CN110066760B - 一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种表达α‑L‑鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用,属于基因工程技术与生物医药领域。将编码序列为SEQ ID NO.2所述序列在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达,用0.5μmol/L IPTG进行诱导并获得活力为5.6U/L的重组鼠李糖苷水解酶。该重组酶具有特异性水解芦丁、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及朝藿定C鼠李糖苷的活性。重组酶添加量为460U/L时,90min内完全催化水解1g/L的朝藿定C生成唯一产物淫羊藿苷。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用,属于基因工程及生物医药技术领域。
背景技术
α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)是一种能够特异性地水解鼠李糖苷键的水解酶,在自然界中分布广泛。该酶能够专一、高效地水解多种存在α-鼠李糖苷键的糖苷类物质,如柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、橙皮苷(hesperidin)以及朝藿定C(epimedin C)等,释放鼠李糖。α-L-鼠李糖苷酶主要来源于微生物,在细菌(芽胞杆菌属、乳杆菌属、单胞菌属等)以及真菌(曲霉、木酶、青霉等)中均有多种α-L-鼠李糖苷酶被报道过。
α-L-鼠李糖苷酶被广泛地运用在食品、医药等领域。食品工业中,α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶和橙皮苷酶的主要活性成分,能够有效地除去柑橘类果汁中存在的苦味,并且能够改善和提升酿酒过程中的香气,α-L-鼠李糖苷酶的应用极大地提升了软硬饮料的品质。医疗与保健领域中,许多黄酮类化合物的生物利用度受到糖苷键的影响,通过利用α-L-鼠李糖苷酶对黄酮芸香糖苷进行水解,增加了黄酮类葡萄糖苷含量,更利于生物活性物质的吸收。
多数从植物中提取的糖苷类黄酮化合物都含有一个或者多个鼠李糖基(包括黄酮3位以及7位),较为常见的有芦丁、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及朝藿定C等。该系列黄酮化合物中,鼠李糖基的存在很大程度上影响了它们的溶解性以及生物活性。利用生物或者化学的手段,将其中的鼠李糖基水解不仅能够极大改善溶解性,提高人体对黄酮类化合物的吸收率,更能够提高黄酮化合物的生物学活性。酶法水解具有温和、高效、专一等特点,适合用于鼠李糖苷类黄酮化合物的水解,因而,高催化活性的黄酮鼠李糖苷水解酶具有巨大的应用潜力。
然而,不是所有有鼠李糖基的化合物都能被α-L-鼠李糖苷酶水解。α-鼠李糖苷键的类型有多种,包括α-1、α-1,2以及α-1,6,配糖基又有黄酮母核C-3、C-7、葡萄糖苷以及鼠李糖苷等多种。另外,α-L-鼠李糖苷酶的水解作用具有高度的催化专一性,某一特定来源的鼠李糖苷酶往往只能水解一种或两种糖苷键。目前,有报道的糖苷水解酶作用的糖苷键主要为鼠李糖苷-α-1,2-葡萄糖苷,针对朝藿定C的鼠李糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键,仅有唯一的鼠李糖苷酶报道具有催化活性。2018年,南京林业大学研究报道,来源于多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的鼠李糖苷酶能够催化水解朝藿定C,在最适条件下,4小时内按3500U/g底物催化浓度为1g/L的朝藿定C水解率达到90.5%。然而,利用全细胞体系进行催化朝藿定C水解的研究未见报道,针对混有其他糖苷类黄酮如淫羊藿提取物的水解尚未有研究。
目前,生产α-L-鼠李糖苷酶的常用方法是曲霉发酵法,酶活最高可达2500 U/mL。虽然,利用曲霉发酵能够获得较高的α-L-鼠李糖苷酶活性,但是其发酵时间往往需要96h以上。另外曲霉发酵法获得的产物中,掺杂其他多种糖苷水解酶,为下游的分离纯化造成巨大的困难,需要非常精细的分离纯化步骤才能保证获得高纯度的特定α-L-鼠李糖苷酶,以实现专一性的水解催化应用。发酵时间过久及分离纯化困难的缺陷,限制了曲霉发酵法生产α-L-鼠李糖苷酶的工业生产利用。因此,挖掘一种能够特异性水解朝藿定C的α-L-鼠李糖苷酶,并将其在大肠杆菌中进行重组表达,对工业化应用具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种重组大肠杆菌,是以大肠杆菌为宿主,表达了α-L-鼠李糖苷酶,所述α-L-鼠李糖苷酶含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中,所述重组大肠杆菌以pET系列载体为表达载体。
