CN102818826A - 基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器及其制备方法，在金电极的表面通过Au-S化学键固定纳米AgBSA微球，纳米AgBSA微球通过共价键合叶酸分子。与传统的电化学生物传感器相比，本发明的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的应用具有如下优点：用于检测肿瘤细胞，具有良好的生物相容性、电化学响应、宽的检测范围、较高的检测灵敏度，并可区分一定浓度下的癌细胞和正常细胞；而且本发明的制备方法具有快速、简便、稳定、成本低的优点，并且对环境无污染。

Description

基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备。

背景技术

癌症是威胁人类健康的重大疾病之一。癌症所导致的死亡主要是由于癌细胞的生长和***速度高于正常细胞，并可转移至其他组织。目前世界上仍缺乏有效的治疗手段来攻克癌症。实现对癌症有效的早期诊断对后期的治疗有着十分重要的意义。然而现代诊断技术大多数都存在着仪器设备昂贵、操作流程复杂、耗时较长等不足。因此，发展一种低成本、快速、简便的生物传感器对癌细胞进行准确、灵敏地检测，对保护人类健康有着相当重大的现实意义。随着纳米科学技术的快速发展，选择合适的纳米复合材料，是制备高性能的生物传感器的关键所在。

发展纳米材料的生物仿生合成是一条极具潜力的绿色合成途径，符合绿色纳米科学和环境健康发展的内在需求。具备良好生物相容性的纳米材料是其能否广泛用于生物医学的基本前提，生物仿生合成有望对实现该前提提供保证。牛血清白蛋白（BSA）是一种球状蛋白，在生物体血清中大量存在，被广泛用于生物纳米技术中，如聚合酶链式反应(PCR),药物递送，分子影像，分子自组装，金属纳米粒子的辅助合成等。银纳米粒子在光电、催化、分子检测、生物医学等领域有着广阔的应用前景。叶酸受体（FR）在大多数肿瘤细胞表面高度表达(如卵巢、结肠、乳腺、***、鼻咽、脑等的癌细胞)，然而在正常组织中不表达或者极少量地分布，基于叶酸（FA）与叶酸受体之间具有很强的亲和力，叶酸可作为俘获肿瘤细胞的靶向分子。本发明利用单一组份的BSA替代有毒的表面活性剂和复杂的植物溶液，在水相体系中，合成得到表面包覆BSA的银纳米粒子组装的微球，并在金电极导电基底上构筑AgBSA纳米仿生界面，为细胞的固定和增殖提供良好的生物相容环境。利用AgBSA微球良好的生物安全性、导电性等优良性能，并通过在仿生界面上引入靶向分子，以提高生物传感器的检测灵敏度和靶向识别功能。

发明内容

本发明的目的在于一种基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器，以低成本、快速、简便地实现对癌细胞进行准确、灵敏地检测。

本发明的技术方案如下：

一种基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器，其特征在于，金电极的表面通过Au-S化学键固定纳米AgBSA微球，纳米AgBSA微球通过共价键合叶酸分子。

上述电化学细胞传感器的制备包括以下步骤：

（1）纳米AgBSA微球的制备：将BSA溶液与AgNO₃溶液按照BSA：AgNO₃为1:1-2的质量比混合均匀，氮气保护静置保存2-3h，搅拌下加入过量的水合肼，陈化10-24h，离心分离，将所得固体洗涤，在0-4℃下冷冻干燥，得纳米AgBSA微球；

（2）AgBSA修饰电极的制备：将步骤（1）所得纳米AgBSA微球分散于蒸馏水中形成1-2mg/mL的水分散液，按照0.1-0.15mL/cm²滴至经抛光和清洗的金电极表面，置于0-4℃下冷冻干燥，得AgBSA修饰电极；

（3）基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备：将经羧基活化处理的叶酸溶液滴至步骤（2）所得AgBSA修饰电极上，置于0-4℃下冷冻干燥，过夜，用PBS溶液冲洗，得对肿瘤细胞具有靶向识别的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器。

步骤（2）中所述清洗的步骤为：将金电极在蒸馏水和乙醇的混合溶液中超声3-5min，用氮气吹干；所述蒸馏水为二次蒸馏水，蒸馏水与乙醇的体积比优选为1:1。

步骤（3）中所述羧基活化处理的方法为：将叶酸（FA）按照1-2g/L的固液比溶解于DMSO中，然后向上述叶酸溶液中加入EDC和NHS，摇床反应3-4h，FA:EDC:NHS的质量比为8:4-5:4-5，优选8:5:5。

