CN105112433A - 一种新的i型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用 - Google Patents

Abstract

本发明利用PCR技术获得<i>T.flagellatus</i>？sp.菌株（CGMCC？NO.1.12170）普鲁兰酶基因<i>pul</i>B的全长序列，该基因全长1728bp，其核苷酸编码序列如SEQ？ID？NO：1所示。编码575个氨基酸，预测蛋白大小66kDa，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。本发明的重组普鲁兰酶可专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉；能够与α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用生产高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、提高啤酒中的发酵度它可以将最小单位的支链分解，可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。

Description

一种新的I型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种膨胀芽孢杆菌属产普鲁兰酶菌株普鲁兰酶编码基因的克隆与表达。本发明还提供该普鲁兰酶编码基因重组质粒的构建和重组普鲁兰酶制备方法。

背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase,EC3.2.1.41)是α-淀粉酶家族GH13中的一种脱支酶，它能够专一性的水解普鲁兰、淀粉和糖原中的α-1,6-糖苷键。普鲁兰酶能分解支链的特性决定了它在淀粉加工业中的广泛应用，比如：在淀粉水解过程中，能专一性切开支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成直链淀粉，后者具有很好的抗水性和成膜性，有望生产可食性包装膜，解决“白色污染”问题；I型普鲁兰酶能够与α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用生产高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、提高啤酒中的发酵度；普鲁兰酶和α-淀粉酶以及糖化酶协同作用，可在以非粮木薯为原料生产酒精的液化和糖化过程发挥作用，普鲁兰酶要求的底物分子结构最小，它可以将最小单位的支链分解，最大限度地利用淀粉原料，加速糖化过程，从而有效的提高淀粉利用率和水解效率。在食品、医药化妆品、分析化学等领域，普鲁兰酶能够逆向合成麦芽糖基-α-环糊精，相比目前广泛应用的环糊精，无任何毒性与溶血性；除此之外，采用普鲁兰酶将各类淀粉脱支后再糊化老化处理可增加抗消化淀粉的含量，后者对人体血糖水平、肥胖、癌症、脂质代谢和能量等方面有重要生理功能。因此，普鲁兰酶在淀粉加工工业、医药食品上具有重要用途和良好的市场前景。

普鲁兰酶最初是由Bender和Wallenefls于1966年通过产气杆菌(Aeorbaetereaerogenes)发酵获得^[1]。此后，各国的科研人员经过广泛深入研究，从不同的地区微生物中获得该酶。1975年日本的YoshiyukiTakaskai发现蜡状芽抱杆菌覃状变种(BacilluscereusVar.mycodes)能产普鲁兰酶^[2]，其最佳作用条件为pH6.0～6.5，温度50℃。上世纪八十年代初，丹麦Novo公司获得嗜酸性分解普鲁兰多糖芽孢杆菌(Bacillusacidopullulyticus)^[3]，此菌产生产的普鲁兰酶耐热(60℃)，耐酸(pH4.5)。该公司投入巨资研发出商品普鲁兰酶Pormozyme，是目前应用最广和产量最大的普鲁兰酶。1986年，日本的YuhsiykuiTakaskai报道了一株能产生耐热普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌BacillussubtilisTU，酶的最佳作用pH为7.0～7.5，最佳作用温度60℃^[4]。上世纪九十年代，Deweer^[5]发现了普鲁兰酶产生菌Bacillusnaganoensis；Tomimura^[6]筛选出Bacillusderamificans，这两株菌所产的普鲁兰酶的酶学性质与B.Acidopullulyticus的酶学性质相似。这两株普鲁兰酶产生菌的发现，进一步拓宽了普鲁兰酶的应用。目前，我国研究人员分离的产普鲁兰酶菌主要来源于芽孢杆菌属和克雷伯菌属^[7,9]，产酶酶活较低，产酶水平一般为2～5U/mL，这些产酶菌株大多为病原菌，其发酵液不能直接用于工业添加，特别是食品工业，因此普鲁兰酶基因的重组表达至关重要。

