CN112680454B - 一种人干扰素-κ的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人干扰素‑κ的生产方法。所述包括：构建大肠杆基因工程菌株、培养、收集菌体、离心破碎收集包涵体、包涵体变性、复性和纯化，其中大肠杆基因工程菌株含有密码子优化的IFN‑κ的核苷酸序列。本发明的方法实现了在全水相条件下的包涵体纯化和目标蛋白复性折叠，复性效果好，折叠正确率高，适合工业化生产。

Description

一种人干扰素-κ的生产方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种人干扰素-κ的生产方法。

背景技术

新型冠状病毒感染的临床症状主要以呼吸***表现为主，目前，尚无特效治疗方法，也没有有效的预防性的疫苗或抗体，缺乏新型冠状病毒抗病毒治疗的高质量循证依据的研究结果。

IFN-κ属于I型干扰素，能够活化干扰素刺激基因，抑制脑心肌炎病毒(ECMV)和人类***瘤病毒(HPV)的复制。I型干扰素家族的多位成员，作为抗病毒药物候选，已经完成临床的药物试验，如重组IFN-α2被应用于抗乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染的治疗药物，IFN-β被应用于治疗多发性硬化症(MS)。对重症急性呼吸综合征急性期患者联合使用激素与IFN-α治疗，可缩短患者的住院时间，促进肺部病变的吸收，减少对激素的需求量，但不会缩短发热持续时间，而且IFN-α治疗可能与机体持续的炎症反应相关，不利于患者的恢复。IFN-κ是一种相对温和的I型干扰素，能有效抑制囊膜病毒的复制，是构成性表达的干扰素成员之一，组成抗病毒的天然免疫屏障，呼吸道给药无明显毒性，能够有效抑制流感病毒PR8、H9N2和H7N9以及寨卡病毒的复制，在降低病毒致病性中发挥重要保护作用，与IFN-α相似，其作用机制主要是通过上调干扰素刺激基因以抑制病毒复制。

目前有关IFN-κ的研究文献很少，涉及IFN-κ具体制备技术的详细资料未见报道，尤其是工业化生产方面的技术方案。从IFN-κ氨基酸组成序列分析及仅有的几篇相关文献分析，IFN-κ疏水性较高，在水相***中容易发生聚合失活；IFN-κ氨基酸序列中含有5个巯基，其中C1-C3及C2-C4形成两对二硫键，构成IFN-κ生物活性所必须的立体结构。在仅有的一篇有关IFN-κ提取制备的文献中，提供的技术方案是采用有机溶媒--正丁醇进行萃取的方法，虽然解决了IFN-κ疏水易聚合的问题，但IFN-κ的两对二硫键无法正确形成，其立体结构无法正确折叠形成，其生物活性必然受到影响。

为了克服现有技术的不足，在本发明中，通过利用密码子优化的IFN-κ的序列构建基因工程菌株，通过种子培养和生物发酵培养、包涵体变性、复性和纯化中的各个组分的协同增效，实现了优异的复性效果和高的蛋白折叠正确率。

发明内容

本发明的目的在于通过菌株构建、培养、变性、复性和纯化各个操作步骤之间的有机结合，提供一种能够制备出具有高的蛋白纯度和蛋白活性的IFN-κ且适合于工业化生产的人IFN-κ(hIFN-κ)的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

根据本发明的第一个方面，提供一种优化的编码hIFN-κ的核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上***、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

根据本发明的第二个方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码hIFN-κ的核苷酸序列，所述核苷酸序列为选自以下的任一种：a)编码如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；b)与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同源性，且能够编码SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的核苷酸序列；c)在SEQ ID NO:2序列基础上***、缺失/添加一个或多个核苷酸残基，且能够编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和d)如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。

其中，所述核酸构建体是可介导hIFN-κ基因表达的载体。优选地，所述核酸构建体为质粒载体或病毒载体；更优选地，所述核酸构建体为质粒载体，且所述质粒选自但不限于pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种。

