CN107557311A - 一株嗜酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株嗜酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用，所述菌株分类命名为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）YHC‑049，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2017415。所述菌株采用的是离子注入诱变目标菌株单倍体，同时诱导原生质体融合，再根据离子注入诱变的特殊性采用流式细胞仪高效筛选重组菌株，所得菌株综合了嗜酸乳杆菌YHC29生长快、嗜酸乳杆菌YHC83产量高的优势，大幅度提高发酵液中抑菌多肽的产量，并且遗传稳定性好，抑菌多肽效价约在2500AU/ml，处于业内领先水平。
Description
技术领域
本发明涉及一株嗜酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用，属于微生物发酵技领域。
背景技术
抑菌多肽是嗜酸乳杆菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500 Da。抑菌多肽可抑制大多数***，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用。食用后在人体的生理pH条件和α—胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品抑菌剂。
我国开发研究抑菌多肽已有多年历史,例如中国科学院微生物研究所就在进行新抗菌多肽生物合成基因的研究（2017年自然科学基金项目），那淑敏等也发现嗜酸乳杆菌中产生微量抑菌多肽，目前国内抑菌多肽效价水平约在1000AU/ml; 国外虽然有研究报道,产量基本维持在较低水平。本发明采用糖蜜、玉米浆等工业废弃物原料，抑菌多肽效价约在2500AU/ml，处于业内领先水平。
经过相关文献、专利的检索，国内外利用这一思路筛选嗜酸乳杆菌发酵产抑菌多肽的相关技术和方法尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株嗜酸乳杆菌及其在发酵产抑菌多肽中的应用，该嗜酸乳杆菌生物量多，产量高，发酵周期缩短到24h。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一株嗜酸乳杆菌，分类命名为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）YHC-049，已于2017年 7月 7日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2017415。
本发明所述的嗜酸乳杆菌的筛选方法是：将实验室保存的嗜酸乳杆菌YHC83和嗜酸乳杆菌YHC29分别培养后用常规方法进行单倍体分离，再对单倍体悬浮液进行低能氮离子注入，进行细胞内DNA染色，经过温育培养半小时后通过流式细胞仪筛选融合菌株，再通过摇瓶发酵筛选获取出发菌株，再对出发菌株进行低能氮离子注入诱变，最后筛选出符合工业应用的目标菌株。
嗜酸乳杆菌YHC29生长快，发酵周期短，嗜酸乳杆菌YHC83产量高，本发明将两者融合，得到目标菌株。
本发明菌株的形态学及生理化学特征如下：
菌落颜色：白色
需氧方式：兼性厌氧
菌落大小：10~20μm
适宜生长温度：30℃~35℃
适宜生长pH：6~7
菌落形态：卵圆形
革兰氏染色：阳性。
本发明所提供的融合嗜酸乳杆菌筛选诱变方法，具体步骤如下
（a)、单倍体细胞悬浮液制备：分别将嗜酸乳杆菌YHC83和嗜酸乳杆菌YHC29制成单倍体细胞悬液，调整浓度为107/毫升。
（b)、低能氮离子注入诱变：分别取0.1 mL的步骤(a)中细胞悬浮液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在10~30 KeV，注入剂量为15×1013~60×1013 ions/cm3下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，分别在无菌条件下用1 mLPBS溶液洗脱，对嗜酸乳杆菌YHC83加入5微升PI进行染色，嗜酸乳杆菌YF2加入5微升FITC进行染色，混合温育半小时后进行流式细胞仪筛选。
（c) 流失细胞仪筛选：对待检测乳酸样品液先进行超声波振荡5秒，调整流式细胞仪激发波长为488nm，软件分析结果，根据荧光分辨率收集所需细胞。
（d）、单细胞悬浮液的制备：将步骤（c）筛选出的融合嗜酸乳杆菌涂布到平板培养基上，并在30~35 ℃下倒置培养2~3d后，制备成细胞悬液，调整浓度为106/毫升。
（e）、低能氮离子注入诱变：取0.1 mL的步骤(d)中细胞悬液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在20~30 KeV，注入剂量为15×1014~60×1014ions/cm3下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1 mL无菌水洗脱，涂布到平板培养基上，在30~35 ℃下倒置培养，培养时间为24~48h。
（f）、复筛：将步骤（e）诱变得到的菌种接种至斜面培养基上培养后，在30~35℃下倒置培养培养时间为24~48h；再接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间24~36 h.，将种子培养基中的种液接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，250 mL摇瓶装液量30~50 mL，发酵温度30~35 ℃，摇床转速150~250rpm,发酵时间24~48h。
