CN109975272A - 基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器和检测方法，该传感器通过先在电极表面修饰CNT‑AuNP和碱水解g‑C3N4(H‑g‑C3N4)，再修饰金纳米簇得到。其具体包括以下步骤：1)制备H‑g‑C3N4；2)制备CNT‑AuNP；3)制备金纳米簇；4)电极修饰：在电极表面依次修饰CNT‑AuNP和H‑g‑C3N4后，再将金纳米簇修饰在电极表面，得到用于检测多巴胺的传感器。本发明的传感器，设计了“on_off_on”的传感模式，降低了背景信号，消除了伪正信号；本发明的传感器具有灵敏度高、选择性强、抗干扰性强等优点。

Description

基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器和检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器和检测方法。
背景技术
多巴胺(DA)是人体内一种重要的神经递质。在生命科学中起着重要作用，它的含量与人的情欲、感觉、行为紧密联系，也和一些疾病密切相关。比如帕金森症是由于制造多巴胺的神经元的死亡，帕金森病人体内多巴胺含量很低。此外精神***症和厌食症等也被证实与多巴胺有关。因此，多巴胺的测定在生理功能和临床上有着重大意义。然而，DA在人体内的浓度很低，仅为0.1mM-1.0mM。因此，多巴胺的精准检测比较困难。目前为止，已经报导了许多方法用于多巴胺的检测，包括高效液相色谱法、质谱法、电化学法和分光光度法等。然而，这些技术都有一定的缺点。比如，色谱和质谱方法依赖于昂贵的设备和特定的样品预处理过程,检测成本太高；电化学方法会受到抗坏血酸和尿酸的干扰；分光光度法的灵敏度较低，检测限高等。
电致化学发光(ECL)是化学发光与电化学的巧妙结合，具有结构简单、免标记、灵敏度高、背景信号低等优点，在生命分析检测中具有广泛的应用。该技术已广泛应用于小分子、蛋白质、DNA和细胞检测等领域。g-C3N4是一种优良的光催化材料，具有优越的光电性能，且对环境友好，被广泛用作ECL发光体，适用于高效ECL传感器的开发。同时，g-C3N4复合碳纳米管(CNT)起到协同效应，提高g-C3N4的ECL发光性能。
除了使用纳米复合材料作为ECL发光体之外，适当的传感策略对提高分析性能也很重要。发光共振能量转移(LRET)作为一种有效的生物分子灵敏检测技术，近年来引起了人们的广泛关注。作为LRET的一种，ECL共振能量转移(ECRET)是被认为是构建灵敏生物传感器的优选方法。但现在缺少一种基于电致化学发光能量转移的、能结合g-C3N4、CNT材料进行多巴胺高灵敏度检测的传感器。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器和检测方法。
本发明利用H-g-C3N4/CNT-AuNP复合材料和金纳米簇设计了“on_off_on”的传感模式，H-g-C3N4(碱水解g-C3N4)具有优异ECL性能，发光信号强，通过DNA链连上金纳米簇后，两者发生共振能量转移，ECL信号减弱，而体系中一旦出现多巴胺，多巴胺会与金纳米簇发生结合，从而阻断共振能量转移，使ECL信号恢复。且信号恢复程度与多巴胺含量正相关。经过验证，发现此模式大大降低了背景信号，而且消除了伪正信号。此模式中，我们制备的高性能材料时初始“on”信号很高，构建的共振转移体系使“off”信号很低，大大增加了传感器的灵敏度。本发明设计的传感器对多巴胺响应灵敏，ECL光强变化与多巴胺含量对数值在5nM-10000nM范围内成线性关系。同时测试了传感器对多巴胺的选择性，发现对于常见干扰物选择性良好。
本发明采用的技术方案是：一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，该传感器通过先在电极表面修饰CNT-AuNP和碱水解g-C3N4(H-g-C3N4)，再修饰金纳米簇得到。
优选的是，所述传感器的制备方法具体包括以下步骤：
1)制备H-g-C3N4；
2)制备CNT-AuNP；
3)制备金纳米簇；
4)电极修饰：在电极表面依次修饰CNT-AuNP和H-g-C3N4后，再将金纳米簇修饰在电极表面，得到用于检测多巴胺的传感器。
优选的是，所述步骤4)包括：先将CNT-AuNP滴加在预处理后的电极表面，干燥后滴加H-g-C3N4，干燥后再滴加EDC/NHS，然后滴加氨基修饰的DNA-1，使DNA-1通过酰胺键与电极结合，最后加入连接有DNA-2的金纳米簇，其中，DNA-1与DNA-2可互补配对。