根据本发明的第三个方面，提供了一种重组hIFN-κ基因工程菌株，所述基因工程菌株包含如上所述的优化的编码hIFN-κ的核苷酸序列或包含如上所述的核酸构建体。

具体地，所述基因工程菌株包含核酸构建体，所述的核酸构建体包含如上所述的编码hIFN-κ的核苷酸序列。

其中，所述基因工程菌株的出发细胞为真核细胞，优选为植物细胞、动物细胞、真菌细胞，更优选为酵母细胞。

其中，所述基因工程菌株的出发细胞为原核细胞，优选为细菌，更优选为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌(Escherichia coli)细胞；最优选为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。

根据本发明的第四个方面，提供一种基因工程菌株的构建方法，包括通过转染(真核细胞)、转导(病毒载体)或转化(原核细胞)的方式将含有能够编码表达hIFN–κ的核苷酸序列的核酸构建体导入宿主细胞而获得所述基因工程菌株。

其中，所述导入是通过转化的方式将能够在原核生物中表达的载体转化到宿主细胞中。优选地，所述转化为电转化；更优选地，所述转化为热激转化。

根据本发明的第五个方面，提供一种生产hIFN–κ蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)基因工程菌株的构建；(2)菌株培养和离心收集菌体；(3)包涵体的收集；(4)包涵体的洗涤；(5)包涵体的变性；(6)包涵体的复性；和(7)包涵体的纯化。

在所述方法中，所述基因工程菌株为上述第三个方面的重组hIFN-κ基因工程菌株。

在所述方法中，通过上述第四个方面的构建方法进行所述基因工程菌株的构建。

在一个具体的实施方式中，所述步骤(1)基因工程菌株的构建包括：根据hIFN-κ的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，将密码子优化后的hIFN-κ的核苷酸序列合成至质粒载体上，将合成好的pET30a-hIFN-κ转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，得到经过基因工程修饰的基因工程菌株pET30a-hIFN-κ-BL21。

优选地，所述质粒载体选自pET30a、pCZN1、pET22b和pET28a中的任意一种；更优选地，所述质粒载体为pET30a。

优选地，在转化大肠杆菌宿主细胞之间进行双酶切和测序验证。

优选地，所述双酶切为XhoⅠ-ApaⅠ双酶切。

优选地，将密码子优化后的SEQ ID NO:2所示的hIFN-κ的核苷酸序列合成至pET30a载体，***位点为NdeⅠ(CATATG)-XhoⅠ(CTCGAG)，对合成的载体pET30a-hIFN-κ进行XhoⅠ-ApaⅠ双酶切及测序验证，将合成好的pET30a-hIFN-κ转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中。

在一个具体的实施方式中，所述步骤(2)的菌株培养包括种子培养和发酵罐培养。

其中，所述种子培养包括将步骤(1)构建的基因工程菌株接种于LB培养基中进行培养。

其中，将步骤(1)构建的基因构建的基因工程菌株接种于LB培养基中，36-38℃培养至OD600值达到3-5且pH回升至7.2-7.5时，进行转种。

在本文中，所述LB培养基的配方如下：

其中，所述发酵罐培养包括将种子培养后的菌株转移至发酵罐中继续培养。

优选地，将种子培养后的菌株转接于发酵罐中，36-38℃培养；更优选地，将种子培养后的菌株以2％-4％的转种量转接于发酵罐中，36-38℃培养，其中，控制溶氧量大于30％，且用氨水或碱液控制pH 6.8-7.2。

优选地，在发酵罐培养中，当OD600值达到10-60时进行加入诱导剂诱导。更优选地，在发酵罐培养中，当OD600值达到20-50时进行诱导。进一步优选地，在发酵罐培养中，当OD600值达到30-40时进行诱导。

优选地，当诱导结束后，降温至8-12℃，离心分离，收集菌体沉淀。优选地，以7000-9000rpm转速离心5-15min，收集菌体沉淀。

其中，所述诱导剂选自乳糖或IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。

其中，当所述诱导剂选自IPTG时，所述IPTG的浓度为0.5-5mM，一次或多次加入后，诱导3-6小时。

其中，当所述诱导剂选自乳糖时，乳糖使用量为发酵液质量0.4％-2.0％，流加进入发酵罐，用时3-8小时，流加结束继续诱导3-8小时。通过流加操作，使得发酵罐中的乳糖含量保持在一个稳定的水平，确保了菌株细胞生长过程中的碳源补充和稳定，避免了乳糖过量导致的适宜微生物生长的C/N失衡以及由此引起的微生物细胞的生长和繁殖的抑制。

