CN109913523A - 一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基，属于发酵工程技术领域。利用本发明的培养基配方配置得到不同氮源的培养基，在不同氮源的培养基中，青春双歧杆菌Z25和两歧双歧杆菌F35菌浓最高时发酵液的pH值不低于4.5、葡萄糖含量不低于2.0g/L，且培养基的渗透压在300～400mOsm/kg，说明菌体停止生长是因为氮源中有效氮源被完全利用结束，而不是因为碳源缺乏或酸抑制或渗透压抑制。据此，可清晰地判断出菌株利用不同氮源的生长速率和利用单位质量不同氮源的增菌量。解决了传统分批培养酸抑制、底物缺乏抑制或渗透压抑制以及发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源渗透压抑制而无法精确分析有效氮源的筛选的难题。

Description

一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基

技术领域

本发明涉及一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基，属于发酵工程技术领域。

背景技术

双歧杆菌广泛存在于动物和人体肠道中，是肠道微生物中非常重要的菌属，近些年来双歧杆菌的益生性得到国内外大量的关注和研究，已经成为了非常重要的益生菌。但是，目前成功商业化的双歧杆菌菌株种类少，产品形式较乳杆菌商业产品多样性低，且活菌含量也低。双歧杆菌产品价格亦非常昂贵，其冻干粉的价格是乳杆菌的几倍。这是因为双歧杆菌的制备非常困难，大部分双歧杆菌的耐渗透压能力均不高，意味着氮源中不被菌株利用的物质会增加发酵液渗透压从而对菌体生长产生负面影响，限制了菌体的最终增殖浓度，其中氮源的利用是制约其发酵生产的关键因素之一。

目前国内外对于氮源的筛选均基于分批培养方式，通过单因素试验和正交实验筛选优质的氮源。但是双歧杆菌严格厌氧生长，不具有呼吸链***，只能依靠底物水平磷酸化来获取能量。双歧杆菌通过分解碳源产生ATP，生长至一定时间，菌株就会因缺乏碳源而停止生长。双歧杆菌通常分解一分子的葡萄糖产生2.5分子的ATP，代谢产物为1.5分子的乙酸和1分子的乳酸，H⁺是限制双歧杆菌生长的主要因素。此外，分批培养方式氮源的添加量往往是过量的，双歧杆菌生长至最大量时可能是因为pH的降低(酸抑制)或碳源缺乏，氮源中可被利用的有效氮成分并未被完全利用。同时，通过测定OD值判断菌浓的高低亦存在弊端，在双歧杆菌增殖培养基优化的过程中因为碳氮不合适等会导致菌的其他代谢产物(如多糖)的产生，导致OD值很高，但活菌数不高。发明人曾采用发酵罐通过恒pH补糖培养，解除了双歧杆菌生长代谢中产生的酸抑制和碳源不足，能够准确分析出双歧杆菌利用每种氮源的增殖效率。但是该方法引入了发酵罐的使用，耗费较大量的时间和人力，此外由于双歧杆菌耐渗透压能力较差，发酵罐恒pH补糖培养中生长至最高点时渗透压过大，会大大抑制菌株的生长，因此，发酵罐恒pH补糖培养不利于氮源的快速、高效、准确筛选。基于此，亟需发明一种能够快速高效准确的筛选双歧杆菌氮源的方法。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种可用于筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基，所述培养基的组成为：氮源1～2g/L，葡萄糖3～8g/L，缓冲盐10～30g/L，七水合硫酸镁0.10～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5～1.0g/L，吐温-80 0.5～1.0mL/L。

在一种实施方式中，所述缓冲盐为：磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸钾或磷酸钠中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述培养基的组成具体为：葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄7.0g/L，Na₂HPO₄ 7.0g/L，MgSO₄·7H2O 0.25g/L，MnSO₄·H2O 0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1.0g/L，吐温-80 1mL/L。

本发明的第二个目是提供一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将不同氮源分别替换MRS培养基中的所有氮源，配制成不同氮源的培养基；

(2)将双歧杆菌种子液接种到不同氮源的培养基中进行厌氧增殖培养，调节培养基的氮源为1～2g/L，碳源为3～8g/L，缓冲液种类为钠盐或钾盐缓冲液，缓冲液浓度为10～30g/L；

