CN109890410A - 免疫球蛋白和它的用途 - Google Patents

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antibody
antigen
monoclonal antibody
conjugate
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M.马希尔拉格
R.J.帕奇
张瑞
M.A.凯斯
M.沃尔
章越梅
S.M.朗瓦拉
J.N.里奥纳德
R.C.卡马乔
M.J.亨特
K.E.达奎诺
W.爱德华兹
R.V.斯万森
W.简
E.齐
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Janssen Pharmaceutica NV
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Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体平台，该单克隆抗体平台被设计成偶联至治疗性肽以增加该治疗性肽在受试者体内的半衰期。本发明另外涉及药物组合物和其使用方法。

Description

免疫球蛋白和它的用途
技术领域
本发明大体上涉及一种新型抗体或其片段，以及其作为载体偶联到治疗性肽以增加治疗性肽的体内半衰期的用途。本发明另外涉及药物组合物和其使用方法。
相关申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2016年10月27日的美国临时专利申请号62/413,613和提交于2016年10月27日的美国临时专利申请号62/413,586的优先权。每个公开均全文以引用方式并入本文。
电子递交的序列表的引用
本专利申请包含序列表，该序列表通过EFS-Web、作为ASCII格式的序列表以电子方式递交，文件名为“PRD3459 Sequence Listing”并且创建日期为2017年10月23日，并且大小为20kb。通过EFS-Web递交的序列表是说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。如果在本文所述的信息和通过EFS-Web用文件名“PRD3459 Sequence Listing”以电子方式递交的序列表之间关于SEQ ID NO:1-27的结构存在任何不一致，那么以本文的信息为准。
背景技术
基于肽的治疗剂由于它们可以提供特异性和选择性而经常被探索和开发，如许多已批准的基于肽的治疗所证实，但是它们的使用方式受到它们的相对短的体内半衰期的限制。已有许多半衰期延长策略被评估并且与基于肽的治疗剂一起利用。抗体或抗体片段已被用作药理学活性部分的半衰期延长部分，以防止或缓和药理学活性部分的快速体内消除。
需要一种改良的免疫球蛋白，该免疫球蛋白可以用作药理学活性部分、优选地基于肽的治疗剂的药理学非活性半衰期延长部分。
上述讨论仅被提出来提供对本领域所面对的问题的实质的更好理解，并且不应以任何方式理解为对现有技术的认可，也不应将本文对任何参考文献的引用理解为认可此类参考文献构成本专利申请的“现有技术”。
发明内容
在一个总的方面中，本发明涉及一种分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别具有SEQ ID NO:16、17、18、19、20和21的多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变结构域(VH)和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变结构域(VL)。更优选地，本发明的分离单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:13的多肽序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:15的多肽序列的轻链(LC)。
本发明还涉及一种编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的分离核酸；一种包含该核酸的载体，优选地表达载体；和一种包含该载体的宿主细胞。另外提供一种产生本发明的分离单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在产生单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养本发明的宿主细胞，以及从细胞或培养物回收抗体或其抗原结合片段。
本发明的实施方案包括直接或通过接头缀合至至少一个药理学活性部分、优选地治疗性肽的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段。本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段可以缀合至任何治疗性肽。治疗性肽的示例包括但不限于胃泌酸调节素、胰高血糖素样肽1(GLP1)、酪酪肽(PYY)、毒蜥外泌肽(exendin)(艾塞那肽(exenatide))、胰淀素(amylin)(普兰林肽(pramlintide))、α-黑色素细胞刺激素(MSH)、***和安非他明调节转录物(CART)、神经肽Y受体Y1(NPY1)拮抗剂、神经肽Y受体Y5(NPY5)拮抗剂、神经降压素S、神经肽B、神经肽W、生长素释放肽(ghrelin)、蛙皮素样受体3(BRS3)、甘丙肽、胆囊收缩素(CCK)、食欲素(orexin)、黑色素聚集素(MCH)、催产素(oxytocin)和顶压素(stresscopin)。
