CN109908879A - 一种检测四环素类抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测四环素类抗生素的方法，属于分析检测技术领域。本发明提供了一种四环素类抗生素分散式固相萃取剂，对四环素类抗生素具有较好的吸附萃取能力，萃取剂中的多种结构的相互作用强度存在差异，本发明萃取剂提高了对四环素类抗生素的吸附量及萃取回收量。本发明的一种基于本发明萃取剂处理后检测四环素类抗生素的方法，对多种蜂蜜样品进行检测的检测限为0.073～0.435ng/g，定量限为0.239～1.449ng/g，线性范围上限为500ng/g；通过加标回收率实验并检测其中TCs含量，加标回收率在88.1％～126.2％，匹配良好、准确度高，适应性好、具有实际应用前景。

Description

一种检测四环素类抗生素的方法

技术领域

本发明涉及一种检测四环素类抗生素的方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

四环素类(Tetracyclines，TCs)抗生素种类众多，其中众多，包括四环素(Tetracycline，TC)，土霉素(Oxytetracycline，OTC)，金霉素(Chlortetracycline，CTC)和地美环素(Demeclocycline，)等第一代四环素，是天然抗生素；随后，经半人工合成得到药效强，副作用小的长效四环素，强力霉素(Doxycycline，DC)。除此之外，TCs通过结构改造合成了多种具有更强水溶性，强抗菌活性及稳定性的TCs药物。尽管TCs多种多样，但常用作兽药污染动物性食品的TCs主要是TC、OTC、CTC、DC，因而对于蜂产品TCs残留的检测主要集中在这几种。

TCs具有其生物活性所必需的特征四环结构，如下述结构所示：

环上基团决定了它们的稳定性、抗菌活性与药代动力学等性质。TCs具有相似的理化性质，其结晶呈淡黄色粉末，易溶于极性有机溶剂，微溶于水，不溶于饱和烷烃。TCs在环境中的残留可能导致细菌产生抗药性，造成耐药性菌株的繁殖与传播。TCs在人体内可通过药物累积造成慢性中毒及其他器官病变。过量摄入TCs会刺激胃肠道，造成肝、肾损伤，影响儿童牙齿骨骼的正常发育等。

因而欧盟、中国、美等家和地区对食品中TCs残留有严格限量，其中蜂蜜中的TCs最大残留限量分别为20μg/kg，50μg/kg及10μg/kg。2002年以来，欧盟以抗生素残留超标为由，禁止我国出产的蜂蜜进入市场，极大地影响了我国蜂产品的出口。因而必须使用高灵敏的检测手段对蜂蜜等食品中的TCs类抗生素进行严格监控，建立更为便捷有效且满足限量所需的检测方法迫在眉睫。

固相萃取法及分散式固相萃取不仅能完成样品的批量处理，同时具有良好的除杂效果量处理，较好的达到多目标检测要求。目前已有报道针对四环素类抗生素的这些方法主要有(1)固相萃取法，比如利用Cleanert PCX固相萃取、商品化OASIS HLB SPE柱或OASISHLB SPE柱及羧酸弱阳离子柱对多种TCs进行检测；(2)QuEChERS法，比如利用使用磁性C18、N-丙基乙二胺吸附剂对多种TCs进行检测；(3)磁固相萃取，合成表面接枝亲水性聚合物刷磁微球对多种TCs进行磁分散固相萃取。然而，上述这些方法均是采用的较为单一的吸附剂，虽然可以有效的去除大部分杂质，但在进行多目标物同时检测杂质时，单一的吸附剂及相同萃取条件很难兼顾多目标物的萃取及回收，同时考虑到单一吸附剂对多目标物吸附萃取能力之间的差别，造成目标物间回收率差别较大。另外，大多吸附剂在除杂净化或浓缩富集过程中对杂质进行无差别吸附，很难针对目标分析物对吸附剂进行调节和改进，这也对TCs等痕量存在的农兽药残留的检查造成了困难。

因此，寻求一种高效、灵敏的TCs检测方法是有迫切需求的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种复配型分散式固相萃取剂，对四环素类抗生素具有较好的吸附萃取能力，萃取剂中的多种结构的相互作用强度存在差异，复配后提高了对四环素类抗生素的吸附量及萃取回收量。利用本发明复配型分散式固相萃取剂处理的蜂蜜样品进行检测，匹配良好、准确度高，具有实际应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种四环素类抗生素分散式固相萃取剂，所述萃取剂的组分，按照重量份数配比，包括70-100份MIL-101(Cr)、0-10份MIL-100(Fe)和0-20份MIL-53(Al)。