(3)计算双歧杆菌利用单位质量的不同氮源的增殖量，单位质量增殖量相对越高的氮源越适宜双歧杆菌增殖；所述单位质量增殖量为双歧杆菌生长至稳定期的OD₆₀₀值除以培养基中氮源的含量。

在一种实施方式中，所述培养基的组成为：氮源1～2g/L，葡萄糖3～8g/L，缓冲盐10～30g/L，七水合硫酸镁0.10～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5～1.0g/L，吐温-80 0.5～1.0mL/L。

在一种实施方式中，所述培养基的组成具体为：葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄7.0g/L，Na₂HPO₄ 7.0g/L，MgSO₄·7H2O 0.25g/L，MnSO₄·H2O 0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1.0g/L，吐温-80 1mL/L。

在一种实施方式中，所述增殖培养具体为：以1～5％的接种量将双歧杆菌种子液分别接入不同氮源的培养基进行培养，待菌浓不再升高，停止培养。

在一种实施方式中，所述双歧杆菌种子液的制备为：挑取双歧杆菌单菌落，接种于MRS液体培养基中活化培养18～24h，将活化1次的双歧杆菌培养液以1～5％的接种量接种至MRS液体培养基，继续活化培养18～24h，得到双歧杆菌种子液。

在一种实施方式中，所述双歧杆菌包括：青春双歧杆菌、长双歧杆菌亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、假小链双歧杆菌。

在一种实施方式中，所述氮源包括：鱼骨蛋白胨、酵母提取物、酵母蛋白103、大豆蛋白胨、安琪蛋白胨、干酪素、酵母浸粉803、酵母浸粉528、水解植物蛋白、胰蛋白胨、胰酪蛋白胨、食品级水解植物蛋白、乳清蛋白粉、大豆蛋白粉、鱼蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏、骨胶原蛋白胨、食品级干酪素、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基，所述培养基的组成为：氮源1～2g/L，葡萄糖3～8g/L，缓冲盐10～30g/L，七水合硫酸镁0.10～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5～1.0g/L，吐温-80 0.5～1.0mL/L。优选的培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄ 7.0g/L，Na₂HPO₄ 7.0g/L，MgSO₄·7H₂O0.25g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1.0g/L，吐温-80 1mL/L。

(2)利用本发明的培养基配方配置得到不同氮源的培养基，在不同氮源的培养基中，青春双歧杆菌Z25和两歧双歧杆菌F35菌浓最高时发酵液的pH值不低于4.5、葡萄糖含量不低于2.0g/L，同时培养基的渗透压在300～400mOsm/kg，说明菌体停止生长是因为氮源中有效氮源被完全利用结束，而不是因为碳源缺乏或酸抑制或渗透压抑制。据此，可清晰地判断出菌株利用不同氮源的生长速率和利用单位质量不同氮源的增菌量。解决了传统分批培养酸抑制、底物缺乏抑制或渗透压抑制以及发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源渗透压抑制导致的无法精确分析有效氮源的筛选的难题。

生物材料

本发明的青春双歧杆菌Z25已经于专利《一种青春双歧杆菌及其用途》(CN107699517A)(公开日：2018-02-16)中公开。

本发明的两歧双歧杆菌F35已经于专利《一种两歧双歧杆菌及其用途》(CN106834187A)(公开日：2017-06-13)中公开。

附图说明

图1：青春双歧杆菌Z25利用不同氮源发酵罐恒pH补糖培养生长曲线。

图2：青春双歧杆菌Z25快速筛选氮源培养基方案；(a)为青春双歧杆菌Z25在氮源1.0g/L，葡萄糖5.0g/L的生长曲线；(b)为青春双歧杆菌Z25在氮源1.0g/L，葡萄糖5.0g/L培养基的pH变化；(c)为青春双歧杆菌Z25在氮源1.0g/L，葡萄糖5.0g/L培养基中的剩余葡萄糖含量(g/L)。