另外提供一种产生缀合至治疗性肽的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括将引入至治疗性肽的侧链上的亲电体、优选地溴代乙酰胺或马来酰亚胺与单克隆抗体或其抗原结合片段的巯基基团、优选地SEQ ID NO:18的半胱氨酸残基的巯基基团反应，从而在治疗性肽和单克隆抗体或其抗原结合片段之间形成共价键。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含直接或通过接头缀合至至少一个药理学活性部分、优选地治疗性肽的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
本发明的另一个总的方面涉及一种增加治疗性肽在受试者体内的半衰期的方法，该方法包括将治疗性肽与单克隆抗体或其抗原结合片段缀合，单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:16、17、18、19、20和21的多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中将治疗性肽在巯基基团、优选地SEQ ID NO:18的Cys残基的巯基基团处缀合至单克隆抗体或其抗原结合片段。
在阅读以下具体实施方式和权利要求书之后，将更好地理解本发明的另外方面、特征和有点。
附图说明
结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施例的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
图1：示出根据本发明实施方案的总体肽-mAb缀合策略。X表示引入至治疗性肽侧链上的亲电体，诸如溴代乙酰胺或马来酰亚胺，它与工程化至半衰期延长mAb的CDR中的Cys残基的巯基基团位点特异性地反应，在治疗性肽和mAb之间形成共价键。
图2：在PH9H5_VH(SEQ ID NO:4)和PH9L3_VL(SEQ ID NO:3)中选择用于取代的CDR残基的概述。用Cys取代的残基用粗体和下划线表示。
图3：示出化合物1(SEQ ID NO:2)的结构。
图4：DIO小鼠中化合物1的药代动力学。
图5：食蟹猴中化合物1的药代动力学。
图6：用化合物1处理的DIO小鼠的食物摄取：短期给药。
图7：用化合物1处理的DIO小鼠的体重减轻：短期给药。
图8：用化合物1处理的DIO小鼠的食物摄取：长期给药。
图9：用化合物1处理的DIO小鼠的体重减轻：长期给药。
图10：示出根据本发明的一个实施方案产生单克隆抗体胃泌酸调节素(mAb-OXM)化合物的反应方案。上部反应为在mAb(例如，MSCB97)的Cys102处二硫化物的还原。下部反应为还原mAb与OXM肽变体的缀合。R为半胱氨酸或谷胱甘肽。MSCB97重链上的Cys102示出为侧接氨基酸作为它们的单字母代码。OXM是指肽变体的氨基酸部分。示出了Aib2、Lys30和溴乙酰化离散聚乙二醇(dPEG)12间隔物。mAb的His1显示为单字母代码。
图11：示出化合物2(SEQ ID NO:27)的结构。
图12：示出在168小时内化合物2在人血浆中的功能稳定性的图。OXM肽类似物mAb缀合物化合物2▲、对照组1(其先前已证明在离体人血浆中稳定)◆、对照组2(其先前已证明在离体人血浆中不稳定)●和○以及另外的OXM肽类似物mAb缀合物化合物3(与H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRARDFVEWLLNK-(COCH2CH2(OCH2CH2)12NHCOCH2Br)-NH2缀合的mAb(SEQ IDNO:25))和化合物4(与H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRARDFVEWLLNTK-(COCH2CH2(OCH2CH2)12NHCOCH2Br)-NH2缀合的mAb(SEQ ID NO:26))▼的归一化至时间零(t＝0)的剩余百分比，随以小时(hr)为单位的时间推移在X轴上。
图13：示出在168小时内化合物2在猴子血浆中的功能稳定性的图。化合物2▲、对照组1(先前证明在离体人血浆中稳定)◆、对照组2(先前证明在离体人血浆中不稳定)●和○以及另外的OXM肽类似物mAb缀合物化合物3和化合物4▼的归一化至时间零(t＝0)的剩余百分比，随以小时(hr)为单位的时间推移在X轴上。
图14：示出显示用化合物2处理的食蟹猴中食物摄取的变化％的图。
图15：示出显示用化合物2处理的食蟹猴中体重减轻的变化％的图。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、物质、设备、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确表示，如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围内的所有单个数值，包括此类范围内的整数和该范围内的分数。
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施例的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B均为真(或存在)。
还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特征时，本文使用的术语“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语指示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他***误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。