随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术构建基因工程菌，以提高目的蛋白的产量，并减少下游工艺的成本，这在世界范围内越来越广泛地得到重视并加以应用。1984年，日本科学家把Klebsiellaaerogenes中的普鲁兰酶基因转移入大肠杆菌并在其中得以有效表达，但此大肠肝菌的酶活水平不高且在非选择性培养基中表现型极不稳定。1985年，Takiazwa把普鲁兰酶基因(包括结构基因和操纵基因)克隆入多拷贝载体pBR322，得到比野生菌株酶活水平高20～40倍的工程菌，此工程菌能保持高酶水平二周。在上述研究中，大部分的酶都是胞内的，不分泌到胞外。1999年，TegauewMartin等人从Bacillusnanganoensis(ATCC53909)(USPTO6,300,115)中分离出了普鲁兰酶基因，并在原核生物表达***枯草芽抱杆菌中得到了表达，所产生的重组普鲁兰酶具有很好的应用特性^[10]。该酶在60℃时测得最适反应为pH5.0，在pH4.5条件下测得最适温度为60℃；在pH4.5，60℃保温55h仍有50％的残余酶活，具有较好的热稳定性。自此以后许多普鲁兰酶基因得到了克隆和表达，特别是进入九十年代后，这些工作进展速度大大加快，相继有许多耐热普鲁兰酶基因被克隆、测序并在大肠和枯草杆菌中表达，并申请专利保护^[11]。已经有数十个普鲁兰酶基因进行了异源表达，主要的表达***为大肠杆菌表达***。表1-1列出了近年来应用基因工程技术表达不同来源的普鲁兰酶基因的情况。从表1-1可以看出，虽然基因工程技术在普鲁兰酶的异源表达研究中取得了一些成绩，但总体来说，普鲁兰酶的表达水平不高。我国从70年代开始便对普鲁兰酶进行研究开发，但是到目前仍然仅限于实验室研究并且产酶酶活较低，通过基因工程手段表达普鲁兰酶，提高普鲁兰酶表达量，将还成为普鲁兰酶基础研究和应用研究的主要发展方向。

表1‐1普鲁兰酶基因工程表达情况

Table1‐2Theconditionofpullulanaseexpressionbygeneengineering

从以上这些报道中可以看出，目前关于基因工程技术在普鲁兰酶研究领域的探索还是有很多，这证实了利用基因工程手段来提高普鲁兰酶表达的有效性。但至今国内还没有从膨胀芽孢杆菌属中克隆出普鲁兰酶基因，构建基因工程体系，得到新普鲁兰酶的报道^[8]。

另外，淀粉加工时通常采取50～55℃的反应温度，这就对普鲁兰酶在该温度下的物理化学的稳定性提出了较高的要求。筛选新型高酶活、具有一定热稳定性的普鲁兰降解酶，具有重要的应用意义。

申请人的课题组先前从木薯淀粉厂的废水中筛选到一株产普鲁兰酶的膨胀芽孢杆菌属菌株Tumebacillusflagellatussp.，其菌种保藏号为：CGMCCNO.1.12170，保藏日期为2012年4月11日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

发明内容

本发明的第一个目的是提供酶活高、耐酸性好的普鲁兰降解酶编码基因。

本发明的第二个目的是提供具有活性的上述普鲁兰酶基因片段的重组质粒。

本发明的第三个目的是提供上述重组普鲁兰酶的酶学特性和功能及应用。

本发明提供的普鲁兰降解酶编码基因，是利用T.flagellatussp.菌株(CGMCCNO.1.12170)所产，记为pulB。

本发明利用PCR技术获得T.flagellatussp.菌株(CGMCCNO.1.12170)普鲁兰酶基因pulB的全长序列，基因全长1728bp，其核苷酸编码序列如SEQIDNO：1所示，在NCBI中的nucleotideBLAST没有搜索到同源序列。该序列编码575个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，预测蛋白大小66kDa。氨基酸序列与数据库里相似性最高的蛋白质为来自Thermicanusaegyptius的环麦芽糖糊精酶。从blastX的结果来看，比对的Identities为54％,Positives为69％。因此，该酶属新酶。在Expasy网站(http://www.expas.org/tools)的多项参数进行预测，通过对蛋白质的结构域进行鉴定和注析的工具SMART(simplemodulararchitectureresearchtool)分析发现，此酶具有淀粉酶的结构域(图1)。蛋白质结构预测和结构域分析表明T.flagellatussp.的PulB蛋白具有4个保守结构域，分别为图2中所示的PUD(CBM2)、CBM48、GH13和DUF(Domainofunknownfunction)。其中PUD结构域为预测的普鲁兰酶底物结合结构域；CBM48存在于多种分解支链的酶中，比如：普鲁兰酶、异淀粉酶等；GH13结构域是在普鲁兰酶中存在的α-淀粉酶催化结构域，能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉中的α-1，6-糖苷键；DUF结构域的功能未知，在细菌和真菌中都发现了这一保守结构域。