图3：青春双歧杆菌Z25利用实施例1中培养基的生长曲线。

图4：青春双歧杆菌Z25利用实施例1中培养基生长的培养液pH变化曲线。

图5：青春双歧杆菌Z25利用实施例1中培养基生长的培养液中葡萄糖变化曲线

图6：两歧双歧杆菌F35利用不同氮源发酵罐恒pH补糖培养生长曲线。

图7：两歧双歧杆菌F35利用实施例2中培养基的生长曲线。

图8：两歧双歧杆菌F35利用实施例2中培养基生长的培养液pH变化曲线。

图9：两歧双歧杆菌F35利用实施例2中培养基生长的培养液中葡萄糖变化曲线。

具体实施方式

(1)葡萄糖的测定：采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定发酵液中的葡萄糖浓度，按照葡萄糖测定试剂盒的指导，具体操作如下：等体积混合试剂1和试剂2，分装成1mL的测试管，样品管加入10μL待测样品，标准管加入10μL葡萄糖标准液，空白管加入10μL蒸馏水。37℃水浴10min，用空白管调0测定样品管和标准管在505nm下的吸光度，通过以下公式计算得到葡萄糖的浓度：

(2)最大生物量的测定：紫外检测器的检测波长设定为600nm，测定菌液的OD₆₀₀值，当吸光度值超过0.8时，将菌悬液稀释一定倍数，使稀释后的吸光度值在0.2～0.8之间，菌悬液的OD₆₀₀值为测定的吸光度值乘以稀释倍数。

(3)pH测定：pH采用精密pH计进行测量。

(4)渗透压的测定：发酵液离心后取100μL用渗透压测定仪直接测定。

(5)恒pH 6.0自动反馈补糖：分别配制400g/L(C碱)的氢氧化钠溶液和400g/L(C糖)的葡萄糖溶液，并分别置于补碱瓶和补糖瓶。开启发酵罐补糖与补碱的关联***关联比例(k)根据以下公式设置：

式中：40，表示氢氧化钠的摩尔分子量，g/mol；W，表示菌株代谢单位质量的葡萄糖产生的酸摩尔数，mol/g。

(6)菌种活化：取冻存的甘油保菌管或冷藏的斜面保菌管，用接种环挑取少量双歧杆菌(青春双歧杆菌Z25或两歧双歧杆菌F35)菌液或菌落于MRS固体培养基划线，将平板置于37℃厌氧恒温培养箱中培养24～48h。从长出的菌落中挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，在恒温37℃厌氧培养箱中活化培养18～24h。

(7)种子液的制备：将活化1次的双歧杆菌(青春双歧杆菌Z25或两歧双歧杆菌F35)培养液以1～5％的接种量接种至MRS液体培养基，在恒温37℃厌氧培养箱中活化培养18～24h。然后离心去除上清液，用无菌生理盐水洗涤一次后，菌泥添加培养液等量的生理盐水重悬菌体，作为氮源筛选培养的种子液。

(8)MRS培养基组成：酵母粉5g/L，无水乙酸钠5g/L，牛肉膏10g/L，无水葡萄糖20～30g/L，蛋白胨10g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，磷酸氢二钾2g/L，一水合硫酸锰0.1g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，吐温-80 1mL/L，调pH为6.0，并额外添加半胱氨酸盐酸盐1.0g/L。

下述实施例中涉及的酵母提取物、酵母浸粉803、酵母浸粉528、酵母蛋白103、大豆蛋白胨、鱼骨蛋白胨均购自安琪酵母有限公司；胰蛋白胨、鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏购自上海创赛科技有限公司；MRS培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；其余化学试剂均是分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1青春双歧杆菌Z25的氮源筛选

(1)传统方法筛选氮源

培养基配制：将25～40g/L不同氮源(酵母提取物、酵母浸粉803、酵母浸粉528、酵母蛋白103、大豆蛋白胨、鱼骨蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏)，分别替换MRS培养基中的所有氮源(胰酪蛋白胨、酵母粉和牛肉膏)，配制成不同氮源的培养基。加热溶解，115℃下灭菌20min。

以2％的接种量接入青春双歧杆菌Z25，置于温度37℃厌氧培养箱中静置培养，待菌株生长至稳定期前后，取样测定OD₆₀₀，当吸光度值超过0.8时，将菌悬液稀释一定倍数，使稀释后的吸光度值在0.2～0.8之间，菌悬液的OD₆₀₀为测定的吸光度值乘以稀释倍数。以MRS为对照，筛选出对菌株增殖效果好的氮源。