在本发明的一种实施方式中，所述分散式固相萃取剂的制备方法包括如下步骤：

研磨金属有机骨架材料MIL-101(Cr)，MIL-100(Fe)和MIL-53(Al)，按照重量份数配比混合均匀，即得分散式固相萃取剂。

在本发明的一种实施方式中，MIL-101(Cr)、MIL-100(Fe)和MIL-53(Al)的质量比优选7：1：2。

在本发明的一种实施方式中，所述金属有机骨架材料的制备方法包括：

金属有机骨架材料对应金属离子及配体经水热法合成，经离心保留合成的固体材料，使用N,N-二甲基甲酰胺、无水乙醇等有机溶剂洗涤，干燥即得金属有机骨架材料。

本发明的第二个目的是提供一种四环素类抗生素的萃取或分离方法，所述方法是利用上述的分散式固相萃取剂对四环素类抗生素进行吸附萃取。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测样稀释在溶剂中，然后以上述分散式固相萃取剂作为吸附萃取剂，加入到待测样溶液中进行吸附萃取，除去液体，保留萃取剂固体；

(2)洗脱步骤(1)中的萃取剂固体，固液分离取清液。

本发明的第三个目的是提供一种蜂蜜中四环素类抗生素的萃取或分离方法，所述方法利用上述的分散式固相萃取剂对四环素类抗生素进行吸附萃取。

在本发明的一种实施方式中，每0.5g蜂蜜样品使用不低于20mg萃取剂进行萃取。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测样稀释在提取剂中进行提取，然后以上述分散式固相萃取剂作为吸附萃取剂，加入到待测样溶液中进行吸附萃取，除去液体，保留萃取剂固体；

(2)洗脱步骤(1)中的萃取剂固体，固液分离取清液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中采用10-20倍体积提取剂(待测物/提取剂w/v，g/mL)提取待测样。

在本发明的一种实施方式中，所述提取剂为Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液或者1％三氯乙酸。

在本发明的一种实施方式中，所述Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的制备方法为：

(1)称取21.01g柠檬酸一水合物，溶解并定容于1L水，得到0.1mol/L柠檬酸溶液；称取71.64g磷酸氢二钠十二水合物，溶解并定容于1L水，测其pH值，必要是可使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH＝4.0±0.05，得到0.2mol/L磷酸氢二钠溶液；

(2)将1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与625mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合，得到Mcllvaine缓冲溶液；称取60.50g Na₂EDTA放入1625mL Mcllvaine缓冲溶液中，超声振荡摇匀，即得Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的洗脱是将每20mg萃取剂固体采用2-8mL洗脱剂进行洗脱。

在本发明的一种实施方式中，所述洗脱剂包括甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种。

本发明的第四个目的是提供一种四环素类抗生素的检测方法，所述检测方法包括：利用上述萃取或分离方法对待测样进行前处理，得到检测样品，然后进行检测。

在本发明的一种实施方式中，所述检测包括利用高效液相、气相、高效液相-质谱联用或气相-质谱联用进行检测。

在本发明的一种实施方式中，当使用高效液相或者高效液相-质谱联用检测时，所述前处理还包括如下步骤：

(1)氮气吹干及定容：将分离得到的待测样溶液置于氮气吹干仪吹至近干，乙腈或乙腈：水(v:v,80:20)定容，过滤膜待测；

(2)标准样品的制备：溶剂稀释不同浓度的待测样，以分散式固相萃取法处理后洗脱吹干并定容，作为标准样品备用。

在本发明的一种实施方式中，所述高效液相的色谱柱为ACQUITY HSS T31.8μm 1.0×150mm色谱柱。

在本发明的一种实施方式中，所述高效液相的具体条件为：

以0.4％甲酸水-乙腈(72：28，V/V)为流动相，流速为0.06mL/min，进样量为10μL，单个样品检测时长12min。

在本发明的一种实施方式中，当使用高效液相-质谱联用检测时，所述质谱的条件为：气帘气(CUR)30psi，雾化气(GS1)45psi，辅助气(GS2)45psi，离子源电压(IS)5500V，离子源温度(TEM)550℃，碰撞室出口电压(CCXP)10V，碰撞室入口电压为10V；配制各四环素类抗生素的单一标准物，手动调谐模式针泵进样，确定分析物定性定量离子对，优化去簇电压(DP)及碰撞电压(CE)，建立MRM多反应监测方法。

