CN110093393A - 一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基及液态发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖3‑10g/L、玉米淀粉15‑25g/L、豆粕粉15‑25g/L、玉米浆干粉3‑10g/L。本发明通过采用含有特定粗蛋白质（干基）及特定含量的豆粕粉和玉米浆干粉、特定含量的葡萄糖和玉米淀粉共四种组分的发酵培养基，取特定的菌种进行接种，并采用特定培养条件的液态发酵方法，制备得到的发酵液的抗菌肽效价≥14000IU/ml，较初始工艺发酵活性4100IU/ml提高了3倍以上，且发酵培养基的成本降到初始工艺的1/4。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌的发酵培养基及液态发酵方法。
背景技术
抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，具有抗菌谱广、耐酸碱以及热稳定性等特点。抗菌肽在医药、农业和工业上具有广阔的应用前景，已有多种抗菌多肽正在进行临床前的可行性研究。
但是，抗菌肽的来源是制约其发展应用的一个关键问题。抗菌肽在动物体内含量极微，从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产。化学合成和基因工程成为获取抗菌肽的主要手段，可是化学合成肽类，成本较高，通过基因工程技术，在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主微生物***而不能获得表达产物。因此，如何实现产业化生产是抗菌肽应用必须解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷与不足，本发明的首要目的在于提供一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L。
其中，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L。
其中，所述豆粕粉的粗蛋白质（干基）≧50%；所述玉米浆干粉的粗蛋白质（干基）≧42%；采用包含较高含量的粗蛋白质（干基）的豆粕粉和玉米浆干粉等的培养基，制备得到的发酵液的抗菌肽效价≥14000IU/ml；而如果采用的豆粕粉和/或玉米浆干粉的粗蛋白质（干基）过低，会导致发酵过程延滞期长、菌体生长缓慢，代谢产物抗菌肽的活性受到较大影响。
一种包含上述高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，包括如下步骤：
1）种子培养基：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L，调节pH为6.8-7.2；
2）种子发酵液的制备：取保存于固体培养基上的菌种，接种至50ml/250ml（三角瓶）的种子培养液中，于31-33℃、摇床转速150r/min、培养时间12-15h；
3）发酵初始培养基：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L，调节pH为6.8-7.2；
4）发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液接种至100ml/500ml（带挡板的三角瓶）的发酵初始培养基中，于31-33℃、摇床转速150r/min、培养时间22-26h；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，并对发酵液进行处理，然后检测发酵液中的抗菌肽。
其中，步骤2）中，所述菌种为产抗菌肽的枯草芽孢杆菌，保存于广东省微生物种质资源库，菌株编号为GW-1-1601-1615-01。
其中，所述接种量为3-7%（v/v）。
其中，步骤5）中，所述发酵液的抗菌肽效价≥14000IU/ ml。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明通过采用含有特定粗蛋白质（干基）及特定含量的豆粕粉和玉米浆干粉、特定含量的葡萄糖和玉米淀粉共四种组分的发酵培养基，取特定的菌种进行接种，并采用特定培养条件的液态发酵方法，制备得到的发酵液的抗菌肽效价≥14000IU/ml（抗菌肽含量高，说明了本发明优化后的培养基对枯草芽孢杆菌的生长较好以及其次级代谢产品的产生量较大），较初始工艺发酵活性4100IU/ml提高了3倍以上，且发酵培养基的成本降到初始工艺的1/4。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
抗菌肽效价的测定方法：A）检测培养基配制：氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、葡萄糖5g/L、琼脂粉20g/L（固体培养基时添加）、pH值7.0；B）指示培养液制备：将大肠杆菌（K12D31）接种于斜面上，37度培养16-24h，用接种环挑一环接种至LB液体培养基中，37℃摇床培养16-18小时，用无菌水将培养好的大肠杆菌菌液吸光值调至OD600值为2.00±0.01（用水做空白对照）；C）将检测培养基（固体）融化后待其冷却至48-50℃时，加入上述大肠杆菌菌液（每100ml培养基中加入100ul），摇匀后吸取10ml到培养皿（平皿直径90mm）内，凝固，用打孔器（直径2.7mm）打孔；D）样品制备：取待测发酵液离心取上清液，在上述打孔的平皿中每孔加入6 ul的待测试样液，每个样重复3次，于28℃培养箱中培养20h后，用游标卡尺测定抑菌圈直径，取平均值；E）抗菌肽效价计算公式：IU（单位/ml）=2X×1000×稀释倍数，X=（y -2.7）/2.1，其中，Y：抑菌圈直径平均值（单位为毫米）；2.7：孔穴直径常数；2.1：抗菌肽浓度与抑菌圈直径的比值常数。
实施例1-3及对比例1-2、应用实施例1及应用对比例1的发酵培养基的成本的计算结果如表1所示：
表1
实施例1
一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L；其中，所述豆粕粉的粗蛋白质（干基）为55%；所述玉米浆干粉的粗蛋白质（干基）为45%；
