NO:6(SEQ ID NO：174)；WO2016/022630的SEQID NO:10(SEQ ID NO：175)；WO2016/022630的SEQ ID NO:14(SEQ ID NO：176)；WO2016/022630的SEQ ID NO:18(SEQ ID NO：177)；WO2016/022630的SEQ ID NO:22(SEQ ID NO：178)；WO2016/022630的SEQ ID NO:26(SEQ ID NO：179)；WO2016/022630的SEQ ID NO:30(SEQ ID NO：180)；WO2016/022630的SEQ ID NO:34(SEQ ID NO：181)；WO2016/022630的SEQID NO:38(SEQ ID NO：182)；WO2016/022630的SEQ ID NO:42(SEQ ID NO：183)；WO2016/022630的SEQ ID NO:46(SEQ ID NO：184)；和/或轻链衍生物，其含有选自WO2016/022630的SEQ ID NO:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44和48的氨基酸序列：WO2016/022630的SEQID NO:4(SEQ ID NO：185)；WO2016/022630的SEQ ID NO:8(SEQ ID NO：186)；WO2016/022630的SEQ ID NO:12(SEQ ID NO：187)；WO2016/022630的SEQ ID NO:16(SEQ ID NO：188)；WO2016/022630的SEQ ID NO:20(SEQ ID NO：189)；WO2016/022630的SEQ ID NO:24(SEQ ID NO：190)；WO2016/022630的SEQ ID NO:28(SEQ ID NO：191)；WO2016/022630的SEQID NO:32(SEQ ID NO：192)；WO2016/022630的SEQ ID NO:36(SEQ ID NO：193)；WO2016/022630的SEQ ID NO:40(SEQ ID NO：194)；WO2016/022630的SEQ ID NO:44(SEQ ID NO：195)；WO2016/022630的SEQ ID NO:48(SEQ ID NO：196)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体中任一种的衍生物，如WO2015/112900中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含：重链衍生物，其含有选自WO 2015/112900的SEQ IDNO:38、50、82和86的氨基酸序列：WO 2015/112900的SEQ ID NO:38(SEQ ID NO：197)；WO2015/112900的SEQ ID NO:50(SEQ ID NO：198)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:82(SEQ IDNO：199)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:86(SEQ ID NO：200)；和/或轻链衍生物，其含有选自WO 2015/112900的SEQ ID NO:42、46、54、58、62、66、70、74和78的氨基酸序列：WO 2015/112900的SEQ ID NO:42(SEQ ID NO：201)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:46(SEQ ID NO：202)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:54(SEQ ID NO：203)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:58(SEQ ID NO：204)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:62(SEQ ID NO：203)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:66(SEQ ID NO：206)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:70(SEQ ID NO：207)；WO2015/112900的SEQ ID NO:74(SEQ ID NO：208)；WO 2015/112900的SEQ ID NO:78(SEQ IDNO：209)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L1抗体中任一种的衍生物，如WO 2010/077634和US 8,217,149中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：重链区衍生物，其含有WO 2010/077634的SEQ ID NO：20的氨基酸序列(SEQ ID NO：210)；和/或轻链可变区衍生物，其含有WO 2010/077634的SEQ ID NO：21的氨基酸序列(SEQ ID NO：211)。

在一个实施方案中，靶向部分包含可从以CNCM保藏号CNCM I-4122、CNCM I-4080和CNCM I-4081获得的杂交瘤获得的抗PD-L1抗体中任一种的衍生物，如US 20120039906中所公开的，其全部公开内容通过引用并入文中。

在一个实施方案中，靶向部分包含针对PD-L1的VHH衍生物，如例如在US 8,907,065和WO 2008/071447中所公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，针对PD-L1的VHH包含US 8,907,065的SEQ ID NO：394-399：US 8,907,065的SEQ ID NO：394(SEQ ID NO：212)；US 8,907,065的SEQ ID NO：395(SEQ ID NO：213)；US 8,907,065的SEQ ID NO：396(SEQ ID NO：214)；US8,907,065的SEQ ID NO：397(SEQ ID NO：215)；US 8,907,065的SEQ ID NO：398(SEQ ID NO：216)；US 8,907,065的SEQ ID NO：399(SEQ ID NO：217)。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有一个或多个针对PD-L2的靶向部分。在一些实施方案中，嵌合蛋白具有一个或多个选择性结合PD-L2多肽的靶向部分。在一些实施方案中，嵌合蛋白包含一种或多种选择性结合PD-L2多肽的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽、或融合蛋白。在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含以低亲和力结合PD-L2的第一靶向部分。

在一个实施方案中，靶向部分包含针对PD-L2的VHH衍生物，如例如在US 8,907,065和WO 2008/071447中公开的，其全部公开内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，针对PD-L2的VHH包含US 8,907,065的SEQ ID NO：449-455：US 8,907,065的SEQ ID NO：449(SEQ ID NO：218)；US 8,907,065的SEQ ID NO：450(SEQ ID NO：219)；US 8,907,065的SEQ ID NO：451(SEQ ID NO：220)；US 8,907,065的SEQ ID NO：452(SEQ ID NO：221)；US 8,907,065的SEQ ID NO：453(SEQ ID NO：222)；US 8,907,065的SEQ ID NO：454(SEQ ID NO：223)；US 8,907,065的SEQ ID NO：455(SEQ ID NO：224)。

在一个实施方案中，靶向部分包含抗PD-L2抗体中任一种的衍生物，如US2011/0271358和WO2010/036959中所公开的，其全部内容通过引用并入本文。在说明性实施方案中，用于本文提供的方法中的抗体或其抗原结合片段包含：重链衍生物，其含有选自US2011/0271358的SEQ ID NO：43-47的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID NO：43(SEQID NO：225)；US2011/0271358的SEQ ID NO：44(SEQ ID NO：226)；US2011/0271358的SEQ IDNO：45(SEQ ID NO：227)；US2011/0271358的SEQ ID NO：46(SEQ ID NO：228)；US2011/0271358的SEQ ID NO：47(SEQ ID NO：229)；和/或轻链衍生物，其含有选自US2011/0271358的SEQ ID NO：48-51的氨基酸序列：US2011/0271358的SEQ ID NO：48(SEQ ID NO：230)；US2011/0271358的SEQ ID NO：49(SEQ ID NO：231)；US2011/0271358的SEQ ID NO：50(SEQID NO：232)；US2011/0271358的SEQ ID NO：51(SEQ ID NO：233)。

在各种实施方案中，本发明的靶向部分可包含靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的序列，其与本文所公开的任何序列至少约60％、至少约61％、至少约62％、至少约63％、至少约64％、至少约65％、至少约66％、至少约67％、至少约68％、至少约69％、至少约70％、至少约71％、至少约72％、至少约73％、至少约74％、至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一(例如，与本文所公开的任何序列具有约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、约99％或约100％序列同一性)。

在各种实施方案中，本发明的靶向部分可包含靶向如本文所公开的PD-1、PD-L1和/或PD-L2的重链、轻链、重链可变区、轻链可变区、互补决定区(CDR)和框架区序列的任何组合。

选择性结合或靶向PD-1、PD-L1和/或PD-L2的另外的抗体、抗体衍生物或形式、肽或多肽、或融合蛋白公开于WO 2011/066389、US 2008/0025980、US 2013/0034559、US 8,779,108、US 2014/0356353、US 8,609,089、US 2010/028330、US 2012/0114649、WO 2010/027827、WO 2011,/066342、US 8,907,065、WO 2016/062722、WO 2009/101611、WO2010/027827、WO 2011/066342、WO 2007/005874、WO 2001/014556、US2011/0271358、WO 2010/036959、WO 2010/077634、US 8,217,149、US 2012/0039906、WO 2012/145493、US 2011/0318373、美国专利号8,779,108、US 20140044738、WO 2009/089149、WO 2007/00587、WO2016061142、WO 2016,02263、WO 2010/077634和WO 2015/112900中，其全部公开内容通过引用并入文中。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对T细胞上的检查点标记物(例如PD-1)的靶向部分，和(ii)针对肿瘤细胞(例如PD-L1或PD-L2)的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对T细胞上的PD-1的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1的第二靶向部分。在另一实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对T细胞上的PD-1的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对T细胞的靶向部分，例如，通过靶向CD8所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对T细胞上的CD8的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对T细胞的靶向部分，例如，通过靶向CD4所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对T细胞上的CD4的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对T细胞的靶向部分，例如，通过靶向CD3、CXCR3、CCR4、CCR9、CD70、CD103、或一个或多个免疫检查点标记物所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对T细胞上的CD3的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对T细胞的靶向部分，例如，通过靶向PD-1所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

作为非限制性实例，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对B细胞的靶向部分，例如，通过靶向CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD70、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDw130、CD138、CDw150和B细胞成熟抗原(BCMA)所介导；和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对B细胞的靶向部分，例如，通过靶向CD19、CD20或CD70所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对B细胞的靶向部分，例如，通过靶向CD20所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对B细胞上的CD20的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

作为非限制性实例，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对NK细胞的靶向部分，例如，通过靶向2B4/SLAMF4、KIR2DS4、CD155/PVR、KIR3DL1、CD94、LMIR1/CD300A、CD69、LMIR2/CD300c、CRACC/SLAMF7、LMIR3/CD300LF、DNAM-1、LMIR5/CD300LB、Fc-εRII、LMIR6/CD300LE、Fc-γRl/CD64、MICA、Fc-γRIIB/CD32b、MICB、Fc-γRIIC/CD32c、MULT-1、Fc-γRIIA/CD32a、结合素-2/CD112、Fc-γRIII/CD16、NKG2A、FcRH1/IRTA5、NKG2C、FcRH2/IRTA4、NKG2D、FcRH4/IRTA1、NKp30、FcRH5/IRTA2、NKp44、Fc-受体样3/CD16-2、NKp46/NCR1、NKp80/KLRF1、NTB-A/SLAMF6、Rae-1、Rae-1α、Rae-1β、Rae-1δ、H60,Rae-1ε、ILT2/CD85j、Rae-1γ、ILT3/CD85k、TREM-1、ILT4/CD85d、TREM-2、ILT5/CD85a、TREM-3、KIR/CD158、TREML1/TLT-1、KIR2DL1、ULBP-1、KIR2DL3、ULBP-2、KIR2DL4/CD158d或ULBP-3所介导；和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对NK细胞的靶向部分，例如，通过靶向Kir1α、DNAM-1或CD64所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对NK细胞的靶向部分，例如，通过靶向KIR1所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对NK细胞上的KIR1的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对NK细胞的靶向部分，例如，通过靶向TIGIT或KIR1所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对NK细胞上的TIGIT的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

作为非限制性实例，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对树突细胞的靶向部分，例如，通过靶向CLEC-9A、XCR1、RANK、CD36/SRB3、LOX-1/SR-E1、CD68、MARCO、CD163、SR-A1/MSR、CD5L、SREC-1、CL-Pl/COLEC12、SREC-II、LIMPIIISRB2、RP105、TLR4、TLR1、TLR5、TLR2、TLR6、TLR3、TLR9、4-IBB配体/TNFSF9、IL-12/IL-23p40、4-氨基-1,8-萘酰亚胺、ILT2/CD85j、CCL21/6Ckine、ILT3/CD85k、8-氧代-dG、ILT4/CD85d、8D6A、ILT5/CD85a、A2B5、lutegrinα4/CD49d、Aag、整联蛋白β2/CD18、AMICA、Langerin、B7-2/CD86、白三烯B4Rl、B7-H3、LMIR1/CD300A、BLAME/SLAMF8、LMIR2/CD300c、Clq R1/CD93、LMIR3/CD300LF、CCR6、LMIR5/CD300LB CCR7、LMIR6/CD300LE、CD40/TNFRSF5、MAG/Siglec-4-a、CD43、MCAM、CD45、MD-1、CD68、MD-2、CD83、MDL-1/CLEC5A、CD84/SLAMF5、MMR、CD97、NCAMLl、CD2F-10/SLAMF9、骨激活素GPNMB、Chern 23、PD-L2、CLEC-1、RP105、CLEC-2、Siglec-2/CD22、CRACC/SLAMF7、Siglec-3/CD33、DC-SIGN、Siglec-5、DC-SIGNR/CD299、Siglec-6、DCAR、Siglec-7、DCIR/CLEC4A、Siglec-9、DEC-205、Siglec-10、Dectin-1/CLEC7A、Siglec-F、Dectin-2/CLEC6A、SIGNR1/CD209、DEP-1/CD148、SIGNR4、DLEC、SLAM、EMMPRIN/CD147、TCCR/WSX-1、Fc-γR1/CD64、TLR3、Fc-γRIIB/CD32b、TREM-1、Fc-γRIIC/CD32c、TREM-2、Fc-γRIIA/CD32a、TREM-3、Fc-γRIII/CD16、TREML1/TLT-1、ICAM-2/CD102、或香草素R1所介导；和(ii)针对肿瘤细胞或免疫细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对树突细胞的靶向部分，例如，通过靶向CLEC-9A、DC-SIGN、CD64、CLEC4A或DEC205所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对树突细胞上的CLEC9A的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对树突细胞的靶向部分，例如，通过靶向CLEC9A所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对树突细胞上的CLEC9A的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对树突细胞的靶向部分，例如，通过靶向XCR1所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对树突细胞上的XCR1的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对树突细胞的靶向部分，例如，通过靶向RANK所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对树突细胞上的RANK的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

作为非限制性实例，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对单核细胞/巨噬细胞的靶向部分，例如，通过靶向SIRP1a、B7-1/CD80、ILT4/CD85d、B7-H1、ILT5/CD85a、共同的β链、整联蛋白α4/CD49d、BLAME/SLAMF8、整联蛋白αX/CDllc、CCL6/C10、整联蛋白β2/CD18、CD155/PVR、整联蛋白β3/CD61、CD31/PECAM-1、Latexin、CD36/SR-B3、白三烯B4R1、CD40/TNFRSF5、LIMPIIISR-B2、CD43、LMIR1/CD300A、CD45、LMIR2/CD300c、CD68、LMIR3/CD300LF、CD84/SLAMF5、LMIR5/CD300LB、CD97、LMIR6/CD300LE、CD163、LRP-1、CD2F-10/SLAMF9、MARCO、CRACC/SLAMF7、MD-1、ECF-L、MD-2、EMMPRIN/CD147、MGL2、内皮糖蛋白/CD105、骨激活素/GPNMB、Fc-γRI/CD64、骨桥蛋白、Fc-γRIIB/CD32b、PD-L2、Fc-γRIIC/CD32c、Siglec-3/CD33、Fc-γRIIA/CD32a、SIGNR1/CD209、Fc-γRIII/CD16、SLAM、GM-CSF Rα、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TLR3、IFN-γRl、TLR4、IFN-gannna R2、TREM-l、IL-l RII、TREM-2、ILT2/CD85j、TREM-3、ILT3/CD85k、TREML1/TLT-1、2B4/SLAMF4、IL-10Rα、ALCAM、IL-10Rβ、氨肽酶N/ANPEP、ILT2/CD85j、共同的β链、ILT3/CD85k、Clq R1/CD93、ILT4/CD85d、CCR1、ILT5/CD85a、CCR2、CD206、整联蛋白α4/CD49d、CCR5、整联蛋白αM/CDll b、CCR8、整联蛋白αX/CDllc、CD155/PVR、整联蛋白β2/CD18、CD14、整联蛋白β3/CD61、CD36/SR-B3、LAIR1、CD43、LAIR2、CD45、白三烯B4-R1、CD68、LIMPIIISR-B2、CD84/SLAMF5、LMIR1/CD300A、CD97、LMIR2/CD300c、CD163、LMIR3/CD300LF、凝血因子III/组织因子、LMIR5/CD300LB、CX3CR1、CX3CL1、LMIR6/CD300LE、CXCR4、LRP-1、CXCR6、M-CSF R、DEP-1/CD148、MD-1、DNAM-1、MD-2、EMMPRIN/CD147、MMR、内皮糖蛋白/CD105、NCAM-L1、Fc-γRI/CD64、PSGL-1、Fc-γRIIIICD16、RP105、G-CSF R、L-选择蛋白、GM-CSF Rα、Siglec-3/CD33、HVEM/TNFRSF14、SLAM、ICAM-1/CD54、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TREM-l、IL-6R、TREM-2、CXCRl/IL-8RA、TREM-3、或TREMLl/TLT-1所介导；和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对单核细胞/巨噬细胞的靶向部分，例如，通过靶向B7-H1、CD31/PECAM-1、CD163、CCR2或巨噬细胞甘露糖受体CD206所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对单核细胞/巨噬细胞的靶向部分，例如，通过靶向SIRP1a所介导，和(ii)针对肿瘤细胞的靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对巨噬细胞上的SIRP1a的靶向部分和针对肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2的第二靶向部分。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有针对以下检查点标记物的一个或多个靶向部分，例如PD-1/PD-L1或PD-L2、CD28/CD80或CD86、CTLA4/CD80或CD86、ICOS/ICOSL或B7RP1、BTLA/HVEM、KIR、LAG3、CD137/CD137L、OX40/OX40L、CD27、CD40L、TIM3/Gal9和A2aR中的一种或多种。

在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含针对相同或不同免疫细胞的两个或更多个靶向部分。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有(i)针对选自T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、NK细胞或其子集的免疫细胞的一个或多个靶向部分，和(ii)针对选自T细胞、B细胞、树突细胞、巨噬细胞、NK细胞或其子集的同一或另一免疫细胞的一个或多个靶向部分，以及本文所述的任何修饰的(例如，突变)信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对T细胞的靶向部分和一个或多个针对同一或另一T细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对T细胞的靶向部分和一个或多个针对B细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对T细胞的靶向部分和一个或多个针对树突细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对T细胞的靶向部分和一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对T细胞的靶向部分和一个或多个针对NK细胞的靶向部分。例如，在一个说明性实施方案中，嵌合蛋白可包括针对CD8的靶向部分和针对Clec9A的靶向部分。在另一说明性实施方案中，嵌合蛋白可包括针对CD8的靶向部分和针对CD3的靶向部分。在另一说明性实施方案中，嵌合蛋白可包括针对CD8的靶向部分和针对PD-1的靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对B细胞的靶向部分和一个或多个针对同一或另一B细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对B细胞的靶向部分和一个或多个针对T细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对B细胞的靶向部分和一个或多个针对树突细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对B细胞的靶向部分和一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对B细胞的靶向部分和一个或多个针对NK细胞的靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对树突细胞的靶向部分和一个或多个针对同一或另一树突细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对树突细胞的靶向部分和一个或多个针对T细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对树突细胞的靶向部分和一个或多个针对B细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对树突细胞的靶向部分和一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对树突细胞的靶向部分和一个或多个针对NK细胞的靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分和一个或多个针对同一或另一巨噬细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分和一个或多个针对T细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分和一个或多个针对B细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分和一个或多个针对树突细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分和一个或多个针对NK细胞的靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对NK细胞的靶向部分和一个或多个针对同一或另一NK细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对NK细胞的靶向部分和一个或多个针对T细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对NK细胞的靶向部分和一个或多个针对B细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对NK细胞的靶向部分和一个或多个针对巨噬细胞的靶向部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含一个或多个针对NK细胞的靶向部分和一个或多个针对树突细胞的靶向部分。

在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含针对肿瘤细胞的靶向部分和针对相同或不同肿瘤细胞的第二靶向部分。在此类实施方案中，靶向部分可结合至本文所述的任何肿瘤抗原。

在各种实施方案中，嵌合构建体如WO 2013/107791中所述构建，其全部内容通过引用并入本文，参见实施例材料和方法及实施例1。

在各种实施方案中，嵌合构建体的功能表征如WO 2013/107791的实施例2-10中进行，其全部内容通过引用并入本文。

靶向部分形式

在各种实施方案中，本发明嵌合蛋白的靶向部分是能够特异性结合的基于蛋白质的因子，如抗体或其衍生物。在一个实施方案中，靶向部分包含抗体。在各种实施方案中，抗体是全长多聚体蛋白，其包含两条重链和两条轻链。每条重链包含一个可变区(例如，V_H)和至少三个恒定区(例如，CH₁、CH₂和CH₃)，并且每条轻链包含一个可变区(V_L)和一个恒定区(C_L)。可变区决定抗体的特异性。每个可变区包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，其侧接有四个相对保守的框架区(FR)。被称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR促成抗体结合特异性。在一些实施方案中，抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。

