CN112501074A - 一种保加利亚乳杆菌的高密度发酵培养基及其发酵工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种保加利亚乳杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺。本发明有效解决了发酵过程所用饮用水中的抑制物和代谢产生的乳酸对菌体增殖和后续菌粉制备工艺的影响。采用本发明进行保加利亚乳杆菌高密度培养，其发酵液活菌数和冻干存活率均得到显著提升。因此，该技术的应用有利于保加利亚乳杆菌菌粉生产效率的提升及生产成本的降低。

Description

一种保加利亚乳杆菌的高密度发酵培养基及其发酵工艺
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种保加利亚乳杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺。
背景技术
近年来，随着微生态学研究的不断深入和人们保健意识的增强，国内对乳杆菌开展了研究和开发，乳杆菌被广泛地应用于食品、医药、饲料、畜牧养殖和环保等行业中。保加利亚乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)在分类学上属德氏乳杆菌亚种，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，不运动，无芽孢的兼性厌氧菌。保加利亚乳杆菌是工业生产发酵乳制品最常用的发酵剂菌种之一，其蛋白分解活性和乳糖代谢能力赋予乳制品独特质地和风味的同时，还提高了乳制品的营养价值。此外，保加利亚乳杆菌还具有调节肠道菌群、改善肠道功能、增强免疫及抗癌、抗肿瘤等众多与人体健康息息相关的生理功能。因此，保加利亚乳杆菌在医疗保健领域有着较为广泛的应用前景。
高密度发酵是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，其核心是确保发酵体系中微生物所需营养物质充足和无生长抑制物的存在或积累。由于保加利亚乳杆菌自身比较脆弱，其生长代谢过程极易受到外界环境影响。因此，在确保发酵培养基营养充分的情况下，消除生长抑制物成为实现保加利亚乳杆菌高密度培养的关键。在众多生长抑制物的研究中，作为发酵培养基溶剂的饮用水，由于氯消毒工序而引入的微生物生长抑制物次氯酸往往被忽略。此外，在高密度发酵过程中，常规操作是当发酵液pH降低至生产工艺控制点后，通过罐体的冷却***快速降低发酵液温度以结束发酵培养过程，随后高速离心收集菌体，但保加利亚乳杆菌在生长代谢过程积累的大量乳酸，不仅对菌体自身的生理代谢产生抑制和毒害作用，还对后续菌体离心和冻干过程的活菌存活率产生较大影响。
基于上述影响保加利亚乳杆菌高密度发酵的限制因素，针对性的调整发酵培养基组成及工艺控制参数，成为提升保加利亚乳杆菌发酵活菌数，进而改善离心和冻干存活率最为直接和有效的手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题是消除饮用水中含有的生长抑制物次氯酸和发酵过程产生的乳酸对保加利亚乳杆菌菌体增殖、离心和冻干的影响，提供一种添加硫代硫酸钠的高密度发酵培养基及发酵终点pH回调的过程控制工艺，使其能够显著提高保加利亚乳杆菌发酵活菌数及冻干存活率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种保加利亚乳杆菌高密度发酵培养基，由以下成分组成：葡萄糖10-25g、牛肉浸膏粉4-10g、酪蛋白胨2-10g、酵母粉2-10g、无水乙酸钠2-8g、乙酸钾2-8g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5-2g、硫代硫酸钠0.01-0.5g和吐温-801-3g，依次溶于蒸馏水中并定容到1000ml，培养基pH调至6.80-7.50，在121℃条件下灭菌15min。其中硫代硫酸钠能够将水中含有的次氯酸根还原成无毒的氯离子，从而消除次氯酸对保加利亚乳杆菌生长代谢的抑制作用。