在本发明的一种实施方式中,所述重组大肠杆菌以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
在本发明的一种实施方式中,编码上述α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明的第二个目的是提供上述重组大肠杆菌的构建方法,所述方法包括以下步骤:
(1)合成α-L-鼠李糖苷酶基因;
(2)将α-L-鼠李糖苷酶基因与表达载体连接,获得pET28a-AnRhaE;
(3)将pET28a-AnRhaE转化至大肠杆菌中。
本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解朝藿定C中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解淫羊藿次苷II中的应用。
本发明的第五个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解芦丁或柚皮苷中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述重组大肠杆菌在水解橙皮苷或新橙皮苷中的应用。
本发明的有益效果:
本发明通过将编码α-L-鼠李糖苷酶的基因序列连接至大肠杆菌表达载体pET28a上,在大肠杆菌宿主BL21(DE3)进行诱导表达。以0.5μmol/L IPTG诱导16h,获得重组酶酶活力为5.6 U/L,通过5 L发酵罐优化放大,以0.5μmol/L IPTG诱导7h,获得重组酶酶活力达574U/L,相比于放大化表达前,酶活提高了100倍。
在添加重组细胞活力为460 U/L(干重4g/L),催化水解浓度为1g/L的朝藿定C,在90min内完全水解。利用重组细胞进行淫羊藿混合样品的水解,添加重组细胞活力为460 U/L,90min内催化1g/L(淫羊藿苷纯度为50%)淫羊藿粗提样品中的朝藿定C和鼠李糖基淫羊藿次苷II,完全水解为淫羊藿苷和宝藿苷I,而不水解其他组分或者产生其他产物。
附图说明
图1:AnRhaE重组大肠杆菌表达SDS-PAGE电泳结果。
图2:AnRhaE水解朝藿定C1,2-鼠李糖苷键HPLC图谱。
图3:AnRhaE鼠李糖苷水解酶催化水解朝藿定C。
图4:AnRhaE水解芦丁及柚皮苷的1,6-鼠李糖苷键HPLC图谱,A:芦丁;B柚皮苷。
图5:AnRhaE水解橙皮苷及新橙皮苷的1,2-鼠李糖苷键HPLC图谱,A:橙皮苷;B:新橙皮苷。
图6:AnRhaE水解淫羊藿粗提品HPLC图谱。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂条,以配制LB固体培养基。
TB培养基:蛋白胨12g/L,酵母粉24g/L,磷酸二氢钾2.31g/L,磷酸氢二钾12.54g/L,甘油4g/L。
(二)鼠李糖苷酶活力测定方法:将底物对硝基苯基鼠李糖苷(pNPR)溶于50mMpH6.0的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液,至pNPR终浓度为10mM。吸取200μL底物溶液,向其中加入400μL酶液,充分混合均匀。按照每孔50μL吸取反应液至96孔酶标板,置于合适的温度进行酶促反应,以加入150μL0.5 M浓度的Na2CO3终止反应,并于405nm处测定吸光值。每组三个平行,每20min终止一组反应并测定吸光度,共记录1h内吸光度值变化。
酶活力定义为:在pH6.0和37℃的反应条件下,每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需酶量为1 U。
(三)对硝基苯酚标曲制备:将对硝基苯酚溶于50mM pH6.0的MES缓冲液,分别配制成终浓度为10μM,50μM,100μM,500μM,1mM,5mM以及10mM的贮液,按照每孔50μL吸取至酶标板,并向其中加入150μL0.5 M浓度的Na2CO3,于405nm处测定吸光值,制备对硝基苯酚标曲。
(四)朝藿定C及淫羊藿苷HPLC测定:采用Shimadzu高效液相色谱进行测定。LC条件:色谱柱,Thermo Hypersil ODS-2column;流动相A,含有1‰甲酸的超纯水;流动相B,含有1‰甲酸的乙腈;流动相比例条件,0-10min,10-40%B,10-30min,40-80%B,30-35min,80-80%B,35-37min,80-10%B,37-40min,10-10%B;流速:1mL/min;柱温:30℃;进样量:10μL;检测器:紫外检测器A290。
实施例1 AnRhaE基因合成及重组表达α-L鼠李糖苷酶大肠杆菌构建
根据NCBI数据库的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的鼠李糖苷水解酶AnRhaE基因进行密码子优化,由金唯智公司进行基因合成,最终基因序列如SEQ ID NO.2所示。
