CN110041431A - 靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法 - Google Patents

靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法，总的来说涉及产生在癌症疗法中使用的融合蛋白的领域，更具体来说，涉及编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其中所述嵌合融合蛋白包含至少一个靶向组成部分和至少一个抵消癌细胞的免疫耐受性的免疫调节组成部分。

Description

靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法
本申请为国际申请日2013年3月13日、国际申请号PCT/IB2013/001155于2014年11月28日进入中国国家阶段、申请号201380028604.0、发明名称“靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法”的分案申请。
与相关申请的交叉引用
本申请要求2012年4月30日提交的印度专利申请号1689/CHE/2012和2012年4月30日提交的印度专利申请号1690/CHE/2012的优先权，两者的内容为所有目的特此通过参考并入本文。
技术领域
本发明总的来说涉及产生在癌症疗法中使用的融合蛋白的领域，更具体来说，涉及编码所述融合蛋白的核苷酸序列，其中所述融合或嵌合多肽包含至少一个靶向组成部分和至少一个抵消癌细胞的免疫耐受性的免疫调节组成部分。
背景技术
免疫***为人体提供了识别和保护自己抵御微生物和被认为是外来的或潜在有害的物质的手段。尽管使用单克隆抗体和T细胞的被动转移以攻击肿瘤细胞的被动免疫疗法已被证明在临床上有效，但诱导这些免疫效应物并建立针对肿瘤细胞的免疫记忆的主动治疗性疫苗接种的目标仍具有挑战性。已经鉴定了几种肿瘤特异性和肿瘤相关抗原，但这些抗原总体上免疫原性弱，并且肿瘤利用多样化的机制产生致耐受性的环境，允许它们避开免疫攻击。克服这样的免疫耐受性并激活稳定水平的抗体和/或T细胞应答的策略，是有效的癌症免疫疗法的关键所在。更重要的是，需要探索个体蛋白和如何产生具有活性三级结构的有活性的嵌合多肽。
发明内容
本发明提供了在癌细胞中表达的多核苷酸以及由其编码的多肽。这些多核苷酸和表达的多肽可用于各种癌症治疗的治疗性方法中。本发明还提供了通过抵消癌细胞的免疫耐受性来减少癌细胞生长的方法，其中T细胞仍具有活性，并抑制已知抑制免疫***对肿瘤的应答的调节性T细胞的召集。因此，通过本发明的多核苷酸序列产生的嵌合多肽，由于所述表达的融合或嵌合多肽，可用于治疗癌症。
一方面，本发明提供了嵌合的多肽，其含有至少一个用于靶向癌细胞的靶向组成部分以及至少一个抵消癌细胞的免疫耐受性的免疫调节组成部分，其中所述靶向组成部分和免疫调节组成部分通过具有足够氨基酸残基长度的氨基酸间隔物相连，使得两个组成部分能够成功地与它们各自的靶点结合。在可替选方式中，所述靶向组成部分和所述抵消癌细胞的免疫耐受性的免疫调节组成部分可以彼此直接结合。本发明的嵌合/融合多肽可用于结合到癌细胞受体并降低癌细胞避开免疫应答的能力。
本发明是基于通过编码所述抵消或逆转癌细胞的免疫耐受性的融合蛋白的多核苷酸的表达来制备嵌合/融合蛋白。癌细胞在肿瘤微环境中能够通过特定免疫抑制机制逃避被化疗药剂或肿瘤靶向抗体的消除，癌细胞的这种能力被称为免疫耐受性。这样的免疫抑制机制包括免疫抑制性细胞因子(例如转化生长因子β(TGF-β))和调节性T细胞和/或免疫抑制性髓样树突状细胞(DC)。通过抵消肿瘤诱导的免疫耐受性，本发明提供了用于癌症治疗的有效组合物和方法，其任选地与另一种现有的癌症治疗相组合。本发明提供了通过激活并放大T细胞介导的针对有抗性或弥散性癌细胞的适应性抗肿瘤效应，来抵消肿瘤诱导的免疫耐受性并增强化疗的抗肿瘤效能的策略。
另一方面，本发明提供了包括与至少一个免疫调节组成部分融合的至少一个靶向组成部分的分子。靶向组成部分特异性结合靶分子，免疫调节组成部分特异性结合下列分子之一：(i)转化生长因子-β(TGF-β)；(ii)程序化死亡-1配体1(PD-L1)或程序化死亡-1配体2(PD-L2)；(iii)核因子KB的受体激活剂(RANK)配体(RANKL)；(iv)转化生长因子-β受体(TGF-pR)；(v)程序化死亡-1(PD-1)；(vi)4-1BB受体或(vii)核因子κΒ的受体激活剂(RANK)。
另一方面，所述靶向组成部分包括特异性结合肿瘤细胞、肿瘤抗原、肿瘤脉管***、肿瘤微环境或肿瘤浸润的免疫细胞的组分的抗体、抗体片段包括抗体的轻链或重链、scFv或含Fc多肽。优选地，靶向组成部分是对肿瘤细胞上的组分具有结合亲和性的抗体或其片段。值得注意的是，每个重链和轻链可以个别地连接到分开和不同的免疫调节组成部分。此外，抗体靶向组成部分的重链或轻链可以连接到免疫调节组成部分，所述免疫调节组成部分进而可以进一步连接到第二免疫调节组成部分，其中在两个免疫调节组成部分之间存在连接物。
另一方面，提供了包含肿瘤靶向组成部分和包含结合于转化生长因子β(TGF-β)的分子的免疫调节组成部分的嵌合多肽，其中所述肿瘤靶向组成部分是结合于EGFR1的抗体，其中所述抗体可以是完整抗体、重链或轻链。所述肿瘤靶向组成部分可以包括靶向癌细胞的单克隆抗体，其包括但不限于西妥昔单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗(ritubximab)、易普利单抗、初利木单抗(tremelimumab)、莫罗单抗-CD3、阿昔单抗、达利珠单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、吉妥珠单抗奥佐米星、阿伦单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、奥马珠单抗、托西莫单抗、I-131托西莫单抗、依法利珠单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、那他珠单抗、依那西普、IGN101(Aphton)、伏洛昔单抗(Biogen Idee and PDLBioPharm)、抗CD80mAb(Biogen Idee)、抗CD23mAb(Biogen Idel)、CAT-3888(CambridgeAntibody Technology)、CDP-791(Imclone)、拉普妥珠单抗(eraptuzumab)(Immunomedics)、MDX-010(Medarex and BMS)、MDX-060(Medarex)、MDX-070(Medarex)、马妥珠单抗(Merck)、CP-675,206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN-30(Seattle Genetics)、泽诺里木单抗(zanolimumab)(Serono and Genmab)、阿卡木单抗(adecatumumab)(Sereno)、奥戈伏单抗(United Therapeutics)、尼妥珠单抗(YM Bioscience)、ABT-874(AbbottLaboratories)、德尼单抗(Amgen)、AM 108(Amgen)、AMG 714(Amgen)、芳妥珠单抗(BiogenIdee and PDL BioPharm)、达利珠单抗(Biogent Idee and PDL BioPharm)、戈利木单抗(Centocor and Schering-Plough)、CNTO 1275(Centocor)、奥克利珠单抗(ocrelizumab)(Genetech and Roche)、HuMax-CD20(Genmab)、贝利木单抗(HGS and GSK)、依帕珠单抗(Immunomedics)、MLN1202(Millennium Pharmaceuticals)、维西珠单抗(PDL BioPharm)、托珠单抗(Roche)、奥克拉利珠单抗(ocrerlizumab)(Roche)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(UCB，以前的Celltech)、艾库组单抗(Alexion Pharmaceuticals)、派克利珠单抗(pexelizumab)(Alexion Pharmaceuticals and Procter&Gamble)、阿昔单抗(Centocor)、兰尼木单抗(ranibizimumab)(Genetech)、美泊利单抗(GSK)、TNX-355(Tanox)或MYO-029(Wyeth)。
另一方面，所述肿瘤靶向组成部分是结合于HER2/Neu、CD20、CTLA4、EGFR1的单克隆抗体，并且其中所述抗体可以是完整抗体、重链或轻链。
另一方面，所述靶向组成部分是特异性结合表皮生长因子受体(EGFR1、Erb-B 1)、HER2/neu(Erb-B2)、CD20、对于Treg功能(CD 152)来说必需的细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、H-1和白介素-6(IL-6)的分子。
另一方面，所述靶向组成部分特异性结合调节性T细胞(treg)、髓系抑制细胞或树突状细胞的组分。另一方面，靶向组成部分特异性结合下列分子之一：(i)CD4；(ii)CD25(IL-2ct受体；IL-2aR)；(iii)转化生长因子-β受体(TGF-pR)；(vi)转化生长因子-β(TGF-β)；(vii)程序化死亡-1(PD-1)；(viii)程序化死亡-1配体(PD-LI或PD-L2)。
另一方面，所述免疫调节组成部分特异性结合下列分子之一：(i)转化生长因子-β(TGF-β)；(ii)程序化死亡-1配体(PD-L1或PD-L2)；或4-1BB受体。
另一方面，所述免疫调节组成部分包括结合TGF-β并抑制其功能的分子。具体来说，所述免疫调节组成部分包括转化生长因子-β受体TGF-βRII、TGF-βRIIb或TGF-βRIII的细胞外配体结合结构域。另一方面，所述免疫调节组成部分包括TGF-βRII的细胞外配体结合结构域(ECD)。另外，所述免疫调节组成部分可以包括结合于4-1BB受体以刺激T细胞来帮助消除肿瘤的H-4-1BB配体。
另一方面，所述靶向组成部分包括特异性结合于HER2/neu、EGFR1、CD20或细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的抗体、抗体片段或多肽，并且其中所述免疫调节组成部分包括TGF-βRII的细胞外配体结合结构域。
另一方面，所述免疫调节组成部分包括特异性结合于程序化死亡-1配体1(PD-L1)或程序化死亡-1配体2(PD-L2)并抑制其活性的分子。另一方面，所述免疫调节组成部分包括程序化死亡-1(PD-1)的细胞外配体结合结构域或胞外结构域。
另一方面，所述靶向组成部分包括特异性结合于HER2/neu、EGFR1、CD20、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、CD25(IL-2a受体；IL-2aR)或CD4的抗体、抗体片段或多肽，并且其中所述免疫调节组成部分包括程序化死亡-1(PD-1)的细胞外配体结合结构域或胞外结构域。
另一方面，所述靶向组成部分包括特异性结合于CD20的抗体或抗体片段，并且所述免疫调节组成部分包括来自于转化生长因子-β(TGF-β)的序列。
一方面，本发明提供了优化的基因，其编码包含至少一个靶向组成部分和至少一个免疫调节组成部分的融合多肽，以用于在人类对象中治疗癌症，其中所述优化的基因已被修饰以在人类对象中提高表达，优选地所述优化的基因包含编码靶向组成部分或免疫调节组成部分并选自SEQ ID NO：12至28的序列。
另一方面，本发明提供了包含优化的基因的载体，用于在人类对象中治疗癌症，其中所述优化的基因已被修饰以增加CG序列。优选地，所述载体包括编码至少一个靶向组成部分和至少一个免疫调节组成部分并选自SEQ ID NO：12至28的序列。
另一方面，本发明提供了一种在对象中治疗癌症的方法，所述方法包括：
a.提供至少一种重组载体，其包含编码至少一个靶向组成部分和至少一个免疫调节组成部分并选自SEQ ID NO：12至28的核苷酸序列；以及
b.在使所述核苷酸序列以在所述对象中产生治疗有效量的所述被编码的融合蛋白的水平表达的条件下，将所述重组载体给药于所述对象。
另一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含优化的基因的多核苷酸，所述优化的基因编码至少一个靶向组成部分和至少一个免疫调节组成部分，并选自SEQ ID NO：12至28。
另一方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，其用编码本发明的融合蛋白肽的多核苷酸转染。
另一方面，本发明设想了一种制备本发明的融合蛋白的方法，所述方法包括：
a.用编码嵌合融合蛋白的多核苷酸序列转染宿主细胞以产生转化的宿主细胞，其中所述多核苷酸序列编码至少一个靶向组成部分和至少一个免疫调节组成部分，并选自SEQ ID NO：12至28；以及
b.将所述转化的宿主细胞维持在足以使所述肽表达的生物条件下。
另一方面，本发明涉及如图1至15中所示的嵌合融合蛋白的用途，其用于治疗癌症的药物中。优选地，将所述融合蛋白在宿主细胞中表达，并将这样的表达的蛋白以治疗性量给药，以在需要的对象中减轻癌症的效应。
另一方面，本发明提供了一种预防或***疾病的方法。所述所述包括向需要的对象给药一种或多种本发明的融合蛋白，在各种不同情况下，所述对象被给药本发明的一种或多种分子并与另一种抗癌疗法相组合，在一种情况下，所述抗癌疗法包括化疗分子、抗体、小分子激酶抑制剂、激素类药剂或细胞毒性剂。所述抗癌疗法还可以包括电离辐射、紫外辐射、冷冻消融、热消融或射频消融。
另一方面，本发明提供了一种制备治疗活性抗体-肽融合蛋白的方法，所述方法包括：
a.制备所述融合蛋白的密码子优化的序列；
b.将所述融合蛋白的优化的序列克隆到能够瞬时或持续表达的宿主细胞中；
c.将所述宿主细胞在培养基中，在适合于生长并允许所述宿主细胞表达所述克隆的蛋白的条件下生长；以及
d.对所述表达的蛋白进行纯化，并任选地检查所述蛋白对其靶的双特异性结合能力。
在优选实施方式中，所述治疗活性抗体-肽融合蛋白是融合到一个或多个抵消癌细胞的免疫耐受性的免疫调节组成部分的靶向抗体。在一种情况下，所述免疫调节组成部分可以通过长度足以允许所述分子的双特异性结合的氨基酸间隔物连接。所述免疫调节组成部分可以结合于所述抗体的重链或轻链的C-端。
在如上所述的优选方法中，所述免疫调节组成部分是(i)转化生长因子-β(TGF-β)、(ii)程序化死亡-1(PD-1)、(iii)CTLA-4或(iv)4-1BB或其部分，并且所述靶向抗体结合表皮生长因子受体(EGFR1、Erb-B 1)、HER2/neu(Erb-B2)、CD20、CD6、CTLA-4、粘蛋白l(MUC-1)、白介素-2(IL-2)或白介素-6(IL-6)。
本发明的方法提供了编码所述治疗活性抗体-肽融合蛋白的核苷酸序列，并且这样的表达可以在瞬时细胞系或稳定细胞系中进行。所述瞬时表达通过将带有所述融合蛋白的载体转染或转化到哺乳动物宿主细胞中来进行。
在所述融合肽表达后，优选地对它们进行纯化和体外试验以检查其双特异性，也就是说具有结合于所述靶向组成部分和免疫调节组成部分两者的能力。这样的试验可以包括体外试验例如ELISA或NK/T-细胞结合测定法，以验证双功能靶结合或免疫细胞刺激。
值得注意的是，在所述特定融合肽展现出所需双特异性后，选择这样的融合肽用于亚克隆到稳定细胞系中进行更大规模的表达和纯化。这样的稳定细胞系以前已被公开，例如哺乳动物细胞系，包括但不限于HEK293、CHO或NSO。