在两个或更多个核酸或多肽序列(例如，环状PYY3-36多肽序列、胃泌酸调节素多肽序列、抗体轻链或重链序列)的上下文中，术语“同一的”或“同一性”百分比是指在进行比较和比对以获得最大对应时，如根据本公开使用一种序列比较算法或通过使用本领域中熟知的方法的目视检查所测量的，相同或具有指定百分比的相同胺基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。随后基于指定程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可进行序列的最佳比对以实现比较，例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性方法研究，通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wi)或通过目视检查(大致上参见，Current Protocolsin Molecular Biology,F.M.Ausubel等编，Current Protocols,a joint venturebetween Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,(1995年增刊)(Ausubel))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例为BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。用于执行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心公共可利用的。
两个核酸序列或多肽基本上同一的另一个指示为，第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽具有免疫交叉反应，如下文所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上同一，例如，在两种多肽仅因保守取代而不同的情况下。两个核酸序列基本上同一的另一个指示为，两个分子在严格条件下彼此杂交，如下文所述。
如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人类等，更优选地为人类。
就本发明方法而言，术语“施用”意指通过使用本发明缀合物或其形式、组合物或药物来治疗性地或预防性地预防、治疗或改善如本文所述的综合征、障碍或疾病的方法。此类方法包括在治疗过程中的不同时间施用有效量的所述缀合物、缀合物形式、组合物或药物，或者以组合形式同时施用。本发明的方法应理解为涵盖所有已知的治疗性处理方案。
术语“有效量”意指在组织***、动物或人中引起生物学反应或药物反应的活性缀合物或药剂的量，而这些生物学反应或药物反应正是研究人员、兽医、医生或其它临床医师所寻求的，包括预防、治疗或改善所治疗的综合征、障碍或疾病的症状。
如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及通过组合指定量的指定成分而直接或间接得到的任何产品。
如本文所用，术语“偶联”是指两个或更多个对象结合或连接在一起。当提及化学或生物化合物时，偶联可以是指两个或更多个化学或生物化合物之间的共价连接。通过非限制性示例，本发明抗体可以与感兴趣肽偶联以形成抗体偶联肽。抗体偶联肽可以通过设计成将抗体缀合至肽的特定化学反应来形成。在某些实施方案中，本发明抗体可以通过接头与本发明肽共价偶联。接头可以例如首先共价连接至抗体或肽，然后共价连接至肽或抗体。
如本文所用，术语“接头”是指包含将肽共价连接至抗体的共价链或原子链的化学模块。接头可以包括但不限于肽接头、烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头、由PEG和嵌入杂环组成的杂交接头以及烃链。PEG接头可以例如包含2-24个PEG单元。
如本文所用，术语“缀合”是指抗体或其片段共价偶联至药物活性部分。术语“缀合至”是指本发明抗体或其片段直接或通过接头间接地共价键合至或共价连接至药物活性部分、优选地治疗性肽。通过非限制性示例，抗体可以是本发明单克隆抗体，并且药物活性部分可以是治疗性肽，诸如环状PYY、胃泌酸调节素肽或任何其他感兴趣治疗性肽。药物活性部分还可以是非肽有机部分(即，“小分子”)。在本公开中，就根据本发明实施方案的抗体或其抗原结合片段而言，短语“包含抗体或其抗原结合片段和与之缀合的药物活性部分(或治疗性肽)的缀合物”与短语“缀合至药物活性部分(或治疗性肽)的抗体或其抗原结合片段”互换使用。
本文所述的肽序列是根据通常的惯例书写的，由此肽的N-端区在左边并且C-端区在右边。虽然氨基酸的同分异构形式是已知的，但是除非另外明确地指明，否则它是所表示的氨基酸的L形式。
抗体
在一个总的方面中，本发明涉及一种新型抗体，其已被工程化为非靶向的并且包含半胱氨酸残基，半胱氨酸残基能够用于以位点特异性的方式化学缀合(即，偶联)药物活性部分诸如治疗性肽(例如，环状PYY肽、胃泌酸调节素或变体肽等)，使得与单独的肽相比，抗体偶联肽具有延长/增加的半衰期。如本文所用，在抗体的上下文中，术语“非靶向的”是指在体内不特异性结合至任何靶标的抗体。如本文所用，“特异性结合至靶标”的抗体是指以1×10-7M或更小、优选地1×10-8M或更小、更优选地5×10-9M或更小、1×10-9M或更小、5×10-10M或更小或1×10-10M或更小的KD结合至靶抗原的抗体。术语“KD”是指从Kd对Ka的比(即Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)的解离常数。根据本公开，抗体的KD值可以使用本领域中的方法确定。例如，抗体的KD可通过使用表面等离振子共振，诸如通过使用生物传感器***(例如***)，或者通过使用生物层干涉测量技术(诸如Octet RED96***)来确定。抗体KD的值越小，抗体与靶抗原结合的亲和力越高。