设计用于扩增AnRhaE序列的引物对F:TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG GCA ATGTCT TTG TCT ATA TCT GGT GT,R:GTG CGG CCG CAA GCT TGT CGACAC CTAAAG TTG ATTCGA ATC TAT。以合成序列为模板,以该引物对进行PCR扩增,选择Primer Star MasterMix(Takara公司)高保真pfu酶进行,条件为预变性95℃,3min;扩增阶段30个循环,按照95℃,10s,53℃,5s,72℃,2min进行;延伸72℃,5min。将PCR产物进行产物纯化,将载体pET28a进行Nco I和Sal I双酶切及产物纯化,用Infusion-Cloning的方法将两步纯化片段重组为载体pET28a-AnRhaE,并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送金唯智测序,比对正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例2诱导重组大肠杆菌发酵产α-L鼠李糖苷酶
将构建完成的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a–AnRhaE(以转化有空载体的菌株BL21(DE3)/pET28a作为对照)于含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB平板划线,37℃培养12h。挑取单菌落转接入5mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基,37℃ 220rpm振荡培养12h。按照1%的接种量转接至100mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL的TB液体培养基,37℃220rpm振荡培养至OD600值为0.8。向培养物中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5μmol/L,以25℃,220rpm继续振荡培养16h。
培养结束吸取1mL培养物测定最终OD600值,以5000×g离心10min收集菌体。用20mL0.1 M pH7.4的PB缓冲液重悬菌体,5000×g离心10min,洗涤菌体除去残余培养基。以0.1M pH7.4的PB缓冲液重悬菌体,控制最终重悬菌液OD600值为5。使用高压均质机对重悬菌液进行破碎,设置工作压力为1400bar,工作一个循环。破碎完成后,收集破碎液,以12000×g离心10min,收集上清,即为α-L-鼠李糖苷酶粗酶液。电泳结果见图1。获得的重组酶酶活力为5.6 U/L。通过5 L发酵罐优化放大,在通气量2.5vvm,搅拌转速为400r/min,恒速12g/h流加甘油补料的条件下,以0.5μmol/L IPTG诱导7h,获得的重组酶酶活力为574 U/L,相比于放大化表达前,酶活提高了100倍。
实施例3重组AnRhaE水解朝藿定C鼠李糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键
制备重组α-L-鼠李糖苷酶酶液,以pNPR测定酶活力。吸取40μL重组α-L-鼠李糖苷酶酶液至1.5mL离心管,加入10μL朝藿定C溶液(浓度1g/L,溶于无水乙醇),添加去离子水150μL。于37℃条件下进行催化反应,每60min向离心管内加入200μL无水乙醇,终止反应。将反应液于12000×g离心10min,经过0.22μm有机滤膜过滤,进行HPLC分析(见图2)。重组α-L-鼠李糖苷酶具有水解朝藿定C的3位鼠李糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键的活性,当添加活力为460U/L,90min完全催化水解1g/L朝藿定C生成淫羊藿苷(见图3)。
实施例4重组AnRhaE水解芦丁及橙皮苷α-1,6-鼠李糖苷键
制备重组α-L-鼠李糖苷酶酶液,以pNPR测定酶活力。通过底物芦丁和橙皮苷的水解实验,确定AnRhaE对α-1,6-鼠李糖苷键的水解活性。吸取40μL至1.5mL离心管,分别加入10μL芦丁和橙皮苷溶液(浓度1g/L,溶于无水乙醇),添加去离子水150μL。于37℃条件下进行催化反应,每60min向离心管内加入200μL无水乙醇,终止反应。将反应液于12000×g离心10min,经过0.22μm有机滤膜过滤,进行HPLC分析。证明重组α-L-鼠李糖苷酶具有水解芦丁的3位葡萄糖苷-α-1,6-鼠李糖苷键的活性,以及水解橙皮苷7位葡萄糖苷-α-1,6-鼠李糖苷键的活性(见图4)。
实施例5重组AnRhaE水解柚皮苷及新橙皮苷α-1,2-鼠李糖苷键
制备重组α-L-鼠李糖苷酶酶液,以pNPR测定酶活力。通过底物柚皮苷和新橙皮苷的水解实验,确定AnRhaE对α-1,2-鼠李糖苷键的水解活性。吸取40μL至1.5mL离心管,加入10μL柚皮苷及新橙皮苷溶液(浓度1g/L,溶于无水乙醇),添加去离子水150μL。于37℃条件下进行催化反应,每60min向离心管内加入200μL无水乙醇,终止反应。将反应液于12000×g离心10min,经过0.22μm有机滤膜过滤,进行HPLC分析。重组α-L-鼠李糖苷酶具有水解柚皮苷的7位葡萄糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键的活性,以及水解新橙皮苷的7位葡萄糖苷-α-1,2-鼠李糖苷键的活性(见图5)。