筛选出高产菌株做下一次诱变的出发菌株，重复d~f，直到筛选出目标菌株。
步骤（b）（e）中低能氮离子注入，优选诱变能量为25KeV。
在上述筛选方法中：步骤（d）和（e）中所采用的平板培养基包含如下质量百分数成分：氮源2%~5%，碳源3%~5%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
步骤（f）所采用的斜面培养基包含如下质量分数成分：氮源2%~5%，碳源3%~5%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
步骤（f)所采用的种子培养基包含如下质量分数成分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
步骤（f）所采用的发酵培养基包含如下质量分数成分：氮源5%~ 10%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
本发明菌株采用的是离子注入诱变目标菌株单倍体，同时诱导原生质体融合，再根据离子注入诱变的特殊性采用流式细胞仪高效筛选重组菌株。相较于经典方法，这种复合诱变方法有效的降低了诱变的疲劳效应，同时也有准确的方向性，在遗传稳定性上也有一定优势，同时减少了十余倍的工作量，大大提高了筛选效率。本发明菌株采用的离子束诱变育种是一种交叉物理学和生物学的新型诱变方式，和经典诱变方法相比，在遗传稳定性，诱变频率性上有巨大优势。最终获得的抑菌多肽效价约在2500AU/ml，大大优于国内外相关生产标准。
上述筛选出的重组嗜酸乳杆菌在发酵生产抑菌多肽中的应用。具体步骤如下：
（1）平板培养：将嗜酸乳杆菌接种到平板培养基，培养温度为30~35℃。培养时间24~48h。
（2）、斜面培养：将步骤(1)平板培养的嗜酸乳杆菌接种到斜面培养基上，培养温度为30~35℃，培养时间为24~48h。
（3）、种子培养：将步骤（2）斜面培养的嗜酸乳杆菌接种到种子培养基中，培养温度为30~35℃，摇瓶装液量10%~30%（v/v），培养时间为24~36h。
（4）、发酵培养：将步骤（3）中的种子培养液接种至发酵培养基，以5%~15%（V/V）接种量接种于发酵培养基中，培养温度为30~35℃，培养时间为24~48h。
其中，所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：氮源2%~5%，碳源3%~5%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
所述斜面培养基包含如下质量分数的组分：所述步骤2）中的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：氮源2%~5%，碳源3%~5%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
所述种子液培养基包含如下质量分数组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
所述发酵培养基包含如下质量分数组分：氮源5%~10%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
有益效果：
本发明筛选得到的嗜酸乳杆菌，大幅度提高发酵液中抑菌多肽的产量，并且遗传稳定性好，连续传代5次后效价并无明显改变。在500L发酵罐中发酵效果也没有明显下降，抑菌多肽效价约在2500AU/ml，处于业内领先水平。本发明菌株完全符合工业化抑菌多肽生产的技术指标，可用于工业化发酵生产，有重大的社会科研意义和经济价值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制本发明。
实施例1
本实施例说明将重组嗜酸乳杆菌株进行低能氮离子注入诱变筛选的方法。
进行第一步低能氮离子注入诱变筛选的具体步骤如下：
(a)、单倍体细胞悬浮液制备：取30℃恒温培养2d的嗜酸乳杆菌YHC83和嗜酸乳杆菌YHC29的新鲜斜面加无菌水10mL，制成菌悬液，用血球计数板计数，制成单倍体细胞悬液，调整浓度为107/毫升。
（b)、低能氮离子注入诱变：分别取0.1 mL的步骤(a)中细胞悬浮液均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，在25 KeV，注入剂量为20×1013 ions/cm3下对其进行氮离子注入。离子注入完毕后，取出平皿，分别在无菌条件下用1 mLPBS溶液洗脱，对嗜酸乳杆菌YHC83加入5微升PI进行染色，嗜酸乳杆菌YF2加入5微升FITC进行染色，混合温育半小时后进行流式细胞仪筛选。
（c) 流失细胞仪筛选：对待检测乳酸样品液先进行超声波振荡5秒，调整流式细胞仪激发波长为488nm，软件分析结果，根据荧光分辨率收集所需细胞。
（d）、单细胞悬浮液的制备：将步骤（c）筛选出的融合嗜酸乳杆菌涂布到平板培养基上，并在30℃下倒置培养2d后，制备成细胞悬液，调整浓度为106/毫升。
(e)、低能氮离子注入诱变：取0.1mL步骤（d）中的菌悬液均匀涂布于无菌平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入，以无菌风吹干。本实验低能氮离子注入机为离子束生物工程装置。在25KeV,注入剂量为25×1014ions/cm3下对其进行氮离子注入，靶室真空度为10-3Pa，以15S脉冲式注入，间隔10S，靶室内放置不接受注入的对照样。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌条件下用1mL无菌水洗脱，涂布到平板上，在30℃下倒置培养48h。
(f)、诱变菌株的筛选：