完整的或其片段的单克隆抗体可用作半衰期延长部分。单克隆抗体是已被充分研究的蛋白质，其已被利用并表征以用于体内用途，并且因此，实现它们拖延的体内半衰期的机制和它们的体内消除机制是熟知的。另外，单克隆抗体的两个“臂”的空间分离和展示对于治疗性部分(即，治疗性肽)的有效二价展示可能是有利的。已经开发出毒素或其它小分子药物以化学方式键合至单克隆抗体的治疗剂，但是它们通常利用单克隆抗体，单克隆抗体结合至特定抗原并且将抗体-药物缀合物靶向至感兴趣组织/细胞，其优选地表达抗原，并且通常药物/小分子以不影响抗体的抗原结合的方式连接至抗体。
对于治疗性肽-mAb缀合物，不期望半衰期延长单克隆抗体的抗原特异性结合。因此，将预期不特异性结合任何靶标的重链(HC)和轻链(LC)可变(V)结构域对用于制备本发明能够偶联的非靶向单克隆抗体。为了获得能够偶联的非靶向单克隆抗体，将半胱氨酸残基工程化到所选择的非靶向抗体的互补决定区(CDR)中的一个中。药物活性部分(例如，治疗性肽/化合物)可包含适当的化学部分，以允许药物活性部分与非靶向单克隆抗体的工程化半胱氨酸残基缀合。根据本发明实施方案的肽-单克隆抗体一般缀合策略示出于图1。
如本文所用，术语“抗体”是广义的并且包括非人(例如，鼠类、大鼠)、人、人适应性、人源化和嵌合单克隆抗体；抗体片段；双特异性或多特异性抗体；二聚体、四聚体或多聚体抗体；以及单链抗体。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明抗体可包含κ或λ轻链恒定结构域。根据具体实施方案，本发明抗体包括例如来自小鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除重链和轻链恒定结构域之外，抗体还包含由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，每个可变区包含三个结构域(即，互补决定区1-3；(CDR1、CDR2和CDR3))。轻链可变区结构域另选地被称为LCDR1、LCDR2和LCRD3，并且重链可变区结构域另选地被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五种主要种类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgG是五类免疫球蛋白中最稳定的，具有约23天的人体内血清半衰期。IgA和IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。四个IgG亚类中的每一个均具有不同的生物功能，这些生物功能被称为效应子功能。这些效应子功能通常通过与Fc受体(FcγR)的相互作用或者通过结合C1q并固定补体来介导。结合FcγR可导致抗体依赖性细胞介导的细胞溶解，而结合补体因子可导致补体介导的细胞裂解。因为延长治疗性肽的半衰期的能力而利用的本发明抗体不具有或具有最小的效应子功能，但是保留了它结合FcRn的能力，FcRn的结合可为抗体具有延长的体内半衰期的主要手段。
在一个实施方案中，本发明涉及一种分离抗体或其抗原结合片段，其包含具有完全人Ig种系V基因序列的轻链可变区和具有除具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR3之外的完全人Ig种系V基因序列的重链可变区，其中抗体或其抗原结合片段在体内不特异性结合任何人抗原。在某些实施方案中，本发明涉及一种分离抗体或其抗原结合片段，其包含具有完全人Ig种系V基因序列的轻链可变区和具有除具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR3之外的完全人Ig种系V基因序列的重链可变区，其中抗体或其抗原结合片段在体内不特异性结合任何人抗原，其中分离抗体或其抗原结合片段偶联至药物活性部分(例如，环状PYY肽、胃泌酸调节素肽和/或本发明的治疗性肽)。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如像，双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够结合与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。根据具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和Fd链段(即包含在Fab片段中的重链部分)。根据其它具体实施方案，抗原结合片段包含Fab和F(ab')。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，这种单链抗体包含通过约15至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单结构域抗体”是指本领域中的常规单结构域抗体，这种单结构域抗体包含重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。
短语“分离抗体或抗体片段”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体或抗体片段(例如，特异性结合靶抗原的分离抗体基本上不含不特异性结合靶抗原的抗体)。此外，分离抗体或抗体片段可基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。
