CN111534566A - 一种梯度稀释液及其在双歧杆菌计数中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种梯度稀释液及其在双歧杆菌计数中的应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液，此梯度稀释液的成分包含L‑半胱氨酸盐酸盐、吐温80、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠；使用此梯度稀释液配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数高达2.0×1010CFU/g以上，而使用常规梯度稀释液(例如，生理盐水、缓冲液、无菌水和蛋白胨水等)配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数在2.0×1010CFU/g以下。

Description

一种梯度稀释液及其在双歧杆菌计数中的应用
技术领域
本发明涉及一种梯度稀释液及其在双歧杆菌计数中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
双歧杆菌(Bifidobacterium)是人体所必需的益生菌之一，对人体有着很多益生作用，例如，促进人体对矿物质的吸收；维持人体肠道微生物平衡，抑制人体肠道内致病菌的生长；增强人体免疫机能，降低人体罹患癌症、肥胖、糖尿病、胃肠疾病等疾病的风险；降低人体胆固醇水平；治疗炎症；抗肿瘤；改善人体对乳制品的耐乳糖性，提高人体对乳制品的消化率等。
由于具有显著的益生功效，双歧杆菌越来越成为人们研究、开发、生产的重点。目前，双歧杆菌已被广泛地应用于食品、医药等领域。
双歧杆菌菌粉是市场上最常见的双歧杆菌产品之一，此种产品主要是通过将双歧杆菌菌体进行干燥获得的。对于双歧杆菌菌粉来说，其含有的双歧杆菌活菌数是衡量其质量的重要标准之一。目前，主要通过平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数。
但是，由于双歧杆菌对营养的要求非常苛刻，对氧非常的敏感，对低pH值的抵抗力差，并且，对渗透压的要求也非常高，因此，双歧杆菌在被梯度稀释的过程中会很容易死亡。而使用平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中双歧杆菌活菌数时，对双歧杆菌菌粉进行梯度稀释的步骤必不可少，这无疑大大影响了使用此方法检测双歧杆菌菌粉中双歧杆菌活菌数时的可靠度和准确性，使得利用此方法检测得到的双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数普遍偏低。
因此，急需找到一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液。
[技术方案]
为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种梯度稀释液，所述梯度稀释液的成分包含抗氧化剂0.5～1g/L、表面活性剂0.5～1g/L、磷酸盐10～15g/L和无机盐1～5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐和/或维生素C；所述表面活性剂为吐温80；所述磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和/或磷酸二氢钠；所述无机盐为氯化钠和/或氯化钾。
在本发明的一种实施方式中，所述梯度稀释液的成分包含L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温800.6g/L、磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾4.5g/L和氯化钠5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述梯度稀释液的pH为6.2～7.0、渗透压为280～320Pa。
在本发明的一种实施方式中，所述梯度稀释液的pH为7.0、渗透压为300。
发明还提供了一种对双歧杆菌进行计数的方法，所述方法为将含有双歧杆菌的待测样品用上述梯度稀释液进行稀释，得到稀释液；对稀释液进行活菌计数。
在本发明的一种实施方式中，所述含有双歧杆菌的待测样品为双歧杆菌菌粉。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌为长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述活菌计数的方法为平板活菌计数法。
发明还提供了上述梯度稀释液或上述方法在双歧杆菌计数中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述双歧杆菌为长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌或两歧双歧杆菌。
[有益效果]
(1)本发明提供了一种可显著提高双歧杆菌在被梯度稀释时的存活率的梯度稀释液，此梯度稀释液的成分包含L-半胱氨酸盐酸盐、吐温80、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠；使用此梯度稀释液配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数高达2.0×1010CFU/g以上，而使用常规梯度稀释液(例如，生理盐水、缓冲液、无菌水和蛋白胨水等)配合平板活菌计数法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数在2.0×1010CFU/g以下。
