CN111458516A - 一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器及其制备方法，包括制备NH2‑MIL‑53(Al)纳米片、制备检测细菌耐药性的探针溶液以及检测细菌耐药性的电化学发光传感器的组装。本发明提供的电化学发光生物传感器可以快捷、简单、可靠且有效的检测耐药性。本发明利用电化学发光技术作为信号输出方式，该技术具有极高的灵敏度，本发明中的电化学发光生物传感器检测细菌是否具有耐药性，并且可用于定量检测大肠杆菌浓度。

Description

一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明涉及电化学发光技术领域，尤其涉及一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器及其制备方法。
背景技术
致病菌对抗生素的耐药性不断增加，经媒体报道，“超级细菌”逐渐引起了公众所关注。新德里金属-β-内酰胺酶-1(NDM-1)是超级细菌携带的一种耐药性基因，它能够中和β-内酰胺类抗生素，使细菌对几乎所有的抗生素产生抗药性。NDM-1超级细菌极强的耐药性大大增加了由其引起的感染的治疗难度,常见的耐药细菌并不能将耐药基因“传”给其他细菌，而NDM-1基因却可以在不同细菌间转移，传递抗性。目前发现的NDM-1主要存在于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中,正常情况下这两种细菌并不致病，但当它们获得了NDM-1基因后就摇身变成了近乎坚不可摧的超级细菌。针对上述问题，更加迫切的需要一种可靠且有效的检测手段检测细菌是否具有耐药性。
目前已建立的检测细菌是否表达NDM-1耐药基因的手段有肉汤稀释法和圆盘扩散法等，以上方法涉及多步耗时的步骤包括:(1)培养细菌，使细菌密度达到到可检测的水平(24-48h)，(2)在96孔板或培养皿上孵育细菌和抗生素(24-48h)，(3)用紫外吸收光谱法或目测法检测细菌的生长。此外，这些检测方法通常需要采集大量的病人样本用于分析，如血液、痰或尿液。分子遗传学技术(如聚合酶链反应和基因芯片)的应用很常见，但这些是基于直接检测从临床样品中分离出来的β-内酰胺酶。直接检测法是利用分光光度法直接检测细胞提取物中β-内酰胺的水解，这是一项费时费力的工作因此不能用于常规检测。基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)近年来今年来被广泛用于抗菌药物耐药机制的研究，但是相对较小的抗生素(～1000Da)难以分析，因为它们与基质的相互作用会产生较高噪声的水平。除此之外，仪器价格及其维护费用等方面也是额外问题。因此，面对不清楚患者是否为耐药菌感染的情况下医生常常采用经验疗法，从而导致抗生素的滥用，细菌抗药性增加。
因此，研发一种快捷、简单、低成本的方法检测细菌耐药性，做到有针对性的用药，对于抗生素在临床上的应用具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法
本发明提供一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备NH2-MIL-53(Al)纳米片；
步骤1.1：将0.7243g 3mmol的AlCl3·6H2O溶解于15mL去离子水中；
步骤1.2：在搅拌条件下缓慢加入0.5435g 3mmol 2-氨基-1,4-苯二甲酸，再继续搅拌30分钟，得到混合液1；
步骤1.3：将15mL6 mmol,的尿素水溶液逐滴加入到所述混合液1中继续搅拌30分钟，得到混合液2；
步骤1.4：将所述混合液2转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中,在150℃条件下静置反应5h，得到混合液3；
步骤1.5：将所述混合液3缓慢冷却至室温，抽吸过滤得到乳白微黄色沉淀，并用大量去离子水冲洗干净，得到混合液4；
步骤1.6：将混合液4分散在20mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌24h；
步骤1.7：用等体积的甲醇代替N,N-二甲基甲酰胺溶液，再继续搅拌24小时，反应完成后除去甲醇，在70℃条件下真空干燥过夜，即得到NH2-MIL-53(Al)纳米片；
步骤2，制备检测细菌耐药性的探针溶液：
用N,N-二甲基甲酰胺溶液配制50μL 100μmol二(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌(N-琥珀亚酰胺酯)-二(六氟磷酸根盐)溶液，加入到缓冲溶液配制的1.5mL 10μmol半刀球蛋白(Con A)溶液中，在25℃且避光条件下缓慢搅拌6h；
步骤3，检测细菌耐药性的电化学发光传感器的组装；