抗体可变区由被三个“抗原结合位点”中断的“框架”区组成。使用不同术语来定义抗原结合位点：(i)三个在VH中(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且三个在VL中(LCDR1、LCDR2、LCDR3)的互补决定区(CDR)是基于序列变异性(Wu和Kabat,J Exp Med 132:211-50,1970；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1991)。(ii)三个在VH中(H1、H2、H3)且三个在VL中(L1、L2、L3)的“高变区”、“HVR”或“HV”是指抗体可变结构域的在结构上高变的区域，如Chothia和Lesk所定义(Chothia和Lesk,Mol Biol 196:901-17,1987)。其它术语包括“IMGT-CDR”(Lefranc等，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003)和“特异性决定残基用途”(SDRU)(Almagro,Mol Recognit 17:132-43,2004)。国际免疫遗传学(IMGT)数据库(http://www_mgt_org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。CDR、HV和IMGT描述之间的对应性在Lefranc等，Dev Comparat Immunol 27:55-77,2003中有所描述。
“框架”或“框架序列”是可变区的除了被定义为抗原结合位点的那些序列之外的其余序列。因为抗原结合位点可以由如上所述的各种术语定义，所以框架的精确氨基酸序列取决于如何定义抗原结合位点。
在本发明的一个实施方案中，分离抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区和重链可变区，轻链可变区具有分别具有SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链可变区具有分别具有SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQID NO:18的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在另一个实施方案中，分离抗体还包含来源于人IgG4Fc区的Fc区。与其它IgG亚型相比，人IgG4Fc区具有减小的结合FcγR和补体因子的能力。优选地，Fc区包含具有消除效应子功能的取代的人IgG4Fc区。因此，分离抗体还包含具有修饰人IgG4Fc区的Fc区，这种Fc区包含以下取代中的一个或多个：在残基233处用脯氨酸取代谷氨酸、在残基234处用丙氨酸或缬氨酸取代苯丙氨酸以及在残基235处用丙氨酸或谷氨酸取代亮氨酸(EU编号，Kabat,E.A.等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Dept.of Health and Human Services,Bethesda,Md.,NIH出版号91-3242)。通过在残基297(EU编号)处用Ala取代Asn来去除IgG4Fc区中的N-键合糖基化位点是确保消除残余效应子活性的另一种方式。
优选地，本发明的抗体作为通过二硫键和各种非共价相互作用连接在一起的二聚体存在。因此，可用于本发明抗体的Fc部分可以是包含取代的人IgG4Fc区，诸如在位置228(EU编号)处的丝氨酸至脯氨酸的取代，这种取代稳定重链二聚体形成并防止半IgG4Fc链的形成。
在另一个实施方案中，去除重链中的C-端Lys残基，如在重组产生的单克隆抗体中常见的。
“人抗体”是指具有重链可变区和轻链可变区的抗体，其中框架和抗原结合位点均来源于人起源的序列。如果所述抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人起源的序列。
如果人抗体的可变区来源于使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的***，则人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区或轻链可变区。此类***包括在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带如本文所述的人免疫球蛋白基因座的小鼠。在与人种系免疫球蛋白序列或重排免疫球蛋白序列进行比较时，“人抗体”可包含由于例如天然存在的体细胞突变或者在框架或抗原结合位点中特意引入置换所引起的氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如Knappik等人，J MolBiol 296:57-86,2000中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成HCDR3(例如Shi等人，J Mol Biol 397:385-96,2010和国际专利公布WO2009/085462中所述。“人抗体”的定义中不包括抗原结合位点来源于非人物种的抗体。
根据本发明实施方案的分离抗体可以是合成的。虽然抗体来源于人免疫球蛋白序列，但是这些抗体可使用***诸如噬菌体展示结合合成的CDR和/或合成的框架来生成，或者可对其进行体外诱变以改善抗体特性，从而得到并非天然存在于体内整套人抗体种系内的抗体。
如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、形成或分离的所有抗体，诸如从动物(例如小鼠)中分离的抗体，即人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体，或从其制备的杂交瘤分离的抗体；从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体；从重组的组合抗体文库分离的抗体；以及通过涉及将人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接在一起的任何其他方法制备、表达、创建或分离的抗体，或者使用Fab臂交换体外产生的抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力，或就双特异性单克隆抗体而言，显示出对于两种不同表位的双重结合特异性。本发明单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以由包括获自转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠的B细胞的杂交瘤产生，转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