种液制备：取步骤（e）中的单菌落接种至斜面培养基上，培养温度为30℃，培养时间为2d，再将斜面培养基上的单菌落接种至种子培养基培养，培养温度为30℃，摇瓶装液量10%（v/v），摇床转速180rpm，培养时间24h。
发酵复筛：将筛选出的种子培养基中的种液接种至发酵培养基培养，接种量10%（V/V)，500mL摇瓶装液量100mL，发酵温度30℃，摇床转速180rpm，发酵时间24h。挑选抑菌多肽产量高的菌株作为作为复筛菌株。挑选产量高的菌株进行再次诱变。
其中步骤（b）中的平板培养基为：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃； 所述百分数为质量百分数。
所述斜面培养基包含如下质量分数的组分：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
所述种子液培养基包含如下质量分数组分：酵母膏2%，玉米浆2%，葡萄糖10%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
所述发酵培养基包含如下质量分数组分：酵母膏3%，玉米浆2%，糖蜜10%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；发酵结束后检测各菌株产量如表1所示。
表1：
| 产物 | 出发菌株YHC-83 | 诱变后菌种 |
| 抑菌多肽/（AU/ml) | 800 | 2500 |
实施例2 本实施例说明菌株的鉴定及遗传稳定性
菌株的鉴定：细胞呈卵圆状，兼性厌氧的革兰氏阳性菌，无鞭毛，在平板培养基上菌落颜色为白色，圆柱形菌落，菌落较薄，湿润，边缘整齐，表面光滑，质地均匀，菌落大小10~20μm，生长最适温度：28~35℃，生长温度范围为30-35℃，生长最适pH：6.0~7.0，生长pH范围为5.2~7.2。
传代发酵实验：将筛选得到的嗜酸乳杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养36h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间36h。将斜面培养物接种到种子培养基后，培养温度30℃，100mL摇瓶装液量45mL，在120rpm摇床转速下培养24h；将种子液接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），培养温度29℃，在180rpm转速下培养24h。发酵培养结束后检测发酵液中抑菌多肽含量结果如表2所示。
表2抑菌多肽高产菌的遗传稳定性
| 传代次数 | 抑菌多肽/（AU/ml) |
| 1 | 2483 |
| 2 | 2450 |
| 3 | 2422 |
| 4 | 2453 |
| 5 | 2400 |
从实验结果可知，经过5次连续传代，突变株较稳定，有较好的传代稳定性。可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3
本实施例说明嗜酸乳杆菌在发酵生产抑菌多肽中的应用
本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，葡萄糖10%，硫酸镁0. 1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏3%，玉米浆2%，糖蜜10%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的嗜酸乳杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养36h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间36h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，500mL摇瓶瓶装液量100mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养21h。发酵培养结束后检测发酵液中抑菌多肽效价为2450 AU/ml。
实施例4
本实施例说明嗜酸乳杆菌在发酵生产抑菌多肽中的应用本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，葡萄糖10%，硫酸镁0. 1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏3%，玉米浆2%，糖蜜10%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的嗜酸乳杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养36h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间36h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，500mL摇瓶瓶装液量100mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养20h。发酵培养结束后检测发酵液中抑菌多肽效价为2456 AU/ml。
实施例5
本实施例说明嗜酸乳杆菌在发酵生产抑菌多肽中的应用本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，葡萄糖10%，硫酸镁0. 1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏3%，玉米浆2%，糖蜜10%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的嗜酸乳杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养36h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间36h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，500mL摇瓶瓶装液量100mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养22h。发酵培养结束后检测发酵液中抑菌多肽的效价为2483AU/ml。