步骤3.1，将步骤1中合成的NH2-MIL-53(Al)纳米片超声分散在DMF溶液中,将该分散液滴涂到处理干净的工作电极表面，干燥后得到NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.2，在步骤2所得的探针溶液中加入EDC、NHS进行活化，将步骤3.1所得修饰电极侵入到活化的探针溶液中进行修饰，即可得到Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.3，将牛血清蛋白(BSA)溶于结合缓冲溶液中，滴到步骤3.2所得的Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极表面进行封闭，即可得到用于检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器。
进一步的方案为，所述步骤2中，缓冲溶液为：含有1mM CaCl2,1mM MnCl2的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，缓冲溶液PH＝8.0。
进一步的方案为，所述步骤3.1中，修饰到工作电极表面的NH2-MIL-53(Al)纳米片的分散浓度为0.1-1mg/mL。
进一步的方案为，所述步骤3.1中，工作电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的一种。
进一步的方案为，步骤3.2中，EDC、NHS的浓度分别为2mg/L和5mg/L,探针溶液ConA-Ru的浓度为0.1-10μM，修饰时间为2-4h。
进一步的方案为，步骤3.3中，BSA溶液浓度为0.1-1％，滴到电极表面的体积为10μL，封闭时间为30-60min。
本发明电化学发光生物传感器检测细菌耐药性的机理：
金属有机骨架(MOFs)，又称多孔配位聚合物(CPs)，是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装，形成的具有分子内孔隙的一种有机-无机杂化材料。具有表面积大、纳米空腔均匀的独特结构，分子孔径和结构、良好催化活性等优异的化学性能，自本世纪初以来一直是热门研究材料。凝集素是一种结构具有多样的蛋白质，可以特异性结合多糖且表现出高度的亲和力，其易于生产和标记的特点为设计生物传感器提供了良好的平台。电化学发光(ECL)生物传感器兼具电化学和化学发光生物传感器的优点，有灵敏度高、易于设计等优点，具有广阔的应用前景。
本发明基于凝集素(Con A)与脂多糖(LPS)的特异性结合构建了一种用于检测细菌耐药性电化学发光生物传感器。首先，以NH2-MIL-53(Al)纳米片作为基底材料修饰电极，可以提供一个多空的界面增大电极表面积，并且该纳米片上的氨基基团可以和Con A探针上的羧基反应，可用于固定探针。凝集素(Con A)作为特异性识别元件识别大肠杆菌(E.coli)表面的脂多糖(LPS)，上面标记的联吡啶钌(Con A-Ru)提供电化学发光信号。当传感器与细菌结合后电化学发光信号减弱，说明该传感器对大肠杆菌具有特异性的响应。当该传感器用于检测不具有耐药性的细菌(E.coli BL21)时,若待测液中的E.coli BL21未与抗生素作用时，溶液中存活的大肠杆菌浓度较大，传感器表面的Con A蛋白会特异性结合大量的细菌，抑制Ru复合物的发光，致使电化学发光强度在检测细菌前后变化率ΔI/I0大(ΔI＝I0–I,I0和I分别为传感器检测细菌前后的电化学发光信号)。若E.coli BL21与各种分别抗生素作用后，溶液中存活的大肠杆菌浓度将减小，与传感器表面特异性结合的细菌的数量较少，对Ru复合物的发光抑制程度较低，致使电化学发光强度在检测细菌前后变化率ΔI/I0较小。因此在检测没有耐药性的细菌时，待测细菌在和抗生素作用前后，传感器的检出信号变化率ΔI/I0由大变小。当该传感器用于检测耐药性细菌时(NDM-1E.coli BL21)时,若NDM-1E.coli BL21与β-内酰胺类抗生素(头孢匹罗、亚胺培南)相互作用，由于β-内酰胺类抗生素会被NDM-1E.coli BL21所表达的β-内酰胺酶分解而失效，溶液中的NDM-1E.coliBL21浓度不会发生改变，因此在检测NDM-1E.coli BL21时，无论细菌是否与β-内酰胺类抗生素作用，传感器在检测细菌前后信号变化率ΔI/I0没有明显的变化。除此之外，若NDM-1E.coli BL21与非β-内酰胺类抗生素(左氧氟沙星、四环素)相互作用，待测液中的细菌所表达的β-内酰胺酶不能分解该类抗生素，则NDM-1E.coli BL21会因抗生素致死，细菌浓度降低。故细菌未与非β-内酰胺类抗生素作用ΔI/I0较大，与非β-内酰胺类抗生素作用后ΔI/I0较小。即可根据检测到的ΔI/I0区分E.coli BL21/NDM-1E.coli BL21，判断细菌是否具有耐药性(表达MβLs基因)。
与相关技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)灵敏度高，本发明利用电化学发光技术作为信号输出方式，该技术具有极高的灵敏度，本发明中的电化学发光生物传感器检测细菌是否具有耐药性，并且可用于定量检测大肠杆菌浓度。