本发明的有益效果：

本发明分散式固相萃取剂对四环素类抗生素具有较好的吸附萃取能力。基于萃取剂中的多种结构的相互作用强度存在的差异，提高了对四环素类抗生素的吸附量及萃取回收量。利用本发明分散式固相萃取剂处理的蜂蜜样品进行检测：检测的检测限LOD为0.073～0.435ng/g，定量限LOQ为0.239～1.449ng/g，线性范围上限为500ng/g；通过加标回收率实验并检测其中TCs含量，加标回收率在88.1％～126.2％，匹配良好、准确度高；且检测方法的适应性好，对多种样品的检测均具有非常准确的检测结果，具有较广的实际应用前景。

附图说明

图1经50mg萃取剂a、b、c、d、e、f萃取并洗脱后样品中四环素族峰面积对比图；其中(a)MIL-101(Cr)，(b)MIL-100(Fe)，(c)MIL-53(Al)，(d)MIL-101(Cr)∶MIL-100(Fe)∶MIL-53(Al)质量比1∶1∶1，(e)MIL-101(Cr)∶MIL-100(Fe)∶MIL-53(Al)质量比3∶1∶1，(f)MIL-101(Cr)∶MIL-100(Fe)∶MIL-53(Al)质量比7∶1∶2；

图2不同萃取剂用量吸附后残留的四环素族浓度对比图；

图3不同提取剂用量处理后的四环素族峰面积对比图；

图4不同洗脱剂用量处理后的四环素族峰面积对比图；

图5 100ng/mL OTC/TC/CTC/DC混合标准物9组离子对的提取离子流色谱图。

具体实施方式

金属有机骨架材料的合成：

(1)MIL-101(Cr)的合成：

MIL-101(Cr)的合成主要参照Ferey G课题组采用的水热合成法，并对该方法进行了一定的简化。将800mg Cr(NO3)3·9H2O，332mg对苯二甲酸，9.6mL水和0.1mL氢氟酸(40％)依次加入30mL的聚四氟乙烯的反应釜内胆中。超声搅拌均匀后装入不锈钢套密封，放入鼓风干燥箱220℃反应8h。反应结束后，待反应釜降至室温，将反应体系及合成物倒入50mL离心管，6000RCF离心10min弃去上清液；下层固体反复用DMF充分洗涤数次，确保洗涤液无色澄清透明，以除去孔道内的对苯二甲酸及金属盐溶液，离心收集MIL-101(Cr)固体；再使用约15mL无水乙醇洗涤三次，置换残留的DMF试剂，离心收集固体。最后将收集的固体材料放入真空干燥箱40℃干燥过夜。

(2)MIL-100(Fe)的合成：

MIL-100(Fe)的合成主要参照Ferey G课题组Horcajada P等的水热合成法，修改了洗涤步骤及条件。将687.5mg均苯三甲酸，277.5mg还原铁粉，20mL水，200μL氢氟酸(40％)和190μL浓硝酸依次加入30mL的聚四氟乙烯的反应釜内胆中。超声搅拌均匀后装入不锈钢套密封，放入鼓风干燥箱150℃反应15h。反应结束后，待反应釜降至室温，将反应体系及合成物倒入50mL离心管，6000RCF离心10min弃去上清液；用热水冲洗三次并80℃左右回流洗涤3小时，用60℃乙醇回流洗涤1小时，直至溶剂无色澄清透明。最终离心收集固体，最后放入真空干燥箱40℃干燥过夜。

(3)MIL-53(Al)的合成：

MIL-53(Al)的合成主要参照Ferey G课题组的水热法合成的纳米孔道MIL-53(Al)，并对其洗涤步骤进行了简化。将1300mg Al(NO3)3·9H2O，288mg对苯二甲酸和5mL水依次加入30mL的聚四氟乙烯的反应釜内胆中。超声搅拌均匀后装入不锈钢套密封，放入鼓风干燥箱220℃反应3天。反应结束后，待反应釜降至室温，将反应体系及合成物倒入50mL离心管，10000RCF离心10min弃去上清液；下层白色固体分别使用15mL超纯水洗涤一次，用DMF洗涤三次，以除去孔道内的对苯二甲酸及金属盐溶液，再用约15mL无水乙醇洗涤两次，置换残留的DMF试剂，离心收集固体。最后将收集的固体材料放入真空干燥箱40℃干燥过夜。