实施例6重组AnRhaE全细胞催化水解淫羊藿提取物样品
通过诱导发酵,获得表达重组AnRhaE的大肠杆菌细胞,利用PB缓冲液(0.1 MpH7.4)进行洗涤细胞后。将重组细胞添加至淫羊藿粗提品溶液中,至其终浓度为1g/L,细胞浓度为16 OD(干重4g/L,活力460 U/L)。吸取500μL重悬细胞加入2000μL浓度1.25g/L的淫羊藿粗提品(溶于PB缓冲液,50%淫羊藿苷纯度)。于37℃条件下进行催化反应,每30min向离心管内吸取500μL,加入至500μL甲醇中终止反应。将反应液于12000×g离心10min,经过0.22μm有机滤膜过滤,进行HPLC分析(见图6)。
结果表明,重组AnRhaE全细胞可在90min内催化1g/L(淫羊藿苷纯度为50%)淫羊藿粗提样品中的朝藿定C和鼠李糖基淫羊藿次苷II,完全水解为淫羊藿苷和宝藿苷I,而不水解其他组分或者产生其他产物。
对比例1其他来源的鼠李糖苷酶经过密码子优化在大肠杆菌中重组表达,及其与构巢曲霉来源α-L-鼠李糖苷酶对比
粪堆梭菌、嗜酸乳杆菌以及黑曲霉来源的鼠李糖苷酶(经过密码子优化后)基因序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示,人工合成该基因序列,将其转入大肠杆菌中重组表达,其余条件同实施例1和2。其中粪堆梭菌和黑曲霉来源的鼠李糖苷酶在大肠杆菌中都没有得到活性表达,形成无活性的包涵体。嗜酸乳杆菌得到了活性表达,其鼠李糖苷酶活力为12.5 U/L,然而该来源的鼠李糖苷酶并未检测到催化水解朝藿定C的活力。
不同来源的鼠李糖苷酶对于pNPR、芦丁、橙皮苷、柚皮甘、新橙皮苷、朝藿定C的水解活性如表1所示。
表1不同来源的鼠李糖苷酶对于含鼠李糖苷键物质的水解活性
组别 | pNPR | 芦丁 | 橙皮苷 | 柚皮苷 | 新橙皮苷 | 朝藿定C |
AnRhaR(黑曲霉) | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
AnRhaE(构巢曲霉) | √ | √ | √(极弱) | √ | √ | √ |
CsRamA(粪堆梭菌) | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
LaRamA(嗜酸乳杆菌) | √ | √ | ND | √ | √ | ND |
CK(对照) | ND | ND | ND | ND | ND | ND |
ND表示未检测到活性,√表示检测到相关水解活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 861
<212> PRT
<213> Aspergillus nidulans
<400> 1
Met Ser Leu Ser Ile Ser Gly Val Thr Phe Glu His His Arg Ser Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ile Gly Glu Pro Ser Pro Arg Ile Ser Trp Arg Phe Asp Gly
20 25 30
Thr Val Ser Asn Trp Thr Gln Ser Ala Tyr Glu Ile Glu Ile Asn Arg
35 40 45
Ala Gly Gln Ala Asn Thr Phe Arg Val Asn Ser Ser Asp Ser Val Leu
50 55 60
Val Pro Trp Pro Ser Asp Pro Leu Gln Ser Gly Glu Glu Ala Thr Val
65 70 75 80
Arg Val Arg Ser Phe Gly Arg Ala Asn Gln Pro Asp Ala Pro Trp Ser
85 90 95
Asp Pro Val Thr Val Glu Pro Gly Leu Leu Asp Glu Asp Asp Trp Gln
100 105 110
Ser Ala Val Ala Ile Val Ser Asp Arg Glu Thr Glu Val Asn Ala Thr
115 120 125
His Arg Pro Ile Tyr Phe Arg Lys Asp Phe Asp Val Asp Glu Glu Ile
130 135 140
Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Ile Thr Ala Leu Gly Val Tyr Glu Ala Glu
145 150 155 160
Ile Asn Gly Gln Pro Val Gly Asp His Val Leu Ala Pro Gly Trp Gln
165 170 175
Ala Tyr Ser His Arg His Glu Tyr Asn Thr Tyr Asp Val Thr Asp Leu