(2)Ru(bpy)3 2+体系具有良好的稳定性、较高的ECL量子产率和生物相容性，将Ru(bpy)3 2+固定在电极表面，不仅可以减少昂贵试剂的使用量，而且还增强了ECL信号强度和简化了实验过程。
(3)信号稳定，Con A-Ru探针通过共价连接的方式修饰到电极表面，避免了传统的Au-S自组装在电位为+0.9V时，Au-S键断裂。
(4)利用了MOF材料多负载的性能，提供了更多的探针连接位点，起到了信号放大的作用。
(5)成本低廉，所需试剂量少。
附图说明
图1为本发明本发明电化学发光生物传感器用于检测细菌耐药性的原理图；
图2a为不同浓度E.coli BL21对应的电化学发光信号，图2b为发光强度值与E.coli BL21浓度的线性关系；
图3电化学发光生物传感器检测E.coli BL21/NDM-1E.coli BL21与各类抗生素作用后对应的ΔI/I0值，根据该值可以判断细菌是否具有耐药性；
图4电化学发光生物传感器检测E.coli BL21的稳定性结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。
一种检测检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，以检测细菌是否表达MβLs为例，选用的细菌为E.coli BL21/NDM-1E.coli具体制备步骤如下：
步骤1，制备NH2-MIL-53(Al)纳米片；
将AlCl3·6H2O(3mmol,0.7243g)溶解于15mL去离子水中，在搅拌条件下缓慢加入2-氨基-1,4-苯二甲酸(3mmol,0.5435g)，再继续搅拌搅拌30分钟。随后,将15mL的尿素(6mmol,0.3604g)水溶液逐滴加入到上述的混合液中继续搅拌30分钟。此后,将上述所的混合物转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中,在150℃条件下静置反应5h。反应完成后，将混合物缓慢冷却至室温，抽吸过滤得到乳白微黄色沉淀，并用大量去离子水冲洗干净。然后，将产品分散在20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌24h。最后，用等体积的甲醇代替DMF溶液，再继续搅拌24小时，反应完成后除去甲醇，在70℃条件下真空干燥过夜，即得到NH2-MIL-53(Al)纳米片。
步骤2，制备检测细菌耐药性的探针溶液：
用DMF溶液配制50μL 100μmol二(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌(N-琥珀亚酰胺酯)-二(六氟磷酸根盐)溶液，加入到缓冲溶液(10mM Tris-HCl,1mM CaCl2,1mMMnCl2,pH＝7.4)配制的1.5mL 10μmol半刀球蛋白(Con A)溶液中，在25℃且避光条件下缓慢搅拌6h。反应结束后即可得到用于检测细菌耐药性探针溶液(Con A-Ru)。
步骤3，检测细菌耐药性的电化学发光传感器的组装；
步骤3.1，将步骤1中合成的NH2-MIL-53(Al)纳米片超声分散在DMF溶液中,将该分散液滴涂到处理干净的工作电极表面，干燥后得到NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.2，在步骤2所得的探针溶液中加入EDC、NHS活化，将步骤3.1所得修饰电极侵入到探针溶液中进行修饰，即可得到Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.3，将牛血清蛋白(BSA)溶于结合缓冲溶液中，滴到步骤3.2所得的Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极表面进行封闭，即可得到用于检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器。
上述检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的使用方法，具体包括以下步骤：
(1)以所述的检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极(饱和KCl)，铂丝电极为对电极，构建三电极***；
(2)在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I0，采用的电化学方法：循环伏安法；扫描范围：0.2V-1.35V；扫描速率：0.1V·S-1；
(3)制备待测细菌溶液及与抗生素作用后的待测细菌溶液。
步骤1，抗菌药物贮存液的制备；
用灭菌蒸馏水配制抗菌药物贮存液，其浓度不低于1000μg/mL。配制好的抗菌药物贮存液贮存于-60℃。
步骤2，配制Luria-Bertani(LB)培养基；
将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl溶于去离子水，搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在121℃下灭菌20min。