PulB可水解普鲁兰糖、支链淀粉等，产生α异头的寡糖，属多功能淀粉酶。多功能淀粉酶是α淀粉酶家族(α-amylasefamily)的新一类成员，包括新普鲁兰酶、麦芽糖淀粉酶和环麦芽糊精酶，它们在结构上具有α-淀粉酶家族共有的4个高度保守的区域，包括了催化部位和底物结合部位，具有稳定(α/β)₈折叠桶结构域，催化部位呈Asp…Glu…Asp模式，但在功能上又兼有糖苷水解酶和糖基转移酶的催化活性，而不同的多功能淀粉酶虽然在结构与功能上具有一定的相似性，但不同来源的酶在底物特异性和水解的特异性等方面存在着差异。

本发明还提供上述普鲁兰酶全长基因(pulB)的克隆方法，即以T.flagellatussp.菌株(CGMCCNO.1.12170)基因组DNA为模板，通过本实验室对该菌株的基因组测序结果，经过生物信息学分析，设计出带适当酶切位点的引物，并通过PCR技术获得该酶基因(pulB)全长(图3)。

本发明还提供1种含有普鲁兰酶基因片段的核苷酸编码序列的重组质粒。该质粒是pET22b-pulB。将含有本发明的普鲁兰酶基因片段编码序列通过常规方法克隆至载体的多克隆位点，即可形成上述重组质粒(见图4)。

本发明还提供重组表达具有活性的I型普鲁兰酶的方法，所用的表达***可以是大肠杆菌表达***，也可以是酵母表达***。

为了获得具有活性的普鲁兰酶，本发明采用大肠杆菌表达***，该大肠杆菌重组表达质粒为pPET-pulB，宿主菌为BL21(DE3)，该重组表达蛋白C端融合6×His标签，该重组蛋白经IPTG诱导之后利用镍柱纯化获得与预测蛋白分子量相一致的重组普鲁兰酶。如图5所示：其中M为蛋白标准分子量，泳道1为不含目的片段的空质粒所作的对照，泳道2～4为IPTG诱导后不同时间表达的PulB。泳道5～7为纯化后的PluB纯化后的PluB的普鲁兰酶比酶活分别约为58U/mg。

本发明对重组普鲁兰酶的最适pH进行了测定。分别配制含1％普鲁兰多糖的pH3.0～7.0的20mM柠檬酸-磷酸钠缓冲液。取含有底物的缓冲液400μL与100μL纯化后的酶液一起在水浴中50℃反应10min。测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100％。图6(左)表明，该酶的最适pH均为5.0，在pH4.6、pH4.8和pH5.4时普鲁兰酶的相对酶活力分别为最适pH条件下的5％、25％和75％。

本发明对重组普鲁兰酶的pH稳定性进行了测定。一定量的纯酶经在4℃、不同pH值缓冲液保留24h后的测定其酶活力，绘制pH稳定性曲线，见图6(右)所示。由图可知，普鲁兰酶在pH4.5～5.5的范围内均有很好的稳定性，相对酶活力均保持在60％以上。

本发明对重组普鲁兰酶最适温度进行了测定。将100μL纯化后的酶液与400μL含1％普鲁兰多糖的柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.0)中混匀，分别在30，35，40，45，50，55，60和65℃温度下反应10min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100％。图7(左)的结果，重组普鲁兰酶的最适反应温度为55℃。见图7(左)所示。

本发明对重组普鲁兰酶的热稳定性进行了测定。将适量酶液放置在不同的(温度30℃～65℃)下恒温水浴保温1h,取样测定剩余酶活力，以保温0min时的酶活力计为100％。图7(右)的结果表明，在55℃条件下处理1h，PulB的酶活基本保持不变。由于淀粉加工时通常采取50～55℃的反应温度，该酶的在这一温度下的热稳定性符合工业发展的需求。见图7(右)所示。

根据IUBMB(InternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)建立的两类分类标准，把普鲁兰酶分成两类，其中I型普鲁兰酶(TypeIpullulanase,EC3.2.1.41)专一水解普鲁兰糖α-1,6-糖苷键产生麦芽三糖；II型普鲁兰酶(TypeIIpullulanase，EC3.2.1.135)能同时水解普鲁兰多糖的α-1,6-糖苷键和α-1,4-糖苷键产生线性的以α-1,4-糖苷键连接的多聚物和麦芽三糖。不同类型的普鲁兰酶与其它水解酶协同作用，生成不同的产物，因此在各个行业中的应用也不尽相同，I型普鲁兰酶在工业上的应用最为广泛。

