CN104749262A

CN104749262A - 一种快速测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的方法

Info

Publication number: CN104749262A
Application number: CN201310737449.1A
Authority: CN
Inventors: 徐永刚; 宇万太; 马强; 周桦
Original assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Institute of Applied Ecology of CAS
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-12-27
Also published as: CN104749262B

Abstract

本发明涉及一种新的畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的提取方法，1）将冻干的禽畜粪便样品研磨过筛；2）称取0.50-1.00g样品置于离心管中，加入50%氯化钙盐酸缓冲液5-10mL，涡旋混合1分钟，超声提取15-30分钟，4500r/min离心10分钟，收集上清液；3）首先用高效液相色谱仪器对氟喹诺酮类药物中的一种或二种以上的标准样品分别进行定性分析，确定其保留时间；4）以峰面积为纵坐标，每种氟喹诺酮药物的对应的浓度（ng/mL）为横坐标建立各氟喹诺酮药物化合物标准曲线；5）对待测样品中的目标物含量进行高效液相色谱测定，根据保留时间确定目标物种类，根据标准曲线确定其含量。本发明重复性好，灵敏度高。

Description

一种快速测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的方法

技术领域

本发明涉及畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的测定，具体的说是一种新的畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的提取方法。

背景技术

氟喹诺酮是一类全人工合成抗菌类药物，在化学上与萘啶酮酸相关，其作用机理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，破坏细菌的代谢和繁殖，迅速杀灭细菌。最初这类药物用于治疗尿道感染，现在已发展到治疗***感染疾病，并且在养殖业中作为预防和治疗药物普遍使用。氟喹诺酮类药物在动物体内吸收性差，75%以上会以原形药物形式排出体外（参考文献1：管荷兰，于海凤，王嘉宇.氟喹诺酮类抗生素在土壤中的归趋及其生态毒性研究进展.生态学杂志，2012,31(12):3228-3234）。近年来，氟喹诺酮类药物药物在养殖畜禽粪中被普遍发现，含量达到mg·kg^-1级别（参考文献2：马丽丽，郭昌胜，胡伟，沙健，朱兴旺，阮悦斐，王玉秋.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定土壤中氟喹诺酮、四环素和磺胺类抗生素.分析化学研究报告，2010，38(1):21-26.；参考文献3：IA.Investigation of thetetracycline,sulfonamide,and fluoroquinolone antimicrobial compoundsin animal manure and agricultural soils in Turkey.Science of the TotalEnvironment，2009，407：4652–4664）。那么大量氟喹诺酮类药物将随畜禽粪便进入环境，将会对地表水、农田土壤，甚至地下水造成污染。因此，对粪便中残留的氟喹诺酮类药物的测定尤为重要。

现阶段国内外提取畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的方法多借鉴测定农药残留的方法。使用以上方法有如下缺点：1）其它方法多采取有机试剂提取，对人体有害；2）部分方法提取后续步骤需要使用固相萃取柱分离，其价格较贵，也会造成操作复杂；3）部分方法多采用液相串联质谱，虽然具有更低的灵敏度，对样品的分离度要求不高，但是存在较强的基质效应，尤其是对复杂的粪便样品，并且仪器的使用及维护成本很高。

发明内容

本发明的目的是提供一种重复性好，灵敏度高，并且简单易行的测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1）采集的禽畜粪便样品首先需要冻干处理，冻干后的样品避光保存，分析前用研钵研磨，并过2mm筛后进行样品前处理；

2）准确称取0.50-1.00g样品置于10-20mL塑料离心管中，加入50%氯化钙盐酸缓冲液5-10mL，涡旋混合1分钟，超声提取15-30分钟，离心(4500r/min)10分钟，收集上清液；

3）残渣用上述方法反复提取2次，合并上清液；

4）溶液过0.22μm滤膜收集于棕色样品瓶中待测；

5）首先用高效液相色谱仪器对单一标准样品进行定性分析（浓度为10-100ng/mL），确定其保留时间。色谱条件：色谱柱为KromasilC18（5um，250×4.6mm)，于激发波长280nm、发射波长450nm处进行检测，流动相为甲醇-水(78.5:21.5，V/V)，流速为1.0mL·min^-1，进样量为20μL。

6）标准曲线制备：制备混合标准品工作液系列浓度为10，50，100，500，1000ng/mL（每种标准品的浓度），在同上色谱条件下进行测定。以为峰面积为纵坐标，氟喹诺酮浓度（ng/mL）为横坐标建立各化合物标准曲线。

7）在同上色谱条件下，对待测样品中的目标物含量进行测定，根据保留时间确定目标物种类，根据标准曲线确定其含量。

重要试剂的配置：

50%氯化钙盐酸缓冲液：50g氯化钙溶于100mL去离子水，用1mol浓度的盐酸调节pH为3.0，即制备成提取液。

流动相：甲醇与水按照78.5:21.5体积比配置所需流动相。

本方法涉及的原理：

低pH下，氟喹诺酮类药物主要以阳离子形态存在，其在粪便中吸附以阳离子吸附为主；而金属离子会同阳离子态的氟喹诺酮类药物竞争吸附位，从而抑制氟喹诺酮吸附或将已吸附的氟喹诺酮解吸下来；且价态越高竞争吸附能力越强：M⁺(Na⁺、K⁺)<M²⁺(Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺)<M³⁺(Al³⁺)。