其中，在发酵罐培养中使用的培养基为：

培养基组分	用量(g/L)
		蛋白胨	12
酵母浸粉	24
		甘油	4
磷酸氢二钾(无水)	10
		磷酸二氢钾	2.3
泡敌(聚醚)	0.2

在一个具体的实施方式中，所述步骤(3)包涵体的收集包括：将步骤(2)收集的菌体用破碎缓冲液重悬，高压均质2-3次，离心收集包涵体。

其中，所述破碎缓冲液为：10-50mM Tris，0.2-0.5M氯化钠，pH 8.0-8.5。优选地，所述破碎缓冲液为：20-40mM Tris，0.3-0.4M氯化钠，pH 8.1-8.4。更优选地，所述破碎缓冲液为：30mM Tris，0.35M氯化钠，pH 8.2。

其中，在步骤(3)中，高压均质后，以7000-9000rpm转速离心5-15min，收集包涵体沉淀。

在一个具体的实施方式中，所述步骤(4)包涵体的洗涤包括：将步骤(3)收集的包涵体用洗涤缓冲液重悬，均质破碎，离心收集洗涤后的包涵体。包涵体在溶解之前进行洗涤的目的在于可以将包涵体中含有的一些诸如外膜蛋白、质粒DNA等的杂质从重组蛋白中除去，从而提高包涵体的纯度。例如，温和去垢剂TritionX-100洗涤可以去除膜碎片和膜蛋白。

其中，所述洗涤缓冲液为5-20mM Tris，0.02-0.05M氯化钠，0.5-2mM EDTA，0.5-2％TritionX-100，pH 8.0-8.5。优选地，所述洗涤缓冲液为10-15mM Tris，0.03-0.04M氯化钠，0.8-1.5mM EDTA，0.6-1.5％TritionX-100，pH 8.1-8.4。

其中，在步骤(4)中，均质破碎后，以7000-9000rpm转速离心5-15min，收集包涵体沉淀。

在一个具体的实施方式中，所述步骤(5)包涵体的变性包括：将步骤(4)洗涤后的包涵体用变性液变性，均质破碎，离心收集包涵体变性后的上清液。

其中，在所述变性之前，将步骤(4)洗涤后的包涵体用去离子水重悬，均质破碎，离心收集预纯化的包涵体。优选地，在所述变性之前，以7000-9000rpm转速离心5-15min，收集包涵体沉淀。

其中，所述变性液为6-8M盐酸胍溶液。优选地，所述盐酸胍溶液为7.0M盐酸胍溶液。盐酸胍溶解蛋白能力极强，速度快，对包涵体氢键具有极强的可逆变性作用，使目标蛋白解聚成线性结构，并溶解于盐酸胍溶液中。

优选地，所述变性液为包含终浓度2-20mM浓度的二硫苏糖醇或巯基乙醇的6-8M盐酸胍溶液。二硫苏糖醇和巯基乙醇是一类用于蛋白变性的强还原剂，其能够使蛋白肽链中的全部二硫键(包括错误的或正确)打开，以便于在后续的复性过程中，重新形成正确的二硫键。

其中，用10-20倍的6.5-7.5M盐酸胍溶液变性。

其中，在步骤(5)中，均质破碎，以7000-9000rpm转速离心5-15min，收集包涵体变性后的上清液。

在一个具体的实施方式中，所述步骤(6)包涵体的复性包括：在2-8℃条件下，在1-3小时内，将包涵体变性后的上清液滴加入复性缓冲液中，滴加完毕后，于2-8℃静置20-72h，得到复性液。

其中，所述复性缓冲液为1-30mM Tris，1-20mM磷酸二氢钠，20-100mM氯化钠，0.2-0.6mM氧化型还原剂，0.5-3mM EDTA，0.05-0.2％TritionX-100，pH7.0-8.5。优选地，所述复性缓冲液为5-25mM Tris，5-15mM磷酸二氢钠，30-80mM氯化钠，0.3-0.5mM氧化型还原剂，1-2mM EDTA，0.08-0.15％TritionX-100，pH 8.1-8.4。