180 185 190
Leu Gln Thr Gly Asp Asn Thr Ile Gly Val Thr Val Gly Glu Gly Trp
195 200 205
Tyr Ala Gly Ala Leu Thr Trp Ser Met Thr Arg Asn Ile Tyr Gly Asp
210 215 220
Thr Leu Gly Leu Leu Ser Leu Leu Ser Ile Ala Thr Ala Asp Gly Lys
225 230 235 240
Thr Ile Tyr Val Pro Ser Asp Glu Thr Trp Gln Ser Ser Thr Gly Pro
245 250 255
Ile Ile Ala Ser Glu Ile Tyr Asn Gly Glu Thr Tyr Asp Ser Thr Gln
260 265 270
Ala Ile Glu Gly Trp Ser Gln Pro Gly Phe Asp Ala Ser Gly Trp Leu
275 280 285
Gly Thr His Glu Val Thr Phe Asp Lys Ser Val Leu Ala Ala Pro Asp
290 295 300
Ala Pro Ala Val Arg Arg Val Glu Glu Arg Arg Leu Glu Ser Val Phe
305 310 315 320
Lys Ser Ala Ser Gly Lys Thr Val Leu Asp Phe Gly Gln Asn Leu Val
325 330 335
Gly Trp Leu Arg Val Arg Val Lys Gly Pro Arg Gly Ser Thr Ile Ser
340 345 350
Phe Val His Thr Glu Val Met Glu Asn Gly Glu Val Ala Thr Arg Pro
355 360 365
Leu Arg Asn Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu Thr Leu Ser Gly Glu Glu
370 375 380
Gln Glu Trp Glu Pro Ser Phe Thr Phe His Gly Phe Arg Tyr Val Gln
385 390 395 400
Val Thr Gly Trp Pro Glu Glu Thr Glu Leu Asn Ala Asp Ser Val Thr
405 410 415
Ala Ile Val Ile Asn Ser Asp Met Glu Gln Thr Gly Phe Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Asn Pro Leu Leu Asn Lys Leu His Glu Asn Ile Ile Trp Ser Met
435 440 445
Arg Gly Asn Phe Leu Ser Ile Pro Thr Asp Cys Pro Gln Arg Asp Glu
450 455 460
Arg Leu Gly Trp Thr Gly Asp Ile His Ala Phe Ala Arg Thr Ala Asn
465 470 475 480
Phe Ile Tyr Asp Thr Ser Gly Phe Leu Arg Gly Trp Leu Arg Asp Ala
485 490 495
Tyr Ser Glu Gln Leu Glu Asn Asn Tyr Ala Pro Pro Tyr Val Ile Pro
500 505 510
Asn Val Leu Gly Pro Gly Ser Pro Thr Ser Ile Trp Gly Asp Ala Ile
515 520 525
Val Ser Val Pro Trp Asp Leu Phe Gln Thr Tyr Gly Asp Lys Ala Met
530 535 540
Leu Ser Glu Gln Tyr Ala Gly Ala Thr Ala Trp Leu Asp Lys Gly Ile
545 550 555 560
Leu Arg Asn Glu Ala Gly Leu Trp Asn Arg Ser Thr Phe Gln Tyr Ala
565 570 575
Asp Trp Leu Asp Pro Leu Ala Pro Pro Asp Asp Pro Gly Ala Ala Thr
580 585 590
Thr Asn Lys Tyr Leu Val Ser Asp Ala Tyr Leu Ile His Ser Thr Glu
595 600 605
Leu Val Ala Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Asp Arg Pro Asp Asp Ala Glu
610 615 620
Arg Tyr Ala Ala Asp Arg Ala Asp Leu Thr Arg Ala Phe Gln Lys Ala