为鉴定该普鲁兰降解酶的催化分类，本发明通过高效液相色谱法(HPLC)对PulB水解普鲁兰多糖的产物进行了分析，色谱分析图见图8所示。该普鲁兰降解酶水解普鲁兰多糖产生的三糖产物，其液相色谱保留时间约为8.003min(如图8A)。通过标准加入法分析，结果表明该酶水解普鲁兰糖的产物的色谱峰与麦芽三糖标准品的峰的保留时间一致，表明PulB的通过内切方式为水解普鲁兰多糖，得到的终产物为三糖。因此PulB的催化分类属于I型普鲁兰酶。

由于鲁兰酶能将最小单位的支链分解，有助于淀粉最终水解成单糖，在制造医用葡萄糖、高麦芽糖浆以及淀粉加工液化糖化等酶解过程起重要作用。通常淀粉酶解过程包括液化和糖化两个步骤：液化过程在淀粉固形物为30％～35％(m/v)的浆液中添加液化酶，在80～105℃温度下进行水解成糊精；糖化过程一般使用糖化酶在60～65℃温度下进行水解，使部分水解的淀粉及糊精分解成葡萄糖。糖化酶能水解α-1,4-糖苷键，但对α-1,6-糖苷键作用效率低，况且α-1,6-糖苷键含量高达4-5％。因此，在这个过程，α-1,6-糖苷键的彻底水解与否对于淀粉质原料水解产单糖的生产无疑是非常关键。因此，有必要对重组普鲁兰酶PulB与糖化酶对淀粉液化液的协同糖化作用进行研究。见图9所示。其中，A为淀粉液化液在糖化酶水解作用下不同时间的葡萄糖产物含量变化；B为淀粉液化液在糖化酶和普鲁兰酶协同水解作用下不同时间的葡萄糖产物含量变化。该图的结果表明，使用两种酶协同水解淀粉能够制备更高葡萄糖含量的产物，缩短糖化时间。

本发明用高效液相色谱(HPLC)分析PulB与糖化酶对淀粉液化液的协同糖化作用后的水解产物。见图10所示。其中：(A)为糖化前的淀粉液化液(糖化0h样品)，从图中看出糖化之前样品葡萄糖含量较低，主要是二糖、三糖等不同聚合度的寡糖组分；(B)为单一添加糖化酶水解淀粉液化液6h所得的产物；从图中可知，糖化6h后液化液中得到较高浓度的葡萄糖组分，但还有少量的三糖组分。由于糖化酶对α-1,6-糖苷键水解效率较低，推测该三糖组分可能为潘糖或异潘糖(由α-1,6-糖苷键和α-1,4-糖苷键组成)；(C)为同时添加糖化酶和普鲁兰酶对淀粉液化液协同水解6h后产物分析图谱；结果表明同时使用两种酶具有更好的效果，所得糖产物都为葡萄糖，并未检测到多余的三糖组分。因此，在工业应用中同时使用两种酶将对葡萄糖浆等产物的制备具有更好、更高效的作用。

综上，本发明获得PulB基因核心结构域的大肠杆菌重组质粒，重组表达蛋白比酶活约58U/mg。重组表达的普鲁兰酶最适pH均为5.0，最适反应温度为55℃；在55℃处理1h，该普鲁兰酶的残余活性达到了90％以上。通过高效液相色谱分析鉴定该重组表达普鲁兰酶为I型普鲁兰酶，能够水解普鲁兰多糖或淀粉中的α-1，6-葡萄糖糖苷键，不能水解直链淀粉和环糊精。

本发明的重组普鲁兰酶可应用于淀粉加工、环保、食品、医疗保健等行业。

附图说明

图1：用SMART分析预测的PulB的功能域。红色代表α-amy的功能域。根据已完成T.flagellatussp.菌株(CGMCCNO.1.12170)基因组DNA测序结果，设计引物扩增了T.flagellatussp的普鲁兰酶编码基因(pulB)。该基因全长1728bp，编码575个氨基酸，蛋白预测分子量为66kDa。用Blastx软件检索GenBank氨基酸数据库发现该基因编码的产物与来自Thermicanusaegyptius的环麦芽糖糊精酶的氨基酸序列相似性最高，Identities为54％，Positives为69％，表明获得普鲁兰酶基因为新基因；用SMART工具分析该基因编码产物的组件结构，自N端的第133-490位氨基酸为家族GH13糖苷键水解酶α-淀粉酶功能域。

图2：利用Expasy网站预测的PulB的组件结构和蛋白结构域。蛋白质结构预测和结构域分析表明T.flagellatussp.的PulB蛋白具有4个保守结构域，分别为图2中所示的PUD(CBM2)、CBM48、GH13和DUF(Domainofunknownfunction)。其中PUD结构域为预测的普鲁兰酶底物结合结构域；CBM48存在于多种分解支链的酶中，比如：普鲁兰酶、异淀粉酶等；GH13结构域是α-淀粉酶催化结构域，能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉中的α-1，6糖苷键；DUF结构域的功能未知。