其中，所述氧化型还原剂选自氧化型谷胱甘肽和氧化型半胱氨酸中的一种或多种。

在一个具体的实施方式中，所述步骤(7)包涵体的复性包括：将步骤(6)获得的复性液经2-3步层析柱纯化，得到纯度大于95％的产品，目标蛋白浓度0.5-2mg/ml。

其中，所述层析是离子交换层析。

优选地，将步骤(6)获得的复性液经2步层析柱纯化，优选地所述2步层析柱纯化通过阳离子交换层析和阴离子交换层析进行。

优选地，将步骤(6)获得的复性液经3步层析柱纯化，优选地所述3步层析柱纯化通过阴离子交换层析、阳离子交换层析和阳离子交换层析进行。

在上述层析中，优选地，所述阴离子交换层析采用的交换介质为季铵基(Q)为配基的离子交换介质；所述阳离子交换层析采用的交换介质为磺酸基(SP)为配基的离子交换介质。

所述阳离子交换层析采用的交换介质为选自SP Bestarose HP、SP BestaroseFF、SP Bestarose XL和SP Sepharose XL中的任一种；更优选地，所述阳离子交换层析采用的交换介质为SP Bestarose HP。

优选地，所述阴离子交换层析采用的交换介质为选自Q Bestarose FF、DEAEBestarose Fast Flow、Q sepharose FF、UNOsphere Q、Q Bestarose XL和Mono Q中的任一种；更优选地，所述阴离子交换层析采用的交换介质为Q Bestarose FF。

在本文中，使用含有阳离子交换介质的阳离子交换层析柱进行阳离子交换层析，使用含有阴离子交换介质的阴离子交换层析柱进行阴离子交换层析。其中，SP型层析柱是指以磺酸基(SP)为配基的离子交换介质为交换介质的阳离子交换层析柱；Q型层析柱是指以季铵基(Q)为配基的离子交换介质为交换介质的阴离子交换层析柱。

不拘于理论的限制，在本发明中，阴离子交换层析是指阴离子交换剂的电荷基团(配基)带正电，而反离子带负电，反离子可与溶液中的阴离子或带负电荷的化合物进行交换反应。阳离子交换是指阳离子交换剂的电荷基团(配基)带负电，而反离子带正电，反离子可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。在一定pH条件下，根据蛋白质所带电荷的不同，离子交换剂上的可交换离子(即反离子)与溶液中被分离的离子吸附结合，从而实现分离。其中，与离子交换介质无结合能力或结合能力弱的蛋白质被洗脱下来，而亲和力强的蛋白被结合在柱上。

在本发明中，阴离子交换层析采用的交换介质为季铵基为配基的离子交换介质。季铵基是一种强碱性基团，其水中解离出OH-而成强碱性，在洗脱时，OH-与溶液中的阴离子进行交换使得其被吸附在介质上。强阴离子型交换介质适用的范围较广，在酸性环境下都能够进行反应。阳离子交换层析采用的交换介质为磺酸基为配基的离子交换介质，磺酸基为强酸性基团，其在溶液中容易离解出H+，故呈强酸性，在洗脱时，H+与溶液中的阳离子进行交换使得溶液中的阳离子被SO^3-吸附结合，从而实现H+与溶液中的阳离子互相交换。强酸性阳离子交换树脂的离解能力非常强，在酸性或碱性条件下均能离解并产生离子交换作用。

根据本发明的第六个方面，提供了根据上述方法制备的hIFN-κ在制备抗病毒、特别是抗囊膜病毒药物方面的应用。

在本文中，除非另有说明，否则所有的术语都具有本领域科学规定的或者公知的含义。

本发明的有益效果体现在：

(1)本发明采用能够为菌株提供碳源的乳糖进行诱导，在温和诱导条件下，通过流加培养方式及后期调控等诱导策略，实现hIFN-κ稳定的生产，且目标蛋白表达量达到4196mg/L发酵液，表达纯度15％。

(2)发明人还预料不到地发现，本发明利用基因工程菌株结合生物发酵法，通过本发明的乳糖诱导剂、盐酸胍变性剂、二硫苏糖醇或巯基乙醇还原剂以及氧化型还原剂的协同作用，实现了在全水相条件下的包涵体纯化和目标蛋白复性折叠，复性效果好，折叠正确率高，适合工业化生产。

