CN105085538A - 具有肿瘤细胞g1期阻滞作用的化合物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明通过对黄柄曲霉固体发酵和对其发酵产物的甲醇提取物进行分离纯化,得到18个细胞松弛素类新化合物,通过抗肿瘤活性评价,发现化合物1黄柄曲霉菌素A对白血病细胞HL-60,人肝癌细胞SMMC-7721,人肺癌细胞A-549,人乳腺癌细胞MCF-7,人结肠癌细胞SW480有一定的抑制作用。本发明人采用4株癌细胞(人早幼粒白血病细胞HL-60、急性早幼粒白血病细胞株NB4、结肠癌细胞株RKO、人结直肠癌细胞HCT116)和两株正常细胞(肾上皮细胞293T和结肠上皮细胞NCM460)对化合物1作用后细胞周期进行了研究,发现化合物1能够特异性的将所4株瘤细胞阻滞在G1期,而对两株正常细胞无明显影响。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及化合物1-18的分离制备方法及用途。具体涉及分离纯化过程,结构确证,肿瘤细胞G1期阻滞作用等。
背景技术
癌症是威胁人类健康的主要的疾病之一,世界卫生组织(WHO)发布的《2014年世界癌症报告》显示,每年大约有1400万新增癌症病例,由癌症导致的死亡人数约820万。该报告分析指出,发展中国家因医疗卫生条件落后而首当其冲,占全球新增病例的60%,年度死亡病例的70%。我们面临的癌症的防治任务十分艰巨,这也使得加速开发安全、有效、低毒的抗癌药物成为众多研究人员追求的共同目标。
长期以来,天然产物都是药物最重要的来源。据统计,从1981年到2010年的三十年之间,直接或间接来源于天然产物的药物平均占到每年上市药物的30-40%之间;2010年,天然产物相关来源的药物比例达到了空前的50%。真菌次生代谢产物种类丰富,近年来,对真菌活性代谢产物的研究越来越多,不时有结构新颖活性良好的化合物被发现,为药物的开发奠定了坚实的物质基础。因此,从真菌中筛选具有抗肿瘤作用的新的天然产物具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的任务是提供具有肿瘤细胞G1期阻滞作用化合物及其分离制备方法。本发明的另一个任务是提供这种具有肿瘤细胞G1期阻滞作用化合物在制备肿瘤细胞G1期阻滞药物中的应用。
本发明提供的具有肿瘤细胞G1期阻滞作用化合物是细胞松弛素类化合物,其结构式如以下式(1),包括化合物1至化合物18:
化合物1:黄柄曲霉菌素A(AsperchalasineA)
化合物2:黄柄曲霉菌素B(AsperchalasineB)
化合物3:黄柄曲霉菌素C(AsperchalasineC)
化合物4:黄柄曲霉菌素D(AsperchalasineD)
化合物5:黄柄曲霉菌素E(AsperchalasineE)
化合物6:黄柄曲霉菌素F(AsperchalasineF)
化合物7:黄柄曲霉菌素G(AsperchalasineG)
化合物8:黄柄曲霉菌素H(AsperchalasineH)
化合物9:黄柄曲霉菌素I(AsperchalasineI)
化合物10:黄柄曲霉菌素J(AsperchalasineJ)
化合物11:黄柄曲霉菌素K(AsperchalasineK)
化合物12:黄柄曲霉菌素L(AsperchalasineL)
化合物13:黄柄曲霉菌素M(AsperchalasineM)
化合物14:黄柄曲霉菌素N(AsperchalasineN)
化合物15:黄柄曲霉菌素O(AsperchalasineO)
化合物16:黄柄曲霉菌素P(AsperchalasineP)
化合物17:黄柄曲霉菌素Q(AsperchalasineQ)
化合物18:黄柄曲霉菌素R(AsperchalasineR)
式(1)
本发明人通过对黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)固体发酵和对其发酵产物的甲醇提取物进行分离纯化,得到上述18个新化合物。运用多种波谱分析方法和其他手段,确定其为细胞松弛素类化合物,具体结构如式(1)所示。通过对化合物1-18的抗肿瘤活性评价,发现化合物1对白血病细胞HL-60,人肝癌细胞SMMC-7721,人肺癌细胞A-549,人乳腺癌细胞MCF-7,人结肠癌细胞SW480有一定的抑制作用。本发明人采用4株癌细胞(人早幼粒白血病细胞HL-60、急性早幼粒白血病细胞株NB4、结肠癌细胞株RKO、人结直肠癌细胞HCT116)和两株正常细胞(肾上皮细胞293T和结肠上皮细胞NCM460)对化合物1作用后细胞周期进行了研究,发现化合物1能够特异性的将所4株瘤细胞阻滞在G1期,而对两株正常细胞无明显影响。