一种包含上述高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，包括如下步骤：
1）种子培养基：葡萄糖5g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L，调节pH为7.0；
2）种子发酵液的制备：取保存于固体培养基上的高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌，接种于50ml/250ml（三角瓶）的种子培养液中，于32℃、摇床转速150r/min、培养时间13h；
3）发酵初始培养基：葡萄糖5g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L，调节pH为7.0；
4）发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液按5%（v/v）的接种量接种至已灭菌100ml/500ml（带挡板的三角瓶）的发酵初始培养基中，于32℃、摇床转速150r/min、培养时间24h；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，检测发酵液的抗菌肽，并计算发酵培养基的成本，结果如表2所示。
实施例2
一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖10g/L、玉米淀粉15g/L、豆粕粉25g/L、玉米浆干粉3g/L；其中，所述豆粕粉的粗蛋白质（干基）为50%；所述玉米浆干粉的粗蛋白质（干基）为50%；
一种包含上述高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，包括如下步骤：
1）种子培养基：葡萄糖10g/L、玉米淀粉15g/L、豆粕粉25g/L、玉米浆干粉3g/L，调节pH为7.0；
2）种子发酵液的制备：取保存于固体培养基上的高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌，接种于50ml/250ml（三角瓶）的种子培养液中，于31℃、摇床转速150r/min、培养时间15h；
3）发酵初始培养基：葡萄糖10g/L、玉米淀粉15g/L、豆粕粉25g/L、玉米浆干粉3g/L，调节pH为7.0；
4）发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液按5%（v/v）的接种量接种至已灭菌100ml/500ml（带挡板的三角瓶）的发酵初始培养基中，于31℃、摇床转速150r/min、培养时间22h；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，检测发酵液的抗菌肽，并计算发酵培养基的成本，结果如表2所示。
实施例3
一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉25g/L、豆粕粉15g/L、玉米浆干粉10g/L；其中，所述豆粕粉的粗蛋白质（干基）为60%；所述玉米浆干粉的粗蛋白质（干基）为55%；
一种包含上述高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，包括如下步骤：
1）种子培养基：葡萄糖5g/L、玉米淀粉25g/L、豆粕粉15g/L、玉米浆干粉10g/L，调节pH为7.0；
2）种子发酵液的制备：取保存于固体培养基上的高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌，接种于50ml/250ml（三角瓶）的种子培养液中，于33℃、摇床转速150r/min、培养时间12h；
3）发酵初始培养基：葡萄糖5g/L、玉米淀粉25g/L、豆粕粉15g/L、玉米浆干粉10g/L，调节pH为7.0；
4）发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液按5%（v/v）的接种量接种至已灭菌100ml/500ml（带挡板的三角瓶）的发酵初始培养基中，于33℃、摇床转速150r/min、培养时间26h；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，检测发酵液的抗菌肽，并计算发酵培养基的成本，结果如表2所示。
应用实施例1：采用50L发酵罐进行液态发酵方法
一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，同实施例1；
一种包含上述高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，包括如下步骤：
1）摇瓶种子培养基：葡萄糖10g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L，调节pH为7.0；
2）一级摇瓶种子液的制备：取生长良好的斜面菌种（高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌）1环，接种于50ml/250ml（三角瓶）的一级种子培养液中，培养条件：培养温度31℃、摇床转速150r/min、培养时间13h；
3）二级摇瓶种子液的制备：取上述种子液，按5%接种量（10ml）接种至200ml/1000ml（三角瓶）的二级种子培养液中，培养条件：培养温度31℃、摇床转速150r/min、培养时间8-12h；
3）发酵初始培养基：葡萄糖10g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L，调节pH为7.0；
4）50L罐发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液按4%接种量（即1000ml）接种至发酵初始培养基中，装液量25L，培养条件：培养温度31℃、转速200r/min、通气量1500L/min、培养时间24h、发酵过程pH自然；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，检测发酵液的抗菌肽，并计算发酵培养基的成本，结果如表2所示。
对比例1
一种枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L；