步骤3，待测细菌溶液的制备；
步骤3.1，将10μL大肠杆菌(E.coli BL21，不具耐药性)菌悬液接种到10mL LB培养基中，在37℃、180rmp条件下过夜震荡培养。然后再将培养后的菌液取100μL转接到10mL LB培养基中，继续培养至OD值为0.6。将培养所得细菌在4000rmp、4℃条件下离心10min,再用结合缓冲溶液重悬，重复三次。用结合缓冲溶液稀释成不同浓度，即可得到不具耐药性的E.coli BL21待测溶液。
步骤3.2，将10μL可合成β-内酰胺酶的大肠杆菌(NDM-1E.coli BL21，具有耐药性)菌悬液接种到10mL含有25μg/L卡那霉素的LB培养基中，在37℃、180rmp条件下过夜震荡培养。然后再将培养后的菌液取100μL转接到10mL含有25μg/L卡那霉素LB培养基中，培养至OD值为0.6，再加入100mΜ异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,继续培养2h。将培养所得的细菌在4000rmp、4℃下离心10min,再用结合缓冲溶液重悬，重复三次。最后，用结合缓冲溶液稀释成不同浓度，即可得到具有耐药性的NDM-1E.coli BL21待测细菌溶液。
步骤4，与抗生素相互作用后的E.coli BL21/NDM-1E.coli BL21待测溶液的制备；
将步骤3中所制备得到的细菌待测液用结合缓冲溶液稀释至OD值为0.2，再分别加入2mg/mL的抗生素溶液，在37℃、180rmp震荡孵育3h,稀释后即可得到抗生素作用后的细菌待测液。
(4)将工作电极浸入50μL已知浓度的E.coli BL21待测液中，60min后用缓冲溶液冲洗除去吸附的物质，在电化学发光测试液中，测试得到E.coli BL21浓度对应的电化学发光强度；重复该步骤得到多组不同E.coli BL21浓度对应的电化学发光强度数据；E.coliBL21浓度范围为5×10～5×107cells/mL，且按照E.coli BL21浓度由小到大的顺序进行测试；
(5)根据步骤(4)得到的多组不同E.coli BL21浓度对应的电化学发光强度数据，拟合得到细菌浓度与电化学发光强度之间的拟合曲线；
(6)将工作电极浸入50μL E.coli BL21/NDM-1E.coli BL21待测液、以及与各类抗生素相互作用后的待测液中60min，用缓冲溶液(pH＝8.0)冲洗除去吸附的物质，在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I。最后，根据检测细菌待测液前后信号变化率ΔI(ΔI＝I0-I/I0,I0检测细菌前的电化学发光强度，I为检测细菌后的电化学发光强度)判断细菌是否为具有耐药性的NDM-1E.coli BL21。
所述的电化学发光测试液为含50mM三丙胺(TPA)的缓冲溶液(10mM Tris-HCl,1mMCaCl2,1mM MnCl2，pH＝7.4)。
本发明所述电化学发光生物传感器可以检测耐β-内酰胺类抗生素的细菌，测试时步骤简单，电化学发光生物传感器组装好以后，与待测大肠杆菌溶液结合60min后就可以一步检测，有利于快速的检测细菌耐药性。
实施例1
一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，以检测细菌是否表达MβLs基因为例，所选用的细菌为E.coli BL21/NDM-1E.coli，具体制备步骤如下：
步骤1，制备NH2-MIL-53(Al)纳米片；
将AlCl3·6H2O(3mmol,0.7243g)溶解于15mL去离子水中，在搅拌条件下缓慢加入2-氨基-1,4-苯二甲酸(NH2-H2BDC,3mmol,0.5435g)，再继续搅拌搅拌30分钟。随后,将15mL的尿素(6mmol,0.3604g)水溶液逐滴加入到上述的混合液中继续搅拌30分钟。此后,将上述所的混合物转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中,在150℃条件下静置反应5h。反应完成后，将混合物缓慢冷却至室温，抽吸过滤得到乳白微黄色沉淀，并用大量去离子水冲洗干净。然后，将产品分散在20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌24h。最后，用等体积的甲醇代替DMF溶液，再继续搅拌24小时，反应完成后除去甲醇，在70℃条件下真空干燥过夜，即得到NH2-MIL-53(Al)纳米片。
步骤2，制备检测细菌耐药性的探针溶液：
用DMF溶液配制50μL 100μmol二(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌(N-琥珀亚酰胺酯)-二(六氟磷酸根盐)溶液，加入到缓冲溶液(10mM Tris-HCl,1mM CaCl2,1mMMnCl2,pH＝7.4)配制的1.5mL 10μmol半刀球蛋白(Con A)溶液中，在25℃且避光条件下缓慢搅拌6h。反应结束后即可得到用于检测细菌耐药性的探针溶液(Con A-Ru)。
