CN110042088A

CN110042088A - 一种禽流感h9n2病毒样颗粒亚单位疫苗

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Publication number: CN110042088A
Application number: CN201910365359.1A
Authority: CN
Inventors: 郭伟伟; 向银辉; 刘大卫; 陈俭梅; 宫晓; 范根成; 杜元钊
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2019-04-30
Publication date: 2019-07-23

Abstract

本发明提供一种禽流感病毒的病毒样颗粒，是使用重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。其中重组杆状病毒包含有编码HA、NA和M1蛋白的核苷酸片段；所述的HA、NA和M1蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:6。本发明所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗。本发明通过对禽流感病毒HA、NA和M1蛋白的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的cDNA序列。对HA、NA和M蛋白进行优化改造后，利用昆虫细胞‑杆状病毒表达***制备的VLP，病毒蛋白产量显著高于SPF胚培养的病毒，生产成本明显降低。

Description

一种禽流感H9N2病毒样颗粒亚单位疫苗

技术领域

本发明属于基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种禽流感H9N2病毒样颗粒亚单位疫苗。

背景技术

禽流感是禽类烈性传染病之一，是由A型流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的。家禽在感染H9亚型禽流感病毒，特别当伴有混合感染时，可导致并引起高死亡率及产蛋率严重下降。作为主要流行于动物和人类中的一种传染性、死亡率高的急性、高度传染性疾病，禽流感广泛发生于世界各地，对人类和养禽业危害很大。

禽流感病毒属于正粘液病毒科的成員，流感病毒颗粒包括下列各种蛋白：血球凝集素HA、神经胺酸苷酶NA、基质蛋白M1、离子通道蛋白M2、核蛋白质NP、病毒聚合酶PB1、病毒聚合酶PB2、病毒聚合酶PA及非结构性蛋白NS2等蛋白質。其中HA蛋白质和NA蛋白质是膜糖蛋白，负责病毒的粘附细胞及病毒颗粒的穿透细胞內部，是用于病毒中和及保护免疫力的主要免疫抗原决定部位的来源。HA蛋白质和NA蛋白质被视为预防性流感疫苗的最主要成分。

杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达***与其他的表达***相比，杆状病毒表达***具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiro et al.,2001)。

现有的禽流感疫苗多为传统疫苗，是使用完整的病原体作为制苗用抗原，存在一定的安全风险。且全病毒的使用会对病毒造成选择压力，加速病毒的变异。

发明内容

本发明提供一种禽流感病毒的病毒样颗粒，并使用该病毒样颗粒来制备疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码HA、NA和M1蛋白的核苷酸片段；所述的HA、NA和M1蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:6；

所述的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11；

本发明所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备禽流感病毒的病毒样颗粒；

本发明再一个方面提供一种禽流感病毒的病毒样颗粒，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。

所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9；

本发明所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗；

本发明还提供一种禽流感病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本发明制备的病毒样颗粒。

本发明通过对禽流感病毒HA、NA和M1蛋白的cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的cDNA序列。对HA、NA和M蛋白进行优化改造后，利用昆虫细胞-杆状病毒表达***制备的VLP，病毒蛋白产量显著高于SPF胚培养的病毒，生产成本明显降低。

具体实施方式

本发明构建的用于表达抗原蛋白的重组杆状病毒，在昆虫细胞中能成功地表达出可溶性的HA、NA、M1蛋白，三个蛋白在体内自动组装成病毒样颗粒(VLPS)。VLP在空间构象上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于VLP不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高，可以减少禽流感全病毒疫苗免疫对病毒变异带来的压力，减少病毒的变异。因此，利用基因工程手段研制AIV-VLP疫苗是AIV新型疫苗研究的热点和方向。

利用本发明的可以生产出AIV-VLP亚单位疫苗，具有商业使用价值

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1、禽流感病毒HA蛋白、NA蛋白、M1蛋白的筛选

2017年申请人从山东某养鸡场的鸡群中分离出一株H9亚型禽流感病毒。将病料按1:5(w/v)比例加入到含双抗的生理盐水中，研磨制成悬液，1000r/min离心5分钟，取上清尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，36℃～37℃孵化3～4日，每日照胚2次，取24小时后死亡的鸡胚，置2～8℃冷却8～16小时，收获鸡胚液，进行HA及HI试验。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明分离的毒株是H9N2型禽流感病毒，无细菌、支原体及外源病毒污染；纯化后的病毒株命名为YBF1701。