一种包含上述枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，包括如下步骤：
1）种子培养基：蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L，调节pH为7.0；
2）种子发酵液的制备：取保存于固体培养基上的产抗菌肽的枯草芽孢杆菌，接种于50ml/250ml（三角瓶）的种子培养液中，于32℃、摇床转速150r/min、培养时间13h；
3）发酵初始培养基：蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L，调节pH为7.0；
4）发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液按5%（v/v）的接种量接种至已灭菌100ml/500ml（带挡板的三角瓶）的发酵初始培养基中，于32℃、摇床转速150r/min、培养时间24h；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，检测发酵液的抗菌肽，并计算发酵培养基的成本，结果如表2所示。
对比例2
一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖10g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L；其中，所述豆粕粉的粗蛋白质（干基）为40%；所述玉米浆干粉的粗蛋白质（干基）为35%；
液态发酵方法同实施例1，然后检测发酵液中的抗菌肽，并计算发酵培养基的成本，结果如表2所示。
应用对比例1：采用50L发酵罐进行液态发酵方法
一种枯草芽孢杆菌培养基，同对比例1；
一种包含上述枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，包括如下步骤：
1）摇瓶种子培养基：蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L，调节pH为7.0；
2）一级摇瓶种子液的制备：取生长良好的斜面菌种（高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌）1环，接种于50ml/250ml（三角瓶）的一级种子培养液中，培养条件：培养温度31℃、摇床转速150r/min、培养时间13h；
3）二级摇瓶种子液的制备：取上述种子液，按5%接种量（10ml）接种至200ml/1000ml（三角瓶）的二级种子培养液中，培养条件：培养温度31℃、摇床转速150r/min、培养时间8-12h；
3）发酵初始培养基：蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L、葡萄糖20g/L，调节pH为7.0；
4）50L罐发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液按4%接种量（即1000ml）接种至发酵初始培养基中，装液量25L，培养条件：培养温度31℃、转速200r/min、通气量1500L/min、培养时间24h、发酵过程pH自然；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，检测发酵液的抗菌肽，并计算发酵培养基的成本，结果如表2所示。
表2
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | 对比例2 | 应用实施例1 | 应用对比例1 | |
| 抗菌肽效价（IU/ml） | 17642 | 15604 | 18477 | 4723 | 9462 | 20603 | 6050 |
| 发酵培养基成本（元/1吨液体） | 237 | 254.3 | 253.5 | 1020 | 235 | 257 | 1020 |
Claims (7)
1.一种高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，包括种子培养基和发酵培养基，其特征在于，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L。
2.根据权利要求1 所述的高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，其特征在于，所述培养基的成分及在发酵液中的含量分别为：葡萄糖5g/L、玉米淀粉20g/L、豆粕粉20g/L、玉米浆干粉5g/L。
3.根据权利要求1 或2所述的高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基，其特征在于，所述豆粕粉的粗蛋白质（干基）≧50%；所述玉米浆干粉的粗蛋白质（干基）≧42%。
4.一种包含权利要求1-3任一项所述的高产抗菌肽枯草芽孢杆菌培养基的液态发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）种子培养基：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L，调节pH为6.8-7.2；
2）种子发酵液的制备：取保存于固体培养基上的菌种，接种至50ml/250ml（三角瓶）的种子培养液中，于31-33℃、摇床转速150r/min、培养时间12-15h；
3）发酵初始培养基：葡萄糖3-10g/L、玉米淀粉15-25g/L、豆粕粉15-25g/L、玉米浆干粉3-10g/L，调节pH为6.8-7.2；
4）发酵培养过程：将上述培养好的种子发酵液接种至100ml/500ml（带挡板的三角瓶）的发酵初始培养基中，于31-33℃、摇床转速150r/min、培养时间22-26h；
5）检测：发酵结束后，取发酵液，并对发酵液进行处理，然后检测发酵液中的抗菌肽。
5.根据权利要求4 所述的液态发酵方法，其特征在于，步骤2）中，所述菌种为产抗菌肽的枯草芽孢杆菌，保存于广东省微生物种质资源库，菌株编号为GW-1-1601-1615-01。
6.根据权利要求4 所述的液态发酵方法，其特征在于，步骤4）中，所述接种量为3-7%（v/v）。
7.根据权利要求4 所述的液态发酵方法，其特征在于，步骤5）中，所述发酵液的抗菌肽效价≥14000IU/ ml。
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