优选的是，所述步骤1)具体包括：将30mg g-C3N4和2.5gNaOH溶于25mL水中，超声1.5h使其分散充分，然后在65℃下搅拌过夜，之后补加1.0gNaOH，再超声2h；将得到的溶液转移到透析袋中，溶液透析持续48小时，每12h换一次水，以除去NaOH，完成后取内液转移至离心管，6500rpm下离心15min，除去颗粒和大片层，保留上清液，得到H-g-C3N4水溶液。
优选的是，所述步骤2)具体包括：
2-1)以氯金酸溶液和柠檬酸钠为原料制备胶体AuNP；
2-2)PDDA功能化CNT的制备：将CNT分散在超纯水中，浓度为1.0mgmL-1，使用体积比为3:1的硫酸、HNO3混合液对其进行超声波处理2h，以获得羧基官能化CNT；然后，将1.0mL羧基官能化CNT溶液分散到5mL的1wt％PDDA水溶液中，并进行超声处理1h，以获得均匀的CNT；之后通过16000rpm离心15min，去除残留的PDDA，用超纯水洗涤沉淀3次，得到PDDA功能化CNT；
2-3)将1.0mL PDDA功能化CNT分散到5.0mL制备好的胶体AuNP中并超声处理10分钟，16000rpm离心10min，获得CNT-AuNP复合材料，再用水冲洗，制成1.0mg/mL的水溶液。
优选的是，所述步骤3)具体包括：将0.15mL 100mM谷胱甘肽溶液加入洁净的样品瓶，用超纯水稀释至5mL，剧烈搅拌下，加入0.5mL 20mM的氯金酸溶液，在70℃恒温水浴锅中反应24h，反应完成后，自然冷却至室温，透析48h除去未反应杂质，冻干保存。
优选的是，所述步骤4)具体包括：
4-1)将饱和甘汞电极先后用0.3μM和0.05μM Al2O3粉末抛光，之后先后在酒精和超纯水中超声，最后用N2吹干；
4-2)滴5μL步骤2)制得的CNT-AuNP于电极上，自然干燥；之后滴加5μL步骤1)制得的H-g-C3N4，自然干燥；
4-3)滴加20μL 1mg/mL EDC/NHS于电极上，活化材料表面羧基，而后将过量的氨基修饰的DNA-1滴于活化的底物电极表面，在4℃下孵育过夜，使DNA-1通过酰胺键与底物电极结合；
4-4)用DEPC水冲洗电极后，加入连接有DNA-2的金纳米簇，孵育2h；最后将20μL含2mM MCH和1％BSA的溶液滴在电极上，在室温下孵育1小时，以封闭非特异性结合位点，用DEPC水冲洗后待用。
优选的是，所述DNA-1结构为：5’-NH2-ATACCAATATCCGCTTTAT-3’；所述DNA-1结构为：3’-TATGGTTATAGGCGAAATA-SH-5’。
一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测方法，采用如上所述的传感器进行多巴胺检测。
本发明的有益效果是：本发明设计的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，设计了“on_off_on”的传感模式，降低了背景信号，而且消除了伪正信号；其对多巴胺响应灵敏，ECL光强变化与多巴胺含量对数值在5nM-10000nM范围内成线性关系；本发明的传感器具有灵敏度高、选择性强、抗干扰性强等优点。
附图说明
图1为本发明的一种实施例中的H-g-C3N4的TEM图；
图2为本发明的一种实施例中的金纳米簇的TEM图；
图3为本发明的一种实施例中的碳纳米管复合金纳米颗粒的TEM图；
图4为本发明的一种实施例中的H-g-C3N4的发射光谱和金纳米簇的激发光谱；
图5为本发明的一种实施例中的H-g-C3N4的ECL光强、H-g-C3N4-AuNC传感器的ECL光强和H-g-C3N4-AuNC传感器在100nM DA体系中的ECL光强图；
图6为本发明的一种实施例中的ECL光强变化值与体系中DA浓度对数的线性关系图；
图7为在一种实施例中本发明的传感器针对不同物质的响应对比的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，该传感器通过先在电极表面修饰CNT-AuNP和H-g-C3N4，再修饰金纳米簇得到。
该传感器的制备方法具体包括以下步骤：
1)制备H-g-C3N4(碱水解g-C3N4)；
2)制备CNT-AuNP；
3)制备金纳米簇；
4)电极修饰：在电极表面依次修饰CNT-AuNP和H-g-C3N4后，再将金纳米簇修饰在电极表面，得到用于检测多巴胺的传感器。
其中，所述步骤4)包括：先将CNT-AuNP滴加在预处理后的电极表面，干燥后滴加H-g-C3N4，干燥后再滴加EDC/NHS，然后滴加氨基修饰的DNA-1，使DNA-1通过酰胺键与电极结合，最后加入连接有DNA-2的金纳米簇，其中，DNA-1与DNA-2可互补配对。