对筛选鉴定的YBF1701株的HA、NA、M1基因进行了序列分析，其中HA基因全长1683bp(核苷酸序列为SEQ ID NO:1)，编码562个氨基酸(氨基酸序列为SEQ ID NO:2)；NA基因全长1563bp(氨基酸序列为SEQ ID NO:3)，编码522个氨基酸(氨基酸序列为SEQ ID NO:4)；M1基因全长759bp(氨基酸序列为SEQ ID NO:5)，编码253个氨基酸(氨基酸序列为SEQID NO:6)。将其与GenBank中收录的HA、NA、M1基因序列进行遗传进化树及核苷酸序列同源性分析，发现YBF1701株HA氨基酸与GenBank中同源性最近的APY18098.1相比，第217位(I变M)、第239位(D变N)、第254位(R变K)、第320位(I变V)、第420位(N变D)、第422位(I变V)、第473位(K变R)发生了变异，同源性为97.5～98.7％；NA氨基酸与GenBank中同源性最近的AKA60605.1相比，第108位(G变A)、第222位(T变I)、第355位(N变I)、第379位(G变A)，同源性约96.5～98.9％；M1氨基酸与GenBank中同源性最近的AIQ82571.1相比，第20位(L变K)、第62位(F变R)、第138位(V变G)、第171位(P变T)、第233位(L变P)，同源性约96.5～98.9％。抗原蛋白分析结果表明筛选病毒的HA、NA、M1蛋白与已报道的H9N2病毒的HA、NA和、M1基因存在着氨基酸差异。

实施例2：表达NA、HA和M1基因的重组杆状病毒的构建

1、HA、NA和M1基因的剪切、优化

将HA基因的N端结构域前的18个氨基酸的信号肽、C端的10个氨基酸的跨膜区剪切掉；将337位的S突变为K，更易于空间结构的形成；将N端加上起始密码子ATG；同时对密码子进行优化，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:7；该核苷酸序列包含了5′端和3′的酶切位点，除去这两个酶切位点的核苷酸后翻译的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。

将NA基因N端前29AA剪切掉，加上起始密码子ATG，C端加入一段终止序列，同时进行密码子的优化，其优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:9，由于内部有终止密码子，这样只能翻译438个氨基酸，其序列为SEQ ID NO:10。

将M1基因的N端加入一段启动子的核苷酸序列，同时进行密码子优化，其优化后的核苷酸为SEQ ID NO:11。进行剪切、优化的序列以及未经剪切优化的序列均由上海生物工程有限公司进行合成，并连入克隆载体。

2、HA阳性质粒的构建

2.2.1酶切反应

2.2.1.1标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：

2.2.1.2将步骤2.2.1.1中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。

2.2.1.3双酶切产物胶回收

取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。

(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。

(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。

(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。

(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。

(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(8)重复步骤(7)。

(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。

(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。

(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。

2.2.3连接反应

(1)标记需要用到的0.2mL离心管。

(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：

(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。

(4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

2.2.4转化反应

(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。

(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。

(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养1h。

(4)制备转化平板，依据质粒抗性制备转化用LB抗性平板。

(5)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(6)将步骤(5)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h。

(7)观察记录转化结果。

2.2.5质粒抽提与PCR鉴定

2.2.5.1质粒抽提

(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(2)吸取菌液至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm，2min，弃上清。

(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1buffer，彻底悬浮菌体。

(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀。室温静置2-4min。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。

(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm，30s，倒掉收集管中液体。重复一次。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μLElutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min，4℃保存管中DNA溶液。

2.2.5.2 PCR鉴定

(1)标记好需要用到的PCR管，按照下表进行加样、混匀，反应体系为25μL：

(2)PCR扩增程序：

(3)测序：将pcr鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。

2.3 HA-NA阳性质粒的构建

将测序正确的阳性质粒进行酶切(BamHI/EcoRI)、连接、转化，方法同上，将PCR鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。

2.4 HA-NA-M1阳性质粒的构建

将测序正确的阳性质粒进行酶切(Not I/Xba I)、连接、转化，方法同上，将PCR鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序。

2.5转化

将测序阳性的质粒转化DH10bac感受态细胞，方法同2.2.4.