图3：利用PCR技术扩增的pulB基因的PCR产物电泳分析图，图示PCR产物的DNA片段大小约为1.7kb，与预期的一致。

图4：构建的重组质粒pPET-pulB和酶切、PCR验证电泳分析图。酶切和PCR验证均出现预期的片段，说明重组质粒构建成功。图中M1：DL2000分子量标记；M2：λ/HindIII分子量标记；CK：以空质粒为模板的空白对照；1-3：重组质粒pET-pulB；4-9：BamHI和HindIII双酶切的pET-pulB；10-15：以转化子为模板的PCR扩增产物。

图5：大肠杆菌蛋白表达产物和纯化的蛋白质的SDS-PAGE电泳分析

大肠杆菌表达***经IPTG诱导表达后，在66kD位置处有较明显蛋白质特征条带出现，该蛋白质大小与基因序列推测所得的理论分子大小相符，经过镍柱纯化后获得单一条带的蛋白，该蛋白质即为异源表达的普鲁兰酶(PulB)。图中M：蛋白质分子量标准；1：BL21/pET-pulBIPTG诱导前；2-3：BL21/pET-pulBIPTG诱导后；4：BL21/pET-22b；5-6：纯化的pulB蛋白质。

图6：重组普鲁兰酶最适pH和pH稳定性测定图示。

图7：重组普鲁兰酶的最适温度和热稳定性测定图示。

图8：重组普鲁兰酶PulB水解普鲁兰糖和直链淀粉的反应产物的高效液相色谱(HPLC)分析图。图中(A)pH5.0的1％普鲁兰糖底物(未经酶水解)；(B)PulB水解普鲁兰糖产物；(C)pH5.0的1.0％直链淀粉底物；(D)PulB水解直链淀粉产物；(E)麦芽糖标样。

图9：不同金属离子对重组普鲁兰酶PulB的影响

图10：重组普鲁兰酶PulB与糖化酶对淀粉液化液的协同糖化作用图示。图中A为糖化酶的单独作用；B为重组普鲁兰酶PulB与糖化酶协同作用。

图11：HPLC分析PulB与糖化酶对淀粉液化液协同糖化后的水解产物。图中(A)为未加糖化酶的淀粉液化液；(B)为单独添加糖化酶的水解产物；(C)为重组普鲁兰酶PulB与糖化酶协同作用的水解产物。

具体实施方式

所用实验材料和相关操作方法如下，未详述处可以参考萨姆布鲁克的《分子

克隆实验指南》第三版，北京:科学出版社，2002。

1.菌株，载体：大肠杆菌菌株E.coliBL21(DE3)和Top10，质粒pPMD18-TVector，pET-22b，均为本实验室保存，与现有文献中相应物质的性质相同。

2.培养基

LB培养基(g/L)：Tryptone(Oxoid)10，YeastExtract(Oxoid)5，NaCl5，pH7.0。

3.实验材料：普鲁兰多糖、可溶性淀粉、直链淀粉等多糖购于上海国药集团；分子生物学需要的试剂购自TaKaRa公司；引物合成和DNA测序由上海生物工程有限公司完成。DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂：酒石酸钾钠18.2g，溶于50ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.63g，NaOH2.1g，苯酚0.5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至100mL，贮于棕色瓶中，在室温下放置(7～10天后使用)。

4.大肠杆菌***表达及纯化酶蛋白：将含有酶pulB基因的pET-22b质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养至转化子出现。用牙签挑取一个单菌落接种至5mLLA(LB培养液+100ug/ml氨苄青霉素)培养液中，37℃，220rpm培养过夜。次日取1.0mL过夜菌至100mLLA中，37℃，220rpm培养，当菌密度(OD₆₀₀)达到0.4～0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃，220rpm继续培养12小时。离心收集上清，用透析袋装上清液，外敷PEG8000,放置冰箱浓缩，当上清体积约为原来的十分之一时，取出上清于4℃，8000rpm离心10min,浓缩上清用Ni-NTA柱结合目的酶蛋白，用梯度浓度的咪唑洗脱蛋白。

5.普鲁兰酶酶活力测定方法：本发明使用DNS还原糖法测定普鲁兰酶的酶活力。具体方法如下：取适当稀释的酶液100μL，添加至400μL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.8，含1％普鲁兰糖)中，60℃条件下反应10min，加入500μLDNS终止反应后于沸水浴煮沸5min，冷却，用酶标仪在540nm波长下检测反应液的吸光度值。以100μL煮沸灭活的酶液为空白对照。根据标准曲线计算产生还原糖的量，每组反应做3个平行样品。

