CN105319254B

CN105319254B - 一种基于Pt/PdCu‑三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用

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Publication number: CN105319254B
Application number: CN201510837818.3A
Authority: CN
Inventors: 刘媛媛; 马洪敏; 魏琴; 张勇; 吴丹; 李燕
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-04-19
Anticipated expiration: 2035-11-26
Also published as: CN105319254A

Abstract

本发明涉及一种基于Pt/PdCu‑三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用。该传感器采用环糊精功能化的石墨烯作为基底，通过环糊精与抗体的主客体识别作用，实现捕获抗体的固定，然后利用具有良好电化学催化性能的Pt/PdCu‑三维石墨烯复合材料作为检测抗体标记物，构建了一种夹心型免疫传感器，实现了对多种肿瘤标志物的高灵敏检测，对肿瘤标志物的早期诊断具有重要的意义。

Description

一种基于Pt/PdCu-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用。具体是采用三维石墨烯负载Pt/PdCu三元合金中空纳米立方体材料，制备检测多种肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

肿瘤标志物是指存在于人体组织中可检测到的反映肿瘤存在的化学类物质。它们在正常成人组织中含量极低或者不存在，但是在患者体内其含量远远超过在正常成人的含量，他们的存在或量变表明了肿瘤性质，人们以此来了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。肿瘤标志物的快速、灵敏电化学免疫检测为肿瘤早期发现和诊断提供了可能，因此，在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法是十分重要的。

目前肿瘤标志物的临床检测方法已经有很多，如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。电化学免疫传感器是将免疫学方法与电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。

本方法采用溶剂热合成的方法，制备了三维石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方体材料，通过金属与氨键的结合，实现了检测抗体的固定，将三维石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方体材料引入传感器的制备中，构建了一种超灵敏的夹心型免疫传感器。在不使用酶的情况下，三维石墨烯负载Pt/PdCu中空纳米立方体对双氧水有良好的催化能力，并在检测过程中产生了良好的电化学信号，有效降低了传感器的检出限，可用于多种肿瘤标志物的分析。

发明内容

本发明的目的是基于三维石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方体材料，实现了对抗体的多重标记，构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。

本发明的技术方案如下：

1.一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）取6 µL、0.5~1.5 mg·mL^-1 环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）滴加6 µL、5~10 µg·mL^-1的抗体，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（4）滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（5）滴加6 µL、0.0001~30 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（6）取6 µL的Pt/PdCu-三维石墨烯二抗标记物溶液，滴涂于电极表面，置于4 ℃冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三维石墨烯构建的免疫传感器。

2.一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备，所述的Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯溶液，制备步骤如下：

（1）取1.5 mL、5.7~7.7 mg·mL^-1PdCl₂溶液，3.2 mL、7.0~9.0 mg·mL^-1氧化石墨烯溶液，10~20 mg CuSO₄·5H₂O，40~60 mg谷氨酸盐置于250 mL烧杯中，再加入35~45 mL乙二醇，超声，磁力搅拌2 h；用7~9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右；将混合溶液移入50mL高压反应釜中，160 ˚C条件下加热6~8 h，冷却至室温；

（2）将所得物质移入含有15~25 mg谷氨酸盐，0.9 mL、2.5~3.5 mg·mL^-1H₂PtCl₆·6H₂O的乙二醇溶液的烧杯中，用7~9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右，然后移至反应釜，在160 ˚C下反应2.5~3.5 h；

（3）用超纯水洗涤几次，将洗涤后的物质放入冰箱中冷冻结冰，最后用冷冻干燥机干燥得到Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯。

3.一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备，用于各种肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站连接饱和甘汞电极，铂丝电极，制备的免疫传感器电极，底液为10 mL、pH值为7.0的PBS缓冲溶液；

（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔 0.1 s，运行时间200 s；

（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL的 PBS中注入10 μL 5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流变化；

（4）根据所得电流强度与肿瘤标志物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

4.本发明所述的肿瘤标志物选自以下之一：鳞状癌细胞抗原(SCCA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、乳腺癌易感基因（CAl5-3）、卵巢癌糖类抗原（CA125）、***特异性抗原(PSA)。

本发明的有益成果

（1）利用溶剂热方法合成的三维石墨烯负载Pt/PdCu三元合金中空纳米立方体复合材料，比表面积大，可以有效地捕获更多的检测抗体，而且还保留了良好的催化性能；

（2）利用环糊精功能化的石墨烯纳米复合材料具有高的导电性、良好的生物相容性，大的比表面积，良好的分散性和高的分子识别能力；

（3）利用环糊精与捕获抗体主客体分子识别作用，实现了抗体的固定，有效地防止检测过程中标记物的脱落；

（4）本发明制备的电化学免疫传感器用于多种肿瘤标志物的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。

具体实施方式

实施例1 一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备

将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

取6 µL、0.5 mg·mL^-1环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

滴加6 µL、5 µg·mL^-1的抗体，晾干后超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；

滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

滴加6 µL、0.0001~30 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液，晾干后超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；

取6 µL的Pt/PdCu-三维石墨烯二抗标记物溶液，滴涂于电极表面，置于4 ℃冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三维石墨烯构建的免疫传感器。

实施例2 一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备

取6 µL、1.0 mg·mL^-1环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

滴加6 µL、7.5 µg·mL^-1的抗体，晾干后超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；