本发明还提供一种保加利亚乳杆菌高密度发酵培养工艺包括如下内容：
①发酵级数：采用五级放大发酵工艺，其各级发酵体积分别为0.1-0.3mL、1-3L、10-30L、100L-300L和1000-3000L。
②过程控制参数：培养温度30-40℃，培养时间6-12h，搅拌转速50-100rpm，罐压0.03-0.05Mpa(氮气)，各级发酵终点pH值控制在4.3-4.7之间，转入下一级培养的接种量控制在1％-10％。
③发酵后处理：保加利亚乳杆菌五级发酵到达终点后，首先将发酵液温度快速降至15-20℃，随后通过补料***缓慢流加30％(w/v)碳酸钠溶液直至发酵液pH回调至6.0-8.0，15-40rpm低速搅拌下维持0.5-2h后离心收集菌体。通过发酵终点的pH回调，消除乳酸对保加利亚乳杆菌生理及代谢的抑制作用，提高菌体活性及后续离心、冻干工序的菌体存活率。
其中，保加利亚乳杆菌菌株优选为保加利亚乳杆菌NQ2508。
本发明通过在冷却发酵液工艺前增加发酵终点pH回调工艺，其主要目的是缓解终点发酵液中酸性物质对菌体的酸胁迫和损伤，保持菌体的高活力状态进而提高后续离心冻干工艺的菌体存活率。
本发明的优点在于通过调整保加利亚乳杆菌发酵培养基和过程控制工艺，解决了发酵过程所用饮用水中的抑制物(次氯酸)和代谢产生的乳酸对菌体增殖和后续菌粉制备工艺的影响，显著提高了保加利亚乳杆菌发酵活菌数和菌粉的冻干存活率，有利于稳定生产，提高生产效率，降低生产成本。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：保加利亚乳杆菌高密度发酵培养基的配置及发酵工艺
保加利亚乳杆菌高密度发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖18.0g、牛肉浸膏粉5.0g、酪蛋白胨4.0g、酵母粉4.0g、无水乙酸钠4g、乙酸钾4.0g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.03g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、硫代硫酸钠0.05g和吐温-80 1.0g，依次溶于蒸馏水中并定容到1000ml，培养基pH调至7.20，在121℃条件下灭菌15min。
保加利亚乳杆菌选取的具体菌株为保加利亚乳杆菌NQ2508，其购自内蒙古双奇药业股份有限公司。保加利亚乳杆菌高密度发酵培养工艺如下：①发酵级数：采用五级放大发酵工艺，其各级发酵体积分别为0.1L、2L、20L、200L和2000L。②过程控制参数：培养温度35℃，培养时间6-12h，搅拌转速60rpm，罐压0.05Mpa(氮气)，各级发酵终点pH值控制在4.50±0.05，转入下一级培养的接种量控制在5％。③发酵后处理：保加利亚乳杆菌五级发酵到达终点后，首先将发酵液温度快速降至15-20℃，随后通过补料***缓慢流加30％(w/v)碳酸钠溶液直至发酵液pH回调至7.0，20rpm低速搅拌下维持1h后离心收集菌体。
实施例2：保加利亚乳杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺
保加利亚乳杆菌高密度发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10.0g、牛肉浸膏粉4.0g、酪蛋白胨8g、酵母粉6.0g、无水乙酸钠3.0g、乙酸钾3.0g、硫酸镁0.3g、硫酸锰0.05g、L-半胱氨酸盐酸盐1.0g、硫代硫酸钠0.01g和吐温-80 1.0g，依次溶于蒸馏水中并定容到1000ml，培养基pH调至7.20，在121℃条件下灭菌15min。其中硫代硫酸钠能够将水中含有的次氯酸根还原成无毒的氯离子，从而消除次氯酸对保加利亚乳杆菌生长代谢的抑制作用。