步骤3，检测细菌耐药性的电化学发光传感器的组装；
步骤3.1，将步骤1中合成的NH2-MIL-53(Al)纳米片超声分散在DMF溶液中,最终浓度为0.1mg/mL,取10μL该分散液滴涂到处理干净的工作电极表面，干燥后得到NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.2，在步骤2所得的探针溶液中加入2mg/L EDC和5mg/L NHS活化，将步骤3.1所得修饰电极侵入到30μL 0.1μM活化后的探针溶液中进行修饰，修饰时间为2h,用缓冲溶液冲洗后即可得到Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.3，将牛血清蛋白(BSA)溶于结合缓冲溶液中，浓度为0.1％，取10μL滴到步骤3.2所得的Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极表面封闭30min，用缓冲溶液冲洗后即可得到用于检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器。
实施例2
一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，以检测细菌是否表达MβLs基因为例，所选用的细菌未E.coli BL21/NDM-1E.coli，具体制备步骤如下：
步骤1，制备NH2-MIL-53(Al)纳米片；
将AlCl3·6H2O(3mmol,0.7243g)溶解于15mL去离子水中，在搅拌条件下缓慢加入2-氨基-1,4-苯二甲酸(NH2-H2BDC,3mmol,0.5435g)，再继续搅拌搅拌30分钟。随后,将15mL的尿素(6mmol,0.3604g)水溶液逐滴加入到上述的混合液中继续搅拌30分钟。此后,将上述所的混合物转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中,在150℃条件下静置反应5h。反应完成后，将混合物缓慢冷却至室温，抽吸过滤得到乳白微黄色沉淀，并用大量去离子水冲洗干净。然后，将产品分散在20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌24h。最后，用等体积的甲醇代替DMF溶液，再继续搅拌24小时，反应完成后除去甲醇，在70℃条件下真空干燥过夜，即得到NH2-MIL-53(Al)纳米片。
步骤2，制备检测细菌耐药性的探针溶液：
用DMF溶液配制50μL 100μmol二(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌(N-琥珀亚酰胺酯)-二(六氟磷酸根盐)溶液，加入到缓冲溶液(10mM Tris-HCl,1mM CaCl2,1mMMnCl2)配制的1.5mL10μmol半刀球蛋白(Con A)溶液中，在25℃且避光条件下缓慢搅拌6h。反应结束后即可得到用于检测细菌耐药性的探针溶液(Con A-Ru)。
步骤3，电化学发光传感器的组装；
步骤3.1，将步骤1中合成的NH2-MIL-53(Al)纳米片超声分散在DMF溶液中,最终浓度为0.5mg/mL,取10μL该分散液滴涂到处理干净的工作电极表面，干燥后得到NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.2，在步骤2所得的探针溶液中加入2mg/L EDC和5mg/L NHS作为活化剂，将步骤3.1所得修饰电极侵入到30μL 7μM活化后的探针溶液中进行修饰，修饰时间为3h,用缓冲溶液冲洗后即可得到Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.3，将牛血清蛋白(BSA)溶于结合缓冲溶液中，浓度为0.5％，取10μL滴到步骤3.2所得的Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极表面封闭40min，用缓冲溶液冲洗后即可得到用于检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器。
实施例3
一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，以检测细菌是否表达MβLs基因为例，所选用的细菌为E.coli BL21/NDM-1E.coli，具体制备步骤如下：
步骤1，制备NH2-MIL-53(Al)纳米片；
将AlCl3·6H2O(3mmol,0.7243g)溶解于15mL去离子水中，在搅拌条件下缓慢加入2-氨基-1,4-苯二甲酸(NH2-H2BDC,3mmol,0.5435g)，再继续搅拌搅拌30分钟。随后,将15mL的尿素(6mmol,0.3604g)水溶液逐滴加入到上述的混合液中继续搅拌30分钟。此后,将上述所的混合物转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中,在150℃条件下静置反应5h。反应完成后，将混合物缓慢冷却至室温，抽吸过滤得到乳白微黄色沉淀，并用大量去离子水冲洗干净。然后，将产品分散在20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，室温搅拌24h。最后，用等体积的甲醇代替DMF溶液，再继续搅拌24小时，反应完成后除去甲醇，在70℃条件下真空干燥过夜，即得到NH2-MIL-53(Al)纳米片。