在一些实施方案中，靶向部分包含抗体衍生物或形式。在一些实施方案中，本发明嵌合蛋白的靶向部分是单结构域抗体、重组的仅重链抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、鲨鱼的仅重链抗体(VNAR)、微蛋白(半胱氨酸结蛋白，knottin)、DARPin；四连接素；亲和体；转移体；Anticalin；AdNectin；Affilin；微体形；肽适体；alterases；塑料抗体；phylomer；stradobodies；maxibodies；evibody；fynomer、犰狳重复蛋白、Kunitz结构域、avimer、atrimer、probody、immunobody、triomab、troybody；pepbody；vaccibody、UniBody；affimers、DuoBody、Fv、Fab、Fab'、F(ab′)₂、肽模拟分子或合成分子，如美国专利号或专利公布号US 7,417,130、US 2004/132094、US 5,831,012、US 2004/023334、US 7,250,297、US6,818,418、US 2004/209243、US 7,838,629、US 7,186,524、US 6,004,746、US 5,475,096、US 2004/146938、US 2004/157209、US 6,994,982、US 6,794,144、US 2010/239633、US 7,803,907、US 2010/119446和/或US 7,166,697中所述，其内容通过引用整体并入本文。还参见Storz MAbs.2011年5月-6月；3(3):310-317。

在一个实施方案中，靶向部分包含单结构域抗体，如来自例如产生VHH抗体的生物的VHH，如骆驼科、鲨鱼或设计的VHH。VHH是抗体衍生的治疗性蛋白质，其含有天然存在的重链抗体的独特结构和功能特性。VHH技术是基于来自缺乏轻链的骆驼科的全功能抗体。这些重链抗体含有单一可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。VHH可以商标NANOBODY或NANOBODIES商购获得。

在一个实施方案中，靶向部分包含VHH。在一些实施方案中，VHH是人源化VHH或骆驼化VHH。

在一些实施方案中，VHH包含全人V_H结构域，例如，HUMABODY(CrescendoBiologics,Cambridge,UK)。在一些实施方案中，全人V_H结构域(例如，HUMABODY)是单价、二价或三价的。在一些实施方案中，全人V_H结构域(例如，HUMABODY)是单特异性或多特异性的，如单特异性、双特异性或三特异性。示例性的全人V_H结构域，例如HUMABODIES，描述于例如WO 2016/113555和WO2016/113557中，其全部公开内容通过引用并入本文。

在各种实施方案中，本发明嵌合蛋白的靶向部分是能够特异性结合至细胞受体的基于蛋白质的因子，如细胞受体的天然配体。在各种实施方案中，细胞受体见于一种或多种免疫细胞上，所述免疫细胞可包括但不限于T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如，M1巨噬细胞)、B细胞、树突细胞或其子集。在一些实施方案中，细胞受体见于巨核细胞、血小板、红细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞或其子集上。

在一些实施方案中，靶向部分是天然配体，如趋化因子。可包括在本发明的嵌合蛋白中的示例性趋化因子包括但不限于CCL1、CCL2、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CLL25、CCL26、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2、CX3CL1、HCC-4和LDGF-PBP。在一个说明性实施方案中，靶向部分可以是XCL1，其是识别并结合至树突细胞受体XCR1的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL1，其是识别并结合至CCR8的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL2，其是识别并结合至CCR2或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL3，其是识别并结合至CCR1、CCR5或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL4，其是识别并结合至CCR1或CCR5或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL5，其是识别并结合至CCR1或CCR3或CCR4或CCR5的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL6，其是识别并结合至CCR1的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL7，其是识别并结合至CCR2或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL8，其是识别并结合至CCR1或CCR2或CCR2B或CCR5或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL9，其是识别并结合至CCR1的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL10，其是识别并结合至CCR1的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL11，其是识别并结合至CCR2或CCR3或CCR5或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL13，其是识别并结合至CCR2或CCR3或CCR5或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL14，其是识别并结合至CCR1或CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL15，其是识别并结合至CCR1或CCR3的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL16，其是识别并结合至CCR1、CCR2、CCR5或CCR8的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL17，其是识别并结合至CCR4的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL19，其是识别并结合至CCR7的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL20，其是识别并结合至CCR6的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL21，其是识别并结合至CCR7的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL22，其是识别并结合至CCR4的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL23，其是识别并结合至CCR1的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL24，其是识别并结合至CCR3的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL25，其是识别并结合至CCR9的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL26，其是识别并结合至CCR3的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL27，其是识别并结合至CCR10的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CCL28，其是识别并结合至CCR3或CCR10的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL1，其是识别并结合至CXCR1或CXCR2的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL2，其是识别并结合至CXCR2的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL3，其是识别并结合至CXCR2的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL4，其是识别并结合至CXCR3B的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL5，其是识别并结合至CXCR2的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL6，其是识别并结合至CXCR1或CXCR2的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL8，其是识别并结合至CXCR1或CXCR2的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL9，其是识别并结合至CXCR3的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL10，其是识别并结合至CXCR3的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL11，其是识别并结合至CXCR3或CXCR7的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL12，其是识别并结合至CXCR4或CXCR7的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL13，其是识别并结合至CXCR5的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CXCL16，其是识别并结合至CXCR6的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是LDGF-PBP，其是识别并结合至CXCR2的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是XCL2，其是识别并结合至XCR1的趋化因子。在另一说明性实施方案中，靶向部分是CX3CL1，其是识别并结合至CX3CR1的趋化因子。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含呈各种组合形式的靶向部分。在一个说明性实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含两个靶向部分，其中两个靶向部分均为抗体或其衍生物。在另一说明性实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含两个靶向部分，其中两个靶向部分均为细胞受体的天然配体。在进一步的说明性实施方案中，本发明的嵌合蛋白可包含两个靶向部分，其中一个靶向部分是抗体或其衍生物，而另一个靶向部分是细胞受体的天然配体。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白的识别结构域功能性地调节(不用于限制，部分或完全中和)目标靶标(例如，抗原、受体)，例如，实质上抑制、减小或中和抗原所具有的生物效应。例如，各种识别结构域可针对一种或多种肿瘤抗原，所述肿瘤抗原主动抑制或具有抑制例如患有肿瘤的患者的免疫***的能力。例如，在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白功能性地调节免疫抑制信号(例如，检查点抑制剂)，例如TIM-3、BTLA、PD-1、CTLA-4、B7-H4、GITR、半乳糖凝集素-9、HVEM、PD-L1、PD-L2、B7-H3、CD244、CD160、TIGIT、SIRPα、ICOS、CD172a和TMIGD2中的一种或多种。例如，在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白被工程改造以破坏、阻断、减少和/或抑制免疫抑制信号的传递，作为非限制性实例，PD-1与PD-L1或PD-L2结合和/或CTLA-4与AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A中的一种或多种结合。

在各种实施方案中，本发明嵌合蛋白的识别结构域结合但不功能性地调节目标靶标(例如，抗原、受体)，例如，识别结构域是结合抗体，或类似于结合抗体。例如，在各种实施方案中，识别结构域仅靶向抗原或受体，但实质上不抑制、减小或功能性调节抗原或受体所具有的生物效应。例如，上述一些较小的抗体形式(例如，与例如完整抗体相比)具有靶向难以接近表位并提供更大的特异性结合区域范围的能力。在各种实施方案中，识别结构域结合物理上与对其生物活性重要的抗原或受***点(例如抗原的活性位点)分开的表位。

这种非中和结合可用于本发明的各种实施方案，包括其中本发明的嵌合蛋白用于经由效应抗原(如本文所述的任一种)直接或间接地将活性免疫细胞募集到需要位点的方法。例如，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白可用于在减少或消除肿瘤的方法中经由CD8将细胞毒性T细胞直接或间接募集到肿瘤细胞(例如，嵌合蛋白可包含抗CD8识别结构域和针对肿瘤抗原的识别结构域)。在此类实施方案中，期望直接或间接募集表达CD8的细胞毒性T细胞，但不会功能性地调节CD8活性。相反，在这些实施方案中，CD8信号传导是肿瘤减轻或消除效应的重要部分。作为进一步的实例，在减轻或消除肿瘤的各种方法中，本发明的嵌合蛋白用于经由CLEC9A直接或间接募集树突细胞(DC)(例如，嵌合蛋白可包含抗CLEC9A识别结构域和针对肿瘤抗原的识别结构域)。在此类实施方案中，期望直接或间接募集表达CLEC9A的DC，但不会功能性地调节CLEC9A活性。相反，在这些实施方案中，CLEC9A信号传导是肿瘤减轻或消除效应的重要部分。

在各种实施方案中，本发明嵌合蛋白的识别结构域与例如在树突细胞上的XCR1结合。例如，在一些实施方案中，识别结构域包含全部或一部分XCL1或非中和性抗XCR1因子。

在各种实施方案中，本发明嵌合蛋白的识别结构域结合至免疫调节抗原(例如，免疫刺激性或免疫抑制性)。在各种实施方案中，免疫调节抗原是4-1BB、OX-40、HVEM、GITR、CD27、CD28、CD30,CD40、ICOS配体；OX-40配体、LIGHT(CD258)、GITR配体、CD70、B7-1、B7-2、CD30配体、CD40配体、ICOS、ICOS配体、CD137配体和TL1A中的一种或多种。在各种实施方案中，此类免疫刺激性抗原在肿瘤细胞上表达。在各种实施方案中，本发明嵌合蛋白的识别结构域结合但不功能性地调节这种免疫刺激性抗原，且因此允许募集表达这些抗原的细胞而不会降低或丧失其潜在的肿瘤减轻或消除能力。

在各种实施方案中，本发明嵌合蛋白的识别结构域可在嵌合蛋白的背景下，所述嵌合蛋白包含两个具有中和活性的识别结构域，或包含两个具有非中和(例如，结合)活性的识别结构域，或包含一个具有中和活性的识别结构域和一个具有非中和(例如，结合)活性的识别结构域。

另外的信号传导剂

一方面，本发明提供了一种嵌合蛋白，其除了本文所述的修饰的IFN-γ外还包含一种或多种信号传导剂(例如，免疫调节剂)。在示例性实施方案中，除了本文所述的修饰的IFN-γ之外，嵌合蛋白还可包含两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种信号传导剂。在各种实施方案中，另外的信号传导剂被修饰以对其一种或多种受体具有降低的亲和力和/或生物活性，这允许活性的减弱(包括激动或拮抗)和/或防止非特异性信号传导或不期望的嵌合蛋白的螯合。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂以其野生型形式具有拮抗作用并且具有一个或多个减弱其拮抗活性的突变。在各种实施方案中，另外的信号传导剂由于一个或多个突变而具有拮抗作用，例如，激动性信号传导剂被转化为拮抗性信号传导剂，并且这种转化的信号传导剂任选地还具有一个或多个减弱其拮抗活性的突变(例如，如WO 2015/007520中所述，其全部内容通过引用并入本文)。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂选自细胞因子、生长因子和激素的修饰形式。这些细胞因子、生长因子和激素的说明性实例包括但不限于淋巴因子、单核因子、传统多肽激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛肽；松弛肽原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质；小鼠***相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；***-I和-II；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ(和I、II和III型干扰素)、集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13和IL-18；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；以及其他多肽因子，包括例如LIF和kit配体(KL)。如本文所用，细胞因子、生长因子和激素包括从天然来源获得的蛋白质或由重组细菌、真核或哺乳动物细胞培养***产生的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等价物。

在一些实施方案中，另外的信号传导剂是生长因子的修饰形式，其选自但不限于转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β、表皮生长因子(EGF)、***如***-I和-II、成纤维细胞生长因子(FGF)、heregulin、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)。

在一个实施方案中，生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)的修饰形式。说明性FGF包括但不限于FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、鼠FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。

在一个实施方案中，生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)的修饰形式。说明性VEGF包括但不限于VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PGF及其同种型，包括VEGF-A的各种同种型，如VEGF₁₂₁、VEGF₁₂₁b、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₆₅b、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆。

在一个实施方案中，生长因子是转化生长因子(TGF)的修饰形式。说明性TGF包括但不限于TGF-α和TGF-β及其亚型，包括TGF-β的各种亚型，包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3。

在一些实施方案中，另外的信号传导剂是激素的修饰形式，其选自但不限于人绒毛膜***、***释放激素、雄激素、***、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体激素、催乳素、生长激素、促肾上腺皮质激素、抗利尿激素、催产素、促甲状腺素释放激素、生长激素释放激素、促肾上腺皮质激素释放激素、生长抑素、多巴胺、褪黑素、甲状腺素、降钙素、甲状旁腺激素、糖皮质激素、盐皮质激素、肾上腺素、去甲肾上腺素、***、胰岛素、胰高血糖素、胰岛淀粉样多肽、骨化三醇、钙化醇、心房利钠肽、胃泌素、促胰液素、胆囊收缩素、神经肽Y、生长素释放肽、PYY3-36、***(IGF)、瘦素、血小板生成素、***(EPO)和血管紧张素原。

在一些实施方案中，另外的信号传导剂是免疫调节剂，例如，白细胞介素、干扰素和肿瘤坏死因子中的一种或多种。

在一些实施方案中，另外的信号传导剂是白细胞介素，包括例如IL-1；IL-2；IL-3；IL-4；IL-5；IL-6；IL-7；IL-8；IL-9；IL-10；IL-11；IL-12；IL-13；IL-14；IL-15；IL-16；IL-17；IL-18；IL-19；IL-20；IL-21；IL-22；IL-23；IL-24；IL-25；IL-26；IL-27；IL-28；IL-29；IL-30；IL-31；IL-32；IL-33；IL-35；IL-36或其片段、变体、类似物或家族成员。白细胞介素是由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞合成的一组多功能细胞因子。已知功能包括刺激免疫细胞(例如T辅助细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞)的增殖、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞的趋化性、和/或干扰素的抑制。白细胞介素活性可使用本领域中已知的测定来确定：Matthews等人,Lymphokines andInterferens:A Practical Approach,Clemens等人编,IRL Press,Washington,D.C.1987,第221-225页；和Orencole&Dinarello(1989)Cytokine1,14-20.

在一些实施方案中，另外的信号传导剂是干扰素的修饰形式，如I、II和III型干扰素。说明性干扰素包括，例如，干扰素-α、干扰素-β、另一种干扰素-γ、干扰素κ、干扰素ε、干扰素τ和干扰素

在一些实施方案中，另外的信号传导剂是肿瘤坏死因子(TNF)或TNF家族中蛋白质的修饰形式，包括但不限于TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40L、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L和TRAIL。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂是具有一个或多个突变的信号传导剂的修饰(例如突变)形式。在各种实施方案中，该等突变允许修饰的信号传导剂具有一种或多种相对于未修饰或未突变，即野生型形式的信号传导剂的减弱的活性，如降低的结合亲和力、降低的内源活性和降低的特异性生物活性中的一种或多种(例如，比较野生型形式与修饰(例如，突变)形式的相同信号传导剂)。在一些实施方案中，减弱或降低结合或亲和力的突变包括实质上降低或消除结合或活性的那些突变。在一些实施方案中，减弱或降低结合或亲和力的突变不同于实质上降低或消除结合或活性的那些突变。因此，在各种实施方案中，突变允许信号传导剂相对于未突变的，即野生型信号传导剂来说更安全，例如，具有降低的全身毒性，减少的副作用和降低的脱靶效应(例如，比较野生型形式与修饰(例如突变)形式的相同信号传导剂)。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂被修饰以具有一个或多个突变，所述突变降低其对其一种或多种受体的结合亲和力或活性。在一些实施方案中，信号传导剂被修饰以具有一个或多个突变，所述突变实质上降低或消除对受体的结合亲和力或活性。在一些实施方案中，野生型信号传导剂所提供的活性是对受体的激动作用(例如，在治疗位点处激活细胞效应)。例如，野生型信号传导剂可以激活其受体。在此类实施方案中，突变导致修饰的信号传导剂对受体具有降低或消除的激活活性。例如，突变可以导致修饰的信号传导剂将减少的激活信号传递给靶细胞，或者可以消除激活信号。在一些实施方案中，野生型信号传导剂所提供的活性是对受体的拮抗作用(例如，在治疗位点处阻断或抑制细胞效应)。例如，野生型信号传导剂可以拮抗或抑制受体。在这些实施方案中，突变导致修饰的信号传导剂对受体具有降低或消除的拮抗活性。例如，突变可以导致修饰的信号传导剂将减少的抑制信号传递给靶细胞，或者可以消除抑制信号。在各种实施方案中，信号传导剂由于一个或多个突变而具有拮抗作用，例如，激动信号传导剂被转化为拮抗信号传导剂(例如，如WO2015/007520中所述，其全部内容通过引用并入本文)并且，这种转化的信号传导剂任选地还具有一个或多个突变，所述突变降低其对其一种或多种受体的结合亲和力或活性，或者实质上降低或消除对其一种或多种受体的结合亲和力或活性。

在一些实施方案中，对受体的降低的亲和力和/或生物活性可通过与一个或多个靶向部分连接而恢复。在其他实施方案中，对受体的降低的亲和力和/或生物活性实质上不能通过一个或多个靶向部分的活性而恢复。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂对靶细胞有活性，因为靶向部分补偿了实质激活所需的缺失/不足结合(例如，没有限制和/或亲合力)。在各种实施方案中，修饰的信号传导剂在进入治疗活性位点的途中实质上无活性，并且实质上对特异性靶向的细胞类型有作用，这极大地减少不希望的副作用。

在一些实施方案中，另外的信号传导剂可包括减弱或降低对一种受体(即治疗性受体)的结合或亲和力的一个或多个突变和实质上降低或消除对第二种受体的结合或活性的一个或多个突变。在此类实施方案中，这些突变可在相同或不同位置处(即，相同突变或多个突变)。在一些实施方案中，降低对一种受体的结合和/或活性的突变不同于实质上减少或消除对另一种受体的结合和/或活性的突变。在一些实施方案中，降低对一种受体的结合和/或活性的突变与实质上减少或消除对另一种受体的结合和/或活性的突变相同。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白具有修饰的信号传导剂，其具有减弱对治疗性受体的结合和/或活性的突变，因此允许更受控制的中靶治疗效果(例如，相对于野生型信号传导剂)；和实质上减少或消除对另一种受体的结合和/或活性的突变，从而减少副作用(例如，相对于野生型信号传导剂)。

在一些实施方案中，结合或活性的实质减少或消除实质上不能用靶向部分来恢复。在一些实施方案中，结合或活性的实质减少或消除可用靶向部分来恢复。在各种实施方案中，实质上减少或消除对第二受体的结合或活性也可防止由其他受体介导的有害作用。替代地或另外，实质上减少或消除对另一种受体的结合或活性造成治疗效果改善，因为减少或消除远离治疗作用位点的治疗性嵌合蛋白的螯合。例如，在一些实施方案中，这消除了对补偿其他受体处的损失的高剂量的本发明嵌合蛋白的需要。这种减少剂量的能力进一步提供了较低的副作用可能性。

在各种实施方案中，另外的修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述突变使得信号传导剂对其一种或多种受体具有降低的，实质上降低的或消除的亲和力，例如结合(例如，K_D)和/或激活(例如，当修饰的信号传导剂是其受体的激动剂时，可测量为例如K_A和/或EC₅₀)和/或抑制(例如，当修饰的信号传导剂是其受体的拮抗剂时，可测量为例如K_I和/或IC₅₀)。在各种实施方案中，对信号传导剂受体的亲和力降低允许活性的减弱(包括激动或拮抗作用)。在此类实施方案中，相对于野生型信号传导剂，修饰的信号传导剂对受体具有约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约10％-20％、约20％-40％、约50％、约40％-60％、约60％-80％、约80％-100％的亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型信号传导剂，结合亲和力至少低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、约低6倍、约低7倍、低约8倍、低约9倍、低至少约10倍、低至少约15倍、低至少约20倍、低至少约25倍、低至少约30倍、低至少约35倍、低至少约40倍、低至少约45倍、低至少约50倍、低至少约100倍、低至少约150倍、或低约10-50倍、低约50-100倍、低约100-150倍、低约150-200倍、或低200倍以上。

在其中嵌合蛋白具有对一种受体有减少的结合并对第二受体有实质上减少或消除的结合的突变的实施方案中，修饰的信号传导剂对一种受体的结合亲和力的减弱或降低小于对另一种受体的亲和力的实质性降低或消除。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对一种受体的结合亲和力的减弱或降低小于对另一种受体的亲和力的实质性降低或消除的约1％、或约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在各种实施方案中，实质性降低或消除是指结合亲和力和/或生物活性比减弱或降低更大的降低。

在各种实施方案中，例如，相对于野生型信号传导剂，另外的修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述突变使信号传导剂的内源活性降低至约75％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％、或约25％、或约20％、或约10％、或约5％、或约3％、或约1％。

在各种实施方案中，另外的修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述突变使得信号传导剂对如本文所述的细胞因子、生长因子和激素中任一种的受体具有降低的亲和力和/或生物活性。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述突变使得信号传导剂对其受体的亲和力降低，其低于靶向部分对其(他们的)受体的结合亲和力。在一些实施方案中，此结合亲和力差异是介于同一细胞上的信号传导剂/受体和靶向部分/受体之间。在一些实施方案中，此结合亲和力差异允许信号传导剂(例如突变的信号传导剂)具有局部的中靶效应并且使作为在野生型信号传导剂下观察到的副作用的基础的脱靶效应最小化。在一些实施方案中，此结合亲和力为至少约2倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约15倍、或至少约25倍、或至少约50倍、或至少约100倍、或至少约150倍。