625 630 635 640
Trp Ile Ser Ala Asn Gly Thr Val Ala Asn Glu Thr Gln Thr Gly Leu
645 650 655
Thr Leu Pro Leu Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Arg Pro Glu His Tyr Thr
660 665 670
Asp Ala Val Ser Arg Leu Val Asp Ile Ile Lys Glu Asn Glu Tyr Lys
675 680 685
Val Gly Thr Gly Phe Ala Gly Thr His Leu Leu Gly His Thr Leu Ser
690 695 700
Ala Tyr Asn Ala Ser Ser Thr Phe Tyr Asn Thr Leu Leu Gln Glu Asp
705 710 715 720
Val Pro Gly Trp Leu Phe Gln Val Leu Met Asn Gly Thr Thr Thr Trp
725 730 735
Glu Arg Trp Asp Ser Met Leu Ala Asn Gly Ser Val Asn Pro Gly Glu
740 745 750
Met Thr Ser Phe Asn His Tyr Ala Val Gly Ser Val Gly Ala Trp Met
755 760 765
His Glu Asn Ile Gly Gly Leu Arg Pro Ile Glu Pro Gly Trp Arg Arg
770 775 780
Phe Ala Val Asp Val Lys Val Gly Gly Gly Leu Ser Ser Ala Gln Glu
785 790 795 800
Arg Phe Leu Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Glu Ser Ser Trp Glu Val Arg
805 810 815
Asp Gly Lys Phe Met Leu Gly Val Lys Val Pro Pro Asn Ser Glu Ala
820 825 830
Val Val Ser Leu Pro Gly Ala Pro Thr Arg Gly Lys Lys Glu Val Ile
835 840 845
Val Gly Ser Gly Met His Arg Phe Glu Ser Thr Leu Gly
850 855 860
<210> 2
<211> 2586
<212> DNA
<213> Aspergillus nidulans
<400> 2
atgtctttgt ctatatctgg tgttactttt gaacatcata gatcagcttt gggtattggt 60
gagccatctc ctaggatttc ttggagattt gacggtacag tttctaattg gacacaatct 120
gcatatgaaa ttgaaattaa cagagctggt caagctaata ctttcagagt taattcttca 180
gattcagtct tggttccttg gccatctgat cctttgcagt ctggtgaaga ggctactgtc 240
agagttcgtt ctttcggtag agctaatcaa ccagacgctc catggtcaga tcccgttact 300
gtcgaacccg gtttgttgga tgaggatgac tggcagtcag ctgtcgctat tgtctctgat 360
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gatgaggaaa ttttgtctgc aagattgtac ataacagctt taggtgttta tgaggctgaa 480
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aacggtgaag ttgctacaag gcctttgagg aatgcaaaag ctactgataa tttaacattg 1140
tctggtgagg agcaagagtg ggagccatct ttcacattcc atggttttag atacgtccaa 1200
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catgaaaaca ttatttggtc aatgagaggt aattttttgt caattccaac agactgccca 1380
caaagagatg aaaggttggg atggactggt gatattcacg catttgcaag aactgctaac 1440
ttcatttatg acacttctgg tttcttgagg ggttggttga gggacgctta ctcagagcaa 1500