步骤2，制备检测细菌耐药性的探针溶液：
用DMF溶液配制50μL 100μmol二(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌(N-琥珀亚酰胺酯)-二(六氟磷酸根盐)溶液，加入到缓冲溶液(10mM Tris-HCl,1mM CaCl2,1mMMnCl2)配制的1.5mL10μmol半刀球蛋白(Con A)溶液中，在25℃且避光条件下缓慢搅拌6h。反应结束后即可得到用于检测细菌耐药性的探针溶液(Con A-Ru)。
步骤3，电化学发光传感器的组装；
步骤3.1，将步骤1中合成的NH2-MIL-53(Al)纳米片超声分散在DMF溶液中,最终浓度为1mg/mL,取10μL该分散液滴涂到处理干净的工作电极表面，干燥后得到NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.2，在步骤2所得的探针溶液中加入2mg/L EDC和5mg/LNHS作为活化剂，将步骤3.1所得修饰电极侵入到30μL 10μM活化后的探针溶液中进行修饰，修饰时间为4h,用缓冲溶液冲洗后即可得到Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.3，将牛血清蛋白(BSA)溶于结合缓冲溶液中，浓度为1％，取10μL滴到步骤3.2所得的Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极表面封闭60min，用缓冲溶液冲洗后即可得到用于检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器。
应用实例
实例1检测细菌浓度
一种检测细菌浓度的的电化学发光生物传感器的使用方法，以检测E.coli BL21为列，包括如下步骤：
(1)以上述制备实施例1制备得到的检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极***；
(2)在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I0，采用的电化学方法：循环伏安法；扫描范围：0.2V-1.35V；扫描速率：0.1V·S-1；该电化学发光测试液为含50mM三丙胺(TPA)的缓冲溶液(10mM Tris-HCl,1mM CaCl2,1mM MnCl2)。
(3)制备待测细菌溶液
步骤1，配制Luria-Bertani(LB)培养基；
将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl溶于去离子水，搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在121℃下灭菌20min。
步骤3，E.coli BL21待测细菌溶液的制备；
步骤3.1，将10μL大肠杆菌(E.coli BL21，不具耐药性)菌悬液接种到10mL LB培养基中，在37℃、180rmp条件下过夜震荡培养。然后再将培养后的菌液取100μL转接到10mL LB培养基中，继续培养至OD600值为0.6。将培养所得细菌在4000rmp、4℃条件下离心10min,再用结合缓冲溶液重悬，重复三次。用结合缓冲溶液稀释成不同浓度，即可得到E.coli BL21待测溶液。
(4)再将实施例1所制备的工作电极依次浸入到上述(3)中所制备的50μL浓度分别为5×10cells/m、5×102cells/mL、5×103cells/mL、5×104cells/mL、5×105cells/mL、5×106cells/mL、5×107cells/mL的E.coli BL21待测溶液中，60min后，用缓冲溶液(pH＝8.0)清洗，在电化学发光测试溶液中，测试不同浓度时的电化学发光强度I(不同浓度的E.coliBL21对应的电化学发光信号，如图2a所示)。
(5)根据测试结果，发现，电化学发光强度I在E.coli BL21浓度为5×10cells/m～5×104cells/mL范围内呈线性关系I＝-454.89lg[E.coli BL21]+2204.9,R2＝0.9798(如图2b所示)。
(5)将实施例1所制备的工作电极浸入到50μL含E.coli BL21的待测溶液中，60min后，用缓冲溶液(pH＝7.4)清洗，在电化学发光测试溶液中，测试电化学发光强度I；根据电化学发光强度与大肠杆菌浓度之间的线性关系，得到大肠杆菌的浓度值CE.coli，单位为cell/mL。
由该实例1可知，电化学发光强度值与大肠杆菌浓度在5×10cells/m～5×104cells/mL浓度范围内呈线性关系.