可使用本领域中已知的方法测量受体结合活性。例如，亲和力和/或结合活性可通过Scatchard图分析和结合数据的计算机拟合(例如，Scatchard,1949)或通过在流动通过条件下的反射干扰分光光度法来评估，如由Brecht等人(1993)所述，所有这些的全部内容通过引用并入本文。

本文所述的野生型信号传导剂的氨基酸序列是本领域中熟知的。因此，在各种实施方案中，另外的修饰的信号传导剂包含与本文所述的信号传导剂的已知野生型氨基酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或在至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)。

在各种实施方案中，另外的修饰的信号传导剂包含与本文所公开的任一序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或在至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％序列同一性)。

在各种实施方案中，另外的修饰的信号传导剂包含具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸突变可独立地选自置换、***、缺失和截短。

在一些实施方案中，氨基酸突变是氨基酸置换，并且可包括如本文所述的保守和/或非保守置换。

如本文所述，另外的修饰的信号传导剂具有影响对一种或多种受体的亲和力和/或活性的突变。在各种实施方案中，存在对治疗性受体(例如，通过其介导所需治疗效应的受体(例如，激动或拮抗作用))的亲和力和/或活性的降低。在各种实施方案中，修饰的信号传导剂具有实质上降低或消除对受体(例如，不通过其介导所需治疗效应的受体(例如，由于结合的混杂性))的亲和力和/或活性的突变。任何修饰的信号传导剂的受体(例如本文所述的细胞因子、生长因子和激素中的一种)是本领域中已知的。

提供对受体的降低亲和力和/或活性(例如，激动性)的说明性突变见于WO 2013/107791(例如关于干扰素)、WO 2015/007542(例如，关于白细胞介素)和WO 2015/007903(例如，关于TNF)中，其各自的全部内容通过引用并入本文。提供对治疗性受体的降低亲和力和/或活性(例如，拮抗性)的说明性突变见于WO 2015/007520中，其全部内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂包含一个或多个突变，所述突变使得信号传导剂对I型细胞因子受体、II型细胞因子受体、趋化因子受体、肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族中的受体、TGF-β受体、免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体、和/或酪氨酸激酶超家族中的受体具有降低的亲和力和/或活性。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂的受体是I型细胞因子受体。I型细胞因子受体是本领域中已知的，包括但不限于IL2(β-亚基)、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、IL12、GM-CSF、G-CSF、LIF、CNTF的受体、以及血小板生成素(TPO)、催乳素和生长激素的受体。说明性I型细胞因子受体包括但不限于GM-CSF受体、G-CSF受体、LIF受体、CNTF受体、TPO受体、和I型IL受体。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂的受体是II型细胞因子受体。II型细胞因子受体是由异源亚基构成的多聚受体，并且是主要针对干扰素的受体。此受体家族包括但不限于干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ、IL10、IL22和组织因子的受体。说明性II型细胞因子受体包括但不限于IFN-α受体(例如IFNAR1和IFNAR2)、IFN-β受体、IFN-γ受体(例如IFNGR1和IFNGR2)、和II型IL受体。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂的受体是G蛋白偶联受体。趋化因子受体是具有七个跨膜结构的G蛋白偶联受体，并且与G蛋白偶联用于信号转导。趋化因子受体包括但不限于CC趋化因子受体、CXC趋化因子受体、CX3C趋化因子受体、和XC趋化因子受体(XCR1)。示例性趋化因子受体包括但不限于CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR3B、CXCR4、CXCR5、CSCR6、CXCR7、XCR1、和CX3CR1。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂的受体是TNFR家族成员。肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员共享富含半胱氨酸的结构域(CRD)，其是通过由围绕CXXCXXC核心基序的三个二硫键产生细长分子而形成。示例性肿瘤坏死因子受体家族成员包括：CDl 20a(TNFRSFlA)、CD 120b(TNFRSFlB)、淋巴毒素-β受体(LTBR,TNFRSF3)、CD 134(TNFRSF4)、CD40(CD40,TNFRSF5)、FAS(FAS,TNFRSF6)、TNFRSF6B(TNFRSF6B)、CD27(CD27,TNFRSF7)、CD30(TNFRSF8)、CD137(TNFRSF9)、TNFRSFlOA(TNFRSFlOA)、TNFRSFlOB、(TNFRSFlOB)、TNFRSFlOC(TNFRSFlOC)、TNFRSFlOD(TNFRSFlOD)、RANK(TNFRSFI lA)、骨保护素(TNFRSFlIB)、TNFRSF12A(TNFRSF12A)、TNFRSF13B(TNFRSF13B)、TNFRSF13C(TNFRSF13C)、TNFRSF14(TNFRSF14)、神经生长因子受体(NGFR,TNFRSF16)、TNFRSF17(TNFRSF17)、TNFRSF18(TNFRSF18)、TNFRSF19(TNFRSF19)、TNFRSF21(TNFRSF21)、和TNFRSF25(TNFRSF25)。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂的受体是TGF-β受体。TGF-β受体是单程丝氨酸/苏氨酸激酶受体。TGF-β受体包括但不限于TGFBR1、TGFBR2、和TGFBR3。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂的受体是Ig超家族受体。免疫球蛋白(Ig)超家族中的受体与免疫球蛋白共享结构同源性。Ig超家族中的受体包括但不限于白细胞介素-1受体、CSF-1R、PDGFR(例如PDGFRA和PDGFRB)、和SCFR。

在各种实施方案中，另外的信号传导剂的受体是酪氨酸激酶超家族受体。酪氨酸激酶超家族中的受体是本领域中熟知的。约有58种已知的受体酪氨酸激酶(RTK)，分为20个亚家族。酪氨酸激酶超家族中的受体包括但不限于FGF受体及其各种同种型，如FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、和FGFR5。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是干扰素β。在此类实施方案中，修饰的干扰素β试剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的干扰素β试剂对IFN-α/β受体(IFNAR)，即IFNAR1和/或IFNAR2链具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是另一种干扰素γ。在此类实施方案中，修饰的干扰素γ试剂对干扰素-γ受体(IFNGR)，即干扰素-γ受体1和/或干扰素-γ受体2亚基也具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的干扰素γ试剂对干扰素-γ受体，即干扰素-γ受体1和/或干扰素-γ受体2亚基具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是一种有效的生长因子，其在生理性和病理性血管生成中起主要作用，调节血管通透性并且可充当表达VEGF受体的细胞上的生长因子。另外的功能尤其包括刺激巨噬细胞谱系和内皮细胞中的细胞迁移。存在生长因子的VEGF家族的几个成员，以及至少三种受体(VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)。VEGF家族的成员可以结合并激活多于一种VEGFR类型。例如，VEGF-A结合VEGFR-1和-2，而VEGF-C可结合VEGFR-2和-3。VEGFR-1和-2激活调节血管生成，而VEGFR-3激活与***生成有关。主要的促血管生成信号是由VEGFR-2的激活而产生。据报道，VEGFR-1激活可能与血管生成中的负面作用有关。还据报道，VEGFR-1信号传导对于体内肿瘤经由骨髓衍生的VEGFR-1阳性细胞的进展(促成在骨中形成转移前微环境)很重要。已经开发了几种基于VEGF-A定向/中和治疗性抗体的疗法，主要用于治疗依赖于血管生成的各种人类肿瘤。但这些并非没有副作用。考虑到这些作为一般的非细胞/组织特异性VEGF/VEGFR相互作用抑制剂起作用，这可能不足为奇。因此，期望将VEGF(例如，VEGF-A)/VEGFR-2抑制限制于特定的靶细胞(例如，肿瘤脉管***内皮细胞)。

在一些实施方案中，VEGF是VEGF-A、VEGF-B、VEFG-C、VEGF-D、或VEGF-E及其同种型，包括VEGF-A的各种同种型，如VEGF₁₂₁、VEGF₁₂₁b、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₆₅b、VEGF₁₈₉、和VEGF₂₀₆。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)和/或VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)和/或VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂对VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有降低的亲和力和/或活性和/或对VEGFR-1(Flt-1)具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。这样的实施方案可用于例如伤口愈合方法或治疗缺血相关疾病(不希望受理论束缚，由VEGFR-2对内皮细胞功能和血管生成的作用所介导)。在各种实施方案中，避免了与VEGFR-1(Flt-1)的结合，其与癌症和促炎活性相关。在各种实施方案中，VEGFR-1(Flt-1)作为诱饵受体，因此实质上降低或消除对此受体的亲和力和/或活性，避免了治疗剂的螯合。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂对VEGFR-1(Flt-1)具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性和/或对VEGFR-2(KDR/Flk-1)具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，VEGF是VEGF-C或VEGF-D。在此类实施方案中，修饰的信号传导剂对VEGFR-3具有降低的亲和力和/或活性。替代地，修饰的信号传导剂对VEGFR-3具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

促血管生成疗法在各种疾病(例如，缺血性心脏病、出血等)中也很重要，并且包括基于VEGF的疗法。VEGFR-2的激活是促血管生成的(作用于内皮细胞)。VEFGR-1的激活可引起对炎性细胞(包括例如巨噬细胞)迁移的刺激，并导致炎症相关的血管通透性。VEFGR-1的激活还可促进骨髓相关的肿瘤微环境形成。因此，在这种情况下，期望对VEGFR-2的激活有选择性的基于VEGF的治疗剂。另外，期望细胞特异性靶向，例如靶向内皮细胞。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂对VEGFR-2具有降低的亲和力和/或活性(例如，拮抗性)和/或对VEGFR-1具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。当经由与肿瘤内皮细胞标记物(例如，PSMA和其他物质)结合的靶向部分靶向肿瘤血管***内皮细胞时，这种构建体抑制VEGFR-2在这种标记物阳性细胞上的特异性激活，同时不激活在途中或在靶细胞上的VEGFR-1(如果活性被消除的话)，从而例如消除对炎症反应的诱导。与VEGF-A中和疗法相比，这将为许多肿瘤类型提供更具选择性和安全性的抗血管生成疗法。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂对VEGFR-2具有降低的亲和力和/或活性(例如，激动性)和/或对VEGFR-1具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。通过靶向血管内皮细胞，在一些实施方案中，此类构建体促进血管生成，而不会引起VEGFR-1相关的炎症反应诱导。因此，这种构建体将具有靶向促血管生成作用，并且实质上降低由VEGFR-2以及VEGR-1的全身激活所引起的副作用的风险。

在一个说明性实施方案中，修饰的信号传导剂是VEGF₁₆₅，其具有SEQ ID NO：237的氨基酸序列。

在另一说明性实施方案中，另一修饰的信号传导剂是VEGF_165b，其具有SEQ ID NO：288的氨基酸序列。

在这些实施方案中，修饰的信号传导剂在氨基酸I83处具有突变(例如，I83处的置换突变，例如，I83K、I83R或I83H)。不希望受理论约束，据信这种突变可造成受体结合亲和力的降低。参见，例如，美国专利号9,078,860，其全部内容通过引用整体并入文中。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是TNF-α。TNF是具有许多不同功能的多效细胞因子，包括细胞生长、分化、细胞凋亡、肿瘤发生、病毒复制、自身免疫、免疫细胞功能和运输、炎症、和败血性休克的调节。其结合至靶细胞上的两种不同膜受体：TNFR1(p55)和TNFR2(p75)。TNFR1表现出非常广泛的表达模式，而TNFR2优先表达于淋巴细胞、Treg、内皮细胞、某些神经元、小胶质细胞、心肌细胞和间充质干细胞的某些群体上。极其不同的生物途径响应于受体激活而被激活，但是也存在一些重叠。作为一般规则，不希望受理论约束，TNFR1信号传导与细胞凋亡(细胞死亡)的诱导相关，而TNFR2信号传导与细胞存活信号的激活(例如，NFkB途径的激活)相关。施用TNF具有全身毒性，且这主要是由于TNFR1的参与。然而，应注意的是，TNFR2的激活也与广泛的活性有关，并且与TNFR1一样，在开发基于TNF的治疗剂的背景下，对TNF靶向和活性的控制很重要。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。TNFR1在大多数组织中表达，并且参与细胞死亡信号传导，而相反，TNFR2参与细胞存活信号传导。因此，在涉及治疗癌症的方法的实施方案中，修饰的信号传导剂对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性和/或对TNFR2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在这些实施方案中，嵌合蛋白可靶向需要细胞凋亡的细胞，例如肿瘤细胞或肿瘤血管***内皮细胞。在涉及促进细胞存活的方法的实施方案中，例如，在用于治疗神经变性疾病的神经发生中，修饰的信号传导剂对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性和/或对TNFR1具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。换句话说，在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含允许有利于死亡或存活信号的修饰的TNF-α试剂。

在一些实施方案中，嵌合蛋白具有修饰的TNF，其对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性和/或对TNFR2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，与野生型TNF和/或仅携带使得对TNFR1的亲和力和/或活性降低的突变的嵌合体相比，这种嵌合体是更有效的细胞凋亡诱导剂。在一些实施方案中，这种嵌合体可用于诱导肿瘤细胞死亡或肿瘤脉管***内皮细胞死亡(例如，在癌症的治疗中)。而且，在一些实施方案中，例如，这些嵌合体避免或减少经由TNFR2激活T_reg细胞，因此进一步支持TNFR1介导的体内抗肿瘤活性。

在一些实施方案中，嵌合蛋白具有修饰的TNF，其对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性和/或对TNFR1具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，这种嵌合体在一些细胞类型中是更有效的细胞存活激活剂，其可以是各种疾病环境下的特定治疗目标，包括但不限于刺激神经发生。此外，这种有利于TNFR2的嵌合体也适用于治疗自身免疫疾病(例如，克罗恩氏病、糖尿病、MS、结肠炎等以及本文所述的许多其他疾病)。在一些实施方案中，嵌合体靶向自身反应性T细胞。在一些实施方案中，嵌合体促进T_reg细胞激活和细胞毒性T细胞的间接抑制。

在一些实施方案中，嵌合体引起自身反应性T细胞的死亡，例如通过激活TNFR2和/或避免TNFR1(例如，对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性和/或对TNFR1具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性的修饰的TNF)。不希望受理论约束，这些自身反应性T细胞的细胞凋亡/存活信号例如通过NFkB途径活性/信号传导变化而改变。

在一些实施方案中，基于TNFR2的嵌合体在疾病中具有另外的治疗应用，包括各种自身免疫疾病、心脏病、脱髓鞘和神经变性疾病、以及感染性疾病等。

在一个实施方案中，野生型TNF-α具有SEQ ID NO：239的氨基酸序列。

在这样的实施方案中，修饰的TNF-α试剂在一个或多个氨基酸位置29、31、32、84、85、86、87、88、89、145、146和147处具有突变，其产生具有降低的受体结合亲和力的修饰的TNF-α。参见，例如，美国专利号7,993,636，其全部内容通过引用并入文中。

在一些实施方案中，修饰的人TNF-α部分在一个或多个氨基酸位置R32、N34、Q67、H73、L75、T77、S86、Y87、V91、I97、T105、P106、A109、P113、Y115、E127、N137、D143和A145处具有突变，如例如在WO/2015/007903中所述，其全部内容通过引用并入本文(根据人类TNF序列编号，Genbank登录号BAG70306，版本BAG70306.1Gl:197692685)。在一些实施方案中，修饰的人TNF-α部分具有选自R32G、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、T77A、S86G、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、V91G、V91A、I97A、I97Q、I97S、T105G、P106G、A109Y、P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G和A145T的置换突变。在一个实施方案中，人TNF-α部分具有选自Y87Q、Y87L、Y87A和Y87F的突变。在另一实施方案中，人TNF-α部分具有选自I97A、I97Q和I97S的突变。在又一实施方案中，人TNF-α部分具有选自Y115A和Y115G的突变。

在一些实施方案中，修饰的TNF-α试剂具有选自N39Y、S147Y和Y87H的一个或多个突变，如WO2008/124086中所述，其全部内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是TNF-β。TNF-β可与LT-β(LT-α1β2)形成同三聚体或异三聚体。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对TNFR1和/或TNFR2和/或疱疹病毒进入介质(HEVM)和/或LT-βR具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，野生型TNF-β具有SEQ ID NO：240的氨基酸序列。

在此类实施方案中，修饰的TNF-β试剂可包含在位置106-113处的一个或多个氨基酸的突变，其产生对TNFR2具有降低的受体结合亲和力和/或活性的修饰的TNF-β。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂在氨基酸位置106-113处具有一个或多个置换突变。在说明性实施方案中，置换突变选自Q107E、Q107D、S106E、S106D、Q107R、Q107N、Q107E/S106E、Q107E/S106D、Q107D/S106E、和Q107D/S106D。在另一实施方案中，修饰的信号传导剂在位置106-113处具有约1至约3个氨基酸的***。

在一些实施方案中，另外的修饰的试剂是TNF家族成员(例如，TNF-α、TNF-β)，其可以是如WO 2015/007903中所述的单链三聚体形式，其全部内容通过引用并入。

在一些实施方案中，修饰的试剂是TNF家族成员(例如，TNF-α、TNF-β)，其对TNFR1具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变造成的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，其全部内容通过引用并入本文)。在这些实施方案中，修饰的试剂是TNF家族成员(例如，TNF-α、TNF-β)，其任选地还对TNFR2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的试剂是TNF家族成员(例如，TNF-α、TNF-β)，其对TNFR2具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变导致的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，其全部内容通过引用并入本文)。在这些实施方案中，修饰的试剂是TNF家族成员(例如，TNF-α、TNF-β)，其任选地还对TNFR1具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。此类实施方案的构建体可用于例如以细胞特异性方式抑制TNF应答的方法。在一些实施方案中，拮抗性TNF家族成员(例如，TNF-α、TNF-β)是单链三聚体形式，如WO2015/007903中所述。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是TRAIL。在一些实施方案中，修饰的TRAIL试剂对DR4(TRAIL-RI)和/或DR5(TRAIL-RII)和/或DcR1和/或DcR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的TRAIL试剂对DR4(TRAIL-RI)和/或DR5(TRAIL-RII)和/或DcR1和/或DcR2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，野生型TRAIL具有SEQ ID NO：241的氨基酸序列。

在此类实施方案中，修饰的TRAIL试剂可在氨基酸位置T127-R132、E144-R149、E155-H161、Y189-Y209、T214-1220、K224-A226、W231、E236-L239、E249-K251、T261-H264和H270-E271处包含突变(根据人类序列编号，Genbank登录号NP_003801，版本10NP_003801.1，Gl:4507593；参见上文)。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是TGFα。在此类实施方案中，修饰的TGFα试剂对表皮生长因子受体(EGFR)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的TGFα试剂对表皮生长因子受体(EGFR)具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是TGFβ。在此类实施方案中，修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂任选地对TGFBR3具有降低的或实质上降低或消除的亲和力和/或活性，不希望受理论约束，其可充当TGF-β受体的配体储库。在一些实施方案中，与TGFBR2相比，TGFβ可偏好TGFBR1，或与TGFBR1相比，偏好TGFBR2。类似地，不希望受理论约束，LAP可充当TGF-β受体的配体储库。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对TGFBR1和/或TGFBR2具有降低的亲和力和/或活性和/或对延迟相关肽(LAP)具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，此类嵌合体可用于Camurati-Engelmann病或与不适当的TGFβ信号传导相关的其他疾病中。

在一些实施方案中，另外的修饰的试剂是TGF家族成员(例如，TGFα、TGFβ)，其对TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3中的一种或多种具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变造成的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，其全部内容通过引用并入本文)。在这些实施方案中，修饰的试剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，其任选地对TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3中的一种或多种也具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一些实施方案中，另外的修饰的试剂是TGF家族成员(例如，TGFα、TGFβ)，其对TGFBR1和/或TGFBR2具有降低的亲和力和/或活性，即拮抗活性(例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变造成的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，其全部内容通过引用并入本文)。在这些实施方案中，修饰的试剂是TGF家族成员(例如TGFα、TGFβ)，其任选地对TGFBR3也具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-1。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂是IL-1α或IL-1β。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-1R1和/或IL-1RAcP具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-1R1和/或IL-1RAcP具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-1R2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-1R2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。例如，在一些实施方案中，本发明的修饰的IL-1试剂避免了对IL-1R2的相互作用，因此实质上降低了其作为治疗剂的诱饵和/或汇集的功能。

在一个实施方案中，野生型IL-1β具有SEQ ID NO：242的氨基酸序列。

IL1是促炎细胞因子和重要的免疫***调节剂。其是CD4T细胞应答的有效激活剂，增加Th17细胞的比例以及产生IFN-γ和IL-4的细胞的扩增。IL-1也是CD8⁺T细胞的有效调节剂，增加抗原特异性CD8⁺T细胞扩增、分化、向外周和记忆的迁移。IL-1受体包含IL-1R1和IL-1R2。与IL-1R1结合并通过IL-1R1信号传导构成了IL-1介导其许多生物(和病理)活性的机制。IL1-R2可充当诱饵受体，从而降低IL-1通过IL-1R1对相互作用和信号传导的可用性。