本发明创新点如下：

1、采用非有机试剂提取：其它方法多采用有机试剂提取，对人体危害较大；另外，本方法中的提取液所需药品容易购买且价格便宜。

2、不使用固相萃取柱：其它方法多采用固相萃取柱分离提取样品，造成提取过程耗时费力，且此消耗品价格较贵。

3、采用高效液相色谱测定：本方法采用配有荧光检测器的高效液相色谱测定提取样品中的氟喹诺酮，该仪器具有速度快、分辨率高和灵敏度高等优点，且运行和维护成本低，完全能达到测定需要。

注意事项：

1）试验中所用器皿需彻底洗净，并用离子水冲洗，以确保无氟喹诺酮类药物存在。

2）若所测定样品中含有植物残体，塑料等杂物，应在冷冻干燥前剔除，以免影响检查结果。

3）氟喹诺酮类药物容易光解，所以整个提取过程最好不要在强光下进行，特别是过滤后的溶液应该保存在棕色试剂瓶中，若短时间内不测定，最好保存在4℃条件下。

具体实施方式

实施例1：测定本方法的回收率、检测限与定量限

具体过程如下：

1）在辽宁省选取规模化养猪场采集猪粪样品，进行多点采样并混合，样品采集后用黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中冷藏存放，然后保持冷冻状态下尽快运回实验室，并进行冷冻干燥处理；

2）冻干后的样品避光保存，分析前用研钵研磨，并过2mm筛后收集过筛后的样品；

3）取四组猪粪样品（每组三份平行的重复样品）中均加入四种常见的氟喹诺酮类药物（诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星）混标溶液，混标溶液中四种化合物的加标浓度分别设置为0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg和10.0mg/kg，混合均匀后放置24h使药物与样品介质充分接触，以模拟实际情况；

4）准确称取每组0.50g样品分别置于10mL塑料离心管中，加入50%氯化钙盐酸缓冲液5mL，涡旋混合60S，超声提取15分钟，离心(4500r/min)10分钟，收集上清液；

5）残渣用上述方法反复提取2次，合并上清液，溶液过0.22μm滤膜收集透过滤膜的液体于棕色样品瓶中待测；

6）用高效液相色谱仪器对100ng/mL的单一标准样品（诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星）进行定性分析，确定其保留时间。色谱条件:色谱柱为Kromasil C18（5um，250×4.6mm)，流动相为甲醇-水(78.5:21.5，V/V)，流速为1.0mL·min^-1，进样量为20μL，于激发波长280nm、发射波长450nm处进行检测。

7）标准曲线：制备四种氟喹诺酮的混合标准品工作液，混合标准品工作液中诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星的系列浓度分别为10、50、100、500、1000ng/mL，以峰面积为纵坐标，氟喹诺酮浓度（ng/mL）为横坐标建立各化合物标准曲线；根据保留时间定性，根据标准曲线确定其含量；根据10ng/mL混合标准品工作液色谱峰，按3倍信噪比计算方法检测限，按10倍信噪比计算样品定量限。

本方法测定猪粪中氟喹诺酮类药物的平均回收率的结果如表1所示。从表中可以看出，该方法回收率很好，测定样品的回收率均在85%以上，定量限在μg/kg级别，因此该方法完全能满足测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的需要。

表1本方法回收率结果

实施例2：对比本方法与其它方法测定的精确度和简便性

本方法具体过程如下：

1)在辽宁省选取规模化养猪场采集猪粪样品，进行多点采样并混合，样品采集后用黑色塑料袋密封，并立即存放于冰盒中冷藏存放，然后保持冷冻状态下尽快运回实验室，并进行冷冻干燥处理；

2)冻干后的样品避光保存，分析前用研钵研磨，并过2mm筛后收集过筛的样品；

3)准确称取三份0.50g猪粪样品分别置于10mL塑料离心管中，加入50%氯化钙盐酸缓冲液5mL，涡旋混合60S，超声提取15分钟，离心(4500r/min)10分钟，收集上清液；

4)残渣用上述方法反复提取2次，合并上清液，溶液过0.22μm滤膜收集透过滤膜的液体于棕色样品瓶中待测；

5)用高效液相色谱仪器对浓度为100ng/mL的单一标准样品（诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星）进行定性分析，确定其保留时间。色谱条件:色谱柱为Kromasil C18（5um，250×4.6mm)，流动相为甲醇-水(78.5:21.5，V/V)，流速为1.0mL·min^-1，进样量为20μL，于激发波长280nm、发射波长450nm处进行检测。

6)标准曲线：制备四种氟喹诺酮的混合标准品工作液，混合标准品工作液中诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星的系列浓度分别为10、50、100、500、1000ng/mL，以峰面积为纵坐标，氟喹诺酮浓度（ng/mL）为横坐标建立各化合物标准曲线；根据保留时间定性，根据标准曲线确定其含量。