2.6挑取杆粒与PCR鉴定

2.6.1挑取杆粒

(1)从2.5转化的平板中，用10μL移液枪头从转化平板中挑取白色单克隆菌落至5ml含卡那霉素抗性、四环素抗性、庆大霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm，10min。

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

2.6.2 PCR鉴定将2.6.1提取的DNA进行PCR鉴定，将结果阳性的质粒进行SF9细胞转染。

实施例3 SF9细胞转染

(1)准备：生物安全柜紫外灭菌30min；TNM-FH培养液置于27℃水浴锅预热至27℃。

(2)将2μg实施例2制备的重组DNA加入到100μl无血清和双抗的TNM-FH培养液中，混匀。将9μl Cellfectin Reagent加入到100μl无血清和双抗的TNM-FH培养液中，混匀。将脂质体与重组DNA混合，室温静止40min。

(3)从27℃培养箱中取出6孔板细胞，弃去上清培养基，用预温的TNM-FH培养液洗细胞三次，并弃去TNM-FH培养液。

(4)每个细胞孔加入2ml 10％胎牛血清的TNM-FH培养液。

(5)将重组DNA与脂质体的混合物轻轻加入到每孔细胞中，轻轻混匀，在27℃条件下静止培养5～6h。

(6)将孔中的液体弃掉，加入2ml完全TNM-FH培养液(含有双抗和10％血清)，27℃条件下静止培养5～6天。

(7)待细胞肿胀，体积变大，脱落后，收集上清液，标记为P1代重组杆状病毒，命名为AIV-VLP-P1。

(8)用AIV-VLP-P1感染新培养的Sf9细胞，提高重组杆状病毒含量，反复接种2代后，收取细胞上清液，4℃或-80℃保存备用。

实施例4蛋白纯化与检测

4.1重组HA-NA-M1蛋白在昆虫细胞Sf9内的表达与鉴定

将重组杆状病毒AIV-VLP-P1感染昆虫细胞Sf9，27℃培养72h，同时以未感染病毒的正常昆虫细胞Sf9 27℃培养48h作为对照，收获细胞，将培养上清冻存备用。细胞用pH7.4的PBS洗涤后，加入1×SDS-PAGE加样缓冲液[50mM Tris-HCl(pH6.8)，100mMDithiothreitol(DTT),2％SDS,0.05％Bromophemol blue,10％Glycerol]，煮沸5min，用12％分离胶、5％浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，100伏约2.5h，考马斯亮蓝R250染色，观察重组杆状病毒感染的昆虫细胞Sf9裂解物中是否出现禽流感病毒HA、NA、M1蛋白的特异性条带。结果序列未经优化的杆粒没有任何外源条带的表达，而序列优化的杆粒均有外源目的条带的表达。

4.2 HA血凝检测将将重组杆状病毒AIV-VLP接种昆虫细胞Sf9，27℃培养72小时后，离心收集细胞沉淀，细胞沉淀中加入适量生理盐水，重悬细胞沉淀，经超声波裂解细胞，以1000r/min 4℃离心10min，收集上清液，进行HA检测。结果显示HA>15log2，而分离的全病毒HA只有8log2.

4.3重组HA-NA-M1蛋白的纯化将重组杆状病毒AIV-VLP接种昆虫细胞Sf9，27℃培养72小时后，离心收集细胞沉淀，细胞沉淀中加入适量生理盐水，重悬细胞沉淀，经超声波裂解细胞，以1000r/min 4℃离心10min，收集上清液，用35％硫酸铵沉淀进行纯化，获得重组HA-NA-M1蛋白病毒样颗粒。