在一些实施方案中，修饰的IL-1对IL-1R1具有降低的亲和力和/或活性(例如，激动活性)。在一些实施方案中，修饰的IL-1对IL-1R2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，存在可恢复的IL-1/IL-1R1信号传导，并且防止治疗性嵌合体在IL-R2处的损失并因此减少所需的IL-1剂量(例如，相对于野生型或仅携带针对IL-R1的衰减突变的嵌合体)。此类构建体可用于例如治疗癌症的方法中，包括例如刺激免疫***以产生抗癌反应。

在一些实施方案中，修饰的IL-1对IL-1R1具有降低的亲和力和/或活性(例如，拮抗活性，例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变造成的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，其全部内容通过引用并入本文)。在一些实施方案中，修饰的IL-1对IL-1R2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在此类实施方案中，IL-1/IL-1R1信号传导不可恢复并且防止治疗性嵌合体在IL-R2处的损失并因此减少所需的IL-1剂量(例如，相对于野生型或仅携带针对IL-R1的衰减突变的嵌合体)。此类构建体可用于例如治疗自身免疫疾病的方法中，包括例如抑制免疫***。

在此类实施方案中，修饰的信号传导剂具有氨基酸52-54的缺失，由此产生修饰的人IL-1β，其对I型IL-1R具有降低的结合亲和力并具有降低的生物活性。参见，例如，WO1994/000491，其全部内容通过引用并入文中。在一些实施方案中，修饰的人IL-1β具有一个或多个选自A117G/P118G、R120X、L122A、T125G/L126G、R127G、Q130X、Q131G、K132A、S137G/Q138Y、L145G、H146X、L145A/L147A、Q148X、Q148G/Q150G、Q150G/D151A、M152G、F162A、F162A/Q164E、F166A、Q164E/E167K、N169G/D170G、I172A、V174A、K208E、K209X、K209A/K210A、K219X、E221X、E221S/N224A、N224S/K225S、E244K、N245Q的置换突变(其中X可以是氨基酸的任何变化，例如，非保守变化)，其表现出对IL-1R减少的结合，例如，如WO2015/007542和WO/2015/007536中所述，其全部内容通过引用并入本文(根据人IL-1β序列编号，Genbank登录号NP_000567，版本NP-000567.1，Gl:10835145)。在一些实施方案中，修饰的人IL-1β可具有选自R120A、R120G、Q130A、Q130W、H146A、H146G、H146E、H146N、H146R、Q148E、Q148G、Q148L、K209A、K209D、K219S、K219Q、E221S和E221K的一个或多个突变。在一个实施方案中，修饰的人IL-1β包含突变Q131G和Q148G。在一个实施方案中，修饰的人IL-1β包含突变Q148G和K208E。在一个实施方案中，修饰的人IL-1β包含突变R120G和Q131G。在一个实施方案中，修饰的人IL-1β包含突变R120G和H146G。在一个实施方案中，修饰的人IL-1β包含突变R120G和K208E。在一个实施方案中，修饰的人IL-1β包含突变R120G、F162A和Q164E。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-2。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-2Rα和/或IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-2Rα具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。此类实施方案可与癌症的治疗相关，例如当修饰的IL-2对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有激动作用时。例如，本发明的构建体可有利于CD8⁺T细胞的减弱激活(其可提供抗肿瘤作用)，所述CD8⁺T细胞具有IL2受体β和γ；并且不利于T_regs(其可提供免疫抑制，促肿瘤作用)，所述T_regs具有IL2受体α、β和γ。此外，在一些实施方案中，相对于IL-2Rα，偏好IL-2Rβ和/或IL-2Rγ避免了IL-2副作用，如肺水肿。并且，基于IL-2的嵌合体适用于治疗自身免疫疾病，例如当修饰的IL-2对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有拮抗作用时(例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变造成的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，其全部内容通过引用并入本文)。例如，本发明的构建体可有利于CD8⁺T细胞的减弱抑制(且因此抑制免疫应答)，所述CD8⁺T细胞具有IL2受体β和γ；并且不利于具有IL2受体α、β和γ的T_regs。或者，在一些实施方案中，携带IL-2的嵌合体有利于T_regs的激活，因此有利于免疫抑制，并且不利于CD8⁺T细胞的激活。例如，这些构建体可用于治疗将受益于免疫抑制的一种或多种疾病，例如自身免疫疾病。

在一些实施方案中，嵌合蛋白具有针对CD8⁺T细胞的本文所述的靶向部分以及对IL-2Rβ和/或IL-2Rγ具有降低的亲和力和/或活性和/或对IL-2Rα具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性的修饰的IL-2试剂。在一些实施方案中，这些构建体提供靶向的CD8⁺T细胞活性，并且通常对T_reg细胞无活性(或具有实质上降低的活性)。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，此类构建体具有增强的免疫刺激效应(例如，不希望受理论约束，不通过刺激Treg)，同时消除或降低与IL-2相关的全身毒性。

在一个实施方案中，野生型IL-2具有SEQ ID NO：243的氨基酸序列。

在此类实施方案中，修饰的IL-2试剂在氨基酸L72(L72G、L72A、L72S、L72T、L72Q、L72E、L72N、L72D、L72R或L72K)、F42(F42A、F42G、F42S、F42T、F42Q、F42E、F42N、F42D、F42R或F42K)和Y45(Y45A、Y45G、Y45S、Y45T、Y45Q、Y45E、Y45N、Y45D、Y45R或Y45K)处具有一个或多个突变。不希望受理论约束，据信与野生型IL-2相比，这些修饰的IL-2试剂对高亲和力IL-2受体具有降低的亲和力并且保持对中等亲和力IL-2受体的亲和力。参见，例如，美国专利公布号2012/0244112，其全部内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-3。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-3受体具有降低的亲和力和/或活性，所述IL-3受体是具有与共同β(βc或CD131)亚基配对的独特α链的异二聚体。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-3受体具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性，所述IL-3受体是具有与共同β(βc或CD131)亚基配对的独特α链的异二聚体。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-4。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对1型和/或2型IL-4受体具有降低的亲和力和/或活性。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对1型和/或2型IL-4受体具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。1型IL-4受体是由具有共同γ链的IL-4Rα亚基构成，并且特异性结合IL-4。2型IL-4受体包括与称为IL-13Rα1的不同亚基结合的IL-4Rα亚基。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对2型IL-4受体具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，野生型IL-4具有SEQ ID NO：244的氨基酸序列。

在此类实施方案中，修饰的IL-4试剂在氨基酸R121(R121A、R121D、R121E、R121F、R121H、R121I、R121K、R121N、R121P、R121T、R121W)、E122(E122F)、Y124(Y124A、Y124Q、Y124R、Y124S、Y124T)和S125(S125A)处具有一个或多个突变。不希望受理论约束，据信这些修饰的IL-4试剂保持由I型受体介导的活性，但显著降低由其他受体介导的生物活性。参见，例如，美国专利号6,433,157，其全部内容通过引用并入本文。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-6。IL-6通过细胞表面I型细胞因子受体复合物发出信号，所述复合物包括结合配体的IL-6R链(CD126)和信号转导组分gp130。IL-6还可与可溶形式的IL-6R(sIL-6R)结合，sIL-6R是IL-6R的细胞外部分。sIL-6R/IL-6复合物可参与神经突向外生长和神经元的存活，且因此可通过髓鞘再生在神经再生中起重要作用。因此，在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-6R/gp130和/或sIL-6R具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-6R/gp130和/或sIL-6R具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，野生型IL-6具有SEQ ID NO：245的氨基酸序列。

在此类实施方案中，修饰的信号传导剂在氨基酸58、160、163、171或177处具有一个或多个突变。不希望受理论约束，据信这些修饰的IL-6试剂表现出对IL-6Rα降低的结合亲和力和降低的生物活性。参见，例如，WO 97/10338，其全部内容通过引用并入文中。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-10。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-10受体-1和IL-10受体-2具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-10受体-1和IL-10受体-2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-11。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-11Rα和/或IL-11Rβ和/或gp130具有降低的亲和力和/或活性。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-11Rα和/或IL-11Rβ和/或gp130具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-12。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2具有降低的亲和力和/或活性。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-13。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-4受体(IL-4Rα)和/或IL-13Rα1具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-4受体(IL-4Rα)和/或IL-13Rα1具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，野生型IL-13具有SEQ ID NO：246的氨基酸序列。

在此类实施方案中，修饰的IL-13试剂在氨基酸13、16、17、66、69、99、102、104、105、106、107、108、109、112、113和114处具有一个或多个突变。不希望受理论约束，据信这些修饰的IL-13试剂表现出降低的生物活性。参见，例如，WO 2002/018422，其全部内容通过引用并入文中。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-18。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-18Rα和/或IL-18Rβ具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-18Rα和/或IL-18Rβ具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IL-18RαII型具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性，IL-18RαII型是缺乏信号传导所需的TIR结构域的IL-18Rα的同种型。

在一个实施方案中，野生型IL-18具有SEQ ID NO：247的氨基酸序列。

在此类实施方案中，修饰的IL-18试剂可在选自Y37-K44、R49-Q54、D59-R63、E67-C74、R80、M87-A97、N127-K129、Q139-M149、K165-K171、R183和Q190-N191的氨基酸或氨基酸区域中包含一个或多个突变，如WO/2015/007542中所述，其全部内容通过引用并入本文(根据人IL-18序列编号，Genbank登录号AAV38697，版本AAV38697.1，Gl:54696650)。

在一个实施方案中，另外的修饰的信号传导剂是IL-33。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对ST-2受体和IL-1RAcP具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对ST-2受体和IL-1RAcP具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。

在一个实施方案中，野生型IL-33具有SEQ ID NO：248的氨基酸序列。

在这样的实施方案中，修饰的IL-33试剂可在选自I113-Y122、S127-E139、E144-D157、Y163-M183、E200、Q215、L220-C227和T260-E269的氨基酸或氨基酸区域中包含一个或多个突变，如WO/2015/007542中所述，其全部内容通过引用并入本文(根据人类序列编号，Genbank登录号NP_254274，版本NP_254274.1，Gl:15559209)。

在一个实施方案中，修饰的信号传导剂是表皮生长因子(EGF)。EGF是有效生长因子家族的成员。成员包括EGF、HB-EGF和其他如TGFα、双调蛋白、神经调节蛋白、表皮调节蛋白、β细胞素。EGF家族受体包括EGFR(ErbB1)、ErbB2、ErbB3和ErbB4。这些可用作同二聚体和/或异二聚体受体亚型。不同的EGF家族成员对各种受体亚型表现出差异选择性。例如，EGF与ErbB1/ErbB1、ErbB1/ErbB2、ErbB4/ErbB2和一些其他异二聚体亚型结合。HB-EGF具有相似的模式，但其也与ErbB4/4结合。EGF(EGF样)生长因子信号传导的正调节或负调节受到相当的治疗关注。例如，EGFR信号传导的抑制在各种癌症的治疗中受到关注，其中EGFR信号传导构成主要的生长促进信号。或者，EGFR信号传导的刺激受到治疗关注，例如，促进伤口愈合(急性和慢性)，口腔粘膜炎(各种癌症疗法的主要副作用，包括但不限于放射疗法)。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂对ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4具有降低的亲和力和/或活性。此类实施方案可用于例如治疗伤口的方法中。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂结合至一种或多种ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4并拮抗受体的活性。在此类实施方案中，修饰的信号传导剂对ErbB1、ErbB2、ErbB3和/或ErbB4具有降低的亲和力和/或活性，这允许受体的活性以减弱方式被拮抗。此类实施方案可用于例如癌症的治疗中。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂对ErbB1具有降低的亲和力和/或活性。ErbB1是激酶抑制剂的治疗靶标-大多数具有副作用，因为他们不是非常有选择性的(例如，吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、布利沙替尼和依替替尼)。在一些实施方案中，减弱的拮抗性ErbB1信号传导比靶向EGF受体的其他试剂更具靶向性并且具有更少的副作用。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂对ErbB1具有降低的亲和力和/或活性(例如，拮抗性，例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变造成的拮抗活性，参见例如WO2015/007520，其全部内容通过引用并入本文)和/或对ErbB4或可与之相互作用的其他亚型具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。通过经由靶向部分的特异性靶向，将实现ErbB1/ErbB1受体激活的细胞选择性抑制(拮抗作用，例如，天然拮抗活性或由一个或多个突变造成的拮抗活性，参见例如WO 2015/007520，其全部内容通过引用并入本文中)-同时不使可能与同抑制相关的副作用有关的其他受体亚型参与。因此，与抑制体内所有细胞类型中EGFR活性的EGFR激酶抑制剂相反，这种构建体将提供细胞选择性(例如，由于受体扩增，过表达等而具有激活的EGFR信号传导的肿瘤细胞)抗EGFR(ErbB1)药物作用，伴有减少的副作用。

在一些实施方案中，另外的修饰的信号传导剂对ErbB4和/或可能与之相互作用的其他亚型具有降低的亲和力和/或活性(例如，激动性)。通过经由靶向部分靶向特定靶细胞，实现ErbB1信号传导的选择性激活(例如，上皮细胞)。在一些实施方案中，这种构建体可用于治疗伤口(促进伤口愈合)，伴有减少的副作用，特别是用于治疗慢性病状和除局部应用治疗之外的应用(例如，全身性伤口愈合)。

在一个实施方案中，修饰的信号传导剂是胰岛素或胰岛素类似物。在一些实施方案中，修饰的胰岛素或胰岛素类似物对胰岛素受体和/或IGF1或IGF2受体具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的胰岛素或胰岛素类似物对胰岛素受体和/或IGF1或IGF2受体具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。对胰岛素受体的减弱反应允许对糖尿病、肥胖症、代谢紊乱等的控制，同时定向远离IGF1或IGF2受体避免了原癌效应。

在一个实施方案中，修饰的信号传导剂是***-I或***-II(IGF-1或IGF-2)。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂是IGF-1。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对胰岛素受体和/或IGF1受体具有降低的亲和力和/或活性。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂可结合至IGF1受体并拮抗受体的活性。在这样的实施方案中，修饰的信号传导剂对IGF1受体具有降低的亲和力和/或活性，这允许受体的活性以减弱方式被拮抗。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对胰岛素受体和/或IGF1受体具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的信号传导剂对IGF2受体具有降低的亲和力和/或活性，这允许受体的活性以减弱方式被拮抗。在一个实施方案中，修饰的信号传导剂对胰岛素受体具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性，因此不干扰胰岛素信号传导。在各种实施方案中，这适用于癌症治疗。在各种实施方案中，本发明的试剂可防止IR同种型A对癌症治疗产生抗性。

在一个实施方案中，修饰的信号传导剂是EPO。在各种实施方案中，相对于野生型EPO或本文所述的其他基于EPO的试剂，修饰的EPO试剂对EPO受体(EPOR)受体和/或肝配蛋白受体(EphR)具有降低的亲和力和/或活性。在一些实施方案中，修饰的EPO试剂对EPO受体(EPOR)受体和/或Eph受体(EphR)具有实质上降低或消除的亲和力和/或活性。说明性EPO受体包括但不限于EPOR同二聚体或EPOR/CD131异二聚体。作为EPO受体还包括β-共同受体(βcR)。说明性Eph受体包括但不限于EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPHA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、和EPHB6。在一些实施方案中，修饰的EPO蛋白包含一个或多个突变，所述突变导致EPO蛋白对包括一种或多种不同EPO受体或Eph受体的受体具有降低的亲和力(例如，异二聚体、异三聚体等，包括但不限于：EPOR-EPHB4、EPOR-βcR-EPOR)。还提供了EP专利公布号2492355的受体，其全部内容通过引用并入本文，包括但不限于NEPOR。

在一个实施方案中，人EPO具有SEQ ID NO：249的氨基酸序列，其中信号肽包含前27个氨基酸。

在一个实施方案中，人EPO蛋白是成熟形式的EPO(信号肽被切除)，其是具有SEQID NO：250的序列的166个氨基酸残基的糖蛋白。

预测人EPO蛋白的结构包含四螺旋束，其包括螺旋A、B、C和D。在各种实施方案中，修饰的EPO蛋白包含位于对于生物活性来说重要的EPO蛋白的四个区域中的一个或多个突变，即氨基酸残基10-20、44-51、96-108和142-156。在一些实施方案中，所述一个或多个突变位于残基11-15、44-51、100-108和147-151处。这些残基定位于螺旋A(Val11、Arg14和Tyr15)、螺旋C(Ser100、Arg103、Ser104和Leu108)、螺旋D(Asn147、Arg150、Gly151和Leu155)和A/B连接环(残基42-51)。在一些实施方案中，修饰的EPO蛋白包含介于氨基酸41-52与氨基酸147、150、151和155之间的残基突变。不希望受理论约束，据信这些残基的突变对受体结合和体外生物活性都具有实质性影响。在一些实施方案中，修饰的EPO蛋白包含在残基11、14、15、100、103、104和108处的突变。不希望受理论约束，据信这些残基的突变对受体结合活性具有适度影响并且对体外生物活性具有更大影响。说明性置换包括但不限于Val11Ser、Arg14Ala、Arg14Gln、Tyr15lle、Pro42Asn、Thr44lle、Lys45Asp、Val46Ala、Tyr51Phe、Ser100Glu、Ser100Thr、Arg103Ala、Ser104lle、Ser104Ala、Leu108Lys、Asn147Lys、Arg150Ala、Gly151Ala、和Leu155Ala中的一种或多种。

在一些实施方案中，修饰的EPO蛋白包含影响生物活性且不结合的突变，例如，Eliot等人Mapping of the Active Site ofRecombinant Human Erythropoietin 1997年1月15日；Blood:89(2)中所列的那些，其全部内容通过引用并入文中。

在一些实施方案中，修饰的EPO蛋白包含一个或多个涉及EPO蛋白表面残基的突变，所述残基参与受体接触。不希望受理论约束，据信这些表面残基的突变不太可能影响蛋白质折叠，从而保留一些生物活性。可以突变的说明性表面残基包括但不限于残基147和150。在说明性实施方案中，突变是置换，包括N147A、N147K、R150A、和R150E中的一种或多种。

在一些实施方案中，修饰的EPO蛋白在残基N59、E62、L67和L70处包含一个或多个突变，以及影响二硫键形成的一个或多个突变。不希望受理论约束，据信这些突变影响折叠和/或经预测处于隐藏位置中并因此间接影响生物活性。

在一个实施方案中，修饰的EPO蛋白包含K20E置换，其显著减少受体结合。参见Elliott等人,(1997)Blood,89:493-502，其全部内容通过引用并入文中。

可掺入本发明的嵌合EPO蛋白中的另外的EPO突变公开于例如以下文献中：Elliott等人,(1997)Blood,89:493-502，其全部内容通过引用并入文中，以及Taylor等人,(2010)PEDS,23(4):251-260，其全部内容通过引用并入文中。

在各种实施方案中，信号传导剂是毒素或毒性酶。在一些实施方案中，毒素或毒性酶源自植物和细菌。说明性毒素或毒性酶包括但不限于白喉毒素、假单胞菌毒素、炭疽毒素、核糖体失活蛋白(RIP)如蓖麻毒蛋白和皂草素、莫迪素、相思豆毒蛋白、核糖体失活蛋白、和刺草抗病毒蛋白。另外的毒素包括Mathew等人,(2009)Cancer Sci100(8):1359-65中公开的那些，其全部公开内容通过引用并入文中。在此类实施方案中，本发明的嵌合蛋白可用于以细胞类型特异性方式诱导细胞死亡。在此类实施方案中，毒素可被修饰，例如突变，以降低毒素的亲和力和/或活性用以实现减弱作用，如本文关于其他信号传导剂所述。

接头

在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白任选地包含一个或多个接头。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含连接靶向部分与信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)的接头。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)内的接头。

在一些实施方案中，提供了编码作为单核苷酸序列连接到本文所述的任何接头上的本发明嵌合蛋白的载体，并且可用于制备此类嵌合蛋白。

在一些实施方案中，接头长度允许靶向部分和信号传导剂(例如，修饰的IFN-γ)与其受体的有效结合。例如，在一些实施方案中，接头长度允许靶向部分中的一个和信号传导剂与同一细胞上的受体的有效结合。

在一些实施方案中，接头长度至少等于靶向部分中的一个和信号传导剂的结合位点与同一细胞上的受体之间的最小距离。在一些实施方案中，接头长度为靶向部分中的一个和信号传导剂的结合位点与同一细胞上的受体之间的最小距离的至少两倍、或三倍、或四倍、或五倍、或十倍、或二十倍、或25倍、或50倍、或一百倍、或更多倍。