TCs的监测：为同时定性定量检测四种四环素，通过手动调谐模式中Q1MS扫描模式及Product Ion扫描模式，监控总离子流图，确定母离子质量及子离子质量，并优化DP及CE参数，获得较高的总离子流相应。四种TCs的质谱检测参数如下表所示：

每种分析物至少确定两组定性离子对，以信号相应较高的461.3/426.2(OTC)，445.2/410.1(TC)，479.2/444.0(CTC)，445.2/427.7(DC)作为四种TCs的定量离子对。在MRM模式下所得到的100ng/mL OTC/TC/CTC/DC混合标准物9组离子对的提取离子流色谱图如图5所示，可知出峰顺序为OTC、TC、CTC、DC。

实施例1分散式固相萃取剂的制备

将干燥后的MIL-101(Cr)，MIL-100(Fe)和MIL-53(Al)固体轻微研磨至均匀粉末，以质量比7：1：2在50mL离心管中混合，将混合后材料置于转盘式混匀器上，20rpm混匀过夜，使混合材料呈均匀细腻粉末，即得分散式固相萃取剂。

实施例2四环素类抗生素的萃取分离-构建标准曲线：

(1)标准样品的萃取分离前处理：以0.5g通过欧盟FVO和美国FDA认证的品牌蜂蜜作为标准样品基质，以0、5、10、20、50、100、200、500ng/g浓度OTC/TC/CTC/DC混合标准物水溶液，经实施例1中制得萃取剂萃取处理；

称取20mg实施例1所得分散式固相萃取剂加入样品缓冲体系中，涡旋振荡使吸附剂均匀分散，超声振荡10min，3000RCF离心3min，弃去上清液保留固体吸附剂；向吸附剂中加入3mL甲醇超声振荡10min，6000RCF离心6min保留上清液全部转移至洁净5mL离心管，置于氮吹仪30℃水浴吹至近干，定容于1mL水中，充分溶解，过0.22μm滤膜待高效液相色谱进样检测。

(2)标准曲线：

将标准样品经HPLC-MS/MS分离检测后，以***自带软件Analyst计算定量离子对所对应的峰面积，制成标准曲线。结果如表1所示，四种TCs线性关系良好，决定系数R²在0.9965～0.9990之间，检出限(LOD，S/N＝3)为0.073～0.435ng/g，定量限(LOQ，S/N＝10)为0.239～1.449ng/g，线性范围上限为500ng/g。

表1 分离所得TCs样品中各物质的标准曲线

实施例3：萃取/分离条件优化

(1)吸附萃取剂种类的选择：

参照实施例2，将(1)中的吸附萃取剂分别替换为50mg表2所示的6种萃取剂，其他条件不变，对样品进行前处理。

表26 种不同萃取剂

经萃取并洗脱处理后样品结果如图1所示。

经6种萃取剂方案萃取、洗脱得到的峰面积，萃取剂a、f具有显著优势，经其萃取的OTC、TC、CTC的峰面积均显著大于100％MIL-100(Fe)(b)、100％MIL-53(Al)(c)以及MIL-101(Cr)含量较低(≤60％)的复配萃取剂d、e这4种萃取剂的萃取效果。因此，具有较好萃取效果回收效果的优选MIL-101(Cr)含量较高(70％-100％)的固相萃取剂。

(2)吸附萃取剂用量：

参照实施例2，将(1)中吸附萃取剂的总用量分别替换为5、10、20、50、100、150或200mg，吸附5mL pH值为4的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液中500ngTCs，检测吸附后残留的TCs浓度。如图2所示，当萃取剂用量少于或等于10mg时，标准偏差大，可能是低剂量萃取剂称量不准确且单位萃取剂吸附容量加大产生的。当萃取剂用量为5～20mg时，四环素残留浓度显著降低，随后趋于稳定；当用量为20～200mg时，四环素残留量无显著差异。低剂量的萃取剂可减少粘稠蜂蜜基质在萃取剂表面的黏连，同时降低单次检测所需的萃取剂成本。因而，实验选取20mg萃取剂用于单次分散式固相萃取。