另一方面，所述培养基可以通过向这样的培养基进行添加来改进。例如，所述培养基可以包括在一开始或以补料分批方式向细胞培养物添加的二价过渡金属盐，以减少培养期间乳酸的积累和/或降低所述融合蛋白的非均质性。所需过渡金属盐包括锌离子，并且所述金属离子的添加可以在生产的不同阶段中进行。
从下面的详细描述、附图和权利要求书，本发明的其他特点和优点将显而易见。
附图说明
图1示出了在LC恒定区处具有抗HER2/neu抗体-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列，其中抗HER2/neu抗体重链(SEQ ID NO：1)和抗HER2/neu抗体轻链(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于抗HER2/neu抗体轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图2示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII融合蛋白在LC恒定区处的氨基酸序列，其中抗EGFR1抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)和抗EGFR1抗体轻链的氨基酸序列(SEQ IDNO：6)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于抗EGFR1抗体轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图3示出了抗CTLA4抗体-TGFβRII融合蛋白在LC恒定区处的氨基酸序列，其中抗CTLA4抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)和抗CTLA4抗体轻链的氨基酸序列(SEQ IDNO：8)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于抗CTLA4抗体轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图4示出了具有抗HER2/neu抗体/HC-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列的抗HER2/neu抗体HC-4-1BB和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中抗HER2/neu抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)被连接到以斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采用书写文本字体，并且抗HER2/neu抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于抗HER2/neu抗体轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图5示出了具有抗EGFR1抗体重链-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列的抗EGFR1抗体HC-4-1BB和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中抗EGFR1抗体重链的氨基酸序列(SEQID NO：5)被连接到以斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采用书写文本字体，并且抗EGFR1抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，并且连接物(SEQ ID NO：3)位于其间。
图6示出了具有抗CTLA4抗体重链-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列的抗CTLA4抗体HC-4-1BB和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中抗CTLA4抗体重链的氨基酸序列(SEQID NO：7)被连接到以斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采用书写文本字体，并且抗CTLA4抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，并且连接物(SEQ ID NO：3)位于其间。
图7示出了具有抗HER2/neu抗体重链-PD1融合蛋白的氨基酸序列的抗HER2/neu抗体HC-PD1和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中抗HER2/neu抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)被连接到以斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采用书写文本字体，并且抗HER2/neu抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，并且连接物(SEQ ID NO：3)位于其间。
图8示出了具有抗EGFR1抗体重链-PD1融合蛋白的氨基酸序列的抗EGFR1抗体HC-PD1和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中抗EGFR1抗体重链的氨基酸序列(SEQ IDNO：5)被连接到以斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采用书写文本字体，并且抗EGFR1抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，并且连接物(SEQ ID NO：3)位于其间。
图9示出了具有抗CTLA4抗体重链-PD1融合蛋白的氨基酸序列的抗CTLA4抗体HC-PD1和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中抗CTLA4抗体重链的氨基酸序列(SEQ IDNO：7)被连接到以斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采用书写文本字体，并且抗CTLA4抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，并且连接物(SEQ ID NO：3)位于其间。
图10示出了具有抗HER2/neu抗体重链-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列的抗HER2/neu抗体HC-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列，其中抗HER2/neu抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)被连接到以斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，4-1BB(免疫调节组成部分)的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)采用书写文本字体，其间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括抗HER2/neu抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图11示出了具有抗EGFR1抗体重链-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列的抗EGFR1抗体HC-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列，其中抗EGFR1抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，4-1BB(免疫调节组成部分)的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)采用书写文本字体，其间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括抗EGFR1抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图12示出了具有抗CTLA4抗体重链-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列的抗CTLA4抗体HC-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列，其中抗CTLA4抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，4-1BB(免疫调节组成部分)的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)采用书写文本字体，其间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括抗CTLA4抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图13示出了具有抗HER2/neu抗体重链-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列的抗HER2/neu抗体HC-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列，其中抗HER2/neu抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，PD-1(免疫调节组成部分)的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)采用书写文本字体，其间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括抗HER2/neu抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图14示出了具有抗EGFR1抗体重链-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列的抗EGFR1抗体HC-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列，其中抗EGFR1抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，PD-1(免疫调节组成部分)的氨基酸序列(SEQID NO：10)采用书写文本字体，其间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括抗EGFR1抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图15示出了具有抗CTLA4抗体重链-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列的抗CTLA4抗体HC-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列，其中抗CTLA4抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，PD-1(免疫调节组成部分)的氨基酸序列(SEQID NO：8)采用书写文本字体，其间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括抗CTLA4抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图16示出了已进行密码子优化用于在CHO细胞中表达的带有连接物的抗HER2/neu抗体重链恒定区(SEQ ID NO：12)和TGFβRII ECD(SEQ ID NO：13)的核苷酸序列。
图17示出了已进行密码子优化用于在CHO细胞中表达的抗HER2/neu抗体重链可变区(SEQ ID NO：14)、抗HER2/neu抗体轻链可变区(SEQ ID NO：15)和带有连接物的抗EGFR1抗体重链恒定区(SEQ ID NO：16)的核苷酸序列。
图18示出了已进行密码子优化用于在CHO细胞中表达的抗EGFR1抗体重链可变区(SEQ ID NO：17)、抗EGFR1抗体轻链可变区(SEQ ID NO：18)、抗CTLA4抗体重链可变区(SEQID NO：19)和抗CTLA4抗体轻链可变区(SEQ ID NO：20)的核苷酸序列。
图19示出了已进行密码子优化用于在CHO细胞中表达的抗CD20抗体IgG1分子(SEQID NO：21)、抗CD20抗体重链可变区(SEQ ID NO：22)和抗CD20抗体轻链可变区(SEQ ID NO：23)的核苷酸序列。
图20示出了已进行密码子优化用于在CHO细胞中表达的4-1BB(SEQ ID NO：24)和抗IL6R抗体重链(SEQ ID NO：25)的核苷酸序列。
图21示出了已进行密码子优化用于在CHO细胞中表达的抗IL6R抗体轻链可变区(SEQ ID NO：26)、抗4-1BB抗体重链(SEQ ID NO：27)和抗4-1BB抗体轻链可变区(SEQ IDNO：28)的核苷酸序列。
图22示出了蛋白A纯化的抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII在12％PAGE上的分析。
图23A示出了通过蛋白A/SEC层析分析的抗HER2/neu抗体-TGFβRII样品，B示出了通过蛋白A/SEC层析分析的抗EGFR1抗体-TGFβRII样品。
图24A示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII分子结合于TGFβ，表明融合蛋白是有功能的，B示出了抗HER2抗体-TGFβRII与Bmab200(赫赛汀)类似抑制BT474细胞系的增殖。
图25示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII与西妥昔单抗类似抑制A431细胞系的增殖。
图26示出了抗HER2抗体-TGFβRII对BT474细胞的ADCC活性与Bmab200(赫赛汀)的活性类似。
图27示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII对A431细胞的ADCC活性，其中所述ADCC活性与西妥昔单抗的活性类似。
图28示出了抗EGFR1抗体-4-1BB与抗EGFR1抗体-TGFβRII和西妥昔单抗相比的ADCC活性。
图29A示出了抗CTLA4抗体-TGFβRII对TGFβ1的结合活性与抗EGFR1抗体-TGFβRII相当，并且B示出了抗CTLA4抗体-TGFβRII对CTLA4的结合活性。
图30A示出了抗CTLA4抗体-TGFβRII的结合活性，以确定PD1-Fc结合水平，并且B示出了抗EGRF1抗体-4-1BB的结合活性，以确定4-1BBL的结合。