实施例1
1)制备H-g-C3N4：将30mg g-C3N4和2.5gNaOH溶于25mL水中，超声1.5h使其分散充分，然后在65℃下搅拌过夜，之后补加1.0gNaOH，再超声2h；将得到的溶液转移到透析袋(Mw＝1000)中，溶液透析持续48小时，每12h换一次水，以除去NaOH，完成后取内液转移至离心管，6500rpm下离心15min，除去颗粒和大片层，保留上清液，得到H-g-C3N4水溶液。
2)制备CNT-AuNP(碳纳米管复合金纳米颗粒)：
2-1)以氯金酸溶液和柠檬酸钠为原料制备胶体AuNP(本实施例中其直径为13nm)：将96mL H2O和4mL 1％HAuCl4溶液混合搅拌加热至沸腾，快速加入10mL 0.1141g柠檬酸钠，煮沸15min，之后冷却搅拌15min；
2-2)PDDA功能化CNT(碳纳米管)的制备：将CNT分散在超纯水中，浓度为1.0mgmL-1，使用体积比为3:1的硫酸、HNO3混合液对其进行超声波处理2h，以获得羧基官能化CNT；然后，将1.0mL羧基官能化CNT溶液分散到5mL的1wt％PDDA水溶液中，并进行超声处理1h，以获得均匀的CNT；之后通过16000rpm离心15min，去除残留的PDDA，用超纯水洗涤沉淀3次，得到PDDA功能化CNT；
2-3)将1.0mL PDDA功能化CNT分散到5.0mL制备好的胶体AuNP中并超声处理10分钟，16000rpm离心10min，获得CNT-AuNP复合材料，再用水冲洗，制成1.0mg/mL的水溶液。
3)制备金纳米簇(AuNC)：将0.15mL 100mM谷胱甘肽(GSH)溶液加入洁净的10mL样品瓶中，用超纯水稀释至5mL，剧烈搅拌下，加入0.5mL20mM的氯金酸溶液，在70℃恒温水浴锅中反应24h，反应完成后，自然冷却至室温，透析48h(Mw＝1000)除去未反应杂质，冻干保存。
4)电极修饰：：
4-1)将饱和甘汞电极先后用0.3μM和0.05μM Al2O3粉末抛光，之后先后在酒精和超纯水中超声，最后用N2吹干；
4-2)滴5μL步骤2)制得的CNT-AuNP于电极上，自然干燥；之后滴加5μL步骤1)制得的H-g-C3N4，自然干燥；
4-3)滴加20μL 1mg/mL EDC/NHS于电极上，活化材料表面羧基，而后将过量的氨基修饰的DNA-1(50μL 1.00×10-4mol/mL)滴于活化的底物电极表面，在4℃下孵育过夜，使DNA-1通过酰胺键与底物电极结合；
4-4)用DEPC水冲洗电极后，加入连接有DNA-2的金纳米簇，孵育2h；最后将20μL含2mM MCH和1％BSA的溶液滴在电极上，在室温下孵育1小时，以封闭非特异性结合位点，用DEPC水冲洗后待用。
其中，所述DNA-1结构为：5’-NH2-ATACCAATATCCGCTTTAT-3’；
所述DNA-1结构为：3’-TATGGTTATAGGCGAAATA-SH-5’。
参照图1为该实施例中的H-g-C3N4的TEM图。
参照图2为该实施例中的金纳米簇的TEM图。
参照图3为该实施例中的碳纳米管复合金纳米颗粒的TEM图。
参照图4为该实施例中的H-g-C3N4的发射光谱和金纳米簇的激发光谱。
参照图5为该实施例中的H-g-C3N4的ECL光强、H-g-C3N4-AuNC传感器的ECL光强和H-g-C3N4-AuNC传感器在100nM DA体系中的ECL光强图。通过测试不同情况下ECL光强，发现电极上未负载AuNC时ECL光强达到12800左右；连上AuNC后，ECL光强降低至约2300；而向体系中引入100nM DA时，ECL光强恢复至约6600。可见“on-off-on”检测策略成功构建。
参照图6为该实施例中的ECL光强变化值与体系中DA浓度对数的线性关系图。在不同多巴胺浓度下测量传感器的ECL光强，可以发现ECL光强变化与多巴胺含量对数值在5nM-10000nM范围内成线性关系。可见设计的传感器对多巴胺响应灵敏。
参照图7为本发明的传感器针对不同物质的响应对比的对比图，其中DA(100nM)，其他(10μM)。通过引入常见干扰物对传感器进行测试，发现传感器对多巴胺的选择性良好。
实施例2
一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测方法，采用实施例1制得的传感器进行多巴胺检测，结合电化学分析手段得出检测结果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (9)