在某些实施方案中，术语“mAb”是指单克隆抗体。在一个实施方案中，mAb具有包含SEQ ID NO:12的重链可变区(VH)序列和包含SEQ ID NO:14的轻链可变区(VL)序列。在某些实施方案中，mAb为具有包含SEQ ID NO:13的重链(HC)序列和包含SEQ ID NO:15的轻链(LC)序列的全人单克隆抗体。在某些实施方案中，SEQ ID NO:13的在位置446处的赖氨酸残基任选地缺失。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链两者的可变区经常对应于来源于一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望的特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区对应于来源于另一个哺乳动物物种(例如，人)的抗体中的序列，以便避免在那个物种中引出免疫反应。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且其中第一免疫球蛋白可变结构域和/或第二免疫球蛋白可变结构域任选地包括缀合的药物活性部分(例如，治疗性肽)。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包括相同缀合药物活性部分。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包括不同药物活性部分。在一个实施方案中，仅第一免疫球蛋白可变结构域包括缀合药物活性部分。在一个实施方案中，仅第二免疫球蛋白可变结构域包括缀合药物活性部分。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体分子、三特异性抗体或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不多于两个表位或两种抗原并且/或者包含两个缀合药物活性部分(例如，相同或不同药物活性部分)的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且其中第一免疫球蛋白可变结构域和/或第二免疫球蛋白可变结构域任选地包括缀合药物活性部分。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包括相同缀合药物活性部分。在一个实施方案中，第一免疫球蛋白可变结构域和第二免疫球蛋白可变结构域包括不同药物活性部分。在一个实施方案中，仅第一免疫球蛋白可变结构域包括缀合药物活性部分。在一个实施方案中，仅第二免疫球蛋白可变结构域包括缀合药物活性部分。在一个实施方案中，双特异性抗体包含第一重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及第二重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，第一重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列对第一表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，第二重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列对第二表位具有结合特异性或包含缺乏任何已知结合特异性的种系序列，并且其中第一重链可变结构域和/或第二重链可变结构域任选地包括缀合药物活性部分。在一个实施方案中，第一重链可变结构域和第二重链可变结构域包括相同缀合药物活性部分。在一个实施方案中，第一重链可变结构域和第二重链可变结构域包括不同缀合药物活性部分。在一个实施方案中，仅第一重链可变结构域包括缀合药物活性部分。在一个实施方案中，仅第二重链可变结构域包括缀合药物活性部分。
如本文所用，“全长抗体”是指具有两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链的抗体。全长抗体重链(HC)由重链可变区(VH)和恒定结构域(CH1、CH2和CH3)组成。全长抗体轻链(LC)由轻链可变区(VL)和恒定结构域(CL)组成。全长抗体可在一条或两条重链中缺乏C-端赖氨酸(K)。
术语“Fab臂”或“半分子”是指一个重链-轻链对。
全长双特异性抗体可以例如使用两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离-缔合而释放和重新形成。可将Fab臂的CH3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位。
如本文所用，就抗体而言，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，就抗体而言，“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