4.4 Western blot将获得的全病毒和4.3获得的重组HA-NA-M1蛋白病毒样颗粒进行SDS-PAGE，将蛋白条带转移到PVDF膜，采用半干法20伏转印30min，转印膜用封闭液封闭过夜，PBST洗涤3次，1∶500稀释的禽流感病毒阳性血清37℃作用1.5h，PBST洗3次，用1∶2000稀释的HRP标记的羊抗鸡酶标抗体37℃作用1.5h，PBST洗涤3次，底物溶液作用5min，在chemiDOC进行显色。结果全病毒条带很弱，而优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11的基因在昆虫细胞Sf9内表达的蛋白条带很亮，说明表达的HA、NA、M1蛋白免疫原性好。

实施例5透射电镜观察

将筛选的流感病毒YBF1701接种SPF鸡胚，72小时后收取尿囊液，进行100倍浓缩。将浓缩的全病毒液和AIV-VLP的P3代表达产物同时进行负染后电镜观察。结果AIV-VLP组装成很多病毒样颗粒，大小为100nm，而浓缩100倍的全病毒液只有微量的颗粒。

实施例6疫苗的制备及效果检测

1、疫苗的制备

1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

2)水相制备：将实施例4的4.3步骤纯化的重组HA-NA-M1蛋白病毒样颗粒与无菌生理盐水适当比例混合，使每0.2ml水相中含蛋白含量不低于20μg/ml(HA≥9log2)。取灭菌后的吐温-80 5份，加入配液罐中，同时加混合抗原液95份，开动搅拌电机搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

3)乳化取油相1.5份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。

2、疫苗的效力检验

2.1血清学方法:

用30～60日龄SPF鸡25只，10只各皮下或肌肉注射全病毒疫苗0.2ml，10只各皮下或肌肉注射AIV-VLP疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:180(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4(微量法)，结果见表1。

2.2免疫攻毒法:

用30～60日龄SPF鸡25只，10只各皮下或肌肉注射全病毒疫苗0.2ml，10只各皮下或肌肉注射AIV-VLP疫苗0.2ml，另5只不免疫作对照。接种后21～28日，每只鸡翅静脉注射10倍稀释的YBF1701株毒液，每只0.2ml，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组应至少9只鸡病毒分离为阴性；对照组应至少4只鸡病毒分离为阳性，结果见表1。

攻毒后3日采集泄殖腔拭子接种鸡胚分离病毒，测定尿囊液HA，无血凝性的胚液再盲传一次，以HA阴性作为保护判定标准。

表1疫苗效力检验结果

注：1、抗体为该组鸡的几何平均抗体值。

结果表明本发明制备的疫苗免疫35日龄SPF鸡后，21日采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。全病毒免疫组HI抗体效价的几何平均值为1:548.7(微量法)，亚单位疫苗组HI抗体效价的几何平均值为1:724.1(微量法)，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:,2(微量法)。说明重组HA-NA-M1蛋白病毒样颗粒稀释2⁸倍后，免疫效果比原倍的全病毒效果好。

同时每只鸡翅静脉注射10倍稀释的YBF1701株毒液，每只0.2ml，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5个，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5个鸡胚中只要有1个鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。结果全病毒免疫组9只鸡病毒分离为阴性；重组HA-NA-M1蛋白病毒样颗粒免疫组10只鸡病毒分离均为阴性，而对照组10只鸡病毒分离为阳性。

上述结果表明本发明制备的亚单位疫苗的效果优于全病毒疫苗，该病毒样颗粒制备的疫苗能很好地预防H9N2的感染，且亚单位疫苗产生的抗体滴度明显高于全病毒疫苗，所以具有良好的应用前景。而且，相比于市售的其它禽流感H9N2病毒疫苗，本发明所提供的亚单位疫苗对YBF1701株毒液的免疫效果最好，表明本发明亚单位疫苗产生的抗体对发生变异的禽流感H9N2病毒株具有更好的中和效果。

综上，本发明将未优化的HA-NA-M1蛋白以及优化的HA-NA-M1蛋白同时构建用于表达抗原蛋白的杆粒载体，结果未经优化的全长HA-NA-M1基因不能在昆虫细胞中表达，而优化的HA-NA-M1蛋白在昆虫细胞中成功地表达出可溶性的重组蛋白。将浓缩100倍的YBF1701毒株、表达的HA-NA-M1上清同时进行电镜观察，结果浓缩100倍的全病毒只有少量的VLP，而未经稀释表达的vp2上清在体内自动组装成病毒样颗粒(VLPS)，且病毒粒子量很多。VLP在空间构想上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于VLP不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种禽流感H9N2病毒样颗粒亚单位疫苗