如本文所述，接头长度允许靶向部分中的一个和信号传导剂与同一细胞上的受体的有效结合，所述结合是顺序的，例如，靶向部分/受体结合在信号传导剂/受体结合之前。

在一些实施方案中，在单个嵌合体中存在两个接头，每个接头将信号传导剂连接至靶向部分。在各种实施方案中，接头长度允许形成具有疾病细胞和效应细胞的位点，而没有空间位阻，这将阻止任一细胞的调节。

本发明考虑使用多种接头序列。在各种实施方案中，接头可衍生自天然存在的多结构域蛋白或者是经验接头，如例如Chichili等人,(2013),Protein Sci.22(2):153-167,Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369中所述，其全部内容通过引用并入文中。在一些实施方案中，接头可使用接头设计数据库和计算机程序来设计，如Chen等人,(2013),Adv Drug Deliv Rev.65(10):1357-1369和Crasto等人,(2000),ProteinEng.13(5):309-312中所述的那些手段，其全部内容通过引用并入文中。在各种实施方案中，接头可以是功能性的。例如但不限于，接头可用以改善本发明嵌合蛋白的折叠和/或稳定性，改善表达，改善药代动力学和/或改善生物活性。

在一些实施方案中，接头是多肽。在一些实施方案中，接头长度小于约100个氨基酸。例如，接头长度可小于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。在一些实施方案中，接头是多肽。在一个实施方案中，接头长度大于约100个氨基酸。例如，接头长度可大于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。在一些实施方案中，接头是柔性的。在另一实施方案中，接头是刚性的。

在涉及具有两个或更多个靶向部分的嵌合蛋白的一些实施方案中，接头将两个靶向部分彼此连接，并且此接头长度较短并且接头将靶向部分与信号传导剂连接，此接头比连接两个靶向部分的接头更长。例如，连接两个靶向部分的接头与连接靶向部分和信号传导剂的接头之间的氨基酸长度的差异可以是约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。

在各种实施方案中，接头实质上是由甘氨酸和丝氨酸残基构成(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％甘氨酸和丝氨酸)。例如，在一些实施方案中，接头是(Gly4Ser)n，其中n为约1至约8，例如1、2、3、4、5、6、7或8。在一个实施方案中，接头序列是GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:251)。另外的说明性接头包括但不限于具有以下序列的接头：LE、GGGGS(SEQ ID NO:252)、(GGGGS)n(n＝1-4；SEQ ID NO:253)、GGGGGGGG(SEQ ID NO:254)、GGGGGG(SEQ ID NO:255)、(EAAAK)n(n＝1-3；SEQ ID NO:256)、A(EAAAK)nA(n＝2-5；；SEQ ID NO:257)、AEAAAKEAAAKA(SEQ ID NO:258)、A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A(SEQ ID NO:259)、PAPAP(SEQ ID NO:260)、KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:261)、EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO:262)、GSAGSAAGSGEF(SEQ ID NO:263)和(XP)n，其中X表示任何氨基酸，例如Ala、Lys或Glu。在各种实施方案中，接头是GGS。

在一些实施方案中，接头是以下中的一种或多种：GGGSE(SEQ ID NO:942)、GSESG(SEQ ID NO:943)、GSEGS(SEQ ID NO:944)、GEGGSGEGSSGEGSSSEGGGSEGGGSEGGGSEGGS(SEQID NO:945)、和每间隔4个氨基酸随机放置G、S和E的接头。

在一些实施方案中，接头是抗体的铰链区(例如IgG、IgA、IgD和IgE的抗体，包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、以及IgA1和IgA2))。在各种实施方案中，接头是抗体的铰链区(例如IgG、IgA、IgD和IgE的抗体，包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、以及IgA1和IgA2))。见于IgG、IgA、IgD和IgE类抗体中的铰链区用作柔性间隔物，允许Fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多样的，在免疫球蛋白类和亚类之间在序列和长度上是变化的。例如，铰链区的长度和柔性在IgG亚类之间变化。IgG1的铰链区包含氨基酸216-231，且因为其是自由柔性的，所以Fab片段可围绕他们的对称轴旋转并在以两个重链间二硫桥中的第一个为中心的球内移动。IgG2具有比IgG1更短的铰链，具有12个氨基酸残基和4个二硫桥。IgG2的铰链区缺少甘氨酸残基，相对较短，并含有刚性聚脯氨酸双螺旋，由额外的重链间二硫桥使其稳定。这些性质限制了IgG2分子的柔性。IgG3与其他亚类的不同之处在于其独特的延伸铰链区(IgG1铰链的约4倍)，含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成非柔性的聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段离Fc片段相对较远，使分子具有更大的柔性。与其他亚类相比，IgG3中的伸长铰链也是其分子量较高的原因。IgG4的铰链区短于IgG1的铰链区，且其柔性介于IgG1与IgG2之间。据报道，铰链区的柔性按IgG3>IgG1>IgG4>IgG2的顺序降低。

根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区可进一步在功能上细分为三个区域：上铰链区、核心区、和下铰链区。参见Shin等人,1992Immunological Reviews 130:87。上铰链区包括从C_H1的羧基端到限制运动的铰链中的第一残基的氨基酸，所述第一残基通常是在两个重链之间形成链间二硫键的第一半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥，且下铰链区连接C_H2结构域的氨基末端并包括C_H2中的残基。同上。野生型人IgG1的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其当通过二硫键形成被二聚化时，产生被认为用作枢轴的环状八肽，从而赋予柔性。在各种实施方案中，本发明的接头包含任何抗体(例如IgG、IgA、IgD和IgE的抗体，包括亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、以及IgA1和IgA2))的上铰链区、核心区和下铰链区中的一个、两个或三个。铰链区还可含有一个或多个糖基化位点，其包括许多结构上不同类型的位点以用于碳水化合物连接。例如，IgA1在铰链区的17个氨基酸区段内含有五个糖基化位点，赋予铰链区多肽对肠蛋白酶的抗性，被认为是分泌型免疫球蛋白的有利特性。在各种实施方案中，本发明的接头包含一个或多个糖基化位点。在各种实施方案中，接头是人IgG4抗体的铰链-CH2-CH3结构域。

如果需要，本发明的嵌合蛋白可以与抗体Fc区连接，所述抗体Fc区包含C_H2和C_H3结构域中的一个或两个，以及任选的铰链区。例如，编码作为单核苷酸序列与Fc区连接的本发明嵌合蛋白的载体可用于制备此类多肽。

在一些实施方案中，接头是合成接头，如PEG。

在各种实施方案中，接头可以是功能性的。例如但不限于，接头可用以改善本发明嵌合蛋白的折叠和/或稳定性，改善表达，改善药代动力学、和/或改善生物活性。在另一实例中，接头可用以将嵌合蛋白靶向特定细胞类型或位置。

在各种实施方案中，每种嵌合蛋白可与另一种试剂缀合和/或融合以延长半衰期或以其他方式改善药效学和药代动力学性质。在一些实施方案中，嵌合蛋白可与PEG、XTEN(例如，作为rPEG)、聚唾液酸(POLYXEN)、白蛋白(例如，人血清白蛋白或HAS)、弹性蛋白样蛋白(ELP)、PAS、HAP、GLK、CTP、转铁蛋白等中的一种或多种融合或缀合。在一些实施方案中，嵌合蛋白可与抗体或抗体片段(如Fc片段)融合或缀合。例如，嵌合蛋白可与人免疫球蛋白(Ig)G的Fc结构域的N末端或C末端融合。在各种实施方案中，每种单独的嵌合蛋白与BioDrugs(2015)29:215–239中所述的一种或多种试剂融合，其全部内容通过引用并入文中。

嵌合蛋白的产生

本文描述了产生本发明的嵌合蛋白的方法。例如，编码本发明嵌合蛋白的DNA序列(例如，编码修饰的信号传导剂(例如，修饰的IFN-β)和靶向部分和接头的DNA序列)可使用本领域中已知的方法化学合成。合成的DNA序列可与其他合适的核苷酸序列连接，包括例如表达控制序列，以产生编码所需嵌合蛋白的基因表达构建体。因此，在各种实施方案中，本发明提供了分离的核酸，其包含编码本发明的嵌合蛋白的核苷酸序列。

编码本发明嵌合蛋白的核酸可掺入(连接)到表达载体中，所述表达载体可通过转染、转化或转导技术引入宿主细胞中。例如，可通过逆转录病毒转导将编码本发明嵌合蛋白的核酸引入宿主细胞中。说明性宿主细胞是大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和骨髓瘤细胞。转化的宿主细胞可在允许宿主细胞表达编码本发明嵌合蛋白的基因的条件下生长。因此，在各种实施方案中，本发明提供了包含编码本发明嵌合蛋白的核酸的表达载体。在各种实施方案中，本发明另外提供了包含此类表达载体的宿主细胞。

具体的表达和纯化条件将根据所用的表达***而变化。例如，如果要在大肠杆菌中表达基因，首先通过将工程化基因定位在合适的细菌启动子(例如Trp或Tac)和原核信号序列的下游，将其克隆到表达载体中。在另一实例中，如果要在真核宿主细胞例如CHO细胞中表达工程化基因，那么首先将其***含有例如合适的真核启动子、分泌信号、增强子和各种内含子的表达载体中。可使用转染、转化或转导技术将基因构建体引入宿主细胞中。

本发明的嵌合蛋白可通过在允许蛋白表达的条件下使用编码嵌合蛋白的表达载体转染的宿主细胞生长来产生。表达后，可使用本领域中熟知的技术收获和纯化蛋白质，例如亲和标签，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸标签，或通过色谱法。

因此，在各种实施方案中，本发明提供了编码本发明嵌合蛋白的核酸。在各种实施方案中，本发明提供了包含编码本发明嵌合蛋白的核酸的宿主细胞。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白可在体内表达，例如，在患者体内。例如，在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以编码本发明嵌合蛋白的核酸形式施用。在各种实施方案中，核酸是DNA或RNA。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白是由修饰的mRNA编码，即包含一个或多个修饰的核苷酸的mRNA。在一些实施方案中，修饰的mRNA包含见于美国专利号8,278,036中的一个或多个修饰，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，修饰的mRNA包含m5C、m5U、m6A、s2U、Ψ和2'-O-甲基-U中的一种或多种。在一些实施方案中，本发明涉及施用编码一种或多种本发明嵌合蛋白的修饰的mRNA。在一些实施方案中，本发明涉及包含其的基因治疗载体。在一些实施方案中，本发明涉及包含其的基因治疗方法。在各种实施方案中，核酸呈溶瘤病毒的形式，例如，腺病毒、逆转录病毒、麻疹、单纯疱疹、新城疫病毒或牛痘。

药学上可接受的盐和赋形剂

本文所述的嵌合蛋白可具有可与无机酸或有机酸反应的足够碱性官能团或者可与无机碱或有机碱反应的羧基以形成药学上可接受的盐。药学上可接受的酸加成盐是由药学上可接受的酸形成，如本领域中所熟知的。此类盐包括在以下出版物中列出的药学上可接受的盐：例如Journal of Pharmaceutical Science,66,2-19(1977)及The Handbook ofPharmaceutical Salts；Properties,Selection,and Use.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编著),Verlag,Zurich(Switzerland)2002，其全文通过引用并入文中。

药学上可接受的盐作为非限制性实例包括硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、樟脑磺酸盐、双羟萘酸盐、苯乙酸盐、三氟乙酸盐、丙烯酸盐、氯苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、邻-乙酰氧基苯甲酸盐、萘-2-苯甲酸盐、异丁酸盐、苯基丁酸盐、α-羟基丁酸盐、丁炔-1,4-二羧酸盐、己炔-1,4-二羧酸盐、癸酸盐、辛酸盐、肉桂酸盐、乙醇酸盐、庚酸盐、马尿酸盐、苹果酸盐、羟基马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、邻苯二甲酸盐、对苯二甲酸盐、丙炔酸盐、丙酸盐、苯基丙酸盐、癸二酸盐、辛二酸盐、对-溴苯磺酸盐、氯苯磺酸盐、乙基磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、甲基磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、萘-1,5-磺酸盐、二甲苯磺酸盐、和酒石酸盐。

术语“药学上可接受的盐”还指的是具有酸性官能团如羧酸官能团和碱的本发明的组合物的盐。适合的碱包括但不限于碱金属如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属如钙和镁的氢氧化物；其他金属如铝和锌的氢氧化物；氨和有机胺，如未取代的或羟基取代的单-、二-或三-烷基胺、二环己基胺；三丁胺；吡啶；N-甲基、N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或三-(2-OH-低级烷基胺)，如单-、双-或三-(2-羟基乙基)胺、2-羟基-叔-丁胺或者三-(羟基甲基)甲胺；N,N-二-低级烷基-N-(羟基-低级烷基)-胺，如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)胺或三-(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；以及氨基酸，如精氨酸、赖氨酸等。

在一些实施方案中，本文所述的组合物呈药学上可接受的盐的形式。

药物组合物和制剂

在各种实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含本文所述的嵌合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂。本文所述的任何药物组合物可作为包含药学上可接受的载体或媒介物的组合物的组分施用于受试者。此类组合物可任选地包含适合量的药学上可接受的赋形剂以便提供用于适当施用的形式。

在各种实施方案中，药物赋形剂可为液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物赋形剂可为例如盐水、***树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、硅胶、尿素等。另外，可使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂、和着色剂。在一个实施方案中，当施用于受试者时，药学上可接受的赋形剂为无菌的。当静脉内施用本文所述的任何试剂时，水为有用的赋形剂。盐水溶液和葡萄糖水溶液及甘油溶液也可用作液体赋形剂，特别是用于可注射溶液。适合的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，那么本文所述的任何试剂还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。适合的药物赋形剂的其他实例描述于Remington's PharmaceuticalSciences 1447-1676(Alfonso R.Gennaro编著，第19版，1995)中，该文献以引用的方式并入本文。

本发明包括各种制剂中的所述药物组合物(和/或另外的治疗剂)。本文所述的任何本发明药物组合物(和/或另外的治疗剂)可采取以下形式：溶液、混悬液、乳液、滴剂、片剂、丸剂、小丸剂、胶囊、含有液体的胶囊、明胶胶囊、粉剂、持续释放制剂、栓剂、乳液、气溶胶、喷雾剂、混悬液、冻干粉末、冷冻混悬液、干燥粉末、或适合使用的任何其他形式。在一个实施方案中，组合物呈胶囊形式。在另一实施方案中，组合物呈片剂形式。在又一实施方案中，药物组合物是以软凝胶胶囊的形式配制。在另一实施方案中，药物组合物是以明胶胶囊的形式配制。在又一实施方案中，将药物组合物配制成液体。

必要时，本发明的药物组合物(和/或另外的试剂)还可包括增溶剂。而且，试剂可用本领域中已知的合适媒介物或递送装置递送。本文概述的组合疗法可在单一递送媒介物或递送装置中共同递送。

包含本发明的药物组合物(和/或另外的试剂)的制剂可方便地以单位剂型提供并且可通过制药领域所熟知的任何方法来制备。此类方法通常包括使治疗剂与载体缔合的步骤，所述载体构成一种或多种辅助成分。通常，通过将治疗剂与液体载体、细碎的固体载体或这两者均匀且紧密地缔合，然后如果需要，使产物成形为所需制剂的剂型(例如，湿法或干法制粒、粉末掺混物等，然后使用本领域已知的常规方法压片)来制备制剂。

在各种实施方案中，本文所述的任何药物组合物(和/或另外的试剂)根据常规程序被配制为适于本文所述施用模式的组合物。

施用路径包括例如：经口、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、***内、经皮、直肠、通过吸入或局部。施用可为局部或全身性的。在一些实施方案中，施用是经口实现。在另一实施方案中，施用是通过肠胃外注射。施用模式可由执业医师自行判断并且部分取决于医学病状的部位。在大多数情况下，施用使得本文所述的任何试剂释放到血流中。

在一个实施方案中，本文所述的嵌合蛋白根据常规程序被配制为适于经口施用的组合物。用于经口递送的组合物可呈例如片剂、锭剂、水性或油性混悬液、颗粒剂、粉剂、乳液、胶囊、糖浆、或酏剂的形式。经口施用的组合物可包含一种或多种试剂，例如增甜剂，如果糖、阿斯巴甜或糖精；调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃红；着色剂；及防腐剂，以提供药学上可口的制剂。此外，在呈片剂或丸剂形式时，可对组合物进行包衣以便在胃肠道内延迟崩解和吸收，从而在延长的时间段内提供持续作用。在渗透活性驱动本文所述的任何嵌合蛋白周围的选择性渗透膜也适用于经口施用的组合物。在这些后面的平台中，来自胶囊周围的环境的液体由驱动化合物吸收，所述化合物膨胀以通过孔置换试剂或试剂组合物。这些递送平台可提供基本上零级递送曲线(delivery profile)，与立即释放制剂的锥形曲线相反。延时材料如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯也可为有用的。口服组合物可包括标准赋形剂，如甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、和碳酸镁。在一个实施方案中，所述赋形剂为药用级的。除活性化合物之外，混悬液还可包含悬浮剂，如例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶等及其混合物。

适于肠胃外施用(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液、混悬液、分散液、乳液等。它们也可以无菌固体组合物(例如，冻干组合物)形式制备，所述无菌固体组合物可在使用前立即溶解或悬浮在无菌可注射介质中。其可含有例如本领域中已知的悬浮剂或分散剂。适用于肠胃外施用的制剂组分包括以下：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及用于调节渗透压的试剂，如氯化钠或右旋糖。

对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体在制造和储存条件下应是稳定的，并且应该防止微生物。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物。

本文所提供的组合物，单独或与其他合适的组分组合，可被制成将通过吸入施用的气溶胶制剂(即，“雾化”)。气溶胶制剂可被置于加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

本文所述的任何本发明的药物组合物(和/或另外的试剂)可通过控制释放或持续释放方式或通过本领域普通技术人员熟知的递送装置施用。实例包括但不限于美国专利号3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；和5,733,556中所述的那些；所述专利各自以引用的方式并入本文。此类剂型可适用于使用例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透***、多层包衣、微粒、脂质体、微球或其组合来提供一种或多种活性成分的控制或持续释放，从而以不同比例提供所需的释放曲线。本领域技术人员已知的适合的控制或持续释放制剂(包括本文所述的那些)可容易选择来与本文所述试剂的活性成分一起使用。本发明因此提供适于经口施用的单一单位剂型，如但不限于适于控制或持续释放的片剂、胶囊、软胶囊以及囊片。

可通过不同条件刺激活性成分的控制或持续释放，所述条件包括但不限于pH的变化、温度的变化、经由适当波长的光的刺激、酶的浓度或利用度、水的浓度或利用度、或其他生理条件或化合物。

在另一实施方案中，控制释放***可置于有待治疗的靶区域附近，由此仅需要一部分全身剂量(参见，例如Goodson，在Medical Applications of Controlled Release中，同上，第2卷，第115-138页(1984))。可使用在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中讨论的其他控制释放***。

药物制剂优选是无菌的。例如，可通过无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物被冻干的情况下，可在冻干和重构之前或之后进行过滤灭菌。

施用和剂量

应理解，有待根据本发明施用的嵌合蛋白的实际剂量将根据具体剂型和施用模式而变化。本领域技术人员可能考虑到许多因素，这些因素可改变嵌合蛋白的作用(例如，体重、性别、饮食、施用时间、施用途径、***速率、受试者状况、药物组合、遗传倾向和反应敏感性)。施用可在最大耐受剂量内连续进行或以一个或多个离散剂量进行。本领域技术人员使用常规剂量施用试验可以确定给定条件组的最佳施用速率。

在一些实施方案中，嵌合蛋白的合适剂量在约0.01mg/kg至约10g/kg受试者体重的范围内、约0.01mg/kg至约1g/kg受试者体重、约0.01mg/kg至约100mg/kg受试者体重、约0.01mg/kg至10mg/kg受试者体重，例如，约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、1.9mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg体重、约100mg/kg体重、约1g/kg体重、约10g/kg体重，包括其间的所有数值和范围。

单独剂量的嵌合蛋白可以单位剂型(例如片剂或胶囊剂)施用，所述单位剂型包含例如每单位剂型约0.01mg至约100g、约0.01mg至约75g、约0.01mg至约50g、约0.01mg至约25g、约0.01mg至约10g、约0.01mg至约7.5g、约0.01mg至约5g、约0.01mg至约2.5g、约0.01mg至约1g、约0.01mg至约100mg、约0.1mg至约100mg、约0.1mg至约90mg、约0.1mg至约80mg、约0.1mg至约70mg、约0.1mg至约60mg、约0.1mg至约50mg、约0.1mg至约40mg活性成分、约0.1mg至约30mg、约0.1mg至约20mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、约0.1mg至约3mg、约0.1mg至约1mg或每单位剂型约5mg至约80mg。例如，单位剂型可为约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约200mg、约500mg、约1g、约2.5g、约5g、约10g、约25g、约50g、约75g、约100g，包括其间的所有数值和范围。