(2)本发明提供了一种可靠度和准确性高的对双歧杆菌进行计数的方法，此方法为先将含有双歧杆菌的待测样品用成分包含L-半胱氨酸盐酸盐、吐温80、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钠的梯度稀释液进行稀释，得到稀释液，再对稀释液进行活菌计数；利用此方法检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数高达2.0×1010CFU/g以上，利用常规方法(即使用常规梯度稀释液的方法)检测双歧杆菌菌粉中的双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数在2.0×1010CFU/g以下。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的氯化钾、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钾、L-半胱氨酸盐酸盐、吐温80、氢氧化钠、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、酵母粉、无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、七水合硫酸镁、一水合硫酸锰均购自国药集团化学试剂有限公司；下述实施例中涉及的长双歧杆菌GDMCC No.60926记载于公开号为CN111206004A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No.60926；下述实施例中涉及的短双歧杆菌GDMCC No.60934记载于公开号为CN110878273A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No.60934；下述实施例中涉及的青春双歧杆菌GDMCC No.60706记载于公开号为CN110331118A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No.60706；下述实施例中涉及的两歧双歧杆菌GDMCC No：60701记载于公开号为CN110331119A的专利申请文本中，保藏编号为GDMCC No：60701。
下述实施例中涉及的试剂如下：
生理盐水：8.5gNaCl溶于1L水。
PBS缓冲液：0.2g氯化钾、1.15g磷酸氢二钠、8g氯化钠和0.2g磷酸二氢钾溶于1L水。
0.1％蛋白胨水：1.0g蛋白胨溶于1L水。
冻干保护剂：将脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖以质量比10:3:3复配后溶于水中至脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖的总浓度为200g/L，105℃灭菌10min。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、琼脂20g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、MnSO40.05 g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
实施例1：长双歧杆菌冻干粉中长双歧杆菌活菌数的检测
具体步骤如下：
(1)按照表1的配方配置梯度稀释液1～8；梯度稀释液1～8均于121℃下灭菌15min；梯度稀释液1～8均用0.1mol/LNaOH调节pH值；
(2)用接种环蘸取保菌管中的长双歧杆菌GDMCC No.60926菌液在MRS固体培养基上划线，于37℃恒温培养36h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养12h，得到种子液；将种子液按2％(v/v)的接种量接种至新鲜的MRS液体培养基中， 37℃恒温培养12h至对数生长末期，得到菌液；将菌液8000g下离心20min，收集菌泥；将菌泥重悬于生理盐水中，得到重悬液；将重悬液的pH调节至6.5后(通过质量体积分数为 3％的NaOH溶液调节pH)将重悬液与冻干保护剂混合，得到混合液；将混合液进行冷冻干燥，得到长双歧杆菌冻干粉；其中，菌泥与生理盐水的质量比为1:1；重悬液与冻干保护剂的体积比为2:1；冷冻干燥在冷冻干燥机(购自西班牙泰事达公司)内完成，包括预冻、一次干燥和二次干燥，预冻为控制层板1h内降温至-50℃，保持4h，一次干燥为控制层板1.3h升温至-30℃，保持30h，二次干燥为控制层板1h升温至25℃，保持20h。
(3)分别使用梯度稀释液1～8配合平板活菌计数法(平板活菌计数法具体可见文献：赵静,梁金钟.直投式产γ-氨基丁酸植物乳杆菌冻干保护剂生产工艺的优化[J].食品工业科技,2015,36(09):140-143.)检测长双歧杆菌冻干粉中长双歧杆菌的活菌数(检测结果见表2)。
由表1-2可知，使用含有L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温800.6g/L、磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾4.5g/L和氯化钠5g/L的梯度稀释液配合平板活菌计数法检测长双歧杆菌菌粉中的长双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数最高，高达(2.1±0.1)×1010CFU/g。
表1梯度稀释液1～8的配方
Figure RE-GDA0002547343630000041
表2使用梯度稀释液1～8配合平板活菌计数法检测得到的长双歧杆菌菌粉中的长双歧杆菌活菌数
组别 活菌数
梯度稀释液1 (1.5±0.4)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液2 (1.8±0.3)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液3 (1.0±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液4 (1.4±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液5 (2.1±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液6 (2.0±0.5)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液7 (1.8±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液8 (1.3±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
实施例2：短双歧杆菌冻干粉中短双歧杆菌活菌数的检测
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将长双歧杆菌GDMCC No.60926替换为短双歧杆菌GDMCCNo.60934，检测结果见表3。
由表3可知，使用含有L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温800.6g/L、磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾4.5g/L和氯化钠5g/L的梯度稀释液配合平板活菌计数法检测短双歧杆菌菌粉中的短双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数最高，高达(2.0±0.1)×1010CFU/g。