表1青春双歧杆菌Z25传统方法氮源筛选的结果

结果表明，培养结束时发酵液的葡萄糖含量均≦1.0g/L，说明各氮源培养基中的葡萄糖几乎全部被利用完全，发酵液pH值已经下降到4.2以下(双歧杆菌耐酸性较差，pH4.2以下抑制生长)(见表1)，说明菌体生长至稳定期时是因为碳源缺乏或酸抑制。氮源可能未被完全利用，菌体利用了多少氮源增殖至现在菌浓未知，无法通过菌株利用单位质量氮源的增殖量，准确地比较分析哪种或哪几种氮源被菌株利用的效率更高。

青春双歧杆菌Z25利用不同氮源生长至稳定期时，菌浓差异不显著，无法较好的区分青春双歧杆菌Z25利用不同氮源的效果，各种不同类型的氮源都能促进青春双歧杆菌Z25的增殖，无法分析菌株对氮源的选择性，因此，需利用恒pH补糖培养减除碳源缺乏和pH过低的抑制。

(2)发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源

培养基配制：采用与步骤(1)中传统分批方法筛选氮源相同的培养基。

发酵：置于biotech-3000 5L×3平行发酵罐(双歧杆菌发酵装置)。以5％的接种量接入青春双歧杆菌Z25，发酵过程中不断的通入氮气，使罐内维持正压。通过发酵***的控制***，恒pH 6.0自动反馈补糖培养，确保菌体在增殖过程中不受到酸和碳源缺乏的抑制。恒pH自动反馈补糖过程中，每2h取样，分别测定菌液OD₆₀₀和发酵液葡萄糖含量。以时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标，绘制菌株在不同氮源下的生长曲线(见图1)。

表2青春双歧杆菌Z25发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源

结果表明，菌株生长至最高点时，葡萄糖含量都在5.0g/L以上，pH为6.0没有抑制菌株生长(pH 4.2以下抑制)(见表2)，培养基其他成分都是充足的，但是通过测定发酵终点时的渗透压，最高渗透压为1200±50mOsm/kg。根据菌株的耐渗透压实验，青春双歧杆菌Z25在1200mOsm/kg渗透压下抑制生长，说明发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源的培养方式不适合双歧杆菌氮源的筛选，培养基中氮源还未耗尽，渗透压就已经抑制菌株生长。

而且发酵罐操作繁琐，工作量巨大，通过发酵罐来筛选大批量氮源需要耗费大量的人力物力财力，对于实验室或工业上实施操作都有很大的挑战。生长至最高点时渗透压严重抑制菌株的生长，对氮源筛选的结果带来很大的影响。

(3)本实施例方法筛选氮源

①缓冲盐的选择

称取不同的氮源(酵母提取物、酵母浸粉803、酵母浸粉528、酵母蛋白103、大豆蛋白胨、鱼骨蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏)1.0g/L，加入其他除了缓冲盐的各组分，混匀溶解，测试最初的渗透压，因为双歧杆菌最适的渗透压范围在300～400mOsm/kg之间，为了保证培养基的渗透压仍然维持在这个范围之内，调节加入的缓冲盐浓度，最终确定为磷酸氢二钾7.0g/L，磷酸氢二钠7.0g/L。

②培养基的碳氮含量

为了确定合适的碳氮含量，将青春双歧杆菌Z25分别接种于不同碳氮含量的优化培养基中进行培养。结果表明：当添加葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L时，青春双歧杆菌Z25生长到最高点时pH在5.0左右(见图2(b))，葡萄糖剩余充足(见图2(c))，此时的渗透压在400mOsm/kg左右，完全不会抑制青春双歧杆菌Z25的生长。

因此确定培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄ 7.0g/L，Na₂HPO₄7.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1.0g/L，吐温-801mL/L。

③确定最适宜双歧杆菌生长的氮源

培养基配制：按步骤②中确定的配方配置不同的氮源(酵母提取物、酵母浸粉803、酵母浸粉528、酵母蛋白103、大豆蛋白胨、鱼骨蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨、牛肉浸粉、牛肉浸膏)培养基。

以2％的接种量接入青春双歧杆菌Z25，置于温度37℃厌氧培养箱中静置培养，每2h取样，一部分样品测定菌液的OD₆₀₀，另一部分样品离心去除菌体后，测定样品中的葡萄糖含量和pH。