在一个实施方案中，嵌合蛋白的施用量为每天约0.01mg至约100g、每天约0.01mg至约75g、每天约0.01mg至约50g、每天约0.01mg至约25g、每天约0.01mg至约10g、每天约0.01mg至约7.5g、每天约0.01mg至约5g、每天约0.01mg至约2.5g、每天约0.01mg至约1g、每天约0.01mg至约100mg、每天约0.1mg至约100mg、每天约0.1mg至约95mg、每天约0.1mg至约90mg、每天约0.1mg至约85mg、每天约0.1mg至约80mg、每天约0.1mg至约75mg、每天约0.1mg至约70mg、每天约0.1mg至约65mg、每天约0.1mg至约6 0mg、每天约0.1mg至约55mg、每天约0.1mg至约50mg、每天约0.1mg至约45mg、每天约0.1mg至约40mg、每天约0.1mg至约35mg、每天约0.1mg至约30mg、每天约0.1mg至约25mg、每天约0.1mg至约20mg、每天约0.1mg至约15mg、每天约0.1mg至约10mg、每天约0.1mg至约5mg、每天约0.1mg至约3mg、每天约0.1mg至约1mg、或每天约5mg至约80mg。在各种实施方案中，嵌合蛋白的日施用剂量为约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg、约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约200mg、约500mg、约1g、约2.5g、约5g、约7.5g、约10g、约25g、约50g、约75g、约100g，包括其间的所有数值和范围。

根据本发明的某些实施方案，包含嵌合蛋白的药物组合物可例如每天施用超过一次(例如，每天约两次、约三次、约四次、约五次、约六次、约七次、约八次、约九次或约十次)、约每天一次、约每隔一天、约每三天一次、约每周一次、约每两周一次、约每月一次、约每两个月一次、约每三个月一次、约每六个月一次、或每年一次。

组合疗法和另外的治疗剂

在各种实施方案中，本发明的药物组合物联合另外的治疗剂共同施用。共同施用可以是同时的或顺序的。

在一个实施方案中，将另外的治疗剂与本发明的嵌合蛋白同时施用于受试者。本文所用的术语“同时”是指另外的治疗剂和嵌合蛋白以不超过约60分钟的时间间隔施用，如不超过约30分钟、不超过约20分钟、不超过约10分钟、不超过约5分钟、或不超过约1分钟。施用另外的治疗剂和嵌合蛋白可以通过同时施用单一制剂(例如，包含另外的治疗剂和嵌合蛋白的制剂)或单独的制剂(例如，包含另外的治疗剂的第一制剂和包含嵌合蛋白的第二制剂)。

如果施用时间使得另外的治疗剂与嵌合蛋白的药理活性在时间上重叠从而发挥组合的治疗效果，那么共同施用则不需要同时施用治疗剂。例如，可顺序地施用另外的治疗剂和嵌合蛋白。本文所用的术语“顺序地”是指另外的治疗剂和嵌合蛋白以超过约60分钟的时间间隔施用。例如，顺序施用另外的治疗剂与嵌合蛋白之间的时间可大于约60分钟、大于约2小时、大于约5小时、大于约10小时、大于约1天、大于约2天、大于约3天、间隔超过约1周、间隔超过约2周、或间隔超过约一个月。最佳施用时间将取决于施用的另外的治疗剂和嵌合蛋白的代谢率、***率、和/或药效学活性。可首先施用另外的治疗剂或嵌合蛋白细胞。

共同施用也不需要通过相同的施用途径将治疗剂施用于受试者。相反，每种治疗剂可通过任何合适的途径施用，例如肠胃外或非肠胃外施用。

在一些实施方案中，本文所述的嵌合蛋白当与另一种治疗剂共同施用时可协同作用。在此类实施方案中，嵌合蛋白和另外的治疗剂可以低于在单一疗法中使用试剂时所用剂量的剂量施用。

在一些实施方案中，本发明涉及化学治疗剂作为另外的治疗剂。例如但不限于，本发明的嵌合蛋白与化学治疗剂的这种组合可用于治疗癌症，如本文中别处所述。化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂，如硫替派和CYTOXAN环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三乙烯基磷酰胺、三乙烯基硫代磷酰胺和三羟甲基胺；番荔素(例如，泡番荔枝辛和布拉他辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(例如，念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB 1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、甲二氯二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素ωI1(参见，例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；双膦酸盐，如氯屈膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、偶氮丝氨酸、争光霉素、放线菌素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧-多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌呤霉素、奎那霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如迪诺特宁、氨甲蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡芦睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；秋水仙胺；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；类美登素，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(例如，T-2毒素、粘液霉素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；类紫杉醇，例如TAXOL紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANE紫杉醇的不含聚氧乙烯化蓖麻油的经白蛋白工程改造纳米粒子制剂(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,111.)和TAXOTERE多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；NAVELBINE.长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(盐酸伊立替康，CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄素，如视黄酸、全反式维甲酸(ATRA)、卡培他滨；考布他汀；醛氢叶酸(LV)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX)；拉帕替尼(Tykerb)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如厄洛替尼(Tarceva))和VEGF-A的抑制剂，以及以上任一者的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此外，治疗方法还可包括使用放射。此外，治疗方法还可包括使用光动力疗法。

在包括但不限于感染性疾病应用的一些实施方案中，本发明涉及抗感染剂作为另外的治疗剂。在一些实施方案中，抗感染剂是抗病毒剂，包括但不限于阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、安普那韦、阿扎那韦、西多福韦、达鲁那韦、地拉夫定、去羟肌苷、二十二烷醇、依法韦仑、艾特格韦、恩曲他滨、恩夫韦肽、依曲韦林、泛昔洛韦和磷卡萘替。在一些实施方案中，抗感染剂是抗细菌剂，包括但不限于头孢菌素抗生素(头孢氨苄、头孢呋辛、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢克洛、头孢唑醇、头孢西丁、头孢丙烯和头孢噻吩)；氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星、左氟沙星、可乐必妥、加替沙星、莫西沙星和诺氟沙星)；四环素类抗生素(四环素、米诺环素、土霉素和强力霉素)；青霉素抗生素(阿莫西林、氨苄青霉素、青霉素V、双氯西林、羧苄青霉素、万古霉素和甲氧西林)；单环内酰胺类抗生素(氨曲南)；及碳青霉烯类抗生素(厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南)。在一些实施方案中，抗感染剂包括抗疟剂(例如，氯喹、奎宁、甲氟喹、伯氨喹、多西环素、蒿甲醚/苯芴醇、阿扎伐醌/氯胍和磺胺多辛/乙胺嘧啶)、甲硝唑、替硝唑、伊维菌素、噻嘧啶双羟萘酸盐、和阿苯达唑。

在包括但不限于自身免疫应用的一些实施方案中，另外的治疗剂是免疫抑制剂。在一些实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂，如甾体抗炎剂或非甾体抗炎剂(NSAID)。类固醇，特别是肾上腺皮质类固醇及其合成类似物，是本领域中熟知的。可用于本发明中的皮质类固醇的实例包括但不限于羟基三苯甲酮、α-甲基***、β-甲基倍他米松、二丙酸倍氯米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、戊酸氯倍他索、***、去氧米松、***、二醋酸二醋酸酯、双氟可龙戊酸酯、氟哌酮、氟氯奈德、特戊酸氟美松、醋酸氟轻松、氟轻松、氟哌嗪丁酯、氟喹诺酮、氟哌啶(氟吡啶)乙酸酯、氟萘甲酮、哈西奈德、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲基强的松龙、曲安奈德、可的松、皮质酮、氟丙酮化合物、氟丙酮化合物、醋酸双氟拉松、氟利昂龙、金甲磺酸、安西法尔、安西非特、倍他米松及其酯类平衡、氯哌嗪酮、氯苄酮、clescinolone、双氯松、双氟泼尼酯、氟二氯松、氟尼缩松、氟米龙、氟培龙、氟雷司酮、氢化可的松、甲基***、对氟米松、***龙、***、二丙酸倍氯米松。可用于本发明中的(NSAIDS)包括但不限于水杨酸、乙酰水杨酸、水杨酸甲酯、水杨酸乙二醇酯、水杨酰胺、苄基-2,5-二乙酰氧基苯甲酸、布洛芬、富林酸、萘普生、酮洛芬、依托芬那酯、保泰松、和吲哚美辛。在一些实施方案中，免疫抑制剂可以是细胞抑制剂，如烷化剂、抗代谢物(例如，硫唑嘌呤、甲氨蝶呤)、细胞毒性抗生素、抗体(例如巴利昔单抗、达利珠单抗和莫罗单抗)、抗免疫亲和素(例如环孢菌素、他克莫司、西罗莫司)、干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、霉酚酸酯、和小生物制剂(例如芬戈莫德、多球壳素)。另外的抗炎剂描述于例如美国专利号4,537,776中，其全部内容通过引用并入本文中。

在一些实施方案中，本发明涉及各种试剂，其是作为另外的治疗剂用于治疗肥胖症的。用于治疗肥胖症的说明性试剂包括但不限于奥利司他(例如ALL1、XENICAL)、劳拉卡因(例如，BELVIQ)、芬特明-托吡酯(例如，QSYMIA)、***(例如，REDUCTIL或MERJDIA)、利莫那班(ACOMPLLA)、艾塞那肽(例如，BYETTA)、普兰林肽(例如，SYMLIN)芬特明、苯并***、二乙基丙酸、苯二甲胺、安非他酮、和二甲双胍。干扰身体吸收食物中特定营养素的能力的试剂属于另外的试剂，例如奥利司他(例如ALU、XENICAL)、葡甘露聚糖、和瓜尔胶。抑制食欲的试剂也属于另外的试剂，例如儿茶酚胺及其衍生物(如苯酞和其他***类药物)、各种抗抑郁药和情绪稳定剂(如安非他酮和托吡酯)、减食欲药物(例如右旋***、地高辛)。增加身体代谢的试剂也属于另外的试剂。

在一些实施方案中，另外的治疗剂可选自食欲抑制剂、神经递质再摄取抑制剂、多巴胺能激动剂、5-羟色胺能激动剂、GABA能信号传导的调节剂、抗惊厥药、抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、P物质(NK1)受体拮抗剂、黑皮质素受体激动剂和拮抗剂、脂肪酶抑制剂、脂肪吸收抑制剂、能量摄入或代谢调节剂、***素受体调节剂、治疗成瘾的试剂、治疗代谢综合征的试剂、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)调节剂；二肽基肽酶4(DPP-4)拮抗剂、治疗心血管疾病的试剂、治疗甘油三酯水平升高的试剂、治疗低HDL的试剂、治疗高胆固醇血症的试剂、和治疗高血压的试剂。一些用于心血管疾病的试剂包括他汀类药物(例如洛伐他汀、阿托伐他汀、氟伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀)和ω-3药物(例如LOVAZA、EPANQVA、VASCEPA、一般酯化的ω-3脂肪酸、鱼油、磷虾油、藻类油)。在一些实施方案中，另外的试剂可选自安非他明、苯并二氮杂卓、噻吩基脲、氯茴苯酸、噻唑烷二酮、双胍、β-阻滞剂、XCE抑制剂、利尿剂、硝酸盐、钙通道阻滞剂、***、***、碘卡西林、赛利司他、利莫那班、它拉那班、托吡酯、加巴喷丁、丙戊酸、氨己烯酸、安非他酮、替加宾、舍曲林、氟西汀、曲唑酮、唑尼沙胺、哌甲酯、伐尼克兰、纳曲酮、二乙基丙酸、苯丙嗪、瑞格列奈、那格列奈、格列美脲、二甲双胍、吡格列酮、罗格列酮、和西他列汀。

在一些实施方案中，本发明涉及作为另外的治疗剂用于治疗糖尿病的试剂。说明性抗糖尿病剂包括但不限于磺酰脲(例如，DYMELOR(乙酰己酰胺)、DIABINESE(氯磺丙脲)、ORINASE(甲苯磺丁脲)和TOLINASE(甲苯磺酰胺)、GLUCOTROL(格列吡嗪)、GLUCOTROL XL(延长释放)、DIABETA(格列本脲)、MICRONASE(格列本脲)、GLYNASE PRESTAB(格列本脲)和AMARYL(格列美脲))；双胍(例如，二甲双胍(GLUCOPHAGE、GLUCOPHAGE XR、RIOMET、FORTAMET和GLUMETZA))；噻唑烷二酮(例如，ACTOS(吡格列酮)和AVANDIA(罗格列酮)；α-葡糖苷酶抑制剂(例如，PRECOSE(阿卡波糖)和GLYSET(米格列醇)；Meglitinide(例如，PRANDIN(瑞格列奈)和STARLIX(那格列奈))；二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制剂(例如，JANUVIA(西他列汀)、NESINA(阿格列汀)、ONGLYZA(沙格列汀)和TRADJENTA(利格列汀))；钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂(例如，INVOKANA(卡格列净))；和组合药丸(例如，GLUCOVANCE，其结合格列本脲(磺酰脲)和二甲双胍、METAGLIP，其结合格列吡嗪(磺酰脲)和二甲双胍、和AVANDAMET，其在一个药丸中使用二甲双胍和罗格列酮(AVANDIA)、KAZANO(阿格列汀和二甲双胍)、OSENI(阿格列汀加吡格列酮)、METFORMIN口服、ACTOS口服、BYETTA皮下、JANUVIA口服、WELCHOL口服、JANUMET口服、格列吡嗪口服、格列美脲口服、GLUCOPHAGE口服、LANTUS皮下、格列本脲口服、ONGLYZA口服、AMARYl口服、LANTUS SOLOSTAR皮下、BYDUREON皮下、LEVEMIRFLEXPEN皮下、ACTOPLUS MET口服、GLUMETZA口服、TRADJENTA口服、溴隐亭口服、KOMBIGLYZEXR口服、INVOKANA口服、PRANDIN口服、LEVEMIR皮下、PARLODEL口服、吡格列酮口服、NOVOLOG皮下、NOVOLOG FLEXPEN皮下、VICTOZA 2-PAK皮下、HUMALOG皮下、STARLIX口服、FORTAMET口服、GLUCOVANCE口服、GLUCOPHAGE XR口服、NOVOLOG混合70-30FLEXPEN皮下、GLYBURIDE-METFORMIN口服、阿卡波糖口服、SYMLINPEN 60皮下、GLUCOTROl XL口服、NOVOLIN R注射、GLUCOTROL口服、DUETACT口服、西格列汀口服、SYMLINPEN 120皮下、HUMALOG KWIKPEN皮下、JANUMET XR口服、GLIPIZIDE-METFORMIN口服、CYCLOSET口服、HUMALOG MIX75-25皮下、那格列奈口服、HUMALOG混合75-25KWIKPEN皮下、HUMULIN 70/30皮下、PRECOSE口服、APIDRA皮下、Humulin R注射、Jentadueto口服、Victoza 3-Pak皮下、Novolin 70/30皮下、NOVOLIN N皮下、地特胰岛素皮下、格列本脲微粉化口服、GLYNASE口服、HUMULIN N皮下、甘精胰岛素皮下、RIOMET口服、吡格列酮-二甲双胍口服、APIDRA SOLOSTAR皮下、赖脯胰岛素皮下、GLYSET口服、HUMULIN 70/30Pen皮下、考来维仑口服、西他列汀-二甲双胍口服、DIABETA口服、胰岛素常规人体注射、HUMULIN N Pen皮下、艾塞那肽皮下、HUMALOG混合50-50KWIKPEN皮下、利拉鲁肽皮下、KAZANO口服、瑞格列奈口服、氯磺丙脲口服、门冬胰岛素皮下、NOVOLOG混合70-30皮下、HUMALOG混合50-50皮下、沙克列汀口服、ACTOPLUS Met XR口服、米格列醇口服、NPH胰岛素人重组皮下、胰岛素NPH和常规人皮下、妥拉磺脲口服、米非司酮口服、门冬胰岛素鱼精蛋白-门冬胰岛素皮下、瑞格列奈-二甲双胍口服、沙克列汀-二甲双胍口服、利格列汀-二甲双胍口服、NESINA口服、OSENI口服、甲苯磺丁脲口服、赖脯胰岛素鱼精蛋白和赖脯皮下、普兰林肽皮下、赖谷胰岛素皮下、吡格列酮-格列美脲口服、PRANDIMET口服、NOVOLOGPenFill皮下、利格列汀口服、艾塞那肽微球皮下、KORLYM口服、阿格列汀口服、阿格列汀-吡格列酮口服、阿格列汀-二甲双胍口服、坎格列净口服、赖脯胰岛素(HUMALOG)；门冬胰岛素(NOVOLOG)；赖谷胰岛素(APIDRA)；常规(NOVOLIN R或HUMULIN R)；NPH(NOVOLIN N或HUMULIN N)；甘精胰岛素(LANTUS)；地特胰岛素(LEVEMIR)；HUMULIN或NOVOLIN 70/30；和NOVOLOG混合70/30HUMALOG混合75/25或50/50。

在一些实施方案中，本发明涉及作为另外的治疗剂用于治疗MS的试剂。说明性MS试剂包括但不限于各种疾病改善疗法：

在一些实施方案中，本发明涉及与输血的组合疗法。例如，本发明的组合物可补充输血。在一些实施方案中，本发明涉及与铁补充剂的组合疗法。

在一些实施方案中，本发明涉及与一种或多种基于EPO的试剂的组合疗法。例如，本发明的组合物可用作其他基于EPO的试剂的佐剂。在一些实施方案中，本发明的组合物用作其他基于EPO的试剂的维持疗法。其他基于EPO的试剂包括以下：依伯汀α，包括但不限于DARBEPOETIN(ARANESP)、EPOCEPT(LUPIN PHARMA)、NANOKINE(NANOGEN PHARMACEUTICAL)、EPOFIT(INTAS PHARMA)、EPOGEN(AMGEN)、EPOGIN、EPREX、(JANSSEN-CILAG)、BINOCRIT7(SANDOZ)、PROCRIT；依泊汀β，包括但不限于NEORECORMON(HOFFMANN-LA ROCHE)、RECORMON、甲氧基聚乙二醇-倍他依泊汀(MIRCERA，ROCHE)；依泊汀δ，包括但不限于DYNEPO(红细胞生成刺激蛋白，SHIRE PLC)；依泊汀Ω，包括但不限于EPOMAX；依泊汀ζ，包括但不限于SILAPO(STADA)和RETACRIT(HOSPIRA)和其他EPO，包括但不限于EPOCEPT(LUPINPHARMACEUTICALS)、EPOTRUST(PANACEA BIOTEC LTD)、ERYPRO SAFE(BIOCON LTD.)、REPOITIN(SERUM INSTITUTE OF INDIA LIMITED)、VINTOR(EMCURE PHARMACEUTICALS)、EPOFIT(INTAS PHARMA)、ERYKINE(INTAS BIOPHARMACEUTICA)、WEPOX(WOCKHARDTBIOTECH)、ESPOGEN(LG LIFE SCIENCES)、RELIPOIETIN(RELIANCE LIFE SCIENCES)、SHANPOIETIN(SHANTHA BIOTECHNICS LTD)、ZYROP(CADILA HEALTHCARE LTD.)、EPIAO(RHUEPO)(SHENYANG SUNSHINE PHARMACEUTICAL CO.LTD)、CINNAPOIETIN(CINNAGEN)。

在一些实施方案中，本发明涉及与一种或多种免疫调节剂的组合疗法，例如但不限于调节免疫检查点的试剂。在各种实施方案中，免疫调节剂靶向PD-1、PD-L1和PD-L2中的一种或多种。在各种实施方案中，免疫调节剂是PD-1抑制剂。在各种实施方案中，免疫调节剂是对PD-1、PD-L1和PD-L2中的一种或多种有特异性的抗体。例如，在一些实施方案中，免疫调节剂是抗体，例如，不限于，纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558、MDX1106、OPDIVO、BRISTOL MYERS SQUIBB)、派姆单抗(KEYTRUDA、MERCK)、pidilizumab(CT-011、CURE TECH)、MK-3475(MERCK)、BMS 936559(BRISTOL MYERS SQUIBB)、MPDL328OA(ROCHE)。在一些实施方案中，免疫调节剂靶向CD137或CD137L中的一种或多种。在各种实施方案中，免疫调节剂是对CD137或CD137L中的一种或多种有特异性的抗体。例如，在一些实施方案中，免疫调节剂是抗体，例如不限于乌瑞鲁单抗(也称为BMS-663513和抗-4-1BB抗体)。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白与乌瑞鲁单抗(任选地与纳武单抗、利丽单抗和乌瑞鲁单抗中的一种或多种)组合用于治疗实体瘤和/或B细胞非何杰金氏淋巴瘤和/或头颈癌和/或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，免疫调节剂是靶向CTLA-4、AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A中的一种或多种的试剂。在各种实施方案中，免疫调节剂是对CTLA-4、AP2M1、CD80、CD86、SHP-2和PPP2R5A中的一种或多种有特异性的抗体。例如，在一些实施方案中，免疫调节剂是抗体，如但不限于伊匹单抗(MDX-010、MDX-101、Yervoy、BMS)和/或曲美母单抗(Pfizer)。在一些实施方案中，本发明的嵌合蛋白与伊匹单抗(任选地与维昔单抗)组合用于治疗黑素瘤、***癌和肺癌中的一种或多种。在各种实施方案中，免疫调节剂靶向CD20。在各种实施方案中，免疫调节剂是CD20特异性抗体。例如，在一些实施方案中，免疫调节剂是抗体，如但不限于奥法木单抗(GENMAB)、奥滨尤妥珠单抗(GAZYVA)、AME-133v(APPLIED MOLECULAREVOLUTION)、奥美珠单抗(GENENTECH)、TRU-015(TRUBION/EMERGENT)、维妥珠单抗(IMMU-106)。