表3使用梯度稀释液1～8配合平板活菌计数法检测得到的短双歧杆菌菌粉中的短双歧杆菌活菌数
组别 活菌数
梯度稀释液1 (1.5±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液2 (1.8±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液3 (1.5±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液4 (1.6±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液5 (2.0±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液6 (1.7±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液7 (1.5±0.3)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液8 (1.4±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
实施例3：青春双歧杆菌冻干粉中青春双歧杆菌活菌数的检测
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将长双歧杆菌GDMCC No.60926替换为青春双歧杆菌GDMCCNo.60706，检测结果见表4。
由表4可知，使用含有L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温800.6g/L、磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾4.5g/L和氯化钠5g/L的梯度稀释液配合平板活菌计数法检测青春双歧杆菌菌粉中的青春双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数最高，高达(2.2±0.2)×1010CFU/g。
表3使用梯度稀释液1～8配合平板活菌计数法检测得到的青春双歧杆菌菌粉中的青春双歧杆菌活菌数
组别 活菌数
梯度稀释液1 (1.4±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液2 (1.7±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液3 (1.0±0.3)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液4 (1.5±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液5 (2.2±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液6 (1.9±0.1)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液7 (1.6±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
梯度稀释液8 (1.3±0.2)×10<sup>10</sup>CFU/g
实施例4：两歧双歧杆菌冻干粉中两歧双歧杆菌活菌数的检测
具体步骤如下：
在实施例1的基础上，将长双歧杆菌GDMCC No.60926替换为两歧双歧杆菌GDMCCNo：60701，检测结果见表4。
由表4可知，使用含有L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温800.6g/L、磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾4.5g/L和氯化钠5g/L的梯度稀释液配合平板活菌计数法检测两歧双歧杆菌菌粉中的两歧双歧杆菌活菌数时，测得的活菌数最高，高达(2.4±0.2)×1010CFU/g。
表3使用梯度稀释液1～8配合平板活菌计数法检测得到的两歧双歧杆菌菌粉中的两歧双歧杆菌活菌数
Figure RE-GDA0002547343630000061
Figure RE-GDA0002547343630000071
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种梯度稀释液，其特征在于，所述梯度稀释液的成分包含抗氧化剂0.5～1g/L、表面活性剂0.5～1g/L、磷酸盐10～15g/L和无机盐1～5g/L。
2.如权利要求1所述的一种梯度稀释液，其特征在于，所述抗氧化剂为L-半胱氨酸盐酸盐和/或维生素C；所述表面活性剂为吐温80；所述磷酸盐为磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和/或磷酸二氢钠；所述无机盐为氯化钠和/或氯化钾。
3.如权利要求2所述的一种梯度稀释液，其特征在于，所述梯度稀释液的成分包含L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、吐温80 0.6g/L、磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾4.5g/L和氯化钠5g/L。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种梯度稀释液，其特征在于，所述梯度稀释液的pH为6.2～7.0、渗透压为280～320Pa。
5.如权利要求4所述的一种梯度稀释液，其特征在于，所述梯度稀释液的pH为7.0、渗透压为300。
6.一种对双歧杆菌进行计数的方法，其特征在于，所述方法为将含有双歧杆菌的待测样品用权利要求1-5任一项所述的梯度稀释液进行稀释，得到稀释液；对稀释液进行活菌计数。
7.如权利要求6所述的一种对双歧杆菌进行计数的方法，其特征在于，所述含有双歧杆菌的待测样品为双歧杆菌菌粉。
8.如权利要求6或7所述的一种对双歧杆菌进行计数的方法，其特征在于，所述双歧杆菌为长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌。
9.如权利要求6-8任一项所述的一种对双歧杆菌进行计数的方法，其特征在于，所述活菌计数的方法为平板活菌计数法。
10.权利要求1-5任一项所述的梯度稀释液或权利要求6-9任一项所述的方法在双歧杆菌计数中的应用。
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