保加利亚乳杆菌选取的具体菌株为保加利亚乳杆菌NQ2508，其购自内蒙古双奇药业股份有限公司。保加利亚乳杆菌高密度发酵培养工艺包括如下内容：①发酵级数：采用五级放大发酵工艺，其各级发酵体积分别为0.1mL、1.0L、10L、100L和1000L。②过程控制参数：培养温度40℃，培养时间6-12h，搅拌转速60rpm，罐压0.05Mpa(氮气)，各级发酵终点pH值控制在4.6±0.05，转入下一级培养的接种量控制在10％。③发酵后处理：保加利亚乳杆菌五级发酵到达终点后，首先将发酵液温度快速降至15-20℃，随后通过补料***缓慢流加30％(w/v)碳酸钠溶液直至发酵液pH回调至7.20，15rpm低速搅拌下维持2h后离心收集菌体。通过发酵终点的pH回调，消除乳酸对保加利亚乳杆菌生理及代谢的抑制作用，提高菌体活性及后续离心、冻干工序的菌体存活率。
实施例3：硫代硫酸钠对培养基中余氯的处理效果
以未添加硫代硫酸钠发酵培养基为对照，使用碘量法测定饮用水配置培养基后余留的氯浓度。其结果显示添加硫代硫酸钠后培养基中有效氯基本被消除(表1)。通过对培养基组分的改进，从而解决了发酵过程所用饮用水中的抑制物(次氯酸)对菌体增殖和后续菌粉制备工艺的影响。
表1培养基中有效氯浓度的测定
Figure BDA0002837969050000041
实施例4：高密度发酵终点pH、滴定酸度和乳酸含量的测定
保加利亚乳杆菌高密度发酵达到发酵终点后，采用pH计、0.1mol/L NaOH及液相质谱分别测定发酵液pH值、滴定酸度和乳酸含量。其结果显示发酵液终点的滴定酸度和乳酸含量较高，回调至中性后乳酸以乳酸盐形式存在，检测值低于检测下限(表2)，乳酸的下降缓解终点发酵液中酸性物质对菌体的酸胁迫和损伤。
表2终点发酵液pH、滴定酸度和乳酸含量的测定
Figure BDA0002837969050000042
实施例5：高密度发酵活菌数及冻干存活率对比试验
以未添加硫代硫酸钠发酵培养基且发酵终点不进行pH回调工序为对照，考察实施例1和2发酵液活菌数及菌粉的冻干存活率。其试验结果显示(表3)，与对照组相比，实施例1和2中发酵液活菌数和菌粉冻干存活率显著提高。
表3保加利亚乳杆菌发酵活菌数及冻干存活率
Figure BDA0002837969050000043
可见，通过对培养基和发酵工艺的改进，从而解决了发酵过程所用饮用水中的抑制物(次氯酸)和代谢产生的乳酸对菌体增殖和后续菌粉制备工艺的影响，显著提高了保加利亚乳杆菌发酵活菌数和菌粉的冻干存活率，有利于稳定生产，提高生产效率，降低生产成本。

Claims (5)

1.一种保加利亚乳杆菌的高密度发酵工艺，其特征在于，(1)高密度发酵采用五级放大发酵工艺；(2)五级发酵到达终点后，首先将发酵液温度快速降至15-20℃，随后通过补料***缓慢流加30％(w/v)碳酸钠溶液直至发酵液pH回调至6.0-8.0，15-40rpm低速搅拌下维持0.5-2h后离心收集菌体。
2.如权利要求1所述发酵工艺，其特征在于，所述步骤(1)高密度发酵培养基由以下成分组成：葡萄糖10-25g、牛肉浸膏粉4-10g、酪蛋白胨2-10g、酵母粉2-10g、无水乙酸钠2-8g、乙酸钾2-8g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5-2g、硫代硫酸钠0.01-0.5g和吐温-80 1-3g，依次溶于蒸馏水中并定容到1000ml，培养基pH调至6.80-7.50，在121℃条件下灭菌15min。
3.如权利要求1所述发酵工艺，其特征在于，五级发酵体积分别为0.1-0.3L、1-3L、10-30L、100L-300L和1000-3000L。
4.如权利要求1所述发酵工艺，其特征在于，步骤(1)五级发酵工艺过程控制参数分别为：培养温度30-40℃，培养时间6-12h，搅拌转速50-100rpm，罐压0.03-0.05Mpa(氮气)，各级发酵终点pH值控制在4.3-4.7之间，转入下一级培养的接种量控制在1％-10％。
5.如权利要求1所述发酵工艺，其特征在于，所述保加利亚乳杆菌为保加利亚乳杆菌NQ2508。
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