如本文所用，就抗体而言，“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，就抗体而言，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“钮扣(knob-in-hole)”策略(参见例如PCT国际公布号WO 2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3域的交界的选定氨基酸可在影响CH3域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性CH3取代对(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
还可使用其它技术，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在另一CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布号US2010/0015133；美国专利公布号US2009/0182127；美国专利公布号US2010/028637或美国专利公布号US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3域中的修饰位置/第二重链的第二CH3域中的修饰位置)促进异源二聚化：L351Y_F405A_Y407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、L351Y_Y407A/T366V_K409F、Y407A/T366A_K409F、或T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布号US2012/0149876或美国专利公布号US2013/0195849中所述。
除上述方法之外，双特异性抗体还可在体外无细胞环境中通过下列方式产生：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入不对称突变，并且在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而根据国际专利公布WO2011/131746中所述的方法允许二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选为选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5-8的pH例如pH7.0或pH7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
除非另有明确说明，否则在整个说明书中，抗体恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU索引执行的，如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中有所描述。
缀合物
在另一个总的方面中，本发明涉及一种包含本发明抗体的缀合物，本发明抗体以位点特异性方式缀合至药物活性部分诸如合成治疗性肽(例如，环状PYY肽或胃泌酸调节素变体肽)，使得与单独的肽相比，抗体偶联肽具有延长/增加的半衰期。缀合物可用于预防、治疗或改善本文所公开的疾病或障碍。本发明另外涉及药物组合物、制备方法以及其使用方法。
在某些实施方案中，本发明抗体被修饰成包含至少一个半胱氨酸残基取代，从而能够与药物活性部分缀合以延长/增加药物活性部分的半衰期。在某些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基取代包含在抗体的互补决定区中。在某些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基取代在重链互补决定区(HCDR)中。在某些实施方案中，至少一个半胱氨酸残基取代在HCDR3中，其中HCDR3包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在某些实施方案中，包含有包含SEQID NO:18的氨基酸序列的HCDR3的抗体具有至少一个能够与药物活性部分缀合的额外半胱氨酸取代。
在某些实施方案中，药物活性部分可包含接头。接头可以被化学修饰成允许抗体与药物活性部分缀合。接头可以包括但不限于肽接头、烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头、由PEG和嵌入杂环组成的杂交接头以及烃链。PEG接头可以例如包含2-24个PEG单元。
在某些实施方案中，本发明单克隆抗体与一个、两个、三个、四个、五个或六个感兴趣的药物活性部分(例如，治疗性肽)缀合。在优选的实施方案中，非靶向单克隆抗体与两个感兴趣的药物活性部分缀合。在单克隆抗体与至少两个感兴趣的药物活性部分缀合的某些实施方案中，感兴趣的药物活性部分可以是相同的药物活性部分或可以是不同的药物活性部分。
将本发明抗体与本发明药物活性部分缀合的方法是本领域中已知的。简而言之，本发明抗体可以用还原剂(例如，TCEP三(2-羧乙基)膦)还原、纯化(例如，通过蛋白A吸附或凝胶过滤)并与药物活性部分缀合(例如，通过在允许缀合的条件下向还原的抗体提供冻干肽)。在缀合反应之后，可以通过离子交换色谱法或疏水相互作用色谱法(HIC)纯化缀合物，最终纯化步骤为蛋白A吸附。在某些实施方案中，可以在利用HIC方法还原之前纯化本发明抗体。关于缀合方法的更详细描述，参见例如实施例3和7以及Dennler等，Antibodies 4:197-224(2015)。
如本文所用，就缀合物而言，“同源二聚化”是指两个相同药物活性部分与抗体的相互作用。如本文所用，就缀合物而言，“同源二聚体”是指偶联至两个相同药物活性部分的抗体。
如本文所用，就缀合物而言，“异源二聚化”是指两个不同药物活性部分与抗体的相互作用。如本文所用，就缀合物而言，“异源二聚体”是指偶联至两个不同药物活性部分的抗体。
环状PYY肽