实施例3 一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备

取6 µL、1.5 mg·mL^-1环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

滴加6 µL、10 µg·mL^-1的抗体，晾干后超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；

实施例4 Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯溶液的制备

（1）取1.5 mL、5.7 mg·mL^-1PdCl₂溶液，3.2 mL、7.0 mg·mL^-1氧化石墨烯溶液，10mg CuSO₄·5H₂O，40 mg谷氨酸盐置于250 mL烧杯中，再加入35 mL乙二醇，超声，磁力搅拌2h；用7 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右；将混合溶液移入50 mL高压反应釜中，160 ˚C条件下加热6 h，冷却至室温；

（2）将所得物质移入含有15 mg谷氨酸盐，0.9 mL、2.5 mg·mL^-1 H₂PtCl₆·6H₂O的乙二醇溶液的烧杯中，用7 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右，然后移至反应釜，在160˚C下反应2.5 h；

实施例5 Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯溶液的制备

（1）取1.5 mL、6.7 mg·mL^-1PdCl₂溶液，3.2 mL、8.0 mg·mL^-1氧化石墨烯溶液，15mg CuSO₄·5H₂O，50 mg谷氨酸盐置于250 mL烧杯中，再加入40 mL乙二醇，超声，磁力搅拌2h；用8 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右；将混合溶液移入50 mL高压反应釜中，160 ˚C条件下加热7 h，冷却至室温；

（2）将所得物质移入含有20 mg谷氨酸盐，0.9 mL、3.0 mg·mL^-1 H₂PtCl₆·6H₂O的乙二醇溶液的烧杯中，用8 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右，然后移至反应釜，在160˚C下反应3 h；

实施例6 Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯溶液的制备

（1）取1.5 mL、7.7 mg·mL^-1PdCl₂溶液，3.2 mL、9.0 mg·mL^-1氧化石墨烯溶液，20mg CuSO₄·5H₂O，60 mg谷氨酸盐置于250 mL烧杯中，再加入45 mL乙二醇，超声，磁力搅拌2h；用9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右；将混合溶液移入50 mL高压反应釜中，160 ˚C条件下加热8 h，冷却至室温；

（2）将所得物质移入含有25 mg谷氨酸盐，0.9 mL、3.5 mg·mL^-1 H₂PtCl₆·6H₂O的乙二醇溶液的烧杯中，用9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右，然后移至反应釜，在160˚C下反应3.5 h；

实施例7 电化学免疫传感器用于鳞状癌细胞抗原的检测

（1）使用电化学工作站连接饱和甘汞电极，铂丝电极，制备的免疫传感器电极，底液为10 mL、pH 5.5 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；

（4）根据所得电流强度与鳞状癌细胞抗原浓度之间的线性关系，绘制工作曲线，测得线性范围为0.1 pg/mL ~ 30 ng/mL，检测限为 0.025 pg/mL。

实施例8 电化学免疫传感器用于癌胚抗原的检测

绘制工作曲线步骤同实施例7，按照绘制工作曲线的方法进行癌胚抗原样品分析，测得线性范围为0.1 pg/mL ~ 25 ng/mL，检测限为 0.025 pg/mL。

实施例9电化学免疫传感器用于甲胎蛋白的检测

绘制工作曲线步骤同实施例7，按照绘制工作曲线的方法进行甲胎蛋白样品分析，测得线性范围为0.5 pg/mL ~ 30 ng/mL，检测限为 0.13 pg/mL。

Claims

（1）Pt/PdCu-三维石墨烯的制备

取1.5 mL、5.7~7.7 mg·mL^-1PdCl₂溶液，3.2 mL、7.0~9.0 mg·mL^-1氧化石墨烯溶液，10~20 mg CuSO₄·5H₂O，40~60 mg谷氨酸盐置于250 mL烧杯中，再加入35~45 mL乙二醇，超声，磁力搅拌2 h；用7~9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右；将混合溶液移入50 mL高压反应釜中，160 ˚C条件下加热6~8 h，冷却至室温；

将所得物质移入含有15~25 mg谷氨酸盐，0.9 mL、2.5~3.5 mg·mL^-1 H₂PtCl₆·6H₂O的乙二醇溶液的烧杯中，用7~9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右，然后移至反应釜，在160 ˚C下反应2.5~3.5 h；

用超纯水洗涤几次，将洗涤后的物质放入冰箱中冷冻结冰，最后用冷冻干燥机干燥得到Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯；

（2）电化学免疫传感器的制备

①将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

②取6 µL、0.5~1.5 mg·mL^-1环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

③ 滴加6 µL、5~10 µg·mL^-1的肿瘤标志物抗体，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

④ 滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑤ 滴加6 µL、0.0001~30 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

⑥ 取6 µL的Pt/PdCu-三维石墨烯二抗标记物溶液，滴涂于电极表面，置于4 ℃冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三维石墨烯构建的免疫传感器；

⑦ 使用电化学工作站连接饱和甘汞电极，铂丝电极，制备的免疫传感器电极，检测底液为10 mL、pH值为7.0的PBS缓冲溶液，用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4V，取样间隔 0.1 s，运行时间200 s；

⑧ 当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL的PBS中注入10 μL 5 mol/L的双氧水溶液，然后记录电流变化，根据所得电流强度与肿瘤标志物浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

2.根据权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其中所述的肿瘤标志物选自以下之一：鳞状癌细胞抗原、癌胚抗原、甲胎蛋白、乳腺癌易感基因、卵巢癌糖类抗原、***特异性抗原。