本发明提供的具有肿瘤细胞G1期阻滞作用的细胞松弛素类化合物的制备方法包括以下步骤:
S1.种子培养基的制备:黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)菌株接入种子培养基,摇床培养,得到种子培养液;所述摇床培养的条件为:25~28℃下,摇床转速100~120rpm,培养时间为3~5天;所述种子培养基的组分为:酵母膏1~5g,麦芽膏1~5g,蛋白胨1~10g,葡萄糖5~15g,水0.5~1.5L。
S2.接种:采用固体发酵方式,在发酵瓶中加入大米固体发酵培养基,接种S1中种子培养液,静置培养;所述大米固体发酵培养基为每0.5~1.5L的三角锥形瓶中加入大米150~250g,水150~250mL;所述静置培养的时间为20~40天,培养温度为25~28℃。
S3.将S2发酵得到的菌丝体及培养基用甲醇提取,减压浓缩回收甲醇,得到浸膏;
S4.将S3所得浸膏经柱层析分离,得到式(1)中所示化合物1-18;所述层析分离方法包括硅胶柱层析(石油醚:丙酮–2:1~4:1),凝胶柱层析(甲醇),半制备高效液相色谱(60~80%甲醇或者乙腈)。
本发明提供的这种具有肿瘤细胞G1期阻滞作用化合物的应为用于制备肿瘤细胞G1期阻滞药物,如用于制备白血病、结肠癌细胞G1期阻滞药物。
附图说明
图1:化合物1的X射线单晶衍晶体结构图。
图2:化合物1的对4株肿瘤细胞(人早幼粒白血病细胞HL-60、急性早幼粒白血病细胞株NB4、结肠癌细胞株RKO、人结直肠癌细胞HCT116)G1期阻滞作用是通过流式细胞仪分析确定的结果图。
具体实施方式
实施例1:
化合物1(黄柄曲霉菌素A,AsperchalasineA)的制备和结构鉴定。
一、如式(1)所示黄柄曲霉菌素A的制备
1.发酵条件
种子培养液的配置:取酵母膏3.0g,麦芽膏3.0g,蛋白胨5.0g,葡萄糖10.0g,溶于适量的水中,再用水定容至1000mL,121℃下高温灭菌30min,备用。将黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)接种到上述培养基中,25~28℃,100~120rpm条件下摇床培养为3~5天,得到种子培养液。
发酵:将200g大米装入1000mL锥形瓶中,加入200mL水,121℃下高温灭菌30min,备用。将上述种子培养液接种到大米培养基中,25~28℃条件下静置培养25~30天。
2.提取分离
将发酵得到的发酵物用甲醇提取4次,于45℃减压浓缩回收甲醇,得到总浸膏。总浸膏用乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯部分(728g)。将乙酸乙酯部分用100-200目硅胶拌样,进行硅胶柱层析,用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱(10:1–3:1),TLC检测,合并相同的组分,共得到8个组分。组分4再经过反复的正反相硅胶柱色谱,凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物黄柄曲霉菌素A(36mg)。
二、如式(1)所示化合物黄柄曲霉菌素A的结构鉴定
对化合物黄柄曲霉菌素A的高分辨质谱,紫外光谱,红外光谱,旋光,核磁共振,圆二色谱和X射线单晶衍射等数据进行综合分析,从而确定该化合物的结构。
化合物1:Colorlesscrystals,UV(MeOH)λmax(logε)204(4.38)nm;IRvmax3359,1782,1689,1627,1443,1384,1270,1118,1057,1021cm–1;ECD(MeOH)λ(Δε)220(+12.3),247(–5.7),273(+0.4),294(–3.8)nm;for1HNMR(600MHz)and13CNMR(150MHz)data,seeTableS1;for1HNMR(400MHz)and13CNMR(100MHz)data,seeTableS2;HRESIMS[M+Na]+m/z999.4967(calcdforC57H72N2O12Na,999.4983)。化合物1的核磁共振(NMR)数据如表(1)所示,其绝对构型是通过X射线单晶衍射确定的,晶体结构如图(1)所示。
表(1).化合物1的1H,13CNMR数据(RecordinCD3OD;JinHz).a
a600MHzfor1Hand150MHzfor13C.