步骤（3）中按照50-100μL/cm²向AgBSA修饰电极上滴加叶酸溶液。

本发明将BSA模板法合成的银微球作为仿生材料，通过Au-S化学键固定到金电极表面，构筑生物相容性良好的仿生界面，再通过共价键合作用将叶酸分子负载到AgBSA微球表面，形成对肿瘤细胞具有靶向识别功能的电化学细胞传感器。通过电化学交流阻抗技术测试表明，该电化学细胞传感器对肿瘤细胞具有高检测灵敏度和靶向性，为肿瘤早期检测及细胞的筛选提供了新的方法。

与传统的电化学生物传感器相比，本发明的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的应用具有如下优点：用于检测肿瘤细胞，具有良好的生物相容性、电化学响应、宽的检测范围、较高的检测灵敏度，并可区分一定浓度下的癌细胞和正常细胞；而且本发明的制备方法具有快速、简便、稳定、成本低的优点，并且对环境无污染。

附图说明

图1是本发明实施例制备的纳米AgBSA微球的SEM图。

图2是Zeta电位表征图，其中a为AgBSA的电位(+4.73mV)，b为FA/AgBSA的电位（-9.23mV）。

图3为基于AgBSA的电化学细胞传感器对正常细胞HFL-I定量检测的交流阻抗图谱。(a)裸金电极，(b)FAAgBSA修饰的金电极，不同浓度的HFL-I细胞在FA/AgBSA修饰的金电极表面增殖2h：(c)5.2×10³，(d)5.2×10⁴，(e)5.2×10⁵，(f)5.2×10⁶，(g)5.2×10⁷cells mL^-1。内插图：基于AgBSA的电化学细胞传感器对正常细胞HFL-I定量检测的校准曲线。

图4为基于AgBSA的电化学细胞传感器对癌细胞KB定量检测的交流阻抗图谱。(a)裸金电极，(b)FA/AgBSA修饰的金电极，不同浓度的KB细胞在FA/AgBSA修饰的金电极表面增殖2h：(c)6.0×10¹，(d)6.0×10²，(e)6.0×10³，(f)6.0×10⁴，(g)6.0×10⁵，(h)6.0×10⁶，(i)6.0×10⁷，(j)1.2×10⁸cellsmL^-1。内插图：基于AgBSA的电化学细胞传感器对癌细胞KB定量检测的校准曲线。

具体实施方式

实验试剂：硝酸银（AgNO₃,AR）、无水乙醇（CH₃CH₂OH,AR）、水合肼（N₂H₄·H₂O）购买自上海化学试剂品有限公司。牛血清白蛋白（BSA,纯度>99.8%，分子量68000）购买自厦门星隆达化学试剂有限公司。叶酸（FA）、乙基-（3-二甲基丙基）碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰256亚胺(NHS)、二甲亚砜（DMSO）购买自Sigma-Aldrich公司。试验所用水为去离子水（18.2MΩ）。

实施例：

（1）AgBSA微球的制备：

向10mL的BSA水溶液中（3mg mL^-1），加入5mL硝酸银溶液(0.05mol/L)，混合均匀，并在室温下剧烈搅拌10min；将所得溶液抽真空，用氮气静置保存2～3h。在剧烈搅拌条件下,迅速加入0.2mL的水合肼，反应30min。待完全反应后，陈化过夜。将产物进行离心分离，得到黑色固体。用蒸馏水和乙醇分别洗涤3-5次，冷冻干燥过夜，得AgBSA微球。

其SEM图如图1所示，由图可见所得AgBSA仿生复合材料形貌均一，粒径主要在300-500nm。

该微球具有亲水性、化学稳定性和生物兼容性，适宜用于细胞的固定及生物分子的交联。

（2）AgBSA修饰电极的制备：

首先分别用1，0.3，0.05μm Al₂O₃抛光粉将金电极（直径2.0mm）抛光；然后将金电极在二次蒸馏水和乙醇（体积比1:1）混合溶液中超声3min，以除去残余在金电极表面的Al₂O₃颗粒；最后将处理好的电极用高纯N₂吹干。

AgBSA修饰电极的制备过程如下：

取3μL的AgBSA微球水分散液(1.5mg mL^-1)，滴至处理好的金电极表面，放置于4℃冰箱中冷冻干燥。

（3）FA/AgBSA修饰电极的制备：

制备原理：羧基与氨基的酰胺化耦合反应。

首先将4mg的FA溶解于2mL的DMSO中，然后将2.5mg的EDC和2.5mg的NHS加入上述叶酸溶液中，摇床反应3h，以活化FA的羧基；取2μL已活化羧基的FA溶液滴加至AgBSA修饰电极上，通过FA表面的羧基与AgBSA表面的氨基进行酰胺化耦合反应；最后将上述修饰电极放置于4℃冰箱中冷冻干燥，过夜，用PBS溶液进行冲洗，以去除未稳定结合的FA。