酶活单位定义：在相应条件，每分钟分解普鲁兰糖所释放的还原碳水化合物，其还原力即相当于1μmol葡萄糖所需的酶量，用1U表示。

实施例1：通过PCR方法获得TumebacillusflagellatesGST4普鲁兰酶全长基因pulB。

根据TumebacillusflagellatesGST4基因组测序结果(来源于对产酶菌株全基因组测序后获得的信息)，通过基因信息学分析，设计PCR引物PulB-F和PulB-R如下：

PulB-F：5’–CGCGGATCCCAATCAGGAAGCTATTTTTCA-3’(正向引物，下划线为限制酶切位点BamHⅠ)，即SEQIDNO:3。

PulB-R：5’–ACCAAGCTTCACCGTTCCGCCGCTCA-3’(反向引物，下划线为限制酶切位点HindIII)，即SEQIDNO:4。

以T.flagellatesGST4基因组总DNA为模板，以上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系组成和PCR反应程序为：50μL反应液中含有:5×PSPCR缓冲液10μL，dNTPs200μM，总DNA模板10ng，引物各3.2pmol，PrimeSTARDNA聚合酶5个单位。扩增程序为：95℃预变性2min；98℃，10sec；53.6℃，15sec；72℃，2min，共30个循环延伸；72℃，10min。

PCR扩增产物回收后经过片段末端加A后连于pMD18-T载体，转化大肠杆菌Top10菌株，获得质粒pMDT-pulB，经上海生工测序，得到基因pulB的碱基序列，长1728bp，如SEQIDNO:1。其碱基序列编码575个氨基酸，其序列如SEQIDNO:2。利用NCBI的数据库的Blastn和Blastp软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行蛋白质同源性搜索，利用Expasy网站(http://www.expasy.org/)进行蛋白结构域分析(图1和图2)。

实施例2：重组质粒和大肠杆菌BL21/pET-pulB基因工程菌的构建

以质粒pMDT-pulB为模板，以下为引物：

PulB-F：5’–CGCGGATCCCAATCAGGAAGCTATTTTTCA-3’(正向引物，下划线为限制酶切位点BamHⅠ)，即SEQIDNO:3。

PulB-R：5’–ACCAAGCTTCACCGTTCCGCCGCTCA-3’(反向引物，下划线为限制酶切位点HindIII)，即SEQIDNO:4。

进行PCR扩增，PCR反应体系组成和PCR反应程序为：50μL反应液中含有:5×PSPCR缓冲液10μL，dNTPs200μM，总DNA模板10ng，引物各3.2pmol，PrimeSTARDNA聚合酶5个单位。扩增程序为：95℃预变性2min；98℃，10sec；53.6℃，15sec；72℃，2min，共30个循环延伸；72℃，10min。经过琼脂糖电泳检测得到如图3所示的pulB基因片段。

PCR产物经BamHⅠ/HindIII双酶切后，与经过同样双酶切的载体pET-22b大片段在连接酶作用下连接，质粒的酶切和连接体系如下：

酶切温度37℃，时间为3h，酶切产物分别纯化后按一定的比例混合，与等体积的LigationKit(TaKaRa公司)的SolutionI混匀，于16℃连接过夜。

次日将10μL连接产物转化宿主大肠杆菌感受态细胞E.coliTop10，冰上放置30min，42℃水浴热击90s，加入600μL42℃预热的SOC培养基，于37℃，200r/min预培养30min，取适量涂布到含氨苄抗性的的LB平板，37℃恒温箱倒置培养过夜。

经过菌落转移和质粒提取进行酶切和PCR验证，获得阳性重组质粒(图4)。该大肠杆菌重组表达质粒为pET-pulB，该重组表达蛋白C端具有融合表达的6×His标签。

实施例3：重组普鲁兰酶表达和纯化

表达：将原核表达质粒pET-pulB按《分子克隆实验指南》的方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养至转化子出现。用牙签从转化子中挑选5个阳性转化子，与含空质粒的受体菌阴性对照一起接种至5mLLA(LB培养液+100ug/ml氨苄青霉素)培养液中，37℃，220rpm培养过夜。次日取1.0mL过夜菌至100mLLA中，37℃，220rpm培养，当菌密度(OD₆₀₀)达到0.4～0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，30℃，220rpm继续培养12小时。离心收集上清，用透析袋装上清液，外敷PEG8000,放置冰箱浓缩，当上清体积约为原来的十分之一时，取出上清于4℃，8000rpm离心10min,浓缩上清即位粗酶液，用于下一步的Ni-NTA柱结合目的酶蛋白进行纯化。

纯化：IMAC柱含5mL柱床体积的螯合琼脂糖凝胶(FF)介质，介质经NiCl装载平衡后用超纯水洗涤，用25mL平衡缓冲液(300mmol/LNaCl，5～10mmol/L咪唑，50mMpH7.4磷酸缓冲液)平衡柱子，粗酶液调节至与平衡缓冲液相同的pH后上柱，用25mL(300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，50mMpH7.4磷酸缓冲液)洗涤杂蛋白，接着用25mL(300mmol/LNaCl，60mmol/L咪唑，50mMpH7.4磷酸缓冲液)洗涤杂蛋白，目的蛋白用25mL(300mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，50mMpH7.4磷酸缓冲液)洗脱，收集含目的蛋白质的洗脱液，用截留分子量为30,000的Millipore的超滤离心管进行缓冲液置换，所得的纯酶溶解在pH5.0，50-100mM磷酸钠-柠檬酸缓冲液中，并加入终浓度为10％的甘油做保护剂，用于进行SDS-PAGE分析、酶活力测定和酶学性质分析。

发酵上清以及纯化的重组酶都分别进行SDS-PAGE电泳分析和普鲁兰酶的酶活力检测，结果显示工程菌株BL21/pET-pulB各阳性转化子均有目的蛋白且表达量与酶活一致。重组酶的表达和纯化后的目的蛋白条如图5。

实施例4：重组普鲁兰酶的酶学特性分析

1.酶的最适pH值的测定：在一系列pH的缓冲液中测定pH对普鲁兰酶活力的影响。使用50mM的磷酸钠-柠檬缓冲液，在pH3.6～6.0的范围，每隔0.2个单位的不同pH值缓冲液中测定普鲁兰酶的活力。取含有底物的不同pH值的缓冲液400μL与100μL纯化后的酶液一起在50℃水浴中反应10min，测定普鲁兰酶活力，计算各pH下的相对酶活力，以其中酶活力最高的设为100％，即为该酶的最适pH值。如图6(左)。

2.酶的pH稳定性分析：将适量酶液分别置于pH3.5～7.0的缓冲液中，酶液于4℃放置24h后，在普鲁兰酶最适条件下测定残余的酶活力，与未经保温酶活力的比较绘制pH稳定性曲线，其中酶活力最高的设为100％。如图6(右)。

3.酶的最适温度的测定：在最适pH条件下将100μL纯化后的酶液与400μL含1％普鲁兰多糖的磷酸钠-柠檬缓冲液(pH5.0)混匀，分别在30，35，40，45，50，55，60和65℃温度下反应10min，然后用DNS法测定普鲁兰酶活力，其中酶活力最高的设为100％。如图7(左)。

4.酶的温度稳定性分析：在最适pH条件下，将适量的酶液放置在温度30℃～65℃内的不同温度的恒温水浴中保温1h后测定残余酶活力，以保温0min时的酶活力计为100％。如图7(右)。

实施例5：重组表达普鲁兰酶的底物特异性分析

用50mM的磷酸钠-柠檬缓冲液(pH5.0)配制1％的普鲁兰多糖、马铃薯淀可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉、α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精溶液，取100μL纯化后的酶液与400μL底物混合，于55℃反应10min，用DNS还原糖法测定重组普鲁兰酶对不同底物的水解酶活。将重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的能力设为100％，计算其水解淀粉、糖原等多糖的能力。结果如表1所示，重组普鲁兰酶能够特异水解普鲁兰多糖和淀粉，其水解淀粉能力约为水解普鲁兰多糖的14％～16％，不能够水解直链淀粉和α-/β-/γ-环糊精。

表1.PluAs-1底物特异性分析

实施例6：重组普鲁兰酶的酶学催化类型分析

由于普鲁兰酶分为两种类型，不同类型的普鲁兰酶的应用不相同，其中，I型普鲁兰酶在工业上的应用最广。为了鉴定重组普鲁兰酶的催化类型，本发明使用高效液相色谱分析方法对重组普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物进行分析，具体操作如下：

取100μL化后的酶液加入到400μL的底物(含1％普鲁兰多糖的20mM磷酸钠-柠檬缓冲液，pH5.0)，55℃反应24h加热灭酶活，将上述酶解液稀释2000倍，取10μL上样于色谱柱，使用戴安高效液相色谱分析***检测酶解液的组成，以稀释2000倍的1％的麦芽三糖作为标准品。HPLC测试条件为：戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：AminexHPX-87H300×7.8mm(有机酸柱)，流动相：5mmol/LH2SO4，pH2.5，柱温45℃，进样量10μL，流速0.6mL/min，示差检测器(Shodex)，检测器温度为45℃。