附图说明

图1示出pET30a-hIFNk质粒构建原理示意图。

图2示出pET30a-hIFN-κ载体双酶切的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1：质粒；泳道2：用XhoⅠ-ApaⅠ酶切消化的质粒；泳道M：DNA标记。

图3示出阳离子交换和阴离子交换层析后纯化蛋白的SDS-PAGE图。

图4示出纯化蛋白的还原-非还原的SDS-PAGE图。

图5示出纯化蛋白的二硫键检测图谱，其中，出峰时间：43.120min:A(21-35)+A(151-161)；44.520min:A(21-35)+A(152-161)；48.453min:A(1-13)+A(87-114)；50.560min:A(1-12)+A(87-114)。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是出于举例的目的，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员将更好地理解和掌握本发明所要求保护的技术方案及其实现的技术效果。

在下面的具体实施例中，采用的菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，Arctic Express,，BL21(DE)3Plyss。采用的工具酶和试剂如下所示：限制性内切酶XhoⅠ(NEB)；限制性内切酶ApaⅠ(Takara)；胰蛋白胨(OXOID Ltd.)；酵母粉(OXOID Ltd.)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；IPTG(INALCO，SPA MILANO ITALY)。在具体实施例中所采用的其他试剂皆为商业可购买的试剂。

实施例1：编码hIFN-κ基因的制备

根据hIFN-κ的氨基酸序列进行大肠杆菌密码子优化，其中，hIFN-κ的氨基酸序列如下所示：MLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCLYYFYKFTALFRRK(SEQ ID NO:1)。

其中适用于大肠杆菌BL21(DE3)的密码子优化原则是：(1)对稀有密码子较为集中的区域进行整体优化，以达到最佳的优化效果；(2)调整富含AT和GC的区域，使序列的GC含量适宜；(3)在设计基因时不全部采用大肠杆菌BL21的最优密码子，仅是部分采用偏好密码子。

hIFN-κ表达序列密码子优化后的基因序列如下所示：

ATGCTGGATTGTAATCTGCTGAATGTGCATCTGCGTCGTGTGACCTGGCAGAATCTGCGTCATCTGAGCAGCATGAGCAATAGCTTTCCGGTTGAATGTCTGCGCGAGAATATTGCCTTTGAACTGCCGCAGGAATTTCTGCAGTATACCCAGCCGATGAAACGCGATATTAAGAAAGCCTTCTATGAAATGAGCCTGCAGGCATTTAATATCTTTAGCCAGCATACCTTTAAGTATTGGAAAGAACGTCATCTGAAACAGATTCAGATTGGCCTGGATCAGCAGGCAGAATATCTGAATCAGTGTCTGGAAGAAGATAAGAATGAGAATGAAGATATGAAGGAAATGAAGGAGAATGAAATGAAACCGAGCGAAGCACGCGTTCCGCAGCTGAGCAGTCTGGAACTGCGTCGCTATTTCCATCGTATTGATAATTTCCTGAAGGAGAAGAAATACAGCGATTGTGCCTGGGAAATTGTTCGCGTTGAAATTCGTCGCTGTCTGTATTATTTCTATAAATTTACCGCCCTGTTCCGCCGCAAATAA(SEQ ID NO:2)。

上述优化后的基因序列由上海近岸科技有限公司合成，备用。

实施例2：pET30a-hIFN-κ载体及表达菌株构建

将实施例1制备的优化后的hIFN-κ基因序列与质粒pET30a由上海近岸科技有限公司合成pET30a-hIFNk表达载体，将其转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞中，转化后在感受态细胞中加入LB培养基(不含卡那霉素)37℃后培养1h，然后将其涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上37℃过夜培养(构建原理如图1所示)。

挑取阳性克隆，扩大培养，提取质粒，进行XhoⅠ-ApaⅠ双酶切验证，结果表明大片段约4500bp，小片段约为1500bp，酶切结果与预期相符，如图2所示。

对测序正确的克隆菌株进行-80℃低温保存。

实施例3：hIFN-κ基因在大肠杆菌中的表达以及包涵体的复性和纯化

1)将实施例2制备的单克隆进行复苏，接种至LB液体培养基中，37℃培养至OD600值达到4，pH回升至7.4时，准备转种。

2)将步骤1)培养的菌落以转种量3％转移至含有如下培养基的发酵罐中继续培养。培养条件如下：培养温度37℃，通过转速及空气流量全程控制溶氧大于30％，全程用氨水控制pH7.0。当OD600值达到35时，加入乳糖进行诱导，其中乳糖使用量为发酵液质量1％，在5h内流加进入发酵罐，流加结束继续诱导5h。诱导结束，立即降温至约10℃，8000rpm离心分离10min，收集菌体沉淀。经测定，目标蛋白表达量达到4340mg/L发酵液，表达纯度18％。

培养基组分	用量(g/L)
		蛋白胨	12
酵母浸粉	24
		甘油	4
磷酸氢二钾(无水)	10
		磷酸二氢钾	2.3
泡敌(聚醚)	0.2

3)将收集的菌体沉淀用破碎缓冲液重悬，高压均质3次，4℃下以8500rpm离心20min，弃上清，收集包涵体沉淀，其中破碎缓冲液配比：30mM Tris，0.35M氯化钠，pH8.2；

4)包涵体沉淀用洗涤缓冲液重悬，均质破碎，离心收集洗涤后的包涵体，其中洗涤缓冲液配比：12mM Tris，0.035M氯化钠，1mM EDTA，1％TritionX-100，pH 8.2；

4)将洗涤后的包涵体用去离子水重悬，均质破碎，离心收集预纯化的包涵体；

5)将预纯化的包涵体用15倍的包含终浓度10mM的巯基乙醇的7.0M盐酸胍溶液变性，处理5h，离心，收集变性液上清液；

6)将变性液于4℃条件下在2小时内滴加入复性缓冲液中，复性缓冲液为：15mMTris，10mM磷酸二氢钠，60mM氯化钠，0.4mM氧化型谷胱甘肽，1.5mM EDTA，0.1％TritionX-100，pH8.0；滴加完毕，于4℃静置48h，得到复性液；

7)将复性液上SP Bestarose FF层析柱(SP-FF)，得到阳离子交换树脂产物；阳离子交换树脂产物上Q Bestarose FF层析柱(Q-FF)，经洗脱缓冲液洗脱得到阴离子交换树脂产物，即纯化后的hIFN-κ的蛋白，其中洗脱缓冲液为20mM PB、0.1％(体积比)TritonX-100和50mM NaCl，pH 6。

纯化后的hIFN-κ的蛋白用毛细管电泳法进行测定，结果显示蛋白纯度为98％且收率为64％。

实施例4：hIFN-κ基因在大肠杆菌中的表达以及包涵体的复性和纯化

1)将实施例2制备的单克隆进行复苏，接种至LB液体培养基中，37℃培养至OD600值达到3，pH回升至7.2时，准备转种。

2)将步骤1)培养的菌落以转种量2％转移至发酵罐中继续培养。培养条件如下：培养温度37℃，通过转速及空气流量全程控制溶氧大于30％，全程用氨水控制pH6.8。当OD600值达到10时，加入乳糖进行诱导，其中乳糖使用量为发酵液质量0.4％，在4h内流加进入发酵罐，流加结束继续诱导4h。诱导结束，立即降温至约8℃，8000rpm离心分离10min，收集菌体沉淀。经测定，目标蛋白表达量达到4250mg/L发酵液，表达纯度15％。

其中，所述发酵罐内含有的培养基与实施例3中相同。

3)将收集的菌体沉淀用破碎缓冲液重悬，高压均质3次，4℃下以8000rpm离心20min，弃上清，收集包涵体沉淀，其中破碎缓冲液配比：10mM Tris，0.2M氯化钠，pH8.0；

4)包涵体沉淀用洗涤缓冲液重悬，均质破碎，离心收集洗涤后的包涵体，其中洗涤缓冲液配比：5mM Tris，0.02M氯化钠，0.5mM EDTA，0.5％TritionX-100，pH 8.2；

4)将洗涤后的包涵体用去离子水重悬，均质破碎，离心收集预纯化的包涵体；

5)将预纯化的包涵体用10倍的包含终浓度5mM的巯基乙醇的6.0M盐酸胍溶液变性，处理5h，离心，收集变性液上清液；

6)将变性液于4℃条件下在2小时内滴加入复性缓冲液中，复性缓冲液为：5mMTris，2mM磷酸二氢钠，20mM氯化钠，0.2mM氧化型半胱氨酸，0.5mM EDTA，0.05％TritionX-100，pH7.5；滴加完毕，于4℃静置48h，得到复性液；

7)将复性液上SP Bestarose FF层析柱(SP-FF)，得到阳离子交换树脂产物；阳离子交换树脂产物上Q Bestarose FF层析柱(Q-FF)，经洗脱缓冲液洗脱得到阴离子交换树脂产物，即纯化后的hIFN-κ的蛋白，其中洗脱缓冲液为10mM PB、0.05％(体积比)TritonX-100和40mM NaCl，pH 6.5。

纯化后的hIFN-κ的蛋白用毛细管电泳法进行测定，结果显示蛋白纯度为97％且收率为62％。

实施例5：hIFN-κ基因在大肠杆菌中的表达以及包涵体的复性和纯化

1)将实施例2制备的单克隆进行复苏，接种至LB液体培养基中，37℃培养至OD600值达到5，pH回升至7.5时，准备转种。

2)将步骤1)培养的菌落以转种量4％转移至发酵罐中继续培养。培养条件如下：培养温度37℃，通过转速及空气流量全程控制溶氧大于30％，全程用氨水控制pH7.2。当OD600值达到60时，加入乳糖进行诱导，其中乳糖使用量为发酵液质量2％，在8h内流加进入发酵罐，流加结束继续诱导8h。诱导结束，立即降温至约12℃，8000rpm离心分离10min，收集菌体沉淀。经测定，目标蛋白表达量达到4196mg/L发酵液，表达纯度16％。

其中，所述发酵罐内含有的培养基与实施例3中相同。

3)将收集的菌体沉淀用破碎缓冲液重悬，高压均质3次，4℃下以8500rpm离心20min，弃上清，收集包涵体沉淀，其中破碎缓冲液配比：50mM Tris，0.5M氯化钠，pH8.5；

4)包涵体沉淀用洗涤缓冲液重悬，均质破碎，离心收集洗涤后的包涵体，其中洗涤缓冲液配比：20mM Tris，0.05M氯化钠，2mM EDTA，2％TritionX-100，pH 8.5；

5)将洗涤后的包涵体用去离子水重悬，均质破碎，离心收集预纯化的包涵体；

6)将预纯化的包涵体用20倍的包含终浓度20mM的巯基乙醇的8.0M盐酸胍溶液变性，处理5h，离心，收集变性液上清液；

7)将变性液于4℃条件下在2小时内滴加入复性缓冲液中，复性缓冲液为：30mMTris，20mM磷酸二氢钠，1000mM氯化钠，0.6mM氧化型谷胱甘肽，3mM EDTA，0.2％TritionX-100，pH8.5；滴加完毕，于4℃静置48h，得到复性液；

8)将复性液上SP Bestarose FF层析柱(SP-FF)，得到阳离子交换树脂产物；阳离子交换树脂产物上Q Bestarose FF层析柱(Q-FF)，经洗脱缓冲液洗脱得到阴离子交换树脂产物，即纯化后的hIFN-κ的蛋白，其中洗脱缓冲液为30mM PB、0.25％(体积比)TritonX-100和60mM NaCl，pH 4.0-6.8。

纯化后的hIFN-κ的蛋白用毛细管电泳法进行测定，结果显示蛋白纯度为95％且收率为63％。

实施例6：hIFN-κ蛋白的检测

将实施例3的层析柱分离的蛋白进行SDS-PAGE分析，如图3所示，经过层析后的目标蛋白纯度高、杂蛋白少，且与hIFN-κ蛋白具有接近的分子量，约22kD。经过二硫键检测，两对特有二硫键配对完全正确，且目标蛋白折叠正确率达到70％-90％，如图4-5所示。结果显示，经过发酵培养和离子交换层析后的蛋白纯度高，且经过复性后的蛋白SDS-PAGE胶中迁移快，这充分说明分离纯化的hIFN-κ发生复性折叠。

另外，参考中华人民共和国药典对目标蛋白进行生物学活性检测，检测结果如下：另外，根据对制备的样品进行检测，蛋白浓度≥1mg/ml；内毒素≤100Eu/mg；纯度(毛细管电泳法)≥95％；纯度(SEC-HPLC法)≥95％；外源DNA残留(qPCR法)≤100ng/mg；效价(细胞病变抑制法)≥5.0x10⁵IU/mg。

本发明的内容不限于以上所列举的各个实施例，本领域普通技术人员应知晓，在不偏离本发明的精神和实质的情况下，通过阅读本发明的说明书可对本发明的技术特征进行各种替代、修改和组合，所述各种替代、修改和组合后的技术方案均为本发明的权利要求的保护范围所涵盖。

序列表

<110> 山东晶辉生物技术有限公司

<120> 一种人干扰素-κ的生产方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 181

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp

1 5 10 15

Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu

20 25 30

Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln

35 40 45

Tyr Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met

50 55 60

Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp

65 70 75 80

Lys Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala

85 90 95

Glu Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Lys Asn Glu Asn Glu Asp

100 105 110

Met Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val

115 120 125

Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp

130 135 140

Asn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val

145 150 155 160

Arg Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala

165 170 175

Leu Phe Arg Arg Lys

180

<210> 2

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctggatt gtaatctgct gaatgtgcat ctgcgtcgtg tgacctggca gaatctgcgt 60

catctgagca gcatgagcaa tagctttccg gttgaatgtc tgcgcgagaa tattgccttt 120

gaactgccgc aggaatttct gcagtatacc cagccgatga aacgcgatat taagaaagcc 180

ttctatgaaa tgagcctgca ggcatttaat atctttagcc agcatacctt taagtattgg 240

aaagaacgtc atctgaaaca gattcagatt ggcctggatc agcaggcaga atatctgaat 300

cagtgtctgg aagaagataa gaatgagaat gaagatatga aggaaatgaa ggagaatgaa 360

atgaaaccga gcgaagcacg cgttccgcag ctgagcagtc tggaactgcg tcgctatttc 420

catcgtattg ataatttcct gaaggagaag aaatacagcg attgtgcctg ggaaattgtt 480

cgcgttgaaa ttcgtcgctg tctgtattat ttctataaat ttaccgccct gttccgccgc 540

aaataa 546

Claims (4)

1.一种人干扰素-κ的生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）基因工程菌株的构建；（2）菌株培养和离心收集菌体；（3）包涵体的收集；（4）包涵体的洗涤；（5）包涵体的变性；（6）包涵体的复性；和（7）包涵体的纯化；

所述基因工程菌株包含优化的编码hIFN-κ的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列为如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；所述基因工程菌株的出发细胞为大肠杆菌；

其中，在步骤（6）中，将包涵体变性后的上清液滴加入复性缓冲液中，所述复性缓冲液为1-30mM Tris，1-20mM磷酸二氢钠，20-100mM氯化钠，0.2-0.6mM氧化型还原剂，0.5-3mMEDTA，0.05-0.2%TritionX-100，pH7.0-8.5；所述氧化型还原剂选自氧化型谷胱甘肽和氧化型半胱氨酸中的一种或多种；

所述菌株培养包括种子培养和发酵罐培养，所述种子培养包括将步骤（1）构建的基因工程菌株接种于LB培养基中进行培养，且所述发酵罐培养包括将种子培养后的菌株转移至发酵罐中继续培养，然后加入诱导剂诱导表达；所述诱导剂为乳糖；

在步骤（5）中，将步骤（4）洗涤后的包涵体用变性液变性，均质破碎，离心收集包涵体变性后的上清液；所述变性液为包含二硫苏糖醇或巯基乙醇的6-8M盐酸胍溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳糖以发酵液质量的0.4%-2.0%的量以流加方式加入到所述发酵罐中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，将步骤（2）收集的菌体用破碎缓冲液重悬，高压均质2-3次，离心收集包涵体；所述破碎缓冲液为10-50mM Tris，0.2-0.5M氯化钠，pH 8.0-8.5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，将步骤（3）收集的包涵体用洗涤缓冲液重悬，均质破碎，离心收集洗涤后的包涵体；所述洗涤缓冲液为5-20mM Tris，0.02-0.05M氯化钠，0.5-2mM EDTA，0.5-2% TritionX-100，pH 8.0-8.5。

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