图2的Zeta电位图证明了叶酸通过酰胺键成功地结合到AgBSA微球的表面。

将处于对数生长期的肿瘤细胞（如KB细胞）稀释成不同浓度的细胞悬液，用上述传感器进行细胞俘获，在恒温培养箱中培育2h，采用电化学交流阻抗技术对不同浓度的KB细胞进行定量检测，作为对照实验，在相同实验条件下用该传感器对正常细胞（如HFL-I细胞）进行测定。

KB细胞和HFL-I细胞的培养：

KB口腔表皮样癌细胞株和HFL-I人胚肺成纤维细胞株购自中科院上海细胞库。

KB细胞在含10%小牛血清的MEM（Gibco）培养基中培养。HFL-I细胞在含10%小牛血清的α-MEM(Thermo)培养基中培养。上述培养基中均含100μg mL^-1的青链霉素。细胞培养环境为5%CO₂的37℃恒温培养箱。实验选用对数生长期细胞。

KB细胞和HFL-I细胞悬液的制备：

取对数生长期的KB细胞和HFL-I细胞，用0.25%的胰酶溶液进行细胞消化。将上述含细胞的培养基在1200rpm离心分离6min，并用无菌pH7.4的PBS溶液清洗2次。所得沉淀物分散于0.5mL无菌pH7.4的PBS（10mM）中，得细胞悬液。经细胞计数，得KB细胞浓度为1.2×10⁸cells mL^-1，HFL-I细胞浓度为5.2×10⁷cells mL^-1。用上述PBS溶液逐级稀释，可得不同浓度的细胞悬液。

FA/AgBSA修饰电极对HFL-I细胞和KB细胞的定量检测

首先将FA/AgBSA修饰电极经过紫外杀菌后，将不同浓度的细胞悬液分别滴至FA/AgBSA修饰电极表面，恒温37℃培育2h。再将修饰电极用PBS溶液轻轻冲洗，以去除未吸附的细胞和死细胞，用于电化学定量检测。

通过电化学交流阻抗技术测定显示，该细胞传感器对HFL-I细胞的检测范围为5.2×10⁴～5.2×10⁶cells mL^-1，而对KB细胞的检测范围为6.0×10¹～1.2×10⁸cells mL^-1，检测下限为20cells mL^-1。如图3、图4所示，表明该传感器适用于癌细胞的定量检测，具有宽的检测范围和低的检测限。并且在细胞浓度达10³cells mL^-1时，该传感器可用于区分癌细胞和正常细胞。

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器，其特征在于，金电极的表面通过Au-S化学键固定纳米AgBSA微球，纳米AgBSA微球通过共价键合叶酸分子。

2.权利要求1所述的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）纳米AgBSA微球的制备：将BSA溶液与AgNO₃溶液按照BSA：AgNO₃为1:1-2的质量比混合均匀，氮气保护静置保存2-3h，搅拌下加入过量的水合肼，陈化10-24h，离心分离，将所得固体洗涤，在0-4℃下冷冻干燥，得纳米AgBSA微球；

（2）AgBSA修饰电极的制备：将步骤（1）所得纳米AgBSA微球分散于蒸馏水中形成1-2mg/mL的水分散液，按照0.1-0.15mL/cm²滴至经抛光和清洗的金电极表面，置于0-4℃下冷冻干燥，得AgBSA修饰电极；

（3）基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备：将经羧基活化处理的叶酸溶液滴至步骤（2）所得AgBSA修饰电极上，置于0-4℃下冷冻干燥，过夜，用PBS溶液冲洗，得对肿瘤细胞具有靶向识别的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器。

3.权利要求2所述的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述清洗的步骤为：将金电极在蒸馏水和乙醇的混合溶液中超声3-5min，用氮气吹干；所述蒸馏水为二次蒸馏水，蒸馏水与乙醇的体积比为1:1。

4.权利要求2所述的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述羧基活化处理的方法为：将叶酸（FA）按照1-2g/L的固液比溶解于DMSO中，然后向上述叶酸溶液中加入EDC和NHS，摇床反应3-4h，FA:EDC:NHS的质量比为8:4-5:4-5。

5.权利要求4所述的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，FA:EDC:NHS的质量比为8:5:5。

6.权利要求2所述的基于纳米AgBSA仿生界面的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中按照50-100μL/cm²向AgBSA修饰电极上滴加叶酸溶液。

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