(3)提取剂的用量：

参照实施例2，将(1)中提取剂的用量替换为2.5～15mL，提取加标相同浓度的样品，回收得到的峰面积入图3所示，可见随着溶液量增加，回收得到的峰面积呈下降趋势，因而应少量使用提取剂。当使用2.5mL提取剂稀释0.5g实际样品时，蜂蜜基质浓度过高，吸附离心过程使得蜂蜜大量粘附于吸附剂固体，造成洗脱后样品浑浊。综合考虑以上因素，选定以5-10mL Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取剂较好。

(4)洗脱剂的用量：

参照实施例2，将(1)中洗脱剂的用量替换为1～10mL，其他条件不变。

如图4所示，不同用量洗脱剂对吸附相同物质的量的吸附剂进行洗脱，所得峰面积先升高后降低，5mL后基本维持不变，OTC，TC及CTC的峰面积在3mL时达到峰值，DC在2mL时达到峰值，综合考虑选用2-8mL作为适宜的洗脱剂用量范围。

实施例4方法适应性：不同种蜂蜜中四环素类抗生素的检测

(1)待测样品的萃取分离前处理：

分别对无锡某超市中采购的(A)土蜂蜜、(B)天山雪蜜(紫椴花蜜)、(C)洋槐山花蜜、(D)荆条蜂巢蜜这4种蜂蜜进行下述处理：

分别准确称取0.500g蜂蜜样品于10mL试管中，溶解于5mL Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液中，超声振荡5min；称取20mg萃取剂加入样品缓冲体系中，涡旋振荡使吸附剂均匀分散，超声振荡10min，3000RCF离心3min，弃去上清液保留固体吸附剂；向吸附剂中加入3mL甲醇超声振荡10min，6000RCF离心6min保留上清液全部转移至洁净5mL离心管；然后所有样品均以10、20、50ng/g三个水平的浓度OTC/TC/CTC/DC标准物进行检测，分别计算其加标回收率，验证方法的准确性。检测结果如表3所示。

表34 种蜂蜜中TCs的检测及方法适应性的验证

注：a.加标浓度10ng/g；b.加标浓度20ng/g；c.加标浓度50ng/g；ND为未检出。

4种样品中，仅A样品土蜂蜜有TC检出，低于远低于国家限量50ng/g，其他样品中均未有检出。

3加标水平回收率显示，4种样品中4种TCs的回收率均在88.1％～126.2％，说明本发明方法可行。回收率随着加标量的增加区域稳定，RSD也显著降低，加标量为20、50ng/g的RSD均小于等于10％。

Claims (10)

1.一种四环素类抗生素分散式固相萃取剂，其特征在于，所述萃取剂的组分，按照重量份数配比，包括70-100份MIL-101(Cr)、0-10份MIL-100(Fe)和0-20份MIL-53(Al)。

2.根据权利要求1所述的分散式固相萃取剂，其特征在于，所述复配型分散式固相萃取剂的制备方法包括如下步骤：

研磨金属有机骨架材料MIL-101(Cr)，MIL-100(Fe)和MIL-53(Al)，按照重量份数配比混合均匀，即得分散式固相萃取剂。

3.根据权利要求1或2所述的分散式固相萃取剂，其特征在于，MIL-101(Cr)、MIL-100(Fe)和MIL-53(Al)的质量比为7：1：2。

4.一种四环素类抗生素的萃取或分离方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-3任一所述的分散式固相萃取剂对四环素类抗生素进行吸附萃取。

5.一种蜂蜜中四环素类抗生素的萃取或分离方法，其特征在于，所述方法利用权利要求1-3任一所述的分散式固相萃取剂对四环素类抗生素进行吸附萃取。

6.根据权利要求5所述的萃取或分离方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将待测样稀释在提取剂中进行提取，然后以权利要求1-3任一所述的分散式固相萃取剂作为吸附萃取剂，加入到待测样溶液中进行吸附萃取，除去液体，保留萃取剂固体；

(2)洗脱步骤(1)中的萃取剂固体，固液分离取清液。

7.根据权利要求6所述的萃取或分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用10-20倍体积提取剂提取待测样。

8.根据权利要求6或7所述的萃取或分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中的洗脱是将每20mg萃取剂固体采用2-8mL洗脱剂进行洗脱。

9.根据权利要求5-8任一所述的萃取或分离方法，其特征在于，每0.5g蜂蜜样品使用不低于20mg萃取剂进行萃取。

10.一种四环素类抗生素的检测方法，其特征在于，所述检测方法是利用权利要求4-9任一所述的萃取或分离方法对待测样品进行前处理，得到检测样品；然后进行检测。