CN109988181A - 一种含对苯二酚混源萜的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化工技术领域,具体涉及一种含对苯二酚混源萜的制备方法及应用；本发明分离自宁夏枸杞(Lycium barbarum)新鲜叶片的内生真菌Bipolaris sp.L1‑2，通过内生真菌Bipolaris sp.L1‑2发酵培养物中制备分离得到，其结构式如式(I)所述，该化合物对人肺鳞癌细胞NCI‑H226和人乳腺癌细胞MBA‑MD‑231具有显著抑制活性，可为开发新型抗肿瘤药物提供候选药物，为开发利用宁夏枸杞(Lycium barbarum)的内生真菌资源提供了科学依据。

Description

一种含对苯二酚混源萜的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域,具体涉及一种含对苯二酚混源萜的制备方法及应用。
背景技术
植物内生真菌分布广泛，种类多样。在与宿主植物互利共生的过程中，内生真菌的代谢会受到宿主植物的激素或代谢物的影响，甚至其基因组也会因基因水平传递而改变。因此，植物内生真菌具有产生结构丰富和活性多样的化合物的潜力。宁夏枸杞(Lyciumbarbarum)是我国传统的药食同源植物，其果和叶均可食用，且富含枸杞多糖、类胡萝卜素、甜菜碱等多类成分，具有抗氧化、降血糖、神经保护等多种活性。虽然对枸杞各部位的成分已有了比较多的研究成果，但关于枸杞内生真菌次级代谢产物的研究却未见报道，因此有望从这一来源获得结构新颖活性优良的化合物。
癌症是目前人类的第三大健康杀手。随着日趋加重的环境污染，人类患癌率日渐升高，而癌症治愈率依然较低。因此，开发新的癌症治疗药物迫在眉睫。
发明内容
本发明目的之一是提供结构新颖的含对苯二酚混源萜的化合物，本发明化合物bipolahydroquinone C，其结构式如式(I)所述：
本发明的目的之二是提供一种制备化合物bipolahydroquinone C的方法，其特征在于：所述化合物bipolahydroquinone C是从内生真菌Bipolaris sp.L1-2发酵培养物中制备分离得到的，包括以下步骤：
S1、制备内生真菌Bipolaris sp.L1-2发酵培养物，并将发酵产物过滤分出发酵液和菌丝体两部分，发酵液经乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层并将其浓缩得到浸膏A；
S2、将菌丝体先用甲醇浸提，合并甲醇浸提液，将其浓缩后分散于水相中，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得到浸膏B；
S3、浸膏A和浸膏B合并得到总浸膏；
S4、总浸膏用大孔树脂进行色谱分离，分离时依次采用乙醇-水从0:100,30:70,50:50,80:20,100:0v/v梯度洗脱，收集梯度为乙醇：水＝50:50的洗脱组分；
S5、收集的洗脱组分用硅胶柱色谱进行分离，分离时依次采用梯度为50:0 至0:1的石油醚-丙酮洗脱液洗脱，收集梯度为10:1至8:1的石油醚-丙酮洗脱组分，该组分为棕黄色，
S6、棕黄色洗脱组分用凝胶柱色谱进行洗脱，洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇，收集首先洗脱出来的橙黄色组分；
S7、橙黄色洗脱组分用硅胶柱色谱进行分离，分离时依次采用梯度为25:1 至20:1的石油醚-丙酮洗脱液洗脱，收集梯度为25:1的石油醚-丙酮洗脱组分；
S8、收集的洗脱组分采用半制备液相色谱进行纯化，接收保留时间为18min、紫外吸收特征波长为204、301nm的组分即得到如式A所示的新化合物 bipolahydroquinone C。
所述S1制备内生真菌Bipolaris sp.L1-2发酵培养物的方法为：内生真菌Bipolaris sp.L1-2接种于PDA培养基，在28摄氏度下培养5天，将培养出的菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃下避光发酵培养31天。
所述PDA培养基组成为20％的马铃薯浸提液1000mL，2％葡萄糖，2％琼脂，马铃薯葡萄糖液体培养基组成为20％的马铃薯浸提液，2％葡萄糖。
所述S5棕黄色洗脱组分以石油醚:丙酮＝2:1为展开剂进行薄层色谱分析，其Rf值为0.4-0.5，硫酸-乙醇显色呈红棕色。
所述S6橙黄色洗脱组分该组分二氯甲烷：乙酸乙酯＝3:1体系进行薄层色谱分析，其Rf为0.4-0.6，硫酸-乙醇显色呈红棕色。
所述S8中半制备液相色谱的液相色谱仪为Waters 1525，流动相为体积比为60:40的乙腈-水，流速为2mL/min，检测器为Waters 2998光电二极管阵列检测器，检测波长为200-400nm，色谱柱为Waters Sunfire C18半制备柱，规格为10×250mm。