图31A示出了抗EGFR1抗体-4-1BB对EGFR的结合活性，并且B示出了PD1-Fc-4-1BB的结合活性以找出PDL1-Fc。
图32示出了抗EGFR1抗体-PD1对EGFR和PD1的结合活性。
图33示出了表达的蛋白及其还原烷基化的照片。
图34A示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合体的轻链(LC)(还原的)的质谱图，并且B示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合体的LC(还原的)的解卷积质谱图。
图35示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合体的重链(HC)(还原的)的质谱图。
图36A示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD的LC(还原的)的质谱图，并且B示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD的LC(还原的)的解卷积质谱图。
图37示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD的HC(还原的)质谱图。
图38A示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的UV色谱图，并且B示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的全离子层析图(TIC)。
图39、40和41分别提供了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的轻链、重链和连接的基序的预期/观察到的胰蛋白酶肽的列表。
图42A示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的UV色谱图，并且B示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的全离子层析图(TIC)。
图43提供了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的轻链的预期/观察到的胰蛋白酶肽的列表。
图44示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的重链的预期/观察到的胰蛋白酶肽的列表。
图45示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的重链的预期/观察到的胰蛋白酶肽的列表。
图46示出了坎妥珠单抗(Cantuzumab)-TGFβRII融合蛋白在LC恒定区处的氨基酸序列，其中坎妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)和坎妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于坎妥珠单抗轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图47示出了西妥木单抗(Cixutumumab)-TGFβRII融合蛋白在LC恒定区处的氨基酸序列，其中西妥木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)和西妥木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于西妥木单抗轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图48示出了克里伏妥珠单抗(Clivatuzumab)-TGFβRII融合蛋白在LC恒定区处的氨基酸序列，其中克里伏妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)和克里伏妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于克里伏妥珠单抗轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图49示出了普托木单抗(Pritumumab)-TGFβRII融合蛋白在LC恒定区处的氨基酸序列，其中普托木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)和普托木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基，并且其中连接物(SEQ ID NO：3)位于普托木单抗轻链与TGF-βRII之间并用斜体示出。
图50示出了坎妥珠单抗HC-4-1BB和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中坎妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，并且坎妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ ID NO：3)。
图51示出了西妥木单抗HC-4-1BB和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中西妥木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，并且西妥木单抗单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ ID NO：3)。
图52示出了克里伏妥珠单抗(Clivatuzumab)HC-4-1BB和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中克里伏妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，并且克里伏妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ IDNO：3)。
图53示出了普托木单抗HC-4-1BB和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中普托木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，并且普托木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ ID NO：3)。
图54示出了坎妥珠单抗-HC-PD1和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中坎妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，并且坎妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ ID NO：3)。
图55示出了西妥木单抗-HC-PD1和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中西妥木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，并且西妥木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ ID NO：3)。
图56示出了克里伏妥珠单抗-HC-PD1和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中克里伏妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ IDNO：3)，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，并且克里伏妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ ID NO：3)。
图57示出了普托木单抗-HC-PD1和LC-TGFβRII融合蛋白的氨基酸序列，其中普托木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，并且普托木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)被连接到用粗体字母标出的TGF-βRII(免疫调节组成部分)(SEQ ID NO：4)的氨基残基，其间具有连接物(SEQ ID NO：3)。
图58示出了坎妥珠单抗HC-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列，其中坎妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括坎妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
图59示出了西妥木单抗HC-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列，其中西妥木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括西妥木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。
图60示出了克里伏妥珠单抗HC-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列，其中克里伏妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ IDNO：11)，并包括克里伏妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。
图61示出了普托木单抗HC-TGFβRII-4-1BB融合蛋白的氨基酸序列，其中普托木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且4-1BB(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：9)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括普托木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)。
图62示出了坎妥珠单抗HC-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列，其中坎妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括坎妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
图63示出了西妥木单抗HC-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列，其中西妥木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括西妥木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。
图64示出了克里伏妥珠单抗HC-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列，其中克里伏妥珠单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括克里伏妥珠单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。
图65示出了普托木单抗HC-TGFβRII-PD1融合蛋白的氨基酸序列，其中普托木单抗重链的氨基酸序列(SEQ ID NO：35)被连接到用斜体示出的连接物(SEQ ID NO：3)，并且TGFβRII(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：4)用粗体字母标出，并且PD1(免疫调节组成部分)的序列(SEQ ID NO：10)采取书写文本字体，中间具有连接物(SEQ ID NO：11)，并包括普托木单抗轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)。
具体实施方式
除非另有指明，否则本发明的实践利用在本领域技术范围之内的免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术。参见例如Sambrook等，《分子克隆实验指南》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第二版(1989)；《分子生物学现代方法》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.Ausubel等主编(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)丛书(Academic Press,Inc.)；《PCR 2：实用方法》(PCR 2:APRACTICAL APPROACH)(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor主编，(1995))；Harlow和Lane主编，(1988)《抗体实验指南》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)；以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.Freshney主编(1987))。
定义
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的意义。本文中使用的术语仅仅是出于描述特定实施方式的目的，并且不打算限制本发明。当在本发明的说明书和权利要求书中使用时，单数形式旨在也包括复数形式，除非上下文明确指明不是如此。下面的术语具有所给出的意义：
当在本文中使用时，术语“多核苷酸”意味着通过磷酸二酯键相连的核苷酸的序列。多核苷酸在本文中以从5’到3’的方向呈现。本发明的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。当多核苷酸是DNA分子时，该分子可以是基因或cDNA分子。核苷酸碱基在本文中用单字母编码标出：腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)，次黄嘌呤(I)和尿嘧啶(U)。本发明的多核苷酸可以使用本领域技术人员公知的标准技术来制备。
当在本文中使用时，术语“优化的”意味着核苷酸序列已被改编，以使用在生产细胞或生物体、一般为真核细胞例如毕赤酵母的细胞、木霉的细胞、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)或人类细胞中优选的密码子来编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列被工程化，以完全或尽可能多地保留由起始核苷酸序列、也被称为“亲本”序列最初编码的氨基酸序列。在本文中，优化的序列已被工程化以具有在CHO哺乳动物细胞中优选的密码子；然而，在本文中也设想了这些序列在其他真核细胞中的优化的表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也被称为是优化的。当在本文中使用时，术语“表达”被定义为特定核苷酸序列由其启动子驱动的转录和/或翻译。
当在本文中使用时，术语细胞的“转染”意味着出于对细胞进行遗传修饰的目的将遗传材料导入到所述细胞中。转染可以通过本领域中已知的各种手段例如转导或电穿孔来实现。
当在本文中使用时，术语“癌症”被定义为以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴***扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、***癌、卵巢癌、***、皮肤癌、眼癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
术语“转入基因”在广义上被用于指称被并入到用于在靶细胞中表达的载体中的任何异源核苷酸序列和相关的表达控制序列例如启动子。本领域技术人员将会认识到，表达控制序列根据促进转入基因在靶细胞中表达的能力来选择。转入基因的实例是编码本发明的嵌合融合蛋白的核酸。
当在本文中使用时，术语“表达载体”是指含有能够被转录的为基因产物的至少一部分编码的核酸序列的载体。表达载体可以含有各种控制序列，其是指操作上连接的编码序列在特定宿主生物体中的转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除了掌控转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体也可能含有起到其他功能的核酸序列。所述术语还包括包含将要在体内或体外递送到宿主细胞中的多核苷酸的重组质粒或病毒。宿主细胞优选为瞬时细胞系或稳定细胞系，更优选为哺乳动物宿主细胞，并选自HEK293、CHO和NSO。
当在本文中使用时，术语“对象”是指人类或脊椎动物包括狗、猫、马、奶牛、猪、绵羊、山羊、鸡、猴、大鼠和小鼠。
当在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指主题化合物的引发研究人员、兽医、医生或其他临床医师所寻求的组织、***、动物或人类的生物学或医学反应的量。
当在本文中使用时，术语“可药用”意味着载体、稀释剂或赋形剂必须与配方中的其他成分相容，并且对其接受者无害。
当在本文中使用时，术语“重组”是指与自然界中通常存在的不同的遗传实体。当应用于多核苷酸或基因时，这意味着所述多核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤以及导致产生与自然界中存在的多核苷酸不同的构建物的其他程序的各种不同组合的产物。
本文中使用的术语“显著同一性”或“显著相似性”当指称核酸或其片段时，表明当与另一个核酸(或其互补链)最适对齐并进行适当的核苷酸***或缺失时，所述序列存在至少约95至99％的核苷酸序列同一性。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换地用于表示通过酰胺键共价连接的至少两个氨基酸的序列聚合物。
当在本文中并与肽相关使用时，术语“同源的”是指两个肽之间的氨基酸序列相似性。当两个肽中的氨基酸位置被同一的氨基酸占据时，它们在该位置处同源。因此，“基本上同源”意味着氨基酸序列大部分但不是完全同源，并保留与它同源的序列的大部分或所有活性。当在本文中使用时，“基本上同源”意味着序列与参比肽具有至少50％的同一性，优选地至少75％、更优选地至少95％的同源性。包括其他肽序列修饰，例如本文公开的序列的氨基酸序列的少量变异、缺失、置换或衍生，只要所述肽具有与未修饰的肽基本上相同的活性或功能即可。值得注意的是，修饰的肽将保留与未修饰的肽相关的活性或功能，所述修饰的肽一般具有与未修饰序列的氨基酸序列“基本上同源的”氨基酸序列。
当在本文中使用时，术语“给药”被定义为将组合物真正物理导入到宿主对象中或其上(在适合时)。本发明考虑到了将组合物导入到对象中的任何和所有方法；所述方法不依赖于任何特定导入手段，并且也不应如此解释。导入手段对于本领域技术人员来说是公知的，并且组合物优选地皮下或肿瘤内给药。本领域技术人员将会认识到，尽管可以使用超过一种途径来给药，但特定途径与其他途径相比能够提供更即时更有效的反应。局部或***递送可以通过包含免疫疫苗在体腔内的施用或灌注、气溶胶的吸入或吹入的给药，或通过肠胃外导入包括肌肉内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下或真皮内给药来实现。在肿瘤位于中枢神经***中的情况下，组合物必须肿瘤内给药，因为在中枢神经***中不存在免疫***的引发。
尽管化疗药剂可以诱导“免疫原性”肿瘤细胞死亡并促进抗原被树突状细胞的交叉呈递，但肿瘤产生致耐受性的环境，允许它们抑制先天和适应性免疫应答的激活并避开免疫效应细胞的免疫攻击。本发明提供了抵消肿瘤微环境中肿瘤诱导的免疫耐受性的策略，并且能够通过激活并扩大针对弥散性癌细胞的T细胞介导的适应性抗肿瘤免疫力，来提高化疗的抗肿瘤效能。
本发明是基于本发明的靶向免疫调节抗体或融合蛋白能够抵消或逆转癌细胞的免疫耐受性这一发现。癌细胞通过肿瘤微环境中的特定免疫抑制性机制，能够避开被化疗药剂或靶向肿瘤的抗体的消除，并且癌细胞的这种能力被称为免疫耐受性。通过抵消肿瘤诱导的免疫耐受性，本发明提供了任选与另一种现有癌症治疗相组合，用于癌症治疗的有效的组合物和方法。
本发明提供了用于产生融合蛋白的组合物和方法，所述融合蛋白抵消肿瘤微环境中的免疫耐受性并促进T细胞介导的适应性抗肿瘤免疫力，用于维持针对复发或弥散性癌症的持久的长期保护。这些融合蛋白被设计成通过下列至少一种机制促进针对肿瘤细胞的长期有效的T细胞介导的免疫应答：
a.通过增强抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)来促进肿瘤细胞死亡；以及
b.通过消除由调节性T细胞和髓系抑制细胞介导的免疫抑制，来增加抗肿瘤CD8+T细胞的激活和增殖。这些抗肿瘤免疫应答的激活可以与肿瘤细胞对免疫效应物介导的细胞毒性的敏化协作，由此建立起增加肿瘤细胞减灭并增强适应性抗肿瘤免疫力的正反馈回路。
此外，本发明的融合蛋白在下列至少一个方面不同于并优于现有的治疗分子：(i)抵消肿瘤微环境中的免疫耐受性并促进T细胞介导的适应性抗肿瘤免疫力，用于维持针对复发或弥散性癌症的长期保护(用于多样化癌症的预防或治疗)；(ii)产生免疫细胞组合物用于多样化癌症的过继性细胞疗法；以及(iii)用作免疫佐剂或疫苗，用于多样化癌症或传染病的预防。
本发明的定向免疫刺激性抗体和/或融合蛋白提供了破坏肿瘤微环境中的免疫抑制网络的能力。肿瘤利用广范围的调控机制来避开或抑制免疫应答。癌细胞通过细胞因子和抑制呈递抗原的树突状细胞(DC)的分化和成熟的分子，主动地促进肿瘤微环境中的免疫耐受性。由肿瘤细胞产生的免疫抑制性细胞因子和配体包括下列：(i)转化生长因子-β(TGF-β)；(ii)程序化死亡-1配体1(PD-L1；B7-H1)；(iii)血管内皮生长因子(VEGF)；和(iv)白介素-10(IL-10)。
除了阻断树突状细胞(DC)成熟之外，这些分子促进免疫抑制性CD4+T细胞的特化亚类(调节性T细胞；Treg细胞)和髓系来源的抑制细胞(MDSC)的发育。Treg是CD4+T细胞的占少数的亚群，其组成性表达CD25[白介素-2(IL-2)受体cc-链]和叉头盒P3(FOXP3)转录因子。Treg(CD4+CD25+FoxP3+细胞)通过在体外和体内限制广范围的免疫细胞包括CD4和CDST细胞、自然杀伤(NK)和NKT细胞、B细胞和抗原呈递细胞(APC)的激活、增殖和效应物功能，来维持免疫耐受性。
Treg细胞在肿瘤微环境中的积累加强了肿瘤的免疫耐受性并促进肿瘤恶化和转移。免疫抑制性细胞因子(TGF-β；PD-L1)的增加的表达和肿瘤浸润Treg，与多种癌症类型中患者的存活率降低相关。本发明的融合蛋白抑制由靶向的肿瘤细胞或或肿瘤浸润Treg细胞和髓系抑制细胞(DC或MDSC)表达的关键的免疫抑制性分子。因此，它们提供了在肿瘤微环境内抑制Treg的发育或功能的靶向能力。
本发明提供了预防或***疾病的方法。所述方法包括向需要的对象给药本发明的一种或多种融合蛋白与另一种抗癌疗法的组合，其中所述抗癌疗法是化疗分子、抗体、小分子激酶抑制剂、激素类药剂、细胞毒性药剂、定向治疗剂、抗血管生成药剂、电离辐射、紫外辐射、冷冻消融、热消融或射频消融。
当在本文中使用时，术语“抗体”包括天然或人工的单价或多价抗体，包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab)片段、通过Fab表达文库产生的片段、抗独特性(抗Id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗Id抗体)以及任何上述物质的表位结合片段。抗体可以来自于任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。一种情况下，抗体是或源自于人类、鼠类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。此外，这样的抗体可以是抗体的人源化形式。抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性的，或具有更高的多特异性。本文中的抗体具体来说包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而链的其余部分与源自于另一个物种或属于另一个抗体类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，还包括这样的抗体的片段，只要它们表现出所需生物活性即可。
可以合并到本文中公开的组合物和方法中的抗体的实例包括但不限于诸如下列的抗体：曲妥珠单抗(抗HER2/neu抗体)；帕妥珠单抗(抗HER2mAb)；西妥昔单抗(针对表皮生长因子受体EGFR的嵌合的单克隆抗体)；帕尼单抗(抗EGFR抗体)；尼妥珠单抗(抗EGFR抗体)；扎鲁木单抗(抗EGFR mAb)；南昔木单抗(Necitumumab)(抗EGFR mAb)；MDX-210(人源化的抗HER-2双特异性抗体)；MDX-210(人源化的抗HER-2双特异性抗体)；MDX-447(人源化的抗EGF受体双特异性抗体)；利妥昔单抗(嵌合的鼠类/人类抗CD20mAb)；奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)(抗CD20mAb)；奥法木单抗(Ofatumumab)(抗CD20mAb)；托西莫单抗-1131(抗CD20mAb)；替伊莫单抗(抗CD20mAb)；贝伐单抗(抗VEGF mAb)；雷莫芦单抗(抗VEGFR2mAb)；雷珠单抗(抗VEGF mAb)；阿柏西普(融合到IgG1Fc的YEGFR1和VEGFR2的细胞外结构域)；AMG386(融合到IgG1Fc的血管生成素-1和-2结合肽)；戴妥珠单抗(Dalotuzumab)(抗1GF-1R mAb)；吉妥珠单抗奥佐米星(抗CD33mAb)；阿伦单抗(抗Campath-1/CD52mAb)；布兰昔单抗(Brentuximab vedotin)(抗CD30mAb)；卡妥索单抗(靶向上皮细胞粘附分子和CD3的双特异性mAb)；他那莫单抗(抗5T4mAb)；吉妥昔单抗(Girentuximab)(抗碳酸酐酶ix抗体)；或法利妥珠单抗(Farletuzumab)(抗叶酸受体抗体)。其他实例包括诸如下列的抗体：PanorexTM(17-1A)(鼠类单克隆抗体)；Panorex(@(17-1A)(嵌合的鼠类单克隆抗体)；BEC2(抗独特型mAb，模拟GD表位)(带有BCG)；安克利(Oncolym)(Lym-1单克隆抗体)；SMART M 195Ab，人源化的13'1LYM-1(Oncolym)，阿弗昔(Ovarex)(B43.13，抗独特型小鼠mAb)；3622W94mAb，其结合于腺癌上的EGP40(17-1A)泛癌(pancarcinoma)抗原；泽耐普(Zenapax)(SMART抗Tac(IL-2受体)抗体；SMART M1 95Ab，人源化Ab，人源化的)；NovoMAb-G2(泛癌特异性Ab)；TNT(针对组蛋白抗原的嵌合mAb)；TNT(针对组蛋白抗原的嵌合mAb)；GJiomab-H(单克隆—人源化Abs)；GN1-250Mab；EMD-72000(嵌合的EGF拮抗剂)；LymphoCide(人源化的IL.L.2抗体)；和双特异性的靶向GD-2的MDX-260，ANA Ab，SMART IDiO Ab，SMART ABL364Ab或ImmuRAIT-CEA。
已利用各种方法来生产抗体。杂交瘤技术是指产生单一抗体类型的克隆的细胞系，其利用各种不同物种包括小鼠(鼠类)、仓鼠、大鼠和人类的细胞。制备抗体的另一种方法利用遗传工程、包括重组DNA技术。例如，由这些技术制造的抗体包括嵌合抗体和人源化抗体等。嵌合抗体将来自于超过一种类型的物种的DNA编码区合并。例如，嵌合抗体可以具有源自于小鼠的可变区和源自于人类的恒定区。人源化抗体尽管含有非人类部分，但主要部分来自于人类。与嵌合抗体类似，人源化抗体可以含有完全人类的恒定区。但是与嵌合抗体不同，可变区可以部分源自于人类。人源化抗体的非人类的合成部分通常来自于鼠类抗体中的CDR。在任何情况下，这些区域对于允许抗体识别并结合于特定抗原来说是关键的。
在一种实施方式中，杂交瘤可以产生包含靶向组成部分和免疫调节组成部分的靶向融合蛋白。在一种实施方式中，包含抗体、抗体片段或多肽的靶向组成部分，使用连接物或不使用连接物，被连接或融合到由多肽构成的免疫调节组成部分。连接物可以是氨基酸连接物。在一种实施方式中，连接物是(GGGGS)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7或8。例如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)。在另一种实施方式中，连接物是EPKSCDK(SEQ ID NO：11)。在各种不同情况下，可以改变连接物的长度以优化靶向组成部分的结合或免疫调节组成部分的功能。在各种不同情况下，免疫调节组成部分是融合到靶向抗体的重链的Fc区或含Fc的融合蛋白的C-端的多肽。在另一种情况下，免疫调节组成部分是融合到靶向抗体的轻链的C-端的多肽。
抗体片段可以包括完整抗体的一部分，例如包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，Fc片段或Fc融合产物，双体抗体，直链抗体，单链抗体分子，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。完整抗体是包括结合抗原的可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是本源序列恒定结构域(例如人类本源序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体或任何其他修饰的Fc(例如糖基化或其他工程化的Fc)。
本发明的融合蛋白可以通过本领域中已知的常规技术，例如通过化学合成如固相肽合成来合成。这样的方法对于本领域技术人员来说是已知的。一般来说，这些方法利用本领域中公知的固相或溶液相合成方法。具体来说，方法包括向生长中的肽链顺序添加一个或多个氨基酸或适合地保护的氨基酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基基团被适合的保护基团保护。然后可以将被保护或衍生的氨基酸连接到惰性固相支持物或在溶液中使用，在适合于形成酰胺键的条件下添加序列中的下一个氨基酸，所述下一个氨基酸具有被适合地保护的互补基团(氨基或羧基)。然后从该新添加的氨基酸残基中除去保护基团，然后添加下一个氨基酸(被适合地保护)，依此类推。在所有所需氨基酸以正确顺序连接后，顺序地或同时地除去任何残留的保护基团和任何固相支持物，以产生最终多肽。通过对这种通用程序进行简单修改，可以一次向生长中的链添加超过一个氨基酸，例如通过将被保护的三肽与正确保护的二肽相偶联(在不使手性中心消旋的条件下)，以在去保护后形成五肽。
典型的保护基团包括叔丁氧基羰基(Boc)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、苯甲氧基羰基(Cbz)、对甲苯磺酰基(Tos)、2,4-二硝基苯基、苯甲基(Bzl)、联苯基异丙氧基-羧基羰基、环己基、异丙基、乙酰基、邻硝基苯基磺酰基等。其中，Boc和Fmoc是优选的。
典型的固相支持物通常是交联的聚合材料。它们包括二乙烯苯交联的基于苯乙烯的聚合物，例如二乙烯苯-羟基甲基苯乙烯共聚物、二乙烯苯-氯甲基苯乙烯共聚物和二乙烯苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物。二乙烯苯-二苯甲基氨基聚苯乙烯共聚物，正如在本文中使用对甲基二苯甲基胺树脂所示，提供了将末端酰胺官能团直接导入到肽链中，当将链从支持物上切下时所述官能团的功能被所述链保留的优点。
在一种方法中，多肽通过常规固相化学合成，在例如Applied Biosystems,Inc.(ABI)430A肽合成仪上，使用允许合成酰胺肽形式的树脂并使用t-Boc氨基酸衍生物(Peninsula Laboratories,Inc.)以及标准的溶剂和试剂来制备。含有L-或D-氨基酸的多肽可以以这种方式合成。多肽组成通过定量氨基酸分析来证实，并且每个肽的具体序列可以通过序列分析来确定。
优选地，多肽可以通过重组DNA技术，通过合成编码所需多肽的DNA来生产。在所需多肽的编码序列被合成或分离后，可以将它们克隆在任何适合的载体中用于表达。对于本领域技术人员来说，大量克隆载体是已知的，并且适合的克隆载体的选择是选择的问题。可以将基因置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选地操纵基因(在本文中合称为“控制”元件)的控制之下，使得编码所需多肽的DNA序列，在用含有该表达构建物的载体转化的宿主细胞中被转录成RNA。编码序列可能含有或可能不含信号肽或前导序列。可以向编码序列添加引起被表达的多肽从宿主生物体分泌的异源前导序列。允许相对于宿主细胞的生长来调控蛋白序列的表达的其他调控序列，也可能是需要的。这样的调控序列对于本领域技术人员来说是已知的，实例包括引起基因表达对化学或物理刺激、包括调控化合物的存在作出响应而打开或关闭的调控序列。在载体中也可能存在其他类型的调控元件，例如增强子序列。
可以将控制序列和其他调控序列连接到编码序列，然后再***到载体例如上面描述的克隆载体中。或者，可以将编码序列直接克隆到已经含有控制序列和适合的限制性位点的表达载体中。
然后可以使用表达载体转化适合的宿主细胞。许多哺乳动物细胞系在本领域中是已知的，并包括可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)获得的永生化的细胞系，例如但不限于中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、HEK293、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、源自于癌细胞例如肉瘤的NOS细胞等。同样地，细菌宿主例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌(Streptococcus spp.)可用于本发明的表达构建物。可用于本发明的酵母宿主包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、白假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)等。与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等。蛋白也可以在锥虫中表达。
取决于所选的表达***和宿主，本发明的蛋白通过将用上述表达载体转化的宿主细胞在表达目的蛋白的条件下生长来生产。然后从宿主细胞分离蛋白并纯化。如果表达***将蛋白分泌到生长培养基中，则可以从培养基直接纯化蛋白。如果蛋白不被分泌，从细胞裂解物中分离它。适合的生长条件和回收方法的选择在本领域的技术范围之内。在纯化后，可以通过重复的Edman降解循环，然后通过HPLC进行氨基酸分析，来确定蛋白质的氨基酸序列。其他氨基酸测序方法在本领域中也是已知的。
在合成或通过其他方式生产后，可以通过例如使用鼠类内皮细胞评估候选多肽抑制脂多糖诱导的NF-κB的核移位的能力，来评估候选多肽的抑制活性。
本发明的融合蛋白可以配制成治疗组合物，所述组合物采取各种不同剂型，例如但不限于液体溶液或悬液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、聚合物微囊或微泡、脂质体和可注射或可输注的溶液。优选的形式取决于给药方式和靶向的具体癌症类型。组合物优选地还包括本领域中公知的可药用介质、载体或佐剂，例如人血清白蛋白、离子交换剂、氧化铝、卵磷脂、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾和盐类或电解质例如硫酸鱼精蛋白。适合的介质是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。制备这样的组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的。参见例如《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，Mack Publishing Company,Easton,Pa.，第18版，1990。
上面的组合物可以使用常规递送模式来给药，包括但不限于静脉内、腹膜内、口服、淋巴内或皮下给药。局部给药到所讨论的肿瘤或炎症位点，例如直接注射到关节炎关节中，也可用于本发明。
治疗有效剂量将由本领域技术人员容易地确定，并且取决于疾病的严重性和过程、患者的健康和对治疗的响应以及治疗医师的判断。实验
下面是执行本发明的特定实施方式的实施例。提供所述实施例仅仅是出于说明的目的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围。已努力尝试以确保所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是当然，一些实验误差和偏差将是容许的。
实施例1
通过为在CHO细胞中表达而进行了密码子优化的基因，来表达包含与免疫调节物(抑制剂或激活剂)配体相连的IgG重链的融合蛋白。将由SEQ ID NO：12至28定义的密码子优化的核苷酸序列在CHO细胞中表达，并且表达的嵌合/融合蛋白示出在表1中。
使用SDS PAGE表征表达的蛋白，并使用蛋白A柱从培养上清液纯化表达的融合蛋白抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII，结果示出在图22中。值得注意的是，抗EGFR1抗体-TGFβRII轻链质量较高，这可能是因为在可变区轻链和重链上存在两个糖基化位点。由于TGFβRII，抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII两者的重链质量较高。此外，抗HER2/neu抗体-TGFβRII的重链具有4个N-糖基化位点，而抗EGFR1抗体-TGFβRII具有5个N-糖基化位点。
实施例2
蛋白A/SEC层析。将抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII样品通过蛋白A/SEC层析进行分析，结果示出在图23中。图23A示出了Bmab200(赫赛汀)的尖锐洗脱峰与更宽的洗脱峰，其据信是由糖基化的存在造成的非均质性的度量，这是由于在TGFβRII区域中存在3个另外的N-糖基化位点。值得注意的是，在-80℃下储存不引起聚集。在SEC柱中峰位置的迁移或早期出现表明由于融合配偶体而造成分子量增加。这再一次证实了全长分子被表达。图23B示出了Bmab200(赫赛汀)的尖锐洗脱峰与更宽的洗脱峰，其据信是由糖基化的存在造成的非均质性的度量，这是由于在TGFβRII区域中存在3个另外的N-糖基化位点。同样地，在-80℃下储存不引起聚集。在SEC柱中峰位置的迁移或早期出现表明由于融合配偶体而造成分子量增加。这再一次证实了全长分子被表达。
实施例3
用于融合蛋白的功能测定法。进行ELISA实验来检查抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII与TGFβ的结合能力。图24A显示，抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII分子结合于TGFβ，表明融合蛋白是有功能的。图24B显示，抗HER2抗体-TGFβRII与Bmab200(赫赛汀)类似，抑制BT474细胞系的增殖。图25显示，抗EGFR1抗体-TGFβRII与西妥昔单抗类似，抑制A431细胞系的增殖。
实施例4
进行了抗HER2/neu抗体-TGFβRII融合蛋白的抗体依赖性细胞性细胞毒性ADCC活性，以确定所述蛋白结合于细胞上的靶受体。结果示出在图26中，其中在BT474细胞中测定了所述活性，并且显然的抗HER2抗体-TGFβRII在BT474细胞上的ADCC活性(细胞裂解的％)与Bmab200(赫赛汀)相近。图27示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII在A431细胞上的ADCC活性，其中所述ADCC活性与西妥昔单抗相近。图28示出了抗EGFR1抗体-4-1BB与抗EGFR1抗体-TGFβRII和西妥昔单抗相比的ADCC活性。
实施例5
表达的蛋白的结合活性。这一测定的目的是试验融合蛋白以剂量依赖性方式结合于细胞上的靶受体的功能性。图29A显示抗CTLA4抗体-TGFβRII对TGFβ1的结合活性与抗EGFR1抗体-TGFβRII相当，B显示了抗CTLA4抗体-TGFβRII对CTLA4的结合活性。图30A示出了抗CTLA4抗体-TGFβRII的结合活性，以确定PD1-Fc结合水平，B示出了抗EGRF1抗体-4-1BB的结合活性，以确定4-1BBL的结合。图31A示出了抗EGFR1抗体-4-1BB对EGFR的结合活性，B示出了PD1-Fc-4-1BB的结合活性以找出PDL1-Fc。图32示出了抗EGFR1抗体-PD1对EGFR和PD1的结合活性。
实施例6
分子的一级结构的证实。如图33中所示，对表达的蛋白进行评估以确定分子量和糖基化的存在。通过还原和非还原SDS PAGE对样品进行分析。将抗体的重链和轻链通过还原烷基化进行分离，以便可以评估还原的结构。融合蛋白的胰蛋白酶消化提供了一级序列的鉴定。进行蛋白的MS/MS分析。
抗HER2/neu抗体-TGFβRII和抗EGFR1抗体-TGFβRII的质谱分析。对图1中示出的融合蛋白进行表达和试验。图34A示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合体的轻链(LC)(还原的)的质谱图，B示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合体的LC(还原的)的解卷积质谱图。图35示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合体的重链(HC)(还原的)的质谱图。
对图2中示出的融合蛋白进行表达和试验。图36A示出了抗EGFR1抗体-TGFβRIIECD的LC(还原的)的质谱图，B示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD的LC(还原的)的解卷积质谱图。图37示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD的HC(还原的)质谱图。
实施例7
使用UV层析检查具有图1和2中所描述的氨基酸序列的融合蛋白，并提供从融合蛋白的胰蛋白酶消化物的层析分离得到的并用UV218-222nm波长试验的层析图。还评估了与UV迹线相对应的总离子电流(TIC)。图38A示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的UV层析图，B示出了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的总离子层析图(TIC)。图39、40和41分别提供了抗HER2/neu抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的轻链、重链和连接基序的预期/观察到的胰蛋白酶肽的列表。值得注意的是，鉴定到了分子的所有预期的肽，包括轻链和重链肽以及连接基序(TGFβRII)的肽。
图42A示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的UV层析图，B示出了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的胰蛋白酶肽的总离子层析图(TIC)。图43、44和45分别提供了抗EGFR1抗体-TGFβRII ECD融合蛋白的轻链、重链和连接基序的预期/观察到的胰蛋白酶肽的列表。同样地，鉴定到了分子的所有预期的肽，包括轻链和重链肽以及连接基序(TGFβRII)的肽。
实施例8
用于重组融合蛋白表达的宿主细胞系是CHO细胞或CHO细胞的衍生株。这里指称的CHO细胞是自由CHO-S细胞，CHO-S细胞是适应于在能够生产高水平的分泌的重组蛋白的化学成分确定的培养基中的高密度无血清悬浮培养的CHO衍生细胞，或CHO K1细胞，其与ATCCNo.CCL-61相同。它基本上是贴壁细胞系。用于稳定细胞系的载体：
自由pCHO 1.0载体，其由ProBioGen AG设计，以在载体的两个不同的杂合CMV启动子的下游表达一个或两个目的基因。这种载体含有二氢叶酸还原酶(DHFR)选择标记和嘌呤霉素抗性基因，允许同时使用MTX和嘌呤霉素进行选择。
将编码轻链或轻链融合蛋白的核酸序列克隆到在EF2/CMV启动子控制下的限制性酶位点AvrII和BstZ17中。将编码重链或重链融合蛋白的核酸序列克隆到在CMV/EF1启动子控制下的限制性酶位点EcoRV和Pad中。
将构建物转染到自由CHO-S细胞/CHOK1细胞中。选择高产的单克隆细胞株用于生产重组融合蛋白。制备MCB并对细胞生存力、生产率、稳定性和其他参数进行表征。将细胞用于培养，随后进行纯化。
实施例9
细胞培养以补料分批方式进行。在细胞培养中，使用的哺乳动物宿主细胞是中华仓鼠卵巢(CHO)细胞，并在一开始供应培养基。CHO细胞被遗传工程改造以产生抗体-肽融合蛋白。在培养基中以0.4mM的浓度添加七水硫酸锌。相反，在对照培养基中不添加任何锌盐。生产发酵运行在37±1℃下，以0.3-0.45x106个细胞/ml的初始细胞计数开始，前3-4天专门用于在分批阶段中生长细胞。接下来的步骤包括将温度降低到31±1℃并继续运行直至第7天。在整个运行中，乳酸减少差不多10-40％。然后使用亲和层析技术从培养基收集产生的融合蛋白。
实施例10
使用以分批补料方式进行的细胞培养。在细胞培养中，在一开始供应哺乳动物宿主细胞和Hyclone CDM4Mab培养基。在培养基中也添加盐(锌)(0.3mM)。生产发酵运行在37±1℃下，以0.3-0.45x106个细胞/ml的初始细胞计数开始，前3-4天专门用于在分批阶段中生长细胞。接下来的步骤包括将温度降低到31±1℃并继续运行直至第7天。