ttggaaaata attatgctcc accatatgtt attcctaacg ttttgggtcc cggttctcct 1560
acatctattt ggggagacgc tattgtttct gttccatggg atttatttca aacatatggt 1620
gataaagcta tgttgtctga acaatacgct ggcgcaacag cttggttgga caagggtatt 1680
ttgaggaacg aggctggttt gtggaatcgt tctacatttc aatacgcaga ctggttggat 1740
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gcttatttga ttcattctac tgaattggtt gcaaatatat ctgcatattt ggatcgtccc 1860
gatgatgctg agagatacgc agctgataga gctgatttga ctagggcttt ccaaaaagct 1920
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tattttaagt tattcgaaag acccgaacac tacacagacg cagtctcaag gttggttgat 2040
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catacattgt cagcatataa tgcatcttct actttctaca acactttgtt gcaagaagac 2160
gtccccggtt ggttgtttca agttttgatg aacggtacaa ctacatggga gagatgggat 2220
tctatgttgg caaacggttc agtcaacccc ggtgaaatga cttcttttaa ccattacgca 2280
gtcggatcag ttggtgcatg gatgcacgag aacattggtg gtttgaggcc tattgagccc 2340
ggttggagga gattcgctgt tgacgtcaag gtcggaggag gattgtcttc agcacaagaa 2400
aggtttttat ctccatacgg ttcagctgag tcatcatggg aggtcagaga tggtaagttt 2460
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<211> 2631
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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Claims (6)
1.一种重组大肠杆菌,其特征在于,以大肠杆菌为宿主,表达了α-L-鼠李糖苷酶,所述α-L-鼠李糖苷酶含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列;以pET系列载体为表达载体;以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主,编码上述α-L-鼠李糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)合成α-L-鼠李糖苷酶基因;
(2)将α-L-鼠李糖苷酶基因与表达载体连接,获得pET28a-AnRhaE;
(3)将pET28a-AnRhaE转化至大肠杆菌中。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述转化是利用化学转化法进行的。
4.权利要求1所述的重组大肠杆菌在水解朝藿定C中的应用。
5.权利要求1所述重组大肠杆菌在水解2,-O-鼠李糖基淫羊藿次苷II中的应用。
6.权利要求1所述重组大肠杆菌在水解芦丁中的应用。
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Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210112 Address after: 712100 No.3, Fenghuang Road, Yangling Demonstration Area, Xianyang City, Shaanxi Province Patentee after: Shaanxi Liangwei Bioengineering Co.,Ltd. Address before: 214000 1800 Lihu Avenue, Binhu District, Wuxi, Jiangsu Patentee before: Jiangnan University |
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TR01 | Transfer of patent right |