实例2检测细菌耐药性
一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的使用方法，以检测细菌是否表达MβLs基因为例，所选用的细菌为E.coli BL21/NDM-1E.coli BL21，包括如下步骤：
(1)以上述制备实施例1制备得到的检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极***；
(2)在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I0，采用的电化学方法：循环伏安法；扫描范围：0.2V-1.35V；扫描速率：0.1V·S-1；该电化学发光测试液为含50mM三丙胺(TPA)的缓冲溶液(10mM Tris-HCl,1mM CaCl2,1mM MnCl2)。
步骤1，抗菌药物贮存液的制备；
用灭菌蒸馏水配制抗菌药物贮存液，其浓度不低于1000μg/mL。配制好的抗菌药物贮存液贮存于-60℃。
步骤2，配制Luria-Bertani(LB)培养基；
将10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl溶于去离子水，搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在121℃下灭菌20min。
步骤3，待测细菌溶液的制备；
步骤3.1，将10μL大肠杆菌(E.coli BL21，不具耐药性)菌悬液接种到10mL LB培养基中，在37℃、180rmp条件下过夜震荡培养。然后再将培养后的菌液取100μL转接到10mL LB培养基中，继续培养至OD值为0.6。将培养所得细菌在4000rmp、4℃条件下离心10min,再用结合缓冲溶液重悬，重复三次。用结合缓冲溶液稀释至OD600为0.2，再进一步的稀释104倍，即可得到E.coli BL21待测溶液。
步骤3.2，将10μL可合成β-内酰胺酶的大肠杆菌(NDM-1E.coli BL21，有耐药性)菌悬液接种到10mL含有25μg/L卡那霉素的LB培养基中，在37℃、180rmp条件下过夜震荡培养。然后再将培养后的菌液取100μL转接到10mL含有25μg/L卡那霉素LB培养基中，培养至OD值为0.6，再加入100mΜ异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,继续培养2h。将培养所得的细菌在4000rmp、4℃下离心10min,再用结合缓冲溶液重悬，重复三次。最后，用结合缓冲溶液稀释至OD600为0.2，再进一步的稀释104倍，即可得到NDM-1E.coli BL21待测溶液。
步骤4，与抗生素相互作用后的E.coli BL21/NDM-1E.coli BL21待测溶液的制备；
将步骤3中所制备得到的细菌待测液用结合缓冲溶液稀释至OD值为0.2，再分别加入2mg/mL四环素、左氧氟沙星、头孢匹罗、亚胺培南溶液，在37℃、180rmp震荡孵育3h,再用结合缓冲溶液稀释104倍，得到与抗生素相互作用后的E.coli BL21/NDM-1E.coliBL21待测液。
(3)再将实施例1所制备的工作电极分别浸入50μL上述(3)中制备得到的E.coliBL21/NDM-1E.coli BL21和与抗生素作用后的待测溶液中，60min后，用结合缓冲溶液(pH＝7.4)冲洗，在电化学发光测试溶液中，测试不同浓度时的电化学发光强度I。
(4)根据测试结果，分别计算ΔI/I0,结果如图3所示。
由该实例2可知，如果待测细菌没有耐药性(E.coli BL21)，与上述四种抗生素中任意的一种相互作用后，与未与抗生素作用相比ΔI/I0明显减小。如果待测细菌具有耐药性(NDM-1E.coli BL21)，若NDM-1E.coli BL21与非β-内酰胺类的抗生素(四环素、左氧氟沙星)相互作用后，细菌表达的β-内酰胺酶不能水解这类抗生素，与未与抗生素作用相比ΔI/I0明显减小。若NDM-1E.coli BL21与β-内酰胺类的抗生素(头孢匹罗、亚胺培南)相互作用后，抗生素被细菌表达的β-内酰胺酶水解失效，与未与抗生素作用相比ΔI/I0无明显变化。因此，可以根据分析ΔI/I0的变化情况来判断细菌是否具有耐药性。
实例3稳定性测试