在一些实施方案中，本发明涉及与WO 2013/10779、WO 2015/007536、WO 2015/007520、WO 2015/007542和WO 2015/007903中描述的一种或多种嵌合剂的组合疗法，其全部内容通过引用并入文中。

在一些实施方案中，本文所述的嵌合蛋白包括经修饰的衍生物，即，通过任何类型的分子与组合物的共价连接，使得共价连接不会阻止组合物的活性。例如但不限制，衍生物包括尤其通过糖基化、脂化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质的连接等进行修饰的组合物。可通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。

在仍另一些实施方案中，本文所述的嵌合蛋白还包含细胞毒性剂，在说明性实施方案中，其包含毒素、化学治疗剂、放射性同位素、和引起细胞凋亡或细胞死亡的试剂。这种试剂可与本文所述的组合物缀合。

本文所述的嵌合蛋白因此可被翻译后修饰以添加效应物部分(如化学接头)、可检测部分(如荧光染料、酶、底物、生物发光物质、放射性物质和化学发光部分)、或功能性部分(如抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性物质)。

说明性细胞毒性剂包括但不限于甲胺蝶呤、氨基蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪；烷基化剂，如二氯甲基二乙胺、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、丝裂霉素C、洛莫司汀(CCNU)、1-甲基亚硝基脲、环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂和卡铂(伯尔定)；蒽环霉素包括道诺霉素(先前称为道诺霉素)、小红莓(阿德力霉素)、地托比星、洋红霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌和比生群；抗生素包括更生霉素(放线菌素D)、博莱霉素、卡里奇霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC)；以及抗有丝***剂，如长春花生物碱、长春新碱和长春花碱。其他细胞毒性剂包括太平洋紫杉醇(泰素)、篦麻毒素、假单胞菌外毒素、吉西他滨、细胞迟缓素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、依托泊苷、替尼泊苷、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、四卡因、利多卡因、***、嘌呤霉素、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、米托坦(O,P'-(DDD))、干扰素、及这些细胞毒性剂的混合物。

其他细胞毒性剂包括但不限于化疗剂，例如碳铂、顺铂、紫杉醇、吉西他滨、加利车霉素、阿霉素、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、放线菌素D、环磷酰胺、长春新碱、博来霉素、VEGF拮抗剂、EGFR拮抗剂、铂类、紫杉醇类、依立替康、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、甲酰四氢叶酸、类固醇、环磷酰胺、美法仑、长春花生物碱(例如、长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨)、氮芥类、酪氨酸激酶抑制剂、放疗、性激素拮抗剂、选择性雄激素受体调节剂、选择性***受体调节剂、PDGF拮抗剂、TNF拮抗剂、IL-1拮抗剂、白细胞介素(例如IL-12或IL-2)、IL-12R拮抗剂、与毒素缀合的单克隆抗体、肿瘤抗原特异性单克隆抗体、Erbitux、Avastin、帕妥珠单抗、抗CD20抗体、Rituxan、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、DXL625、或其任意组合。来自植物和细菌的毒性酶如蓖麻毒素、白喉毒素和假单胞菌毒素可与治疗剂(例如抗体)缀合以产生细胞类型特异性杀灭试剂(Youle等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:5483(1980)；Gilliland等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 77:4539(1980)；Krolick等人,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 77:5419(1980))。

其他细胞毒性剂包括细胞毒性核糖核酸酶，如由Goldenberg在美国专利号6,653,104中所述。本发明的实施方案还涉及放射免疫缀合物，其中在使用或不使用复合物形成剂的情况下使发射α或β粒子的放射性核素稳定偶联于嵌合蛋白。这种放射性核素包括β-发射体，如磷-32、钪-47、铜-67、镓-67、钇-88、钇-90、碘-125、碘-131、钐-153、镥-177、铼-186或铼-188、和α-发射体，如砹-211、铅-212、铋-212、铋-213或锕-225。

说明性可检测部分还包括但不限于辣根过氧化酶、乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶。其他说明性荧光物质包括但不限于若丹明、荧光素、异硫氰酸荧光素、伞形酮、二氯三嗪基胺、藻红素和丹磺酰氯。其他说明性化学发光部分包括但不限于流明诺。其他说明性生物发光物质包括但不限于荧光素和水母素。其他说明性放射性物质包括但不限于碘-125、碳-14、硫-35、氚和磷-32。

治疗方法

本文所述的方法和组合物可用于治疗各种疾病和病症，包括但不限于癌症、感染、免疫病症、贫血、自身免疫疾病、心血管疾病、伤口愈合、缺血相关疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、及许多其他疾病和病症。

此外，任何本发明的试剂可用于治疗各种疾病和病症或制造用于治疗各种疾病和病症的药物，包括但不限于癌症、感染、免疫病症、炎性疾病或病症、和自身免疫疾病。

在一些实施方案中，本发明涉及以下中一种或多种的治疗或患者：慢性肉芽肿病、骨硬化病、特发性肺纤维化、弗里德赖希氏共济失调、特应性皮炎、南美锥虫病、癌症、心力衰竭、自身免疫疾病，镰状细胞疾病、地中海贫血、失血、输血反应、糖尿病、维生素B12缺乏症、胶原血管疾病、Shwachman综合征、血小板减少性紫癜、腹腔疾病、内分泌不足状态如甲状腺功能减退症或艾迪生病、自身免疫性疾病如克罗恩氏病、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎或青少年类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎免疫病症如嗜酸性筋膜炎、低免疫球蛋白血症或胸腺瘤/胸腺癌、移植物抗宿主病、白血病前期、非血液综合征(如Down's、Dubowwitz、Seckel)、Felty综合征、溶血性尿毒综合征、骨髓增生异常综合征、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓纤维化、全血细胞减少、纯红细胞再生障碍、Schoenlein-Henoch紫癜、疟疾、蛋白质饥饿、月经过多、***性硬化、肝硬化、代谢紊乱状态、和充血性心力衰竭。

在一些实施方案中，本发明涉及慢性肉芽肿病、骨硬化病、特发性肺纤维化、弗里德赖希共济失调、特应性皮炎、南美锥虫病、分枝杆菌感染、癌症、硬皮病、肝炎、肝炎C、感染性休克和类风湿性关节炎中的一种或多种的治疗或患者。

在一些实施方案中，本发明涉及癌症治疗或癌症患者。如本文所用，癌症是指可能干扰身体器官和***的正常功能的任何不受控制的细胞生长，并且包括原发性和转移性肿瘤。原发性肿瘤或从其初始位置和接种重要器官转移的癌症可最终通过受影响器官的功能恶化来最终导致受试者死亡。转移是癌细胞或癌细胞群，不同于原发肿瘤位置，由癌细胞从原发肿瘤向身体其他部分的传播所致。转移可最终导致受试者死亡。例如，癌症可包括良性和恶性癌症、息肉、增生、以及休眠肿瘤或微转移。

可以治疗的说明性癌症包括但不限于癌，例如，各种亚型，包括例如腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、肉瘤(包括例如骨和软组织)、白血病(包括例如急性髓细胞、急性淋巴细胞、慢性髓细胞、慢性淋巴细胞和毛细胞)、淋巴瘤和骨髓瘤(包括例如何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、轻链、非分泌、MGUS和浆细胞瘤)和中枢神经***癌症(包括例如脑(例如，神经胶质瘤(例如，星形细胞瘤、少突神经胶质瘤和室管膜瘤)、脑膜瘤、垂体腺瘤和神经瘤、以及脊髓肿瘤(例如，脑膜瘤和神经纤维瘤)。

可以治疗的说明性癌症包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经***癌症；乳腺癌；腹膜癌；***；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；***癌；消化***癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内瘤变、肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；***癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸***癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿***癌；外阴癌；淋巴瘤包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小型非***细胞NHL；大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌和肉瘤；以及移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)、以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征。

在一些实施方案中，本发明涉及微生物感染和/或慢性感染的治疗或患者。说明性感染包括但不限于南美锥虫病、HIV/AIDS、结核病、骨髓炎、乙型肝炎、丙型肝炎、爱泼斯坦-巴尔病毒或细小病毒、T细胞白血病病毒、细菌过度生长综合征、真菌或寄生虫感染。

在各种实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防一种或多种炎性疾病或病症，例如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸***疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、脓毒性休克、类风湿关节炎、炎症性肠病、炎症性盆腔疾病、疼痛、眼部炎症性疾病、乳糜泻、Leigh综合征、甘油激酶缺乏症、家族性嗜酸性粒细胞增多症(FE)、常染色体隐性痉挛性共济失调、喉部炎症；肺结核、慢性胆囊炎、支气管扩张、矽肺病及其他肺尘埃沉着病。

在各种实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防一种或多种自身免疫疾病或病症，例如多发性硬化、糖尿病、狼疮、乳糜泻、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征、硬皮病、古德帕斯彻氏综合征、韦格纳肉芽肿病、自身免疫性癫痫、拉斯穆森脑炎、原发性胆汁硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、艾迪生氏病、桥本氏甲状腺炎、纤维肌痛、梅尼尔综合征；移植排斥(例如，预防同种异体移植物排斥)恶性贫血、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、赖特氏综合征、格雷夫氏病及其他自身免疫疾病。

在各种实施方案中，本发明的组合物用于治疗，控制或预防心血管疾病，例如影响心脏和脉管***的疾病或病症，包括但不限于冠心病(CHD)、脑血管疾病(CVD)、主动脉狭窄、外周血管疾病、动脉粥样硬化、动脉硬化、心肌梗塞(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、短暂性脑缺血发作(TIA)、心绞痛(稳定和不稳定)、心房颤动、心律失常、呕吐疾病和/或充血性心力衰竭。

在各种实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防一种或多种代谢相关病症。在各种实施方案中，本发明可用于治疗，控制或预防糖尿病，包括1型和2型糖尿病和与肥胖相关的糖尿病。本发明的组合物和方法可用于治疗或预防糖尿病相关病症，包括但不限于糖尿病肾病、高血糖症、葡萄糖耐量降低、胰岛素抵抗、肥胖、脂质紊乱、血脂异常、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、低HDL水平、高LDL水平、动脉粥样硬化及其后遗症、血管再狭窄、肠易激综合征、炎症性肠病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、其他炎症、胰腺炎、腹部肥胖、神经退行性疾病、视网膜病、肿瘤性疾病、脂肪细胞瘤、脂肪细胞癌，如脂肪肉瘤、***癌和其他癌症，包括胃癌、乳腺癌、膀胱癌和结肠癌、血管生成、阿尔茨海默氏病、牛皮癣、高血压、代谢综合征(例如，一个人患有以下三种或更多种疾病：腹部肥胖、高甘油三酯血症、低HDL胆固醇、高血压和高空腹血糖)、卵巢高雄激素血症(***)、以及其他胰岛素抵抗是一种因素的疾病，如睡眠呼吸暂停。本发明的组合物和方法可用于治疗，控制或预防肥胖，包括遗传或环境，以及与肥胖有关的疾病。本文的肥胖相关病症与肥胖相关，由肥胖导致或由肥胖引起。肥胖相关疾病的实例包括肥胖、糖尿病、暴食、狂食和贪食症、高血压、血浆胰岛素浓度升高和胰岛素抵抗、血脂异常、高脂血症、子宫内膜癌、乳腺癌、***癌、肾癌和结肠癌、骨关节炎、阻塞性睡眠呼吸暂停、胆结石、心脏病、心律不齐和心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、冠心病、猝死、中风、多囊卵巢疾病、颅咽管瘤、Prader-Willi综合征、Frohlich综合征、GH缺乏症受试者、正常变异身材矮小、特纳综合征和显示代谢活动减少或静息能量消耗占总非脂肪质量的百分比减少的其他病理状况，例如患有急性淋巴细胞白血病的儿童。肥胖相关疾病的进一步实例是代谢综合征、胰岛素抵抗综合征、生殖激素异常、性和生殖功能障碍，例如生育能力受损、不育、雄性性腺功能减退和女性多毛症、与母亲肥胖相关的胎儿缺陷、胃肠动力障碍，如肥胖相关的胃食管反流、呼吸***疾病，如肥胖-通气不足综合征(Pickwickian综合征)、呼吸困难、心血管疾病、炎症，如脉管***性全身炎症、动脉硬化、高胆固醇血症、腰痛、胆囊疾病、高尿酸血症、痛风和肾癌、以及麻醉风险增加。本发明的组合物和方法也可用于治疗阿尔茨海默氏病。

在各种实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防一种或多种呼吸***疾病，例如特发性肺纤维化(IPF)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管扩张、过敏性鼻炎、鼻窦炎、肺血管收缩、炎症、过敏、呼吸障碍、呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、肺动脉高压、肺血管收缩、肺气肿、汉坦病毒肺综合征(HPS)、Loeffler综合征、古德帕斯彻氏综合征、胸膜炎、肺炎、肺水肿、肺纤维化、结节病、呼吸道合胞病毒感染相关并发症及其他呼吸道疾病。

在一些实施方案中，本发明是用于治疗或预防一种或多种神经变性疾病。说明性神经变性疾病包括但不限于弗里德赖希氏共济失调、多发性硬化症(包括但不限于良性多发性硬化症；复发缓解型多发性硬化症(RRMS)；继发性进行性多发性硬化症(SPMS)；进行性复发性多发性硬化症(PRMS)；原发性进行性多发性硬化症(PPMS))、阿尔茨海默氏病(包括但不限于早发性阿尔茨海默氏病、晚发性阿尔茨海默氏病和家族性阿尔茨海默氏病(FAD)、帕金森氏病和帕金森氏综合征(包括但不限于特发性帕金森氏病、血管性帕金森氏综合征、药物性帕金森氏综合征、带有卢伊体的痴呆、遗传性帕金森氏病、少年帕金森氏病)、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化症(ALS，包括但不限于散发性ALS、家族性ALS、西太平洋ALS、青少年ALS、平山病(Hiramaya Disease))。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白可用于治疗伤口，例如，非愈合伤口、溃疡、烧伤或冻伤、慢性或急性伤口、开放或闭合伤口、内部或外部伤口(说明性外伤是穿透性和非穿透性伤口。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白可用于治疗缺血，作为非限制性实例，与急性冠状动脉综合征、急性肺损伤(ALI)、急性心肌梗塞(AMI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)相关的缺血、动脉闭塞性疾病、动脉硬化、关节软骨缺损、无菌性全身炎症、动脉粥样硬化性心血管疾病、自身免疫性疾病、骨折、骨折、脑水肿、脑灌注不足、Buerger病、烧伤、癌症、心血管疾病、软骨损伤、脑梗塞、脑缺血、脑卒中、脑血管疾病、化疗引起的神经病变、慢性感染、慢性肠系膜缺血、跛行、充血性心力衰竭、***损伤、挫伤、冠状动脉疾病(CAD)、严重肢体缺血(CLI)、克罗恩氏病、深静脉血栓形成、深部伤口、溃疡愈合延迟、伤口愈合延迟、糖尿病(I型和II型)、糖尿病神经病变、糖尿病性缺血、弥散性血管内凝血(DIC)、栓塞性脑缺血、冻伤、移植物抗宿主病、遗传性出血性血管扩张性缺血性血管病、高氧损伤、缺氧、炎症、炎症性肠病、炎症性疾病、受伤肌腱、间歇性跛行、肠缺血、缺血、缺血性脑病、缺血性心脏病、缺血性外周血管疾病、缺血性胎盘、缺血性肾病、缺血性血管病、缺血再灌注损伤、裂伤、左主干病变、肢体缺血、下肢肢体缺血、心肌梗死、心肌缺血、器官缺血、骨关节炎、骨质疏松症、骨肉瘤、帕金森氏病、外周动脉疾病(PAD)、外周动脉疾病、外周血运缺血、周围神经病变、外周血管疾病、癌症前期、肺水肿、肺栓塞、重塑障碍、肾缺血、视网膜缺血、视网膜病变、败血症、皮肤溃疡、实体器官移植、脊髓损伤、中风、软骨下骨囊肿、血栓形成、血栓性脑缺血、组织缺血、短暂性脑缺血发作(TIA)、创伤性脑损伤、溃疡性结肠炎、肾脏血管疾病、血管炎症、von Hippel-Lindau综合征、或组织或器官的伤口

在各种实施方案中，本发明涉及贫血症中的一种或多种的治疗，包括由慢性肾病(例如，来自透析)和/或抗癌剂(例如，化学疗法和/或HIV治疗(例如，齐多夫定(INN)或叠氮胸苷(AZT))、炎症性肠病(例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)引起的贫血症、与炎性病症(例如关节炎、狼疮、IBD)相关的贫血、与糖尿病、精神***症、脑疟疾有关的贫血、再生障碍性贫血、和治疗癌症(如化疗和/或辐射)的骨髓增生异常，以及各种骨髓增生异常综合征疾病(如镰状细胞贫血、血红蛋白SC疾病、血红蛋白C病、α-和β-地中海贫血、早产新生儿贫血、和相当病症)。

在一些实施方案中，本发明涉及贫血的治疗或患者，即红细胞数和/或红细胞中发现的血红蛋白量低于正常的病症。在各种实施方案中，贫血可以是急性的或慢性的。例如，本发明喷血包括但不限于铁缺乏贫血、肾贫血、慢性疾病/炎症性贫血、恶性贫血(如大红细胞性胃液缺乏性贫血、青少年恶性贫血以及先天性恶性贫血)、癌症相关贫血、抗癌相关的贫血症(例如化学疗法相关贫血、放射疗法相关贫血)、纯红细胞再生障碍、母细胞过量的难治性贫血、再生障碍性贫血、X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血、溶血性贫血、镰状细胞贫血、由ESA产生受损引起的贫血、骨髓增生异常综合征、低色指数性贫血、小红细胞性贫血、铁粒幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、库利氏贫血、地中海贫血、戴阿蒙布粒凡贫血、范康尼氏贫血以及药物诱导的免疫性溶血性贫血。贫血可导致严重症状，包括缺氧、慢性疲劳、不专心、皮肤灰白、低血压、眩晕以及心脏衰竭。

在一些实施方案中，本发明涉及慢性肾衰竭引起的贫血的治疗。在一些实施方案中，本发明涉及治疗由使用一种或多种肾替代疗法引起的贫血，包括透析、血液透析、腹膜透析、血液过滤、血液透析过滤和肾移植。

在一些实施方案中，本发明涉及未进行透析的慢性肾病患者的贫血的治疗。例如，本发明涉及处于1期CKD、或2期CKD、或3期CKD、或4期CKD或5期CKD的患者。在一些实施方案中，本发明患者为4期CKD或5期CKD。在一些实施方案中，本发明患者已经历肾移植。在一些实施方案中，本发明涉及贫血的治疗是患有急性肾损伤(AKI)的患者。

在一些实施方案中，贫血通过化学疗法诱导。例如，化学疗法可以是任何骨髓抑制化学疗法。在一些实施方案中，化学疗法是来那度胺、沙利度胺、***、阿霉素和盐酸阿霉素脂质体中的一种或多种。在一些实施方案中，化学疗法是一种或多种基于铂的药物，包括顺铂(例如，PLATINOL)和卡铂(例如，PARAPLATIN)。在一些实施方案中，化学疗法是本文所述的任一种化学治疗剂。在一些实施方案中，化学疗法是Groopman等人J Natl CancerInst(1999)91(19):1616-1634所述的任何试剂，其全部内容通过引用并入文中。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗晚期癌症患者的化疗相关性贫血(例如，IV期、或III期或II期癌症)。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法用于治疗接受剂量密集化学疗法或其他侵入性化疗方案的癌症患者中的化疗相关性贫血。

在一些实施方案中，本发明涉及患有一种或多种基于血液的癌症(例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤)的患者中的贫血的治疗。这些癌症可能直接影响骨髓。此外，本发明涉及已扩散至骨或骨髓的转移性癌症。在一些实施方案中，本发明涉及在进行辐射疗法的患者中的贫血的治疗。这种辐射疗法可能损害骨髓，降低其制造红细胞的能力。在其他实施方案中，本发明涉及患有铁、维生素B12和叶酸中的一种或多种的减少或缺乏的患者中的贫血的治疗。在其他实施方案中，本发明涉及患有过度出血的患者中的贫血的治疗，包括但不限于手术后或来自引起内出血的肿瘤。在其他实施方案中，本发明涉及患有慢性疾病贫血的患者中的贫血的治疗。