表3青春双歧杆菌Z25利用本实施例方法筛选氮源

结果表明，青春双歧杆菌Z25生长到稳定期时，不同氮源的培养基中葡萄糖浓度都是足够的，此时的pH在4.5以上，不足以抑制菌株生长。生长速率被抑制时，单位质量的酵母浸粉528ΔOD值为1.00±0.01，酵母提取物ΔOD值为0.88±0.01，酵母蛋白103ΔOD值为0.75±0.01，酵母浸粉803ΔOD值为0.63±0.02，牛肉浸粉ΔOD值为0.59±0.01，胰蛋白胨ΔOD值0.44±0.01，鱼骨蛋白胨ΔOD值为0.38±0.01，牛骨蛋白胨ΔOD值为0.31±0.01，大豆蛋白胨ΔOD值为0.28±0.01，水解植物蛋白ΔOD值为0.10±0.01，对照MRSΔOD值为1.35±0.01，从结果中可以得知单一氮源对青春双歧杆菌Z25的增殖效果不明显，低于对照MRS；酵母类氮源酵母提取物、酵母浸粉803、酵母蛋白103、酵母浸粉528和牛肉浸粉的效果中等；其次是胰蛋白胨、鱼骨蛋白胨、牛骨蛋白胨；大豆蛋白胨、水解植物蛋白生长情况最差，基本上不能利用这类氮源。

本发明筛选的氮源结果与发酵罐恒pH自动反馈补糖得出的结论不一致，主要因为恒pH自动反馈补糖培养受到了渗透压的抑制，氮源没有被完全利用，而本发明的氮源筛选方法能准确地比较不同氮源对菌株的增殖效率。

实施例2：两歧双歧杆菌F35的氮源筛选

与实施例1中方法相同，不同之处仅在于将菌种换成两歧双歧杆菌F35。

(1)传统方法筛选氮源

表4两歧双歧杆菌F35传统氮源筛选的结果

结果表明，培养结束时发酵液的葡萄糖含量均≦1.0g/L，说明各氮源培养基中的葡萄糖几乎全部被利用完全，发酵液pH值已经下降到3.5～4.2(双歧杆菌耐酸性较差，pH4.2以下抑制生长)(表1)；说明菌体生长至稳定期时是因为碳源缺乏或酸抑制。氮源可能未被完全利用，菌体利用了多少氮源增殖至现在菌浓未知，无法通过菌株利用单位质量氮源的增殖量，准确地比较分析哪种或哪几种氮源被菌株利用的效率更高。

两歧双歧杆菌F35利用不同氮源生长至稳定期时，菌浓差异不显著，无法较好的区分两歧双歧杆菌F35利用不同氮源的效果，相比而言，两歧双歧杆菌F35利用植物类和动物类氮源效果较好。

(2)发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源

表5两歧双歧杆菌F35发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源

根据图6发酵罐恒pH补糖培养得出的结果，可以看出每种氮源之间比生长速率和最大生物量有明显的差异，菌株生长至最高点时，葡萄糖充足，pH 6.0没有抑制菌株生长，培养基其他成分都是充足的，通过测定发酵终点时的渗透压，最高达到了1200±50mOsm/kg。根据菌株的耐渗透压实验，两歧双歧杆菌F35在1200mOsm/kg渗透压下抑制生长。根据图5，适宜两歧双歧杆菌F35增殖的有效氮源分别是牛肉浸粉、鱼骨蛋白胨、牛骨蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨。但是发酵罐恒pH补糖培养筛选氮源的培养方式不适合双歧杆菌氮源的筛选，因为无法确定发酵结束时，两歧双歧杆菌F35停止生长是因为渗透压抑制还是氮源被耗尽。

且发酵罐操作繁琐，工作量巨大，通过发酵罐来筛选大批量氮源需要耗费大量的人力物力财力，对于实验室或工业上实施操作都有很大的挑战。生长至最高点时渗透压严重抑制菌株的生长，对氮源筛选的结果带来很大的影响。

(3)本实施例方法筛选氮源

所采用的培养基配方与实施例1中步骤(3)相同，具体为：葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄ 7.0g/L，Na₂HPO₄ 7.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，MnSO₄·H₂O 0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1.0g/L，吐温-80 1mL/L。