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagacag tatcactaat aactatacta ctagtagcaa cagtaagcaa tgcagataag 60

atctgcatcg gctatcaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120

aatgtccctg tgacacatgt caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180

gcaacaagct tgggacaccc tcttattcta gacacctgca ccattgaagg actaatctat 240

ggcaatcctt cttgtgatct attgttggga ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300

ccatcagctg ttaacggatt gtgttatccc gggaatgtag aaaatctaga agagctaagg 360

tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa aggatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420

aatgtgtctt acagtgggac aagcaaagca tgttcagatt cattctacag aagcatgaga 480

tggttgactc aaaagaacaa cgcttaccct atccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540

gagaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatac tacgcagaca 600

aatctgtaca caagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggatc 660

ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720

tattggtcgg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa gatctgatgg gaatctaata 780

gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccacg gaagaatcct gaagactgat 840

ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaga aaggtggatt aaacacaaca 900

ttgccattcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcgaaata cattggcata 960

aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ctagatctag tagaggacta 1020

ttcggggcca tagcaggatt tatagaggga ggttggtcag gactagttgc tggttggtat 1080

ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140

aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataacatag tcgacaaaat gaacaagcag 1200

tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gtagaaacta gacttaacat gatcaataat 1260

aagatcgatg atcaaatcca ggatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320

gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgac gcaaatgtaa acaatctata taataaagtg 1380

aagagggcgt tgggttccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctataccac 1440

aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag aaggaagtat 1500

caagaggagt caaaattaga aagacagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560

acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgat tgcaatgggg 1620

tttgctgcct ttttgttctg ggctatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata 1680

taa 1683

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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1 5 10 15

Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu

20 25 30

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50 55 60

Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr

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Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg

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165 170 175

Thr Asn Asn Gln Glu Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His

180 185 190

Pro Pro Thr Asp Thr Thr Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr

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210 215 220

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Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp

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Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser

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Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Val

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Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser

325 330 335

Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp

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Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln

355 360 365

Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp

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Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln

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Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn

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Met Ile Asn Asp Lys Val Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr

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Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu

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Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn

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<212> DNA

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accacggcta attccaagtc acaggtaaat aggcaagtca tagttgacag tgacagttgg 1200

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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65 70 75 80

Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala

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<212> DNA

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu Thr

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Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg Trp

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Asn Asn Gln Glu Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His Pro

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Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Ile Phe Lys Pro Leu Ile

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Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asp Gly

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Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser His

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Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val Gln

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275 280 285

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Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Ser

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Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly

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Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn

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Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu His

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Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly

435 440 445

Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys

450 455 460

Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Arg

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Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggatccatga caactacaat gacgcttcac tttcgccaga acgagtgtag caatccatca 60

aacaaccaag ttgtgccttg tgaaccaatt attattgaga agaacacagt tcacttgaac 120

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gtatgtcgcg ataactggaa aggttccaat aggccagtcc tctatataaa tatggcagat 840

tatagtattg aatcaagtta tgtttgttct ggacttgtag gagacacacc aagagacgat 900

gacagcacgt ccagctcgaa ctgcagagac ccaaataacg aacgtggtgc ccccggagtt 960

aagggttggg cattcgatga tggcattgac atctggatgg gaaggaccat aaagtcagat 1020

agtcgctcgg gttatgaaac atttagggtg gtcaacgcat ggactacggc aaactcgaag 1080

tcccaagtaa atcgccaggt cattgtggat tccgatagtt ggagtggata ctctggaatc 1140

ttctcggttg agggaaagaa ttgtattaat agatgttttt acgttgagct cattaggggc 1200

cgccctcaag aaacccgcgt ctggtggact agtaactcta taatcgtgtt ttgtggaacc 1260

agtggcacgt acggtactgg ctcttggcca gacggagcca acatagactt catgcctatc 1320

taagatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 1380

acacctcccc ctgaacctga aacataaaat gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat 1440