实施例6
本实施例说明嗜酸乳杆菌在发酵生产抑菌多肽中的应用本实施例营养基配方（%为质量百分比）
平板培养基为：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
斜面培养基：酵母膏3%，玉米浆1%，葡萄糖5%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，琼脂1.5%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
种子培养基：酵母膏2%，玉米浆2%，葡萄糖10%，硫酸镁0. 1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
发酵培养基：酵母膏3%，玉米浆2%，糖蜜10%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.1%，氯化铁0.1%，其余为水，pH调至6.8，培养温度为30℃；
将筛选得到的嗜酸乳杆菌接种至平板培养基上于30℃条件下倒置培养36h后，将其接种至斜面培养基培养，培养温度30℃，培养时间36h。在超净工作台内，用5ml移液管吸取无菌水于斜面中，再用大口5ml移液管吸取斜面上均匀涂抹的菌悬液接种到种子培养基，培养温度30℃，500mL摇瓶瓶装液量100mL，在180rpm摇床转速下培养24h；将摇床上种子液合并后接种到50L种子罐中进行培养，种子罐中种子培养基的装液量为35L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养24h。再将种子罐压入到500 L发酵罐中进行发酵，发酵罐中发酵培养基的装液量为350 L，接种量10%（v/v），培养温度30℃，在180rpm转速下培养20h。发酵培养结束后检测发酵液中抑菌多肽效价为2496AU/ml。
抑菌多肽效价的测定：
（1）指示大肠杆菌菌液100 mL均匀涂布于 LB固体培养基上，用牛津杯打孔（孔径6mm），加稀释菌样量50 mL/孔，静置30 min，放入37 ℃培养箱过夜培养后，测定抑菌圈大小。
（2）未出现抑菌圈的最高稀释浓度作为一个活力单位，即1 AU，稀释浓度的倒数就是细菌素的效价值（AU/mL）。
计算公式为：抑菌多肽的效价值=2n×（1000/x）。式中：n——指示菌显示抑菌圈的孔 数；x——每孔加样细菌素的体积。
Claims (7)
1.一株嗜酸乳杆菌，分类命名为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）YHC-049，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2017415。
2.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在发酵产抑菌多肽中的应用。
3.权利要求2所述的嗜酸乳杆菌在发酵产抑菌多肽中的应用，其特征在于包括如下步骤：
平板培养：将嗜酸乳杆菌接种至平板培养基上培养，培养温度为30~35℃，培养时间为24~48h；
斜面培养：将步骤1）平板培养基培养的嗜酸乳杆菌接种至斜面培养基培养，培养温度为30~35℃，培养时间为24~48h；
种子培养：将步骤2）中嗜酸乳杆菌的斜面培养物接种至种子培养基培养，培养温度为30~35℃，培养时间16~24h；
4） 发酵培养：将步骤3)中种子培养的嗜酸乳杆菌接种至发酵培养基培养，接种量5%~15%（V/V)，发酵温度30~35℃，发酵时间16~24h。
4.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌在发酵产抑菌多肽中的应用，其特征在于：所述步骤1）中平板培养基包含如下质量百分数的组分：氮源2%~5%，碳源3%~5%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
5.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌在发酵产抑菌多肽中的应用，其特征在于所述步骤2）中的斜面培养基包含如下质量百分数的组分：氮源2%~5%，碳源3%~5%，无机盐0.1%~0.5%，琼脂1%~3%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
6.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌在发酵产抑菌多肽中的应用，其特征在于所述步骤3）中的种子培养基包含如下质量百分数的组分：氮源3%~5%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
7.根据权利要求3所述的嗜酸乳杆菌在发酵产抑菌多肽中的应用，其特征在于所述步骤4）中的发酵培养基中包含如下质量分数的组分：氮源5%~10%，碳源5%~10%，无机盐0.1%~0.5%，其余为水，pH调至6~7，其中所述氮源为玉米浆、酵母膏或者氨水中的一种或几种混合物；碳源为葡萄糖、蔗糖或者糖蜜中的一种或多种混合；所述无机盐为铁盐、钠盐、钾盐或者镁盐中的一种或几种混合。
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