表6两歧双歧杆菌F35本实施例方法筛选氮源

以2％的接种量接入待实验菌株，置于温度37℃厌氧培养箱中静置培养，每2h取样，一部分样品测定菌液的OD₆₀₀，另一部分样品离心去除菌体后，测定样品中的葡萄糖含量和pH，根据图8和图9，两歧双歧杆菌F35停止生长时pH值高于5.0(未完全抑制菌株生长)，葡萄糖含量亦充足。此时的渗透压维持在300～400mOsm/kg之间，不足以抑制菌株生长。单位质量的牛肉浸粉ΔOD值为0.95±0.01，鱼骨蛋白胨ΔOD值为0.90±0.02，大豆蛋白胨ΔOD值为0.81±0.01，牛骨蛋白胨ΔOD值为0.80±0.02，牛肉蛋白胨ΔOD值为0.72±0.01，根据图7，分析适宜两歧双歧杆菌F35增殖的氮源分别是牛肉浸粉、鱼骨蛋白胨、大豆蛋白胨、牛骨蛋白胨、牛肉蛋白胨。

由于传统方法发酵结束时pH和碳源缺乏的抑制，无法准确分析双歧杆菌利用的氮源种类，发酵罐恒pH自动反馈补糖培养又因为发酵结束时渗透压的抑制，无法准确分析双歧杆菌对氮源的选择性，因此，本发明筛选的氮源方法是最有效且最准确的，为筛选对双歧杆菌增殖效率高的氮源提供便利。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种可用于筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的培养基，其特征在于，所述培养基的组成为：氮源1～2g/L，葡萄糖3～8g/L，缓冲盐10～30g/L，七水合硫酸镁0.10～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5～1.0g/L，吐温-80 0.5～1.0mL/L。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述缓冲盐为：磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸钾或磷酸钠中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的组成具体为：葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄ 7.0g/L，Na₂HPO₄ 7.0g/L，MgSO₄·7H2O 0.25g/L，MnSO₄·H2O 0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1.0g/L，吐温-80 1mL/L。

4.一种筛选适宜双歧杆菌增殖的氮源的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将不同氮源分别替换MRS培养基中的所有氮源，配制成不同氮源的培养基；

(2)将双歧杆菌种子液接种到不同氮源的培养基中进行厌氧增殖培养，调节培养基的氮源为1～2g/L，碳源为3～8g/L，缓冲液种类为钠盐或钾盐缓冲液，缓冲液浓度为10～30g/L；

(3)计算双歧杆菌利用单位质量的不同氮源的增殖量，单位质量增殖量相对越高的氮源越适宜双歧杆菌增殖；所述单位质量增殖量为双歧杆菌生长至稳定期的OD₆₀₀值除以培养基中氮源的含量。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基的组成为：氮源1～2g/L，葡萄糖3～8g/L，缓冲盐10～30g/L，七水合硫酸镁0.10～0.30g/L，一水合硫酸锰0.01～0.1g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5～1.0g/L，吐温-80 0.5～1.0mL/L。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基的组成具体为：葡萄糖5.0g/L，氮源1.0g/L，K₂HPO₄ 7.0g/L，Na₂HPO₄ 7.0g/L，MgSO₄·7H2O 0.25g/L，MnSO₄·H2O 0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1.0g/L，吐温-80 1mL/L。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述增殖培养具体为：以1～5％的接种量将双歧杆菌种子液分别接入不同氮源的培养基进行培养，待菌浓不再升高，停止培养。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌种子液的制备为：挑取双歧杆菌单菌落，接种于MRS液体培养基中活化培养18～24h，将活化1次的双歧杆菌培养液以1～5％的接种量接种至MRS液体培养基，继续活化培养18～24h，得到双歧杆菌种子液。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌包括：青春双歧杆菌、长双歧杆菌亚种、长双歧杆菌婴儿亚种、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、假小链双歧杆菌。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述氮源包括：鱼骨蛋白胨、酵母提取物、酵母蛋白103、大豆蛋白胨、安琪蛋白胨、干酪素、酵母浸粉803、酵母浸粉528、水解植物蛋白、胰蛋白胨、胰酪蛋白胨、食品级水解植物蛋白、乳清蛋白粉、大豆蛋白粉、鱼蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏、牛肉浸膏、骨胶原蛋白胨、食品级干酪素、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨。