CN108285493B - 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种恢复衰竭免疫细胞功能的融合蛋白，其包含识别衰竭免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接；其中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列或具有类似功能的至少90％的相似序列；本发明还涉及该融合蛋白的应用。本发明所述的人工融合蛋白既能识别衰竭性免疫细胞，又能激活扩增识别的免疫细胞，恢复免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能，本发明制备制备的融合蛋白与现有技术相比，其进一步改进了对CD8效应细胞的增殖效用，同时也增加了效应细胞的激活和共刺激分子的表达，能进一步增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。

Description

一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及融合蛋白技术领域，尤其涉及一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤的发生是由于机体细胞***过程中产生基因突变，突变细胞的生长失去调节控制的结果。如果肿瘤细胞不能在短期内被清除，持续的抗原刺激会逐渐造成肿瘤抗原特异性T细胞的功能性衰竭(Nature Medicine 1999，5:677-685)，形成对肿瘤的耐受，免疫***对肿瘤细胞不再敏感，造成肿瘤进一步的生长和扩散，形成癌症(PNAS.2002，99:12293-7)。由病毒感染导致慢性疾病的发生也是抗原特异性细胞衰竭的结果(TrendsImmunol.2014，35:51-60；Blood 2007， 109:4671-4678；Cell Death and Disease 2015，6:e1694)。研究表明，大部分肿瘤侵润性淋巴细胞(TIL)和抗病毒特异性T细胞都高表达免疫抑制性受体(PNAS 2010，107:7875-7880；JI 2007，178:2714-2720)，处于衰竭状态，丧失了特异性识别与杀伤抗原阳性靶细胞的功能。衰竭性T细胞丧失分泌功能性细胞因子的能力，如伽马干扰素(IFNγ)等(Blood 2013，121:1367-1376；J.Biomed.Biotechnol. 2011，451694)。即使机体内存在大量的特异性T细胞，衰竭的免疫细胞也不能清除抗原阳性靶细胞(J Immunol 2005；175:6169-6176)。在表型上，衰竭性T 细胞普遍高表达的免疫抑制检查点受体包括程序性死亡受体(PD-1)，程序性死亡配体(PD-L1/L2)，T细胞免疫球蛋白3(Tim-3)，细胞毒T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)和淋巴细胞活化基因3(Lag-3)等(NatImmunol.2011；12:492-9)。这些信号通路的激活会通过诱导磷酸酶抑制磷酸化反应，消弱免疫细胞活化信号，抑制T细胞的扩增，降低效应T细胞的功能，促进T细胞的凋亡，引起免疫耐受(J Clin Invest.2011，121:2350-2360)。所以，激活这一类抗原特异性的免疫细胞群体，让他们重新恢复杀灭抗原阳性靶细胞的功能，才能清除肿瘤细胞或病毒感染细胞(Trends Immunol.2015；36:265-276)，最终达到治愈的目的。
抗体可以特异性地识别靶细胞表面的蛋白抗原，检查点抑制性抗体可以阻抑衰竭性细胞表面的免疫抑制性信号，例如通过PD-1抗体(Pembrolizumab和 Nivolumab)与PD-1的结合防止抑制性信号的传导与激活，恢复衰竭性免疫细胞的功能，已经在临床上显示治疗癌症的临床效果，尤其是在部分患者身上得到了肿瘤完全消失和较长的临床效果持续性(N Engl J Med 2012，366:2455-2465；N Engl J Med 2012，366:2443-2454)。但是，对缺乏效应细胞的患者临床效果还不理想(NATURE 2014，515:568-571)，而且这种T细胞的恢复持续时间短 (Science 2016，354:1160-1165)，患者体内的特异性免疫细胞又会很快重新回到衰竭状态(Science 2016，354:1165-1169)。同时，只是阻断T细胞抑制信号不会导致免疫细胞数量的增加，而缺乏T效应细胞的患者基本上又不会产生临床效果(Nature 2014，515:568-571)，所以进一步限制检查点抗体的临床治疗效果。
利用白细胞生长因子***具有一定的效果和不同程度的副作用(SeminOncol.2015，42:539–548)。白介素2(IL-2)的临床应用是癌症治疗第一个的免疫疗法，能彻底清除患者体内的肿瘤细胞，在部分癌症患者达到完全治愈和长期生存的效果(Cancer2008，113:293–301；JCO 2005，23:133-141)。但是，细胞因子对所有表达其受体的细胞都会产生激活作用，从而可能激活非目性细胞而导致脱靶效应，临床应用会产生一系列毒副作用，限制它的临床应用(JI 2014， 192:5451-5458)，所以目前IL-2的临床应用范围和疗效有非常大的局限性 (Immunity 2013，38:13-25)。
截止目前，还没有一种既能针对性地识别衰竭的肿瘤特异性T细胞，又能恢复其功能和扩增其数量的蛋白药物。因此急需开发一种能够识别并扩增特异性免疫细胞的免疫药物，来克服现有临床药物的不足。
发明内容
本发明的目的在于克服现有临床药物的不足，提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，其既可识别衰竭性免疫细胞，又能扩增特异性免疫细胞的数量，恢复免疫细胞的功能。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，从而避免两个功能区的蛋白结构相互干扰，保证融合蛋白的双功能特征，同时具有新的免疫功能功能。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
进一步地，识别衰竭性免疫细胞的功能区是利用PD-1单链抗体识别衰竭性免疫细胞表型的受体PD-1，激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区采用IL-2来激活衰竭性免疫细胞，通过非功能区连接后的融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：5 所示。
进一步地，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述衰竭性免疫细胞的表型受体是具有共抑制性功能的免疫检查点PD-1。此类受体基因在免疫细胞表面会过度表达，此信号通路的活化会导致免疫细胞的衰竭和功能丧失。
进一步地，所述PD-1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列(GenBank:L27440.1)。
进一步地，识别所述PD-1的抗体为PD-1单链抗体，所述PD-1单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示序列或至少90％的相似序列。
进一步地，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区是采用细胞因子或功能类似突变体激活性抗体来激活衰竭性免疫细胞，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区采用细胞因子IL-2，所述IL-2的氨基酸系列为SEQ ID NO：3所示序列 (GenBank:S77834.1)或或至少90％的相似序列，其受体主要表达在T细胞和 NK细胞表面。细胞因子或功能类似突变体是指在不改变其基本功能的前提下，通过氨基酸序列突变或只是利用功能区多肽，增加其对目的细胞的激活反应，减少其对非目的细胞的作用。例如，通过IL-2上氨基酸序列的改变，突变体可能降低或增加与T调节性细胞的激活，减少对非靶细胞及组织器官的作用，从而减少临床应用的副作用。
进一步地，所述非功能区氨基酸片段的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示序列，或至少90％的相似序列。
进一步地，所述衰竭性免疫细胞为衰竭的特异性T细胞或衰竭的NK细胞中的至少一种。
上述各氨基酸序列如下表所示：
Figure RE-GDA0001669126700000041
进一步地，所述融合蛋白的制备方法包括如下步骤：
步骤1)由人PD-1抗体单链的C端和白介素2的N端氨基酸序列通过非功能性氨基酸片段连接，组成融合蛋白构造基因；
步骤2)将步骤1)所述的融合蛋白构造基因转入真核细胞表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞(CHO)；
步骤3)将步骤2)所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，经亲和纯化后制得重组融合蛋白。
进一步地，上述制备方法中，所述PD-1抗体单链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述白介素2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
进一步地，所述真核细胞表达载体为pcDNA3.1。
本发明额第二个目的是提供一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白应用，该融合蛋白的医药用途用于非诊断或非治疗目的。
进一步地，所述应用为融合蛋白的单独应用或为融合蛋白与化疗、靶向药物、抗体药物、细胞治疗组成及放射治疗的联合应用，以用于制备治疗因免疫细胞衰竭而引起疾病的药物。
进一步地，所述疾病包括癌症和慢性病毒感染疾病。
进一步地，所述癌症包括肾细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌，肝癌、软巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌；所述慢性病毒感染疾病中的病毒包括HIV、 HBV、HCV、EBV，HPV、CMV。
与现有技术相比，本发明所述的融合蛋白具有独特的体内外免疫活性，而且具有以下有益效果：
本发明所述的融合蛋白能够满足恢复患者免疫功能的需要，该重组融合蛋白既能识别衰竭的免疫细胞，又能扩增其数量，恢复其功能；且其临床应用可以增强抑制肿瘤生长和控制病毒感染的功能，具有很好的临床前景和广泛的应用范围。
发明人之前已经申请关于一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白的专利，该专利公开号为CN107082812A，该专利实施例制备的融合蛋白为双链，其采用PD-1抗体重链和PD-1抗体轻链制备。本发明在上述专利的基础上，进行进一步创新，采用PD-1单链抗体制备融合蛋白，其与专利CN107082812A制备的融合蛋白相比，改进了对CD8效应细胞的增殖效用，同时也增加了效应细胞的激活和共刺激分子的表达，其能够更好的抑制肿瘤生长和控制病毒感染。
附图说明
图1为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白凝胶电泳分析图；A带为还原状态下的蛋白，B带为原始状态下的蛋白，MK为蛋白标准分子量标记。
图2为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白人PBMC体外试验淋巴细胞的CD137激活表达示意图。
图3为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白人PBMC体外试验屏蔽淋巴细胞中PD-1信号的示意图。
图4为本发明一实施例中制备的重组融合蛋白人腹水体外试验增加CD8+T 细胞中细胞因子表达的示意图。
图5为本发明一实施例中的重组融合蛋白小鼠体内试验CD8+T细胞和NK 细胞在外周血淋巴细胞中的比例示意图。
图6为本发明一实施例中的重组融合蛋白增加小鼠肿瘤侵润CD8+T细胞的比例示意图。
图7为本发明一实施例中的重组融合蛋白增加NSG小鼠移植人PBMC细胞的比例示意图。
图8为本发明一实施例中的重组融合蛋白增加NSG肿瘤内小鼠移植人淋巴细胞的侵润的比例示意图。
图9为未加蛋白组对照(CTRL)、本发明一实施例中的融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)、重组融合蛋白(αPD1-IL2)诱导CD8+细胞的比例示意图；
图10为未加蛋白组对照(CTRL)、采用本发明一实施例中的融合蛋白 (αPD1scFvFcIL2)处理、采用重组融合蛋白(αPD1-IL2)处理后CD137+的CD8 细胞的比例示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接。本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法及其在治疗因免疫细胞衰竭而引起疾病中的应用。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为重组融合蛋白的基因构建和生产纯化。
根据人PD-1单链抗体(SEQ ID NO：2)C端和白介素2(SEQ ID NO：3) 的N端氨基酸序列，通过基因合成，酶切和进一步克隆，通过非功能人工构建氨基酸(SEQ ID NO：4)将两部分连接，组成融合蛋白人工构造基因序列(SEQ ID NO：5)，然后转入真核细胞表达载体pcDNA3.1(-)。最后将融合蛋白的表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中。转染的细胞置于37℃、5％CO2孵箱中培养，72小时后取上清液，进一步通过Protein A的亲和层析纯化，最后纯化的蛋白为双功能重组融合人工蛋白(αPD1scFvFcIL2)。同时，利用PD-1 抗体序列和白介素2序列制备的Fc融合蛋白作为非融合蛋白试验对照 (αPD1scFvFc，IL2Fc)。如图1所示，经过电泳检测确认纯化的融合蛋白分子量大约为67kD，证明依据本发明设计的重组融合人工蛋白可以通过CHO细胞生产。最后用分光光度计测试蛋白浓度并稀释在PBS中，用作进一步体内外的活性测试及功能研究。
实施例2
本实施例为双功能重组融合蛋白对人PBMC细胞体外培养的活性及功能测定。
人外周血经利用淋巴细胞密度梯度离心法(Ficoll)分离纯化，在24孔板中用X-Vivo15培养基稀释至细胞密度为5×106/ml，加入试验蛋白至最终浓度为 200ng/ml。然后置于37℃、5％CO2孵箱中培养72小时，细胞收集后用流式抗体染色，洗涤后用流式细胞仪进行表型测定和数据分析。图2中显示，与未加蛋白组对照相比，PD-1抗体(αPD1scFvFc)不能诱导CD137的表达(0.06％vs 0.09％), 而融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)处理能显著增加CD8-和CD8+细胞中CD137的表达(0.96％)。同时，如图3显示，培养后融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)和PD-1 抗体(αPD1scFvFc)处理组中PD-1+荧光强度降低(0.037％，0.01％)，而白介素2(IL2Fc)处理组PD-1+的荧光强度升高(0.81％)。试验证明，依据本发明设计的重组融合蛋白不但能够激活人PBMC细胞，同时降低或屏蔽细胞表面 PD-1+的信号。
实施例3
本实施例为双功能重组融合蛋白对人腹水免疫细胞活性及功能的测定。
取人肺癌患者腹水，在24孔板中加入试验蛋白至最终浓度为200ng/ml。然后置于37℃、5％CO2孵箱中培养72小时后取出，细胞收集后用CD8和PD-1 流式抗体染色，然后用穿孔素破细胞膜后进行CD8+细胞中的TNFα和IFNγ流式抗体内染，洗涤后用流式细胞仪进行表型测定和数据分析。如图4中显示，与未融合的PD-1抗体(αPD1scFvFc)相比，融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)处理能显著增加腹水中PBMC的TNFα(13.0％vs 5.29％)的表达。
实施例4
本实施例为双功能重组融合蛋白对体内免疫效应细胞的影响。
通过腹腔(IP)分别每2天注射融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)(10μg/只)或白介素2(IL2Fc)(10μg/只)或抗PD1蛋白(αPD1scFvFc)(10μg/只)或相应体积的PBS(对照组)于C57B6试验小鼠中，第7天从尾部取外周血，用抗小鼠CD8，CD4，CD25和NK1.1的流式抗体染色后检测，数据分析如图5所示。与对照组(PBS)，白介素2(IL2Fc)和抗PD1蛋白(αPD1scFvFc)组相比，重组融合蛋白(antiPD1scFvFcIL2)能够显著增加了CD8与NK细胞在淋巴细胞中的比例。体内试验证明，本发明合成的融合蛋白免疫学效应超过非融合蛋白的免疫作用。
实施例5
本实施例为融合蛋白增加肿瘤中侵润淋巴细胞的比例。
在每只C57B6小鼠的皮下接种1×106鼠肺癌细胞(LLC)，等肿瘤体积增长到100mm3时分别通过腹腔每2天注射融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)(10μg/只) 或白介素2(IL2Fc)(10μg/只)或抗PD1蛋白(αPD1scFvFc)(10μg/只)或相应体积的PBS(对照组)，总共注射5次。第20天时取肿瘤组织研磨与过滤成单细胞，用流式抗体进行染色分析肿瘤中淋巴细胞的比例，数据分析如图6所示。与抗PD1蛋白(αPD1scFvFc)(0.22％)或PBS组(0.32％)相比，重组融合蛋白(αPD1scFvIL2)(0.95％)显著增加了肿瘤组织中CD8+淋巴细胞的比例，证明融合蛋白可以增加肿瘤淋巴细胞的侵润。
实施例6
本实施例为融合蛋白增加NSG小鼠移植人淋巴细胞的扩增。