实施例2
化合物1对4株癌细胞(人早幼粒白血病细胞HL-60、急性早幼粒白血病细胞株NB4、结肠癌细胞株RKO、人结直肠癌细胞HCT116)G1期的阻滞作用。
化合物1的对4株肿瘤细胞(人早幼粒白血病细胞HL-60、急性早幼粒白血病细胞株NB4、结肠癌细胞株RKO、人结直肠癌细胞HCT116)G1期阻滞作用是通过流式细胞仪分析确定的,结果如图(2)所示。
实验结论:化合物1对4株癌细胞(人早幼粒白血病细胞HL-60、急性早幼粒白血病细胞株NB4、结肠癌细胞株RKO、人结直肠癌细胞HCT116)有很强的G1期阻滞作用,对两株正常细胞(肾上皮细胞293T和结肠上皮细胞NCM460)无明显影响,在癌细胞和正常细胞之间具有很高的选择性,具有开发为癌细胞G1期阻滞药物的潜力。
实施例3
化合物2-12的13CNMR数据检测及化合物13-18的13CNMR数据检测,结果见以下附表(1)和附表(2):
附表(1):化合物2-12的13CNMR数据(RecordinCD3OD;100MHz)
附表(2)化合物13-18的13CNMR数据(RecordinCD3OD;100MHz)
aRecordinDMSO-d6。
Claims (4)
1.从黄柄曲霉中分离纯化得到的具有式(1)所示结构的新细胞松弛素类化合物1-18。
化合物1:黄柄曲霉菌素A(AsperchalasineA)
化合物2:黄柄曲霉菌素B(AsperchalasineB)
化合物3:黄柄曲霉菌素C(AsperchalasineC)
化合物4:黄柄曲霉菌素D(AsperchalasineD)
化合物5:黄柄曲霉菌素E(AsperchalasineE)
化合物6:黄柄曲霉菌素F(AsperchalasineF)
化合物7:黄柄曲霉菌素G(AsperchalasineG)
化合物8:黄柄曲霉菌素H(AsperchalasineH)
化合物9:黄柄曲霉菌素I(AsperchalasineI)
化合物10:黄柄曲霉菌素J(AsperchalasineJ)
化合物11:黄柄曲霉菌素K(AsperchalasineK)
化合物12:黄柄曲霉菌素L(AsperchalasineL)
化合物13:黄柄曲霉菌素M(AsperchalasineM)
化合物14:黄柄曲霉菌素N(AsperchalasineN)
化合物15:黄柄曲霉菌素O(AsperchalasineO)
化合物16:黄柄曲霉菌素P(AsperchalasineP)
化合物17:黄柄曲霉菌素Q(AsperchalasineQ)
化合物18:黄柄曲霉菌素R(AsperchalasineR)
式(1)。
2.权利要求1所述的细胞松弛素类化合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.种子培养基的制备:黄柄曲霉(Aspergillusflavipes)菌株接入种子培养基,摇床培养,得到种子培养液;所述摇床培养的条件为:25~28℃下,摇床转速100~120rpm,培养时间为3~5天;所述种子培养基的组分为:酵母膏1~5g,麦芽膏1~5g,蛋白胨1~10g,葡萄糖5~15g,水0.5~1.5L。
S2.接种:采用固体发酵方式,在发酵瓶中加入大米固体发酵培养基,接种S1中种子培养液,静置培养;所述大米固体发酵培养基为每0.5~1.5L的三角锥形瓶中加入大米150~250g,水150~250mL;所述静置培养的时间为20~40天,培养温度为25~28℃。
S3.将S2发酵得到的菌丝体及培养基用甲醇提取,减压浓缩回收甲醇,得到浸膏;
S4.将S3所得浸膏经柱层析分离,得到式(1)中所示化合物1-18;所述层析分离方法包括硅胶柱层析(石油醚:丙酮–2:1~4:1),凝胶柱层析(甲醇),半制备高效液相色谱(60~80%甲醇或者乙腈)。
3.权利要求1中所述的化合物1在制备抗肿瘤G1期阻滞药物中的应用。
4.权利要求1所述的化合物在制备用于白血病、结肠癌细胞G1期阻滞药物中的应用。
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