在一些实施方案中，本发明方法和组合物刺激红细胞产生。在一些实施方案中，本发明方法和组合物刺激骨髓中定型红细胞祖细胞的***和分化。

本发明的某些实施方案特别适用于治疗癌症患者的化疗诱导的贫血。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物允许在癌症患者结束化疗后继续施用嵌合蛋白。在一些实施方案中，相对于非癌症患者，本发明的方法和组合物允许治疗癌症患者而没有减少剂量。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物允许治疗接受化疗并被认为是可治愈的癌症患者。在各种实施方案中，癌症患者具有血栓、近期手术、长期卧床休息或活动受限以及用化学治疗剂治疗的一种或多种病史。

试剂盒

本发明还提供了用于施用本文所述任何试剂的试剂盒(例如，含有或不含有各种另外的治疗剂的嵌合蛋白)。所述试剂盒是材料或组分的组合，包括至少一种本文所述的本发明的药物组合物。因此，在一些实施方案中，试剂盒含有至少一种本文所述的药物组合物。

配置在试剂盒中的组分的确切性质取决于其预期目的。在一个实施方案中，所述试剂盒被配置用于治疗人类受试者。

使用说明书可包括在试剂盒中。使用说明书通常包括描述在使用试剂盒的组分来实现所需结果(如抑制癌症)时采用的技术的明确表述。任选地，试剂盒也含有其他适用组分，如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、施用器、吸移或测量工具、绑扎材料或如将易于由本领域技术人员认识到的其他适用附件。

可向从业者提供试剂盒中组装的以保持材料或组分的可操作性和效用的任何便利和适合方式储存的材料或组分。。例如，可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供组分。组分通常包含在合适的包装材料中。在各种实施方案中，包装材料通过熟知方法构造，优选提供无菌、无污染物的环境。所述包装材料具有指示试剂盒和/或其组分的内容物和/或目的的外部标签。

定义

如本文所用的，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可意指一个或多于一个。

除非明确规定或根据上下文显而易见，如本文所用的术语“或”应理解为包括性的并且包括“或”及“和”。

此外，当与参考数字指示结合使用时，术语“约”表示引用的数字指示加上或减去该参考数字指示的最多10％，例如，在所述值的(加或减)10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％。例如，语言“约50”覆盖了45至55的范围。

当与医疗用途结合使用时，“有效量”为有效于提供对感兴趣疾病的可测量治疗、预防或其发病率的减小的量。

如本文所用，如果相对于不存在这种调节，在存在试剂或刺激物的情况下的活性和/或效果的读出减少了显著量，例如减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多、至多并包括至少约100％，则某些物质“减少”。如本领域普通技术人员将理解的，在一些实施方案中，活性降低并且一些下游读出将减少但是其他读出可增加。

反之，如果相对于不存在这种试剂或刺激物，在存在试剂或刺激物的情况下的活性和/或效果的读出增加了显著量，例如增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多、至多并包括至少约100％或更多、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，则活性“增加”。

如本文所提及，除非另外指定，所有组成百分比均按总组合物的重量计。如本文所用的，单词“包括”及其变型意图为非限制性的，以使得列表中的项目的详述不排除也可适用于此技术的组合物和方法的其他类似项目。类似地，术语“可以”和“可”及其变型意图为非限制性的，以使得实施方案可以或可包括某些元素或特征的详述不排除不包括那些元素或特征的本技术的其他实施方案。

尽管作为诸如包括、含有或具有等术语的同义词的开放式术语“包括”在本文中用于描述并要求保护本发明，可选地可以使用诸如“由…组成”或“基本上由…组成”等替代性术语来描述本发明或其实施方案。

如本文所用的，单词“优选的”和“优选地”是指本技术在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详述并不意味着其他实施方案不适用的，并且并不意图从本技术的范围内排除其他实施方案。

本文描述的实现治疗效果所需要的组合物的量可出于特定目的根据常规程序凭经验确定。一般来说，对于出于治疗目的施用治疗剂，治疗剂以药理学有效剂量给予。“药理学有效量”、“药理学有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生所需生理效果的量或能够实现所需结果，尤其是治疗病症或疾病的量。如本文所用的有效量包括足以例如延迟病症或疾病的症状的发展、改变病症或疾病的症状的进程(例如，减缓疾病症状的进展)、减少或消除病症或疾病的一个或多个症状或表现并且逆转病症或疾病的症状的量。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，不论是否实现改善。

可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定有效量、毒性、和治疗效力，所述标准药物程序是例如用于测定LD50(对约50％群体致死的剂量)和ED50(在约50％群体中治疗有效的剂量)。所述剂量可根据所采用的剂型和利用的施用途径而改变。毒性效应与治疗效应之间的剂量比为治疗指数并且可表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，表现出大治疗指数的组合物和方法是优选的。初始可由体外测定(包括例如细胞培养测定)评估治疗有效剂量。并且，可在动物模型中配制剂量，以实现循环血浆浓度范围，所述循环血浆浓度范围包括如在细胞培养物中或在适当的动物模型中所测定的IC50。可例如通过高效液相色谱测量血浆中所述组合物的水平。可通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的效果。可由医师确定剂量，并且必要时进行调整以适合所观察到的治疗效果。

在某些实施方案中，所述效果将引起至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约90％的可量化变化。在一些实施方案中，所述效果将引起约10％、约20％、约30％、约50％、约70％或甚至约90％或更大的可量化变化。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，不论是否实现改善。

如本文所用，“治疗方法”同样适用于组合物用于治疗本文所述疾病或病症的用途和/或组合物使用和/或用于制备用于治疗本文所述疾病或病症的药剂。本发明还通过以下非限制性实施例进行说明。

实施例

人干扰素γ中的潜在突变是基于相关干扰素受体复合物的同源建模和结构分析进行选择，所述突变可导致与IFNγ受体(例如IFNγ受体1或2亚基)的相互作用的丧失，并且可通过AcTakine(即，信号传导剂与靶向剂的嵌合体)效应恢复相互作用和受体激活。

实施例1：鉴定与IFN-γ受体1亚基相互作用的IFN-γ接触残基

构建了人IFN-γ与IFN-γ受体1亚基的复合物的同源模型。

检查IFN-γ与IFN-γ受体1亚基之间的接触残基的列表。基于该分析，这些残基的侧链发生突变以除去接触，而不引入空间位阻。

实施例2：含IFN-γ的嵌合蛋白的构建及表征

在此实施例中，构建并表征嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含靶向人CD20的重组的仅重链抗体(VHH)、柔性20*Gly-Gly-Ser接头、和修饰的人IFNγ(hIFN-γ)。

被认为影响hIFN-γ与干扰素γ受体1(IFNGR1)的结合的氨基酸位点中hIFN-γ的突变体是使用野生型(本文称为P-552且具有SEQ ID NO：947的氨基酸序列)的标准定点诱变进行的。对于SEQ ID NO：947，点突变包括：V22A、A23G、A23G+D24G、D24G、H111A、H111D、I114A、Q115A、A118G、和I114A+A118G。这九种突变体在本文中分别称为P-667至P-676；修饰的hIFN-γ分别具有SEQ ID NO：953至SEQ ID NO：962的氨基酸序列。并且，制造hIFN-γ的五个C末端缺失：5个氨基酸的缺失(Δc5)、7个氨基酸的缺失(Δc7)、14个氨基酸的缺失(Δc14)、15个氨基酸的缺失(Δc15)、和16个氨基酸的缺失(Δc16)。五个C末端缺失在本文中分别称为P-662至P-666；修饰的hIFN-γ分别具有SEQ ID NO：948至SEQ ID NO：952的氨基酸序列)。注意到，在此实施例中使用的野生型hIFN-γ和修饰的hIFN-γ各自都缺少hIFN-γ的N末端信号序列；比较SEQ ID NO：946和SEQ ID NO：947的氨基酸序列。图1中示出了示例性修饰的hIFN-γ。

将嵌合蛋白hCD20VHH–(GGS)₂₀–野生型hIFN-γ–6xHis或嵌合蛋白hCD20VHH–(GGS)₂₀–修饰的hIFN-γ–6xHis的编码序列克隆到pMTW载体中用于哺乳动物表达。使用聚乙烯亚胺将所得构建体转染到Hek293T细胞中。使用Ni excel(GE Healthcare)从上清液中纯化蛋白质；使用PD10柱(GE Healthcare)从样品中除去咪唑。

最初在GAS-荧光素酶报告基因测定中测试每个IFN-γ突变的作用，其报道细胞的IFNGR1已结合IFN-γ。使用pGAS-TA-荧光素酶报告基因，在CD20阳性Hek293T细胞和CD20阴性(模拟)Hek293T细胞中比较包含野生型或修饰的hIFN-γ的嵌合蛋白诱导STAT1信号传导的能力。此处，使用磷酸钙，用含有或不含表达CD20的质粒的GAS-荧光素酶报告基因转染细胞。转染后两天，将细胞重新悬浮并用包含野生型或突变IFN-γ的嵌合蛋白的连续稀释液(如图2A至图2P所示)刺激过夜。使用EnSight^TM读数器(Perkin Elmer)测量荧光素酶。

如图2D至图2H和图2P所示，14个氨基酸的缺失、15个氨基酸的缺失、和16个氨基酸的缺失的变体(分别为P-664、P-665和P-666)、V22A单点突变体(P-667)、A23G单点突变体(P-668)、双点突变体A23G-D24G(P-669)、D24G单点突变体(P-670)和双点突变体I114A-A118G(P-676)在表达CD20的细胞中与模拟转染的细胞相比具有增加的荧光素酶信号。因此，这些包含CD20靶向部分的嵌合蛋白在其表面上表达CD20的细胞中特异性地激活信号传导。

然后在检测STAT1磷酸化的第二测定中测试IFN-γ突变的作用，所述STAT1磷酸化是细胞的IFNGR1已被IFN-γ结合的指示物。此处，用表达CD20的质粒(CD20阳性)或空载体(CD20阴性)转染Hek293T。转染后两天，在37℃下用包含野生型或突变IFN-γ的嵌合蛋白的连续稀释液(如图3A至图3H所示)刺激细胞15分钟。然后，将细胞固定(10分钟，37℃，固定缓冲液I；BD Biosciences)，透化(30分钟，在冰上，Perm III缓冲液I；BD Biosciences)，洗涤，然后用抗-STAT1pY701抗体(BD Biosciences)染色。用FACSCalibur^TM(BD Biosciences)获取数据，并用软件(FlowJo,LLC)分析。

如图3B至图3D和图3F所示，14个氨基酸的缺失、15个氨基酸的缺失和16个氨基酸的缺失的变体(分别为P-664、P-665和P-666)及双点突变体A23G-D24G(P-669)与模拟转染的细胞(CD20阴性)相比在CD20阳性的细胞中诱导STAT1磷酸化。因此，这四种嵌合蛋白在其表面上表达CD20的细胞中特异性地激活信号传导。

相反，A23G单点突变体(P-668；图3E)、D24G单点突变体(P-670；图3G)和双点突变体I114A-A118G(P-676；图3H)在表达CD20的细胞中和在模拟转染的细胞中诱导等同的STAT1磷酸化。因此，这其他三种嵌合蛋白在第二测定中非特异性地激活信号传导，即使他们在第一测定中特异性地激活信号传导。

使用两种不同的实验测定，包含抗人CD20VHH和三种INF-γ缺失(Δc14、Δc15和Δc16)中的一种或双点突变体(A23G-D24G)的嵌合蛋白特异性结合并激活在表达CD20的细胞上的IFNGR1。

等效方案

尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但应了解可对其进行进一步修改并且本申请旨在涵盖任何通常根据本发明的原理而对本发明进行的任何变动、使用或适应性调整，并且包括虽然不属于本公开内容但属于本发明所属领域的已知或习用实施手段的和属于上文所述的实质特征的以及符合所附权利要求范围的变更。

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文确切描述的具体实施方案的许多等效方案。这些等效方案意图涵盖在以下权利要求书的范围中。

以引用的方式并入

本文引用的所有专利和出版物以引用的方式整体并入本文。

本文中讨论的公布仅仅提供它们在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认由于先前发明而使本发明无权先于这些公布。

如本文所用的，所有标题仅用于组织，并不意图以任何方式限制本公开。任何单个部分的内容可同样适用于所有部分。

Claims (59)

1.一种嵌合蛋白，其包含：

(a)修饰的IFN-γ，与野生型IFN-γ相比，所述修饰的IFN-γ具有一个或多个突变，所述突变赋予改善的安全性，

(b)一个或多个靶向部分，所述靶向部分包含特异性结合至目标抗原或受体的识别结构域；并且

其中所述修饰的IFN-γ和所述一个或多个靶向部分任选地与一个或多个接头连接。

2.如权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述IFN-γ是人IFN-γ。

3.如权利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ对IFN-γ受体表现出降低的亲和力和/或生物活性。

4.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ对IFN-γ受体1亚基表现出降低的亲和力和/或生物活性。

5.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ对IFN-γ受体2亚基表现出降低的亲和力和/或生物活性。

6.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ在C末端处具有截短。

7.如权利要求6所述的嵌合蛋白，其中C末端处的所述截短是约5至约20个氨基酸残基。

8.如权利要求7所述的嵌合蛋白，其中C末端处的所述截短是约16个氨基酸残基。

9.如权利要求7所述的嵌合蛋白，其中C末端处的所述截短是约15个氨基酸残基。

10.如权利要求7所述的嵌合蛋白，其中C末端处的所述截短是约14个氨基酸残基。

11.如权利要求7所述的嵌合蛋白，其中C末端处的所述截短是约7个氨基酸残基。

12.如权利要求7所述的嵌合蛋白，其中C末端处的所述截短是约5个氨基酸残基。

13.如权利要求3所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ在位置Q1、V5、E9、K12、H19、S20、V22、A23、D24、N25、G26、T27、L30、K108、H111、E112、I114、Q115、A118、E119和K125处包含一个或多个突变。

14.如权利要求13所述的嵌合蛋白，其中所述一个或多个突变是选自V5E、S20E、V22A、A23G、A23F、D24G、G26Q、H111A、H111D、I114A、Q115A和A118G的置换。

15.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含V22A突变。

16.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含A23G突变。

17.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含D24G突变。

18.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含H111A突变或H111D突变。

19.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含I114A突变。

20.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含Q115A突变。

21.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含A118G突变。

22.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含A23G突变和D24G突变。

23.如权利要求14所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ包含I114A突变和A118G突变。

24.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的IFN-γ是单链IFN-γ。

25.如权利要求24所述的嵌合蛋白，其中所述单链IFN-γ包含与第二IFN-γ链连接的第一IFN-γ链。

26.如权利要求25所述的嵌合蛋白，其中所述第一IFN-γ链的C末端与所述第二IFN-γ链的N末端连接。

27.如权利要求25所述的嵌合蛋白，其中所述第一IFN-γ链包含N末端和/或C末端截短。

28.如权利要求25所述的嵌合蛋白，其中所述第二IFN-γ链包含N末端和/或C末端截短。

29.如权利要求25所述的嵌合蛋白，其中所述第一IFN-γ链和/或第二IFN-γ链包含一个或多个氨基酸置换。

30.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述一个或多个突变赋予降低的亲和力和/或生物活性，其可通过与一个或多个靶向部分连接而恢复。

31.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述靶向部分是针对肿瘤细胞。

32.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述靶向部分是针对免疫细胞。

33.如权利要求32所述的嵌合蛋白，其中所述免疫细胞选自T细胞、调节性T细胞(Treg)、B细胞、骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、树突细胞、巨噬细胞和NK细胞。

34.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述靶向部分包含识别结构域，所述识别结构域是全长抗体、单结构域抗体、重组的仅重链抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、鲨鱼的仅重链抗体(VNAR)、微蛋白(例如，半胱氨酸结蛋白，knottin)、darpin、anticalin、adnectin、适体、Fv、Fab、Fab'、F(ab′)₂、肽模拟分子、受体的天然配体、或合成分子。

35.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述识别结构域是单结构域抗体(NANOBODY)。

36.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述识别结构域是V_HH、人源化V_HH或骆驼化V_HH。

37.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述识别结构域功能性地调节所述目标抗原或受体。

38.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述识别结构域结合但不会功能性地调节所述目标抗原或受体。

39.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其包含两个或更多个靶向部分。

40.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，还包含一个或多个另外的修饰的信号传导剂。

41.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含两个信号传导剂或两个靶向部分或两个这两者。

42.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含三个信号传导剂或三个靶向部分或三个这两者。

43.如权利要求40所述的嵌合蛋白，其中所述修饰的信号传导剂相对于野生型信号传导剂包含一个或多个突变，所述突变赋予对受体降低的亲和力和/或生物活性或活性。

44.如权利要求40所述的嵌合蛋白，其中所述一个或多个突变允许活性减弱。

45.如权利要求44所述的嵌合蛋白，其中激动或拮抗活性减弱。

46.如权利要求44或45所述的嵌合蛋白，其中所述信号传导剂包含一个或多个突变，所述突变将其活性从激动转化为拮抗。

47.如权利要求43所述的嵌合蛋白，其中所述突变赋予降低的亲和力和/或生物活性或活性，其可通过与一个或多个靶向部分连接而恢复。

48.如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白适用于患有以下一种或多种疾病的患者：癌症、感染、免疫病症、自身免疫疾病、心血管疾病、伤口、缺血相关疾病、神经变性疾病和/或代谢疾病。

49.一种重组核酸组合物，其编码一种或多种如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白。

50.一种宿主细胞，其包含如权利要求49所述的核酸。

51.一种治疗癌症的方法，其包括将有效量的上述权利要求中任一项所述的嵌合蛋白施用于有此需要的患者。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述癌症选自以下中的一种或多种：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经***癌症；乳腺癌；腹膜癌；***；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；***癌；消化***癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内瘤变、肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；***癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸***癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿***癌；外阴癌；淋巴瘤包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小型非***细胞NHL；大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌和肉瘤；及移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)、以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征。

53.一种治疗自身免疫疾病或病症的方法，其包括将有效量的如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白施用于有此需要的患者。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述自身免疫疾病或病症选自以下中的一种或多种：多发性硬化症、克罗恩氏病、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎或青少年类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎免疫病症如嗜酸性筋膜炎、低免疫球蛋白血症、或胸腺瘤/胸腺癌、移植物抗宿主病、白血病前期、非血液综合征(例如Down's、Dubowwitz、Seckel)、Felty综合征、溶血性尿毒综合征、骨髓增生异常综合征、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓纤维化、全血细胞减少、纯红细胞再生障碍、Schoenlein-Henoch紫癜、疟疾、蛋白质饥饿、月经过多、***性硬化、肝硬化、代谢紊乱状态、和充血性心力衰竭。

55.一种治疗感染的方法，其包括将有效量的如以上权利要求中任一项所述的嵌合蛋白施用于有此需要的患者。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述感染选自HIV/AIDS、结核病、骨髓炎、乙型肝炎、丙型肝炎、爱泼斯坦-巴尔病毒或细小病毒、T细胞白血病病毒、细菌过度生长综合征、真菌或寄生虫感染。

57.如权利要求1-48中任一项所述的嵌合蛋白在治疗癌症中的用途，所述癌症任选地选自基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经***癌；乳腺癌；腹膜癌；***；绒毛膜癌；结肠癌和直肠癌；***癌；消化***癌；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞瘤；上皮内瘤变、肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；***癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸***癌；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿***癌；外阴癌；淋巴瘤包括何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴细胞性NHL；高级小型非***细胞NHL；大肿块NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和瓦氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌和肉瘤；及移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)、以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生、水肿(例如，与脑肿瘤相关的水肿)和梅格斯氏综合征。

58.如权利要求1-48中任一项所述的嵌合蛋白在治疗自身免疫疾病或病症中的用途，所述自身免疫疾病或病症任选地选自多发性硬化症、克罗恩氏病、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎或青少年类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎免疫病症如嗜酸性筋膜炎、低免疫球蛋白血症、或胸腺瘤/胸腺癌、移植物抗宿主病、白血病前期、非血液综合征(例如Down's、Dubowwitz、Seckel)、Felty综合征、溶血性尿毒综合征、骨髓增生异常综合征、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓纤维化、全血细胞减少、纯红细胞再生障碍、Schoenlein-Henoch紫癜、疟疾、蛋白质饥饿、月经过多、***性硬化、肝硬化、代谢紊乱状态、和充血性心力衰竭。

59.如权利要求1-48中任一项所述的嵌合蛋白在治疗感染中的用途，所述感染任选地选自HIV/AIDS、结核病、骨髓炎、乙型肝炎、丙型肝炎、爱泼斯坦-巴尔病毒或细小病毒、T细胞白血病病毒、细菌过度生长综合征、真菌或寄生虫感染。