从NSG小鼠的尾静脉接种4×106人PBMC细胞，第八天开始分别通过腹腔每2天注射融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)(10μg/只)或白介素2(IL2Fc)(10μg/ 只)或抗PD1蛋白(αPD1scFvFc)(10μg/只)或相应体积的PBS(对照组)，总共注射3次。第12天时通过尾静脉取50μl外周血，加入流式抗体进行染色，破红后用流式细胞分析仪分析人CD45+细胞在外周血淋巴细胞中的比例，数据分析如图7所示。在没有进行蛋白注射前(第7天)，各组中人CD45+的细胞比例基本相同。而在第12天时，白介素2(IL2Fc)或抗PD1蛋白(αPD1scFvFc) 或PBS组基本没有检测出人CD45阳性细胞，而重组融合蛋白(αPD1scFvIL2) 组人CD45+细胞超过27％。本试验表明，融合蛋白具有非融合蛋白所不具有的功能，只有本发明的融合蛋白才能显著增加了NSG小鼠中人CD45+的比例，引起免疫细胞扩增。
实施例7
本实施例为融合蛋白增加NSG肿瘤内小鼠移植人淋巴细胞的侵润。
在NSG小鼠的皮下接种1×106人肺癌细胞A549，等肿瘤生长至面积 100mm2，通过尾静脉接种2×106人PBMC细胞，同时通过腹腔每2天注射融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)(10μg/只)或白介素2(IL2Fc)(10μg/只)或抗PD1 蛋白(αPD1scFvFc)(10μg/只)，总共注射2次。第21天时取肿瘤组织，研磨成单细胞后加入流式抗体进行染色，用流式细胞分析仪分析人CD45+细胞在肿瘤中的比例，数据分析如图8所示。第21天时，白介素2(IL2Fc)或抗PD1蛋白(αPD1scFvFc)组人CD45阳性细胞比例分别为1.18％和0.11％，而重组融合蛋白(αPD1scFvIL2)组人CD45+细胞比例达到10.4％。本试验表明，融合蛋白能显著增加了NSG小鼠人肿瘤中人CD45+的比例，诱导免疫细胞的肿瘤侵润。
对比例
采用中国专利CN107082812A中实施例1制备的重组融合蛋白(αPD1-IL2)，与本发明实施例1制备的重组融合蛋白(αPD1scFvFcIL2)进行比较，其体外活性、免疫效应细胞比例及活性的对比如下所示：
人外周血经利用淋巴细胞密度梯度离心法(Ficoll)分离纯化，在24孔板中用X-Vivo15培养基稀释至细胞密度为5×106/ml，加入试验蛋白至最终浓度为 200ng/ml。然后置于37℃、5％CO2孵箱中培养72小时，细胞收集后用流式抗体染色，洗涤后用流式细胞仪进行表型测定和数据分析。图9中显示，与未加蛋白组对照(CTRL)相比，CN107082812A中实施例1制备的重组融合蛋白(αPD1-IL2) 诱导CD8细胞比例为(6.29％vs 5.03％)，而本发明中融合蛋白(αPD1scFvFcIL2) 处理的CD8+细胞为7.94％。同时，如图10显示，培养后本发明融合蛋白处理后 CD137+的CD8细胞比例为21.4％，而对照组(CTRL)和αPD1-IL2处理的CD137+的CD8细胞比例为2.06％和4.07％。试验证明，依据本发明设计的重组融合蛋白不但增加CD8+效应细胞比例，同时促进效应细胞活化信号(CD137)的表达。
由上述实施例可知，本发明所述的恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，既能识别衰竭性免疫细胞，又能激活扩增免疫细胞，恢复免疫细胞杀伤抗原阳性细胞的功能。融合蛋白具有非融合蛋白具有的功能，既能激活免疫细胞，又能屏蔽 PD1的信号，同时只有融合蛋白才能定向扩增NSG小鼠中人CD45+细胞的数量，诱导免疫细胞肿瘤的亲润。由于肿瘤的发生与扩散和慢性病毒感染是免疫细胞衰竭与免疫***耐受的结果，而恢复衰竭性免疫细胞的功能和扩增免疫细胞的数量可以增强机体抗肿瘤和抗慢性病毒感染的能力，且本发明制备制备的融合蛋白与现有技术相比，其进一步改进了对CD8效应细胞的增殖效用，同时也增加了效应细胞的激活和共刺激分子的表达，由此类推，上述融合蛋白的临床应用可以更好地抑制肿瘤生长和控制病毒感染，具有很好的临床前景和广泛的应用范围；且
上述双功能重组融合蛋白可单独应用或与化疗，靶向药物，抗体药物，细胞治疗及放射疗法组成联合应用，用于制备治疗因免疫细胞衰竭而引起的疾病的药物，例如治疗癌症药物和治疗慢性病毒感染的药物等。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海科医联创生物技术有限公司
<120> 一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> PD-1(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr
1 5 10 15
Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe
20 25 30
Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr
35 40 45
Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu
50 55 60
Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu
65 70 75 80
Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn
85 90 95
Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala
100 105 110
Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg
115 120 125
Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Ser Ala Gly
130 135 140
Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly Leu Leu Gly Ser
145 150 155 160
Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys Ser Arg Ala Ala
165 170 175
Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro Leu Lys Glu Asp
180 185 190
Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly Glu Leu Asp Phe
195 200 205
Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro Cys Val Pro Glu
210 215 220
Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly Met Gly Thr Ser
225 230 235 240
Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg Ser Ala Gln Pro
245 250 255
Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
260 265
<210> 2
<211> 243
<212> PRT
<213> PD-1单链抗体(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
130 135 140
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 3
<211> 133
<212> PRT
<213> IL-2（白介素-2）(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 4
<211> 231
<212> PRT
<213> 非功能性氨基酸片段(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
225 230
<210> 5
<211> 607
<212> PRT
<213> 重组融合蛋白(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
130 135 140
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser
145 150 155 160
Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
165 170 175
Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp
180 185 190
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
195 200 205
Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
465 470 475 480
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
485 490 495
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
500 505 510
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
515 520 525
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
530 535 540
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
545 550 555 560
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
565 570 575
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
580 585 590
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
595 600 605

Claims (4)

1.一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白，包含识别衰竭性免疫细胞的功能区和激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区，两个功能区通过一定长度的非功能性氨基酸片段连接，所述识别衰竭性免疫细胞的功能区是识别衰竭性免疫细胞的表型受体，所述激活扩增衰竭性免疫细胞的功能区是采用细胞因子来激活衰竭性免疫细胞，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列。
2.一种如权利要求1所述的恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）由人PD-1抗体单链的C端和白介素2的N端氨基酸序列通过非功能性氨基酸片段连接，通过基因合成，酶切和进一步克隆，组成融合蛋白构造基因；
步骤2）将步骤1）所述的融合蛋白构造基因转入真核细胞表达载体，并转染至仓鼠卵巢细胞；
步骤3）将步骤2）所述的仓鼠卵巢细胞放置在孵箱中培养一段时间，取上清液，经亲和纯化后制得重组融合蛋白；
其中，所述PD-1抗体单链的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述白介素2的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述非功能性氨基酸片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
3.根据权利要求2所述的一种恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述真核细胞表达载体为pcDNA3.1。
4.一种如权利要求1所述的恢复衰竭性免疫细胞功能的融合蛋白在制备治疗因免疫细胞衰竭而引起疾病的药物中的应用。
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