以上述制备实施例1制备得到的检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器为工作电极，实验条件与上述实例1相同，ECL生物传感器与5×103cells/mL E.coli BL 21相互作用后，在0.2V-1.35V下连续扫描10圈ECL响应信号，结果如图4所示。ECL生物传感器的ECL信号强度连续扫描10圈的相对标准偏差为2.8％。结果表明，本发明制备的ECL生物传感器具有良好的稳定性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备NH2-MIL-53(Al)纳米片；
步骤1.1：将0.7243g 3mmol的AlCl3·6H2O溶解于15mL去离子水中；
步骤1.2：在搅拌条件下缓慢加入0.5435g 3mmol 2-氨基-1,4-苯二甲酸，再继续搅拌30分钟，得到混合液1；
步骤1.3：将15mL 6mmol的尿素水溶液逐滴加入到所述混合液1中继续搅拌30分钟，得到混合液2；
步骤1.4：将所述混合液2转移到50mL聚四氟乙烯高压反应釜中,在150℃条件下静置反应5h，得到混合液3；
步骤1.5：将所述混合液3缓慢冷却至室温，抽吸过滤得到乳白微黄色沉淀，并用大量去离子水冲洗干净，得到混合液4；
步骤1.6：将混合液4分散在20mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌24h；
步骤1.7：用等体积的甲醇代替N,N-二甲基甲酰胺溶液，再继续搅拌24小时，反应完成后除去甲醇，在70℃条件下真空干燥过夜，即得到NH2-MIL-53(Al)纳米片；
步骤2，制备检测细菌耐药性的探针溶液：
用N,N-二甲基甲酰胺溶液配制50μL 100μmol二(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌(N-琥珀亚酰胺酯)-二(六氟磷酸根盐)溶液，加入到缓冲溶液配制的1.5mL 10μmol半刀球蛋白(Con A)溶液中，在25℃且避光条件下缓慢搅拌6h；
步骤3，检测细菌耐药性的电化学发光传感器的组装；
步骤3.1，将步骤1中合成的NH2-MIL-53(Al)纳米片超声分散在DMF溶液中,将该分散液滴涂到处理干净的工作电极表面，干燥后得到NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.2，在步骤2所得的探针溶液中加入EDC、NHS进行活化，将步骤3.1所得修饰电极侵入到活化的探针溶液中进行修饰，即可得到Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极；
步骤3.3，将牛血清蛋白(BSA)溶于结合缓冲溶液中，滴到步骤3.2所得的Con A-Ru/NH2-MIL-53(Al)/GCE修饰电极表面进行封闭，即可得到用于检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，缓冲溶液为：含有1mM CaCl2,1mM MnCl2的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液，缓冲溶液PH＝7.4。
3.根据权利要求2所述的一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3.1中，修饰到工作电极表面的NH2-MIL-53(Al)纳米片的分散浓度为0.1-1mg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤3.1中，工作电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的一种。
5.根据权利要求4所述的一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤3.2中，EDC、NHS的浓度分别为2mg/L和5mg/L,探针溶液Con A-Ru的浓度为0.1-10μM，修饰时间为2-4h。
6.根据权利要求5所述的一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤3.3中，BSA溶液浓度为0.1-1％，滴到电极表面的体积为10μL，封闭时间为30-60min。
7.一种检测细菌耐药性的电化学发光生物传感器，其特征在于，所述电化学发光生物传感器由权利要求1-6任一所述的制备方法制得。
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