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<210> 10

<211> 438

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Thr Thr Thr Met Thr Leu His Phe Arg Gln Asn Glu Cys Ser Asn

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Pro Ser Asn Asn Gln Val Val Pro Cys Glu Pro Ile Ile Ile Glu Lys

20 25 30

Asn Thr Val His Leu Asn Ser Thr Thr Ile Glu Arg Glu Ile Cys Pro

35 40 45

Lys Val Ala Glu Tyr Lys Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr

50 55 60

Gly Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Ala

65 70 75 80

Gly Asp Ile Trp Leu Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Ser Leu Gly

85 90 95

Lys Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Lys Asn Lys

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His Ser Asn Gly Thr Thr His Asp Arg Ile Pro His Arg Thr Leu Leu

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Met Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys

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Ile Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His

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Ile Cys Val Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Ile Ile Tyr

165 170 175

Asp Gly Met Leu Ala Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Lys Asn Ile Leu

180 185 190

Arg Ile Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Ala Val

195 200 205

Val Met Thr Asp Gly Ser Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Arg Ile Leu

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Phe Ile Arg Glu Gly Lys Ile Ile Ser Ile Ser Pro Leu Ser Gly Ser

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Trp Ala Phe Asp Asp Gly Ile Asp Ile Trp Met Gly Arg Thr Ile Lys

325 330 335

Ser Asp Ser Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Arg Val Val Asn Ala Trp

340 345 350

Thr Thr Ala Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val Asp

355 360 365

Ser Asp Ser Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys

370 375 380

Asn Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro

385 390 395 400

Gln Glu Thr Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Ile Val Phe Cys

405 410 415

Gly Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn

420 425 430

Ile Asp Phe Met Pro Ile

435

<210> 11

<211> 890

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcggccgcac tcccgaatac taataaatta tggagatcat taagatgatc accatcagtc 60

agatcaacaa gtatttcact gtcttcgtga ctgttctcta gtaaaagaat ctttgaattt 120

ttaggatgtc gctgcttact gaagtagaga cttacgtgtt gtccatcata cctagcggac 180

caaagaaggc cgaaattgcg cagcgcctcg aagatgtatt cgcgggaaag aacacagact 240

tggaggccct catggagtgg attaaaacca gaccgattct ctctcccctg accaagggca 300

tactgggccg cgtctttaca ctgacggtgc cgtcagagcg tggtctgcaa aggcgcagat 360

ttgtccagaa cgcgcttaac ggaaatggcg atcctaataa catggataaa gcggtaaagt 420

tgtataaaaa actgaaacgc gagatgactt ttcacggagc aaaagaagta gccttgagtt 480

actcgacagg cgctcttgca tcttgtatgg gtcttatata taaccgtatg ggcaccggaa 540

ctgctgaggg tgcgttgggc ctcgtgtgcg caacttgcga gcagatagct gacgcgcagc 600

accgttctca tcgtcaaatg gcgactacga cgaacacttt gattcgccac gagaatagaa 660

tggtgctggc aagtacaact gcaaaagcca tggaacaaat ggcaggttca tcagaacagg 720

ctgcagaggc catggaggtg gcatcgcaag ccaggcaaat ggtacaggcg atgcgtactg 780

tcggaacgca cccgaactcg tcaaccggtt tgaaagacga cccccttgag aatctgcaag 840

catatcaaaa ccgtatggga gtccaactcc agaggtttaa gtgatctaga 890

Claims

1.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒中包含有编码HA、NA和M1蛋白的核苷酸片段；所述的HA、NA和M1蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:6。

2.如权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的编码HA、NA和M1蛋白的核苷酸片段，其序列分别为SEQ ID NO:7；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:11。

3.权利要求1或2所述的重组杆状病毒在昆虫细胞中制备禽流感病毒的病毒样颗粒中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9。

5.一种制备禽流感病毒的病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1或2所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集备禽流感病毒的病毒样颗粒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9。

7.一种禽流感病毒的病毒样颗粒，其特征在于，所述的病毒样颗粒是使用权利要求5或6所述的方法制备的。

8.权利要求7所述的病毒样颗粒在制备疫苗中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为亚单位疫苗。

10.一种禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原为权利要求7所述的病毒样颗粒。