实施例11
使用蛋白A柱纯化抗体-肽融合免疫调节分子。在无菌条件下，试验从含有融合单克隆抗体的重组CHO细胞系分泌的培养上清液的滴度和内毒素。使用用结合缓冲液清洗和平衡的Mab Select Xtra蛋白A亲和树脂对上清液进行亲和层析。使用0.5M磷酸盐将上清液的pH调整到与柱子相同的pH；允许上清液以0.5ml/分钟的流速结合于柱子/通过柱子，以实现最大结合。所有抗体-蛋白融合分子通过Fc区域结合，而杂质作为通流物被消除。将柱子用平衡缓冲液清洗，并使用pH3.0的0.1M甘氨酸洗脱结合的融合分子。将被洗脱蛋白的pH调整到中性pH或稳定配方的pH，并将纯化的蛋白储存在-20℃或2-8℃。
实施例12
区分曲妥珠单抗与曲妥珠单抗-TGFβRII受体融合分子
过表达ErbB2受体的乳腺癌肿瘤将通过组成性激活或与ErbB受体家族的其他成员的异源二聚化引起肿瘤恶化。这涉及与ErbB信号通路相关的生长因子的结合。除此之外，肿瘤产生微环境，在其中通过激活TGFβ和参与抑制免疫***的特定细胞因子来抑制免疫***。产生了新的分子，其中将曲妥珠单抗(抗ErbB2抗体)与TGFβRIΙ受体融合成融合蛋白。据假设，曲妥珠单抗将起到归巢到过表达ErbB2的乳腺癌细胞的靶向分子的作用，同时TGFβRII受体将螯合TGFβ，引起免疫激活。实验将利用赫赛汀抗性的表达ErbB2的细胞系(通过在赫赛汀存在下生长BT474细胞来选择)在TGFβ、细胞毒性CD8阳性细胞和NK细胞存在下的生长。尽管曲妥珠单抗在诱导细胞毒性中无效，但曲妥珠单抗TGFβRII受体融合分子将螯合TGFβ，从而阻止细胞毒性CD8和NK细胞的抑制。这将导致在曲妥珠单抗-TGFβRII受体融合体处理的细胞中，与用单独的曲妥珠单抗处理的细胞相比，观察到细胞毒性增高。实验的读出使用阿尔玛蓝(Alamar Blue)，这是一种与存在的活细胞成正比被激活的刃天青染料。另一种方法是使用cytotox glo来测量细胞毒性，所述试剂测量直接对应于死细胞比例的蛋白酶的释放。另一种方法可以使用流式细胞仪，使用膜联蛋白V和碘化丙啶直接测量凋亡和会死的细胞群体。这些多重实验的结果将阐明对偶联分子与单独的曲妥珠单抗相比的活性的理解。
尽管已参考上述实施例对本发明进行了描述，但应该理解，修改和变化被涵盖在本发明的精神和范围之内。因此，本发明仅受权利要求书的限制。
序列表
<110> 比奥孔有限公司（Biocon Limited）
<120> 靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法（TARGETED/IMMUNOMODULATORYFUSION PROTEINS AND METHODS FOR MAKING
SAME）
<130> SPI186689-51
<150> 1689/CHE/2012
<151> 2012-04-30
<150> 1690/CHE/2012
<151> 2012-04-30
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 6
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 447
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 8
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 205
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 9
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 10
<211> 150
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 10
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val
145 150
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 11
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
1 5
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<211> 1032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 12
gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 60
ggcaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 120
tggaactctg gcgctctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 180
ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccctcca gctctctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 300
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgagct cctgggaggc 360
cctagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 420
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 480
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 540
tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 600
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 660
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacaccc tgccccctag ccgggaagag 720
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaagg gcttctaccc ctccgatatc 780
gccgtggaat gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 840
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 900
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960
cagaagtccc tgtccctgag cccaggcaaa ggcggaggcg gatctggcgg cggaggatct 1020
ggtggcggat cc 1032
<210> 13
<211> 425
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 13
ggatccacca tccccccaca cgtgcagaaa tccgtgaaca acgacatgat cgtgaccgac 60
aacaacggcg ctgtgaagtt cccccagctg tgcaagttct gcgacgtgcg gttctctacc 120
tgcgacaacc agaaatcctg catgtccaac tgctccatca cctccatctg cgagaagccc 180
caggaagtgt gcgtcgccgt ctggcggaag aacgacgaga acatcaccct ggaaaccgtg 240
tgccacgacc ccaagctgcc ctaccacgac ttcatcctgg aagatgccgc ctcccccaag 300
tgcatcatga aggaaaagaa gaagcccggc gagactttct tcatgtgcag ctgctcctcc 360
gacgagtgca acgacaacat catcttctcc gaagagtaca acacctccaa ccccgactga 420
agctt 425
<210> 14
<211> 430
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 14
gcggccgcca tgaacttcgg cctgcggctg atcttcctgg tgctgaccct gaagggcgtg 60
cagtgcgagg tgcagctggt ggaatccggc ggaggcctgg tccagcctgg cggatctctg 120
agactgtcct gcgccgcctc cggcttcaac atcaaggaca cctacatcca ctgggtccga 180
caggcccctg gcaagggcct ggaatgggtg gcccggatct accccaccaa cggctacacc 240
agatacgccg actccgtgaa gggccggttc accatctccg ccgacacctc caagaacacc 300
gcctacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgctccaga 360
tggggaggcg acggcttcta cgccatggac tactggggcc agggcaccct ggtcaccgtg 420
ctccgctagc 430
<210> 15
<211> 442
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 15
gcggccgcca tggaatccca gacccaggtg ctgatctccc tgctgttctg ggtgtccggc 60
acctgtggcg acatccagat gacccagtcc ccctccagcc tgtccgcctc tgtgggcgac 120
agagtgacca tcacctgtcg ggcctcccag gacgtgaaca ccgccgtggc ctggtatcag 180
cagaagcccg gcaaggcccc caagctgctg atctactccg cctccttcct gtactccggc 240
gtgccctccc ggttctccgg ctctagatcc ggcaccgact ttaccctgac catctccagc 300
ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagc actacaccac cccccccacc 360
tttggccagg gcaccaaggt ggaaatcaag cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc 420
cccaccctcc gacgagcagc tg 442
<210> 16
<211> 1032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 16
gctagcacca agggcccctc cgtgtttccc ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 60
ggcaccgccg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 120
tggaactctg gcgctctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 180
ggcctgtact ccctgtcctc cgtcgtgacc gtgccctcca gctctctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 300
aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggaggc 360
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 420
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 480
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 540
tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 600
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 660
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacaccc tgcctcccag ccgggacgag 720
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaagg gcttctaccc ctccgatatc 780
gccgtggaat gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 840
ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 900
cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960
cagaagtccc tgtctctgag ccccggcaaa ggcggcggag gatctggcgg tggcggatca 1020
ggcggaggat cc 1032
<210> 17
<211> 427
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 17
gcggccgcca tgaacttcgg cctgcggctg atcttcctgg tgctgaccct gaagggcgtg 60
cagtgccagg tgcagctgaa gcagtccgga cctggcctgg tgcagccttc ccagtccctg 120
tccatcacct gtaccgtgtc cggcttctcc ctgaccaact acggcgtgca ctgggtccga 180
cagtccccag gcaagggcct ggaatggctg ggagtgattt ggagcggcgg caacaccgac 240
tacaacaccc ccttcacctc ccggctgtcc atcaacaagg acaactccaa gtcccaggtg 300
ttcttcaaga tgaactccct gcagtccaac gacaccgcca tctactactg cgccagagcc 360
ctgacctact atgactacga gttcgcctac tggggacagg gcaccctggt caccgtgtct 420
cgctagc 427
<210> 18
<211> 442
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 18