1.一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，该传感器通过先在电极表面修饰CNT-AuNP和H-g-C3N4，再修饰金纳米簇得到，其中，所述H-g-C3N4为碱水解g-C3N4。
2.根据权利要求1所述的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，所述传感器的制备方法具体包括以下步骤：
1)制备H-g-C3N4；
2)制备CNT-AuNP；
3)制备金纳米簇；
4)电极修饰：在电极表面依次修饰CNT-AuNP和H-g-C3N4后，再将金纳米簇修饰在电极表面，得到用于检测多巴胺的传感器。
3.根据权利要求2所述的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，所述步骤4)包括：先将CNT-AuNP滴加在预处理后的电极表面，干燥后滴加H-g-C3N4，干燥后再滴加EDC/NHS，然后滴加氨基修饰的DNA-1，使DNA-1通过酰胺键与电极结合，最后加入连接有DNA-2的金纳米簇，其中，DNA-1与DNA-2可互补配对。
4.根据权利要求3所述的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，所述步骤1)具体包括：将30mg g-C3N4和2.5gNaOH溶于25mL水中，超声1.5h使其分散充分，然后在65℃下搅拌过夜，之后补加1.0gNaOH，再超声2h；将得到的溶液转移到透析袋中，溶液透析持续48小时，每12h换一次水，以除去NaOH，完成后取内液转移至离心管，6500rpm下离心15min，除去颗粒和大片层，保留上清液，得到H-g-C3N4水溶液。
5.根据权利要求4所述的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，所述步骤2)具体包括：
2-1)以氯金酸溶液和柠檬酸钠为原料制备胶体AuNP；
2-2)PDDA功能化CNT的制备：将CNT分散在超纯水中，浓度为1.0mgmL-1，使用体积比为3:1的硫酸、HNO3混合液对其进行超声波处理2h，以获得羧基官能化CNT；然后，将1.0mL羧基官能化CNT溶液分散到5mL的1wt％PDDA水溶液中，并进行超声处理1h，以获得均匀的CNT；之后通过16000rpm离心15min，去除残留的PDDA，用超纯水洗涤沉淀3次，得到PDDA功能化CNT；
2-3)将1.0mL PDDA功能化CNT分散到5.0mL制备好的胶体AuNP中并超声处理10分钟，16000rpm离心10min，获得CNT-AuNP复合材料，再用水冲洗，制成1.0mg/mL的水溶液。
6.根据权利要求5所述的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，所述步骤3)具体包括：将0.15mL 100mM谷胱甘肽溶液加入洁净的样品瓶，用超纯水稀释至5mL，剧烈搅拌下，加入0.5mL 20mM的氯金酸溶液，在70℃恒温水浴锅中反应24h，反应完成后，自然冷却至室温，透析48h除去未反应杂质，冻干保存。
7.根据权利要求6所述的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，所述步骤4)具体包括：
4-1)将饱和甘汞电极先后用0.3μM和0.05μM Al2O3粉末抛光，之后先后在酒精和超纯水中超声，最后用N2吹干；
4-2)滴5μL步骤2)制得的CNT-AuNP于电极上，自然干燥；之后滴加5μL步骤1)制得的H-g-C3N4，自然干燥；
4-3)滴加20μL 1mg/mL EDC/NHS于电极上，活化材料表面羧基，而后将过量的氨基修饰的DNA-1滴于活化的底物电极表面，在4℃下孵育过夜，使DNA-1通过酰胺键与底物电极结合；
4-4)用DEPC水冲洗电极后，加入连接有DNA-2的金纳米簇，孵育2h；最后将20μL含2mMMCH和1％BSA的溶液滴在电极上，在室温下孵育1小时，以封闭非特异性结合位点，用DEPC水冲洗后待用。
8.根据权利要求1所述的基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测传感器，其特征在于，所述DNA-1结构为：5’-NH2-ATACCAATATCCGCTTTAT-3’；所述DNA-1结构为：3’-TATGGTTATAGGCGAAATA-SH-5’。
9.一种基于电致化学发光能量转移的多巴胺检测方法，其特征在于，采用如权利要求1-8中任意一项制得的传感器进行多巴胺检测。
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