HPLC分析结果如图8所示。重组普鲁兰酶PulB能够水解普鲁兰糖、支链淀粉，水解产物中都有麦芽三糖存在(支链淀粉酶水解图未显示)，但这些反应产物中没有葡萄糖出现，且不能水解直链淀粉。说明重组普鲁兰酶能特异性水解α-1,6-糖苷键，不能作用α-1,4-糖苷键，属于I型普鲁兰酶。

实施例7：金属离子对酶水解活性的影响分析

在最适的pH5.0和温度55℃条件下，一定量的纯化酶PulB在含有1mmol/L的金属离子的1％的普鲁兰糖溶液中作用30分钟后，测定PulB在各种金属离子缓冲液中的水解酶活力，以不加金属离子的酶液作为对照。结果如图9所示，所有金属离子对普鲁兰酶PulB都没有明显的促进作用，Zn²⁺、Pb²⁺、Co²⁺、Cu²⁺对酶活力有明显的抑制作用，其中Cu²⁺的抑制作用可使酶基本失活，Ba²⁺对酶活的抑制作用则相对比较小，而Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe²⁺、Mn²⁺则对酶活几乎不产生影响(图9)。

实施例8：重组普鲁兰酶PulB与糖化酶对淀粉液化液的协同糖化作用

配置5％的马铃薯可溶性淀粉浆液，加入1.2U/g的α-淀粉酶于90℃对淀粉浆液进行液化，人工搅拌至碘色为棕色。液化后的淀粉利用糖化酶和普鲁兰酶PulB进行糖化，反应温度为50℃，每隔12h取样，使用葡萄糖检测试剂盒(氧化酶法)测定糖化过程中的葡萄糖产量。

将上述糖化6h样品，离心后稀释10000倍，取10μL上样于色谱柱。HPLC测试条件为：戴安Utimat3000，自动进样器，色谱柱：AminexHPX-87H300×7.8mm(有机酸柱)，流动相：5mmol/LH2SO4，pH2.5，柱温45℃，进样量10μL，流速0.6mL/min，示差检测器(Shodex)，检测器温度为45℃。

结果如图11所示。

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序列表

<110>广西科学院

<120>一种新的I型普鲁兰酶的编码基因及其重组表达和应用

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>1728

<212>DNA

<213>膨胀芽孢杆菌（Tumebacillusflagellatussp.）GST4

<400>1

atgaatcaggaagctatttttcacatgtctcacggcgcgtacgcgtacgcgttgggaccg60

catcatgcgttgatcaaacttcgcgccaagcgcggagacttgaaatcggtgcatatggtg120

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gagtcgtacggtttccgcattctcctgttgagcggcggaacggtgtag1728

<210>2

<211>575

<212>氨基酸

<213>膨胀芽孢杆菌（Tumebacillusflagellatussp.）GST4

<400>1

MNQEAIFHMSHGAYAYALGPHHALIKLRAKRGDLKSVHMVHEDRFELPGSYATQELNYAG60

SDEFYDYFTAVVETRTRKLRYRFLLDNGPEQYWYGERALSNIADFAGWFQLAYLPNRDLF120

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EGVSGRDLLTDRVYSGTFDLESYGFRILLLSGGTV

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

cgcggatcccaatcaggaagctatttttca30

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

accaagcttcaccgttccgccgctca26

Claims (6)

1.一种来源于膨胀芽孢杆菌属的普鲁兰酶编码基因，其特征为所述基因为编码I型普鲁兰酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，记为pulB。

2.如权利1所述的普鲁兰酶编码基因，其特征在于所述的编码I型普鲁兰酶的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。

3.具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段，其特征在于所述的片段为SEQIDNO：2的氨基酸，记为PulB，蛋白片段的分子量大小为66kDa。

4.含有编码如权利要求3所述的氨基酸片段的核苷酸序列的重组质粒，其特征在于由所述核苷酸序列克隆至载体pET-22b的多克隆位点而获得，记为pET-pulB。

5.一种重组表达如权利要求3所述的具有I型普鲁兰酶活性的氨基酸片段的***，其特征在于，所述***是大肠杆菌表达***，或者是酵母表达***。

6.根据权利要求4所述重组质粒重组表达获得的I型普鲁兰酶片段在环保、食品、或保健中的应用。