gcggccgcca tggaatccca gacccaggtg ctgatctccc tgctgttctg ggtgtccggc 60
acctgtggcg acatcctgct gacccagtcc cccgtgatcc tgtccgtgtc tcctggcgag 120
cgggtgtcct tctcctgccg ggcctcccag tccatcggca ccaacatcca ctggtatcag 180
cagcggacca acggctcccc tcggctgctg attaagtacg cctccgagtc tatctccggc 240
atcccctccc ggttctccgg ctctggctcc ggcaccgact tcaccctgtc catcaactcc 300
gtggaatccg aggatatcgc cgactactac tgccagcaga acaacaactg gcccaccacc 360
ttcggcgctg gcaccaagct ggaactgaag cggaccgtgg ccgctccctc cgtgttcatc 420
cccaccctcc gacgagcagc tg 442
<210> 19
<211> 424
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 19
gcggccgcca tgaacttcgg cctgcggctg atcttcctgg tgctgaccct gaagggcgtg 60
cagtgccagg tgcagctggt ggaatccggc ggaggcgtgg tgcagcctgg cagatccctg 120
agactgtcct gcgccgcctc cggcttcacc ttctccagct acaccatgca ctgggtccga 180
caggcccctg gcaagggcct ggaatgggtc accttcatca gctacgacgg caacaacaag 240
tactacgccg actccgtgaa gggccggttc accatctccc gggacaactc caagaacacc 300
ctgtacctgc agatgaactc cctgcgggcc gaggacaccg ccatctacta ctgcgcccgg 360
accggctggc tgggcccttt tgattactgg ggccagggca ccctggtcac cgtgtcctcc 420
tagc 424
<210> 20
<211> 445
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 20
gcggccgcca tggaatccca gacccaggtg ctgatctccc tgctgttctg ggtgtccggc 60
acctgtggcg agatcgtgct gacccagtcc cccggcaccc tgtctctgag ccctggcgag 120
agagccaccc tgtcctgcag agcctcccag tccgtgggct cctcctacct ggcttggtat 180
cagcagaagc ccggccaggc ccctcggctg ctgatctacg gcgctttctc tcgggccacc 240
ggcatccctg accggttctc tggctccggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc 300
cggctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agtacggctc ctccccctgg 360
acctttggcc agggcaccaa ggtggaaatc aagcggaccg tggccgctcc ctccgtgttc 420
cttcccaccc tccgacgagc agctg 445
<210> 21
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 21
gctagcacaa agggccctag tgtgtttcct ctggctccct cttccaaatc cacttctggt 60
ggcactgctg ctctgggatg cctggtgaag gattactttc ctgaacctgt gactgtctca 120
tggaactctg gtgctctgac ttctggtgtc cacactttcc ctgctgtgct gcagtctagt 180
ggactgtact ctctgtcatc tgtggtcact gtgccctctt catctctggg aacccagacc 240
tacatttgta atgtgaacca caaaccatcc aacactaaag tggacaaaaa agccgaaccc 300
aaatcctgtg acaaaaccca cacctgccca ccttgtcctg cccctgaact gctgggagga 360
ccttctgtgt ttctgttccc accaaaacca aaagataccc tgatgatctc tagaacccct 420
gaggtgacat gtgtggtggt ggatgtgtct catgaggacc ctgaggtcaa atttaattgg 480
tacgtcgatg gagtggaagt ccacaatgcc aaaaccaagc ctagagagga acagtacaat 540
tcaacctaca gagtcgtcag tgtgctgact gtgctgcatc aggattggct gaatggcaag 600
gaatacaagt gtaaagtctc aaacaaggcc ctgcctgctc caattgagaa aacaatctca 660
aaggccaagg gacagcctag ggaaccccag gtctacaccc tgccaccttc acgcgacgaa 720
ctgaccaaaa accaggtgtc cctgacatgc ctggtcaaag gcttctaccc ttctgacatt 780
gctgtggagt gggagtcaaa tggacagcct gagaacaact acaaaacaac cccccctgtg 840
ctggattctg atggctcttt ctttctgtac tccaaactga ctgtggacaa gtctagatgg 900
cagcagggga atgtcttttc ttgctctgtc atgcatgagg ctctgcataa ccactacact 960
cagaaatccc tgtctctgtc tcccgggaaa ggcggcggag gatctggcgg aggcggttct 1020
ggtggtggcg gatcc 1035
<210> 22
<211> 435
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 22
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtcagg tgcagctgca gcagcctggt gccgagctcg tgaaacctgg cgcctccgtg 120
aagatgtcct gcaaggcctc cggctacacc ttcaccagct acaacatgca ctgggtcaag 180
cagacccccg gcagaggcct ggaatggatc ggcgctatct accccggcaa cggcgacacc 240
tcctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc accctgaccg ccgacaagtc ctcttccacc 300
gcctacatgc agctgtcctc cctgacctcc gaggactccg ccgtgtacta ctgcgcccgg 360
tctacctact acggcggcga ctggtacttc aacgtgtggg gcgctggcac caccgtgacc 420
gtgtctgctg ctagc 435
<210> 23
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 23
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtcaga tcgtgctgtc ccagtcccct gccatcctgt ctgctagccc tggcgagaaa 120
gtgacaatga cctgccgggc ctcctcctcc gtgtcctaca tccactggtt ccagcagaag 180
cccggctcca gccccaagcc ttggatctac gccacctcca acctggcctc tggcgtgcca 240
gtgcggtttt ccggctctgg ctctggcacc tcctactccc tgaccatctc tcgggtggaa 300
gccgaggatg ccgccaccta ctactgccag cagtggacca gcaacccccc cacatttggc 360
ggaggcacca agctggaaat caagcggacc gtggcggcgc cctct 405
<210> 24
<211> 631
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 24
ggatccgcct gtccttgggc cgtgtccggc gctagagcct ctcctggctc tgccgcctcc 60
cccagactga gagagggccc tgagctgtcc cctgacgatc ctgccggcct gctggacctg 120
agacagggca tgtttgccca gctggtggcc cagaacgtgc tgctgatcga cggccccctg 180
tcctggtact ctgatcctgg cctggccggc gtgtccctga ccggcggact gtcctacaaa 240
gaggacacca aagaactggt ggtggccaag gctggcgtgt actacgtgtt ctttcagctg 300
gaactgcggc gggtggtggc cggcgagggc tctggatctg tgtccctggc cctgcatctg 360
cagcccctga gatctgccgc tggcgccgct gctctggccc tgacagtgga tctgcctcct 420
gcctcctccg aggcccggaa ctccgcattc gggtttcagg gccggctgct gcacctgtct 480
gctggccaga gactgggagt gcatctgcac accgaggcca gagccagaca cgcctggcag 540
ctgacccagg gcgctaccgt gctgggcctg ttcagagtga cccccgagat cccagccggc 600
ctgcccagcc ctagatccga gtgataagct t 631
<210> 25
<211> 1458
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 25
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtcagg tgcagctgca ggaatctggc cctggactcg tgcggccttc ccaaaccctg 120
tctctgacct gtaccgtgtc cggctactcc atcacctccg accacgcctg gtcttgggtg 180
cgacagcctc ctggcagagg cctggaatgg atcggctaca tctcctactc cggcatcacc 240
acctacaacc ccagcctgaa gtccagagtg accatgctgc gggacacctc caagaaccag 300
ttctccctgc ggctgtcctc cgtgaccgct gctgataccg ccgtgtacta ctgcgccaga 360
tctctggcca ggaccaccgc catggattac tggggccagg gctccctcgt gaccgtgtcc 420
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cctctggccc cttcctctaa atctacctct 480
ggcggcaccg ccgctctggg ctgcctcgtg aaggactact tccccgagcc cgtgacagtg 540
tcttggaact ctggcgccct gacctccggc gtgcacacct ttccagctgt gctgcagtcc 600
tccggcctgt actccctgtc cagcgtcgtg actgtgccct cctcatctct gggcacccag 660
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc tccaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 720
cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgt cccccttgtc ctgcccctga actgctgggc 780
ggaccctctg tgttcctgtt cccaccaaaa ccgaaagaca ccctgatgat ctcccggacc 840
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccacgagg accctgaagt gaagttcaat 900
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcctagaga ggaacagtac 960
aactccacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 1020
aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccccatcga aaagaccatc 1080
tccaaggcca agggccagcc acgggaaccc caggtgtaca cactgccccc tagccgcgac 1140
gagctgacca agaatcaggt gtccctgaca tgcctcgtga aaggcttcta cccctccgat 1200
atcgccgtgg aatgggagtc caacggccag cctgagaaca actacaagac caccccccct 1260
gtgctggact ccgacggctc attcttcctg tactcaaagc tgacagtgga caagtcccgg 1320
tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1380
acccagaagt ccctgtccct gagccccggg aaaggcggcg gaggatctgg cggaggcggt 1440
tctggtggtg gcggatcc 1458