本发明的目的之三是提供化合物bipolahydroquinone C或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的之四是提供一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括有效量的作为活性成份的权利要求1所述的化合物bipolahydroquinone C，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
本发明的有益效果为：从宁夏枸杞(Lycium barbarum)新鲜叶片的内生真菌Bipolaris sp.L1-2的液体发酵产物中提取并分离得到新化合物 bipolahydroquinone C。该化合物对人肺鳞癌细胞NCI-H226和人乳腺癌细胞 MDA-MB-231具有显著抑制活性，可为开发新型抗肿瘤药物提供候选药物，为开发利用宁夏枸杞(Lycium barbarum)的内生真菌资源提供了科学依据。同时该分子可以通过微生物发酵生产，具有可重复多次发酵，成本低，对环境污染小的优点。
附图说明
图1为bipolahydroquinone C的结构式；
图2为化合物bipolahydroquinone C的高分辨质谱图；
图3为化合物bipolahydroquinone C的1HNMR谱；
图4为化合物bipolahydroquinone C的13CNMR谱；
图5为化合物bipolahydroquinone C的1H-1H COSY谱；
图6为化合物bipolahydroquinone C的HSQC谱；
图7为化合物bipolahydroquinone C的HMBC谱；
图8为化合物bipolahydroquinone C的NOESY谱；
具体实施方式
实施例1
结合实施例、附图对本发明作进一步描述：
制备过程
将分离自宁夏枸杞(Lycium barbarum)新鲜叶片的内生真菌Bipolaris sp.L1-2接种于PDA培养基(组成为：20％的马铃薯浸提液1000mL，20g葡萄糖， 20g琼脂)在28摄氏度下培养5天，将培养出的菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基(20％的马铃薯浸提液1000mL，20g葡萄糖)中，在28℃下避光发酵培养 31天。发酵产物用纱布过滤分出发酵液和菌丝体两部分；发酵液经乙酸乙酯萃取，重复三次，合并乙酸乙酯层并将其浓缩得到浸膏A；菌丝体先用甲醇浸提，重复三次，合并甲醇浸提液，将其浓缩后分散于水相中，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得到浸膏B；浸膏A和浸膏B合并得到总浸膏。
所得总浸膏用大孔树脂进行色谱分离，分离时依次采用乙醇-水从0:100,30:70,50:50,80:20,100:0v/v梯度洗脱，收集梯度为乙醇：水＝50:50的洗脱组分；该组分再用硅胶柱色谱进行分离，分离时依次采用梯度为50:0至0:1 的石油醚-丙酮洗脱液洗脱，收集梯度为10:1至8:1的石油醚-丙酮洗脱组分，该组分为棕黄色，以石油醚：丙酮＝2:1为展开剂进行薄层色谱分析，该组分Rf 值为0.4-0.5，硫酸-乙醇显色呈红棕色。该组分用凝胶柱色谱进行洗脱，洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇，收集首先洗脱出来的橙黄色组分，该组分用二氯甲烷：乙酸乙酯＝3:1体系进行薄层色谱分析，其Rf为0.4-0.6，硫酸-乙醇显色呈红棕色。该组分用硅胶柱色谱进行分离，分离时依次采用梯度为25:1 至20:1的石油醚-丙酮洗脱液洗脱，收集梯度为25:1的石油醚-丙酮洗脱组分。该组分采用半制备液相色谱进行纯化(液相色谱仪为Waters 1525，流动相为体积比为60:40的乙腈-水，流速为2mL/min，检测器为Waters 2998光电二极管阵列检测器，检测波长为200-400nm，色谱柱为WatersSunfire C18半制备柱，规格为10×250mm)，接收保留时间为18.0min、紫外吸收特征波长为204、301nm 的组分即得到如式A所示的新化合物bipolahydroquinone C。
活性测试
将对数增长期的人肺鳞癌细胞NCI-H226和人乳腺癌细胞MDA-MB-231分别制成靶细胞悬液。靶细胞悬液接种于96孔板中，每孔接种100μL，同时保留空白孔，于37℃、5％CO2下培养过夜。待细胞贴壁后，实验孔加入10μL含不同浓度测试样品的培养基，对照孔加入等体积的培养基，置于37℃、5％CO2下培养48h 后，加入10μL的CCK8溶液，用酶标仪检测波长450nm下的OD值。按照公式“抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)”计算抑制率，绘制剂量反应回归曲线，计算IC50值。实验结果表明，bipolahydroquinone C对NCI-H226和MDA-MB-231具有显著的细胞毒活性，IC50分别为5.46和6.66μM。