方法1（文献来源：赵扬，郑志明，金社胜，周大卫，侯晓林.液质联用法同时测定猪粪便中16种（氟）喹诺酮类药物残留.农业环境科学学报2011,30(6):1248-1253.）测定具体过程如下：

准确称取三份冻干后的猪粪样品0.50g置20mL离心管，加入质量浓度50％硝酸镁-4％氨水的混合液8mL，涡旋混合1分钟，超声提取30分钟，离心（12000r／min）10分钟。取4mL上清液过HLB固相萃取柱（预先用甲醇、超纯水活化），2％甲醇淋洗，用5mL4％氨化甲醇溶液洗脱。洗脱液45℃用氮气吹至近干，用0.1％甲酸溶液定容至l mL，涡旋30秒，过0.22m滤膜，供液相色谱-质谱／质谱分析。

色谱-质谱条件：

（1）色谱条件：BEH C18色谱柱（1.7mm，2.1×50mm），流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液，柱温35℃，流速0.3mL·min^-1，梯度洗脱程序：0～6min，10%；6～7.5min，10%～65%；7.5～8min，65%～10%；8～9min，10%，进样量5μL。

（2）质谱条件：电喷雾离子源（ESI⁺）；雾化气、脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为氩气；源温度为115℃，脱溶剂气温度为360℃；脱溶剂气流速为550L·h^-1，锥孔气流速为50L·h^-1；毛细管电压为0.8kV，检测方式为MRM模式。

方法2（文献来源：张敏，刘庆玉，敖永华.高效液相色谱-荧光检测畜禽粪污中四种氟喹诺酮类抗生素残留.湖北农业科学,2012,51(3):602-604.）测定具体过程如下：

准确称取三份冻干后的猪粪便样品1.00g，置于10mL离心管中，加2mL乙腈和0.2g无水硫酸钠浸泡提取，涡漩混匀1分钟，超声提取25分钟，离心（4000r／min）10分钟，将上清液转入浓缩瓶中，再重复提取两次，合并上清液。样品上层清液用4mL正己烷萃取两次，氮气吹至近干，用2mL乙腈饱和的正己烷溶解残余物，转入10mL离心管中，4000r／min离心10分钟，弃去正己烷层，下层清液用0.22m滤膜过滤，供高效液相色谱仪测定。

采用高效液相色谱-荧光检测，以0.01mol/L四丁基溴化胺（pH3.0）/乙腈（94/6,V/V）为流动相，于激发波长280nm、发射波长480nm处进行检测。

使用本方法与其它方法测定样品氟喹诺酮类药物的结果如表2所示。由结果可以看出，方法1和2测定的结果明显低于本方法测定的结果，这是因为其它方法提取过程采用固相萃取柱或有机试剂分离纯化提取液造成测定目标物损失；本方法测定所需时间明显短于其它两种方法。

表2本方法与其它方法测定猪粪样品氟喹诺酮类药物结果对比

注：时间为提取12个样品所需时间

结论

由以上两实例的结果可以看出，本发明重复性好，灵敏度高，简单易行的优点，能够满足测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的分析要求。

Claims

1.一种快速测定畜禽粪便中氟喹诺酮类药物的方法，其特征在于：

1）将冻干的禽畜粪便样品研磨，并过2mm筛后，筛下组份待用；

2）准确称取0.50-1.00g样品置于离心管中，加入50%氯化钙盐酸缓冲液5-10mL，涡旋混合1分钟，超声提取15-30分钟，4500r/min离心10分钟，收集上清液；

3）残渣用上述步骤2）的方法反复提取2-5次，合并上清液；

4）溶液过0.22μm滤膜收集透过滤膜样品待测；

5）首先用高效液相色谱仪器对氟喹诺酮类药物中的一种或二种以上的标准样品分别进行定性分析，确定其保留时间；

6）标准曲线制备：制备系列浓度的氟喹诺酮类药物中的一种或二种以上的混合标准品工作液，标准品工作液中每种标准品的系列浓度分别为10、50、100、500、1000ng/mL，在同上步骤5）相同的色谱条件下进行高效液相色谱测定；

以峰面积为纵坐标，每种氟喹诺酮药物的对应的浓度（ng/mL）为横坐标建立各氟喹诺酮药物化合物标准曲线；

7）在同上步骤5）色谱条件下，对待测样品中的目标物含量进行高效液相色谱测定，根据保留时间确定目标物种类，根据标准曲线确定其含量。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤1）采集的禽畜粪便样品首先需要冻干处理，冻干后的样品避光保存，分析前用研钵研磨，并过2mm筛后进行样品前处理。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述氟喹诺酮类药物为诺氟沙星、环丙沙星、洛美沙星和恩诺沙星中的一种或二种以上。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：色谱条件：色谱柱为Kromasil C18（5um，250×4.6mm)，于激发波长280nm、发射波长450nm处进行检测，流动相为甲醇-水(78.5:21.5，V/V)，流速为1.0mL·min^-1，进样量为20μL。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：50%氯化钙盐酸缓冲液：50g氯化钙溶于100mL去离子水，用1mol浓度的盐酸调节pH为3.0，即制备成提取液。