<210> 26
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 26
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtgaca tccagatgac ccagtccccc tccagcctgt ctgcctctgt gggcgacaga 120
gtgaccatca cctgtcgggc ctcccaggac atctcctcct acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc tactacacct cccggctgca ctccggcgtg 240
ccctctagat tttccggctc tggctccggc accgacttta ccttcaccat cagctccctg 300
cagcccgagg atatcgccac ctactactgc cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttt 360
ggccagggca ccaaggtgga aatcaagcgg accgtggcgg cgccc 405
<210> 27
<211> 1455
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 27
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtcagg tgcagctgca gcagtgggga gctggactgc tgaagccctc cgagacactg 120
tctctgacct gcgctgtgta cggcggctcc ttctccggct actactggtc ctggattcgg 180
cagtcccctg agaagggcct ggaatggatc ggcgagatca accacggcgg ctacgtgacc 240
tacaacccca gcctggaatc cagagtgacc atctccgtgg acacctccaa gaaccagttc 300
tccctgaagc tgtcctccgt gaccgccgct gataccgccg tgtactactg cgccagagac 360
tacggccctg gcaactacga ctggtacttc gacctgtggg gcagaggcac cctcgtgacc 420
gtgtcctctg ctagcaccaa gggcccctcc gtgtttcctc tggccccttg ctcacgctcc 480
acctccgaat ctaccgccgc tctgggctgc ctcgtgaagg actacttccc cgagcccgtg 540
actgtgtctt ggaactctgg cgccctgacc tccggcgtgc acacctttcc agctgtgctg 600
cagtcctccg gcctgtactc cctgtccagc gtcgtgacag tgccctccag ctctctgggc 660
accaagacct acacctgtaa cgtggaccac aagccctcca acaccaaggt ggacaagcgg 720
gtggaatcta aatacggccc tccctgccct ccttgcccag cccctgaatt tctgggcgga 780
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaaaccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 840
gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc caggaagatc ccgaggtgca gttcaattgg 900
tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagttcaac 960
tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 1020
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc ctgcccagct ccatcgaaaa gaccatcagc 1080
aaggccaagg gccagccccg ggaaccccag gtgtacacac tgcctccaag ccaggaagag 1140
atgaccaaga atcaggtgtc cctgacctgt ctcgtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1200
gccgtggaat gggagtccaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1260
ctggactccg acggcagctt cttcctgtac tctcgcctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1320
caggaaggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagtccc tgtccctgtc tctggggaaa ggcggcggag gatctggcgg aggcggttct 1440
ggtggtggcg gatcc 1455
<210> 28
<211> 411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 28
gcggccgcca tgaattttgg actgaggctg attttcctgg tgctgaccct gaaaggcgtc 60
cagtgtgaga tcgtgctgac ccagtctcct gccaccctgt ctctgagccc tggcgagaga 120
gctaccctgt cctgccgtgc ctcccaatcc gtgtcctctt acctggcctg gtatcagcaa 180
aagcccggcc aggctccccg gctgctgatc tacgatgcct ccaatagagc caccggcatc 240
cctgccagat tctccggctc tggctctggc accgacttta ccctgaccat ctcctctctg 300
gaacccgagg acttcgccgt gtactactgc cagcagcggt ccaactggcc tcccgccctg 360
acatttggcg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcggaccg tggcggcgcc c 411
<210> 29
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Thr Thr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 30
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 31
<211> 460
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Pro Leu Arg Phe Leu Glu Trp Ser Thr Gln Asp His Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
130 135 140
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
275 280 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
325 330 335
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
355 360 365
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 32
<211> 213
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 32
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala
20 25 30
Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gly Glu Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Lys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Gln His
85 90 95
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Ala Glu Cys
210
<210> 33
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Phe Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr
20 25 30
Val Leu His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Thr Asn Lys Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Asn Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Asn Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Asn Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Asn His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 34
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 34
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Ser Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Asn Arg Tyr Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Pro Arg Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 35
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 35
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Pro Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Gly Arg Val Pro Tyr Arg Ser Thr Trp Tyr Pro Leu Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 36
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu His Ser Lys Val Pro Thr Gln Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ser Thr Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (14)

1.一种制备治疗活性抗体-肽融合蛋白的方法，所述方法包括：
制备所述抗体-肽融合蛋白的密码子优化的核苷酸序列，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含CG序列的增加，其中所述抗体-肽融合蛋白包含靶向组成部分和免疫调节组成部分，其中所述靶向组成部分和所述免疫调节组成部分通过选自SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：11的氨基酸间隔物相连，其中所述免疫调节组成部分是包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的TGF-βRII；其中所述靶向组成部分选自：由重链SEQ ID NO：5和轻链SEQ ID NO：6构成的抗EGFR1抗体、由重链SEQ ID NO：1和轻链SEQ ID NO：2构成的抗HER2/Neu抗体、以及由重链SEQ ID NO：7和轻链SEQ ID NO：8构成的抗CTLA4抗体，其中SEQ ID NO：4通过氨基酸间隔物连接至抗HER2/Neu抗体的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的C-端、抗EGFR1抗体的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的C-端、抗CTLA-4抗体的SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的C-端；
将所述抗体-肽融合蛋白的优化的序列克隆到能够瞬时或持续表达的中华仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞中；
在发酵培养基中在适合生长的条件下生长CHO宿主细胞并允许所述CHO宿主细胞表达克隆的蛋白，其中所述发酵培养基包含二价过渡金属盐；以及
对表达的抗体-肽融合蛋白进行纯化，并任选地检查所述抗体-肽融合蛋白对其靶的双特异性结合能力。
2.权利要求1的方法，其中在一开始或以补料分批方式向细胞培养物引入所述二价过渡金属盐。
3.权利要求1的方法，其中所述二价过渡金属盐包括锌离子。
4.权利要求3的方法，其中所述二价过渡金属盐是七水硫酸锌。
5.权利要求1的方法，其中所述二价过渡金属盐的量足以减少培养期间乳酸的积累。
6.权利要求5的方法，其中在整个运行中，乳酸减少差不多10～40％。
7.权利要求1的方法，其中以约0.3mM至约0.4mM的浓度将所述二价过渡金属盐添加至培养基中。
8.权利要求1的方法，其中在前3～4天将所述发酵培养基维持在37±1℃的温度下，然后降至31±1℃直至第7天。
9.权利要求1的方法，其中所述发酵培养基包含约0.3～0.45x106的初始细胞计数。
10.权利要求1的方法，其中使用具有特定pH的Mab Select Xtra蛋白A柱对所表达的抗体-肽融合蛋白进行亲和层析。
11.权利要求1的方法，其中将结合并通过所述Mab Select Xtra蛋白A柱的上清液的pH调整到所述蛋白A柱的特定pH。
12.权利要求1的方法，其中所述抗体-肽融合蛋白通过所述抗体的Fc区域结合至柱子，而杂质作为通流物被消除。
13.权利要求1的方法，其中使用pH 3.0的甘氨酸洗脱结合至柱子的抗体-肽融合蛋白，然后调整至中性pH用于储存。
14.权利要求1的方法，其中将纯化的蛋白储存在-20℃或2-8℃。
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