表1 bipolahydroquinone C的核磁数据
化合物bipolahydroquinone C的理化数据：淡黄色油状物，[α]24.4 D+154(c 0.46,MeOH)；IR(KBr)νmax 3345,2978,2944,1656,1639,1458,1092,738cm-1； UV(MeOH)λmax(logε)301(2.90)nm；HRESIMS m/z 511.2682[M+Na]+(计算值为 C28H40O7Na,511.2666)。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.化合物bipolahydroquinone C，其结构式如式(I)所述，
。
2.一种制备权利要求1所述的化合物bipolahydroquinone C的方法，其特征在于，所述化合物bipolahydroquinone C是从内生真菌Bipolaris sp.L1-2发酵培养物中制备分离得到的，包括以下步骤：
S1、制备内生真菌Bipolaris sp.L1-2发酵培养物，并将发酵产物过滤分出发酵液和菌丝体两部分，发酵液经乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层并将其浓缩得到浸膏A；
S2、将菌丝体先用甲醇浸提，合并甲醇浸提液，将其浓缩后分散于水相中，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得到浸膏B；
S3、浸膏A和浸膏B合并得到总浸膏；
S4、总浸膏用大孔树脂进行色谱分离，分离时依次采用乙醇-水从0:100,30:70,50:50,80:20,100:0v/v梯度洗脱，收集梯度为乙醇：水＝50:50的洗脱组分；
S5、收集的洗脱组分用硅胶柱色谱进行分离，分离时依次采用梯度为50:0至0:1的石油醚-丙酮洗脱液洗脱，收集梯度为10:1至8:1的石油醚-丙酮洗脱组分，该组分为棕黄色，
S6、棕黄色洗脱组分用凝胶柱色谱进行洗脱，洗脱液为体积比1:1的二氯甲烷-甲醇，收集首先洗脱出来的橙黄色组分；
S7、橙黄色洗脱组分用硅胶柱色谱进行分离，分离时依次采用梯度为25:1至20:1的石油醚-丙酮洗脱液洗脱，收集梯度为25:1的石油醚-丙酮洗脱组分；
S8、收集的洗脱组分采用半制备液相色谱进行纯化，接收保留时间为18min、紫外吸收特征波长为204、301nm的组分即得到如式A所示的新化合物bipolahydroquinone C。
3.根据权利要求2所述的制备化合物bipolahydroquinone C的方法，其特征在于：所述S1制备内生真菌Bipolaris sp.L1-2发酵培养物的方法为：内生真菌Bipolaris sp.L1-2接种于PDA培养基，在28摄氏度下培养5天，将培养出的菌种接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，在28℃下避光发酵培养31天。
4.根据权利3所述的制备化合物bipolahydroquinone C的方法，其特征在于：所述PDA培养基组成为20％的马铃薯浸提液1000mL，2％葡萄糖，2％琼脂，马铃薯葡萄糖液体培养基组成为20％的马铃薯浸提液，2％葡萄糖。
5.根据权利要求2所述的制备化合物bipolahydroquinone C的方法，其特征在于：所述S5棕黄色洗脱组分以石油醚:丙酮＝2:1为展开剂进行薄层色谱分析，其Rf值为0.4-0.5，硫酸-乙醇显色呈红棕色。
6.根据权利要求2所述的制备化合物bipolahydroquinone C的方法，其特征在于：所述S6橙黄色洗脱组分该组分二氯甲烷：乙酸乙酯＝3:1体系进行薄层色谱分析，其Rf为0.4-0.6，硫酸-乙醇显色呈红棕色。
7.根据权利要求2所述的制备化合物bipolahydroquinone C的方法，其特征在于：所述S8中半制备液相色谱的液相色谱仪为Waters 1525，流动相为体积比为60:40的乙腈-水，流速为2mL/min，检测器为Waters 2998光电二极管阵列检测器，检测波长为200-400nm，色谱柱为Waters Sunfire C18半制备柱，规格为10×250mm。
8.权利要求1所述的化合物bipolahydroquinone C或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种抗肿瘤药物，其特征在于：包括有效量的作为活性成份的权利要求1所述的化合物bipolahydroquinone C，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。
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