PYY3-36为由远端肠道中的L细胞分泌的内源性激素，其起到抑制食物摄取的Y2受体激动剂的作用。鉴于它在控制食欲和食物摄取方面的作用以及它在哺乳动物胃肠道中的抗分泌和促吸收作用，PYY3-36可有效治疗肥胖和相关障碍以及许多胃肠道障碍。然而，PYY3–36本身作为治疗剂的治疗效用受到它的快速代谢和短循环半衰期的限制。因此，本发明抗体可用作PYY3–36、优选地修饰PYY3–36的载体，它延长PYY3-36肽的半衰期并减少肽的体内代谢。
在本发明的某些实施方案中，修饰PYY3-36肽是环状PYY肽。术语“环状PYY肽”、“环状PYY3-36类似物”和“环状PYY3-36肽类似物”可互换使用。可用于缀合物的环状PYY肽的示例描述于提交于2016年10月27日的美国临时专利申请号62/413,613和用代理人案卷号PRD3411与本专利申请同一天提交的名称为“Cyclic peptide tyrosine tyrosinecompounds as modulators of neuropeptide receptors”的美国专利申请号______中，这些申请的内容据此全文以引用方式并入。
包含本发明抗体和环状PYY肽的缀合物的示例描述于提交于2016年10月27日的美国临时专利申请号62/413,586和用代理人案卷号PRD3436与本专利申请同一天提交的名称为“Antibody coupled cyclic peptide tyrosine tyrosine compounds as modulatorsof neuropeptide Y receptors”的美国专利申请号______中，这些申请的内容据此全文以引用方式并入。例如，在环状PYY肽中，环的N-端氨基酸残基通过它的α-氨基官能团键合到连接基团，连接基团继而在NTSC-PYY肽的位置31处连接到氨基酸的侧链残基。赖氨酸残基可以在hPYY3-36序列的各种位置处并入，以提供便利的功能性手段以实现进一步衍生化。赖氨酸残基可被修饰以直接或间接与单克隆抗体偶联。在与单克隆抗体的间接偶联中，赖氨酸残基可被修饰成包含允许环状PYY肽与单克隆抗体偶联的接头。本领域的技术人员应认识到，相关的直向同源物也可以如此有效地使用并且在本文中考虑。
胃泌酸调节素肽
胃泌酸调节素(OXM)为在肠中从肠内分泌L细胞分泌的37个氨基酸的肽。通过它对GLP-1受体(GLP1R)和胰高血糖素受体(GCGR)的激动剂活性，OXM增强β-细胞功能，减少食物摄取并增强能量消耗。通过这些互补机制，相对于目前市售的GLP1R激动剂，OXM介导的体重减轻可能是优异的。OXM还可以减少血浆胆固醇和三甘油酯。OXM在人体内的半衰期很短，大约为几分钟(Schjoldager等，Eur.J.Clin.Invest.18(5):499-503(1988))。因此，本发明的一个实施方案涉及一种包含本发明抗体的缀合物，本发明抗体共价键合至胃泌酸调节素以提供胃泌酸调节素的双重激动剂特性和足以实现每周一次给药的拖延半衰期。
延长肽半衰期是通过稳定OXM肽以免遭蛋白水解的影响并且通过降低血浆清除率来实现的。例如，通过在位置2处用氨基异丁酸(Aib)取代丝氨酸来减轻通过DPP4的蛋白水解。通过引入从Q20R到S16E和Q24E的分叉型盐桥来稳定肽的螺旋拓扑，并且通过用亮氨酸取代甲硫氨酸27来减轻潜在的氧化倾向。通过单克隆抗体(mAb)的共价连接来增加肽的循环寿命。此类抗体-药物缀合物可由于它可减少肾小球过滤的大小并且通过经由新生儿Fc受体再循环而表现出长效的血浆半衰期。短的寡聚乙二醇间隔物插置在mAb和肽之间以确保肽无阻地进入GCGR和GLP1R。
根据本发明实施方案，本发明胃泌酸调节素缀合物包含四个特征。(A)双重激动作用：胃泌酸调节素缀合物具有对GLP-1和胰高血糖素受体的双重激动作用。(B)受体平衡：胃泌酸调节素缀合物对GLP1R或GCGR没有过度的效力偏向，因为对GLP1R的过度偏向可导致缀合物，其中在GCGR靶接合之前在逐步升级的暴露下发生GLP-1介导的胃肠道不良事件，并且对GCGR的过度偏向可减轻血糖功效。(C)生物分布：胃泌酸调节素缀合物对GLP-1受体效力具有适度偏向(相对于单独的胃泌酸调节素)，目的是在类似的暴露下实现外周GCGR和中枢能量摄取调节GLP1R的靶接合。(D)每周一次给药：胃泌酸调节素缀合物通过能够每周一次向有需要的受试者施用而具有竞争性。
其它治疗性肽
本文还提供包含能够与本文所述的单克隆抗体平台缀合的其它肽的缀合物。肽可以例如选自由以下项组成的组：胰高血糖素样肽1(GLP1)、毒蜥外泌肽(艾塞那肽)、胰淀素(普兰林肽)、α-黑色素细胞刺激素(MSH)、***和安非他明调节转录物(CART)、神经肽Y受体Y1(NPY1)拮抗剂、神经肽Y受体Y5(NPY5)拮抗剂、神经降压素S、神经肽B、神经肽W、生长素释放肽、蛙皮素样受体3(BRS3)、甘丙肽、胆囊收缩素(CCK)、食欲素、黑色素聚集素(MCH)、催产素和顶压素。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是来源于胰高血糖素原基因的组织特异性翻译后加工的30个氨基酸长的肽激素。GLP-1是在食物消耗时由肠的肠内分泌L-细胞和某些神经元产生和分泌的。初始产物GLP-1(1-37)易受酰胺化和蛋白水解切割影响，它产生两种截短的并且等效的生物活性形式GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。内源性GLP-1通过多个途径，主要通过二肽基肽酶-4(DPP-4或DPP-IV)，但是还通过中性肽链内切酶24.11(NEP24.11)，并且通过肾脏清除被快速降解，导致半衰期为约2分钟。基于GLP-1的治疗与体重减轻和较低的低血糖风险相关联，这在II型糖尿病的治疗方面是重要的。
毒蜥外泌肽(艾塞那肽)为属于肠降血糖素模拟物组的GLP-1激动剂，它已被批准用于治疗II型糖尿病(T2DM)。艾塞那肽为毒蜥外泌肽-4的合成型式，为39个氨基酸的肽激素，它是具有葡萄糖调节作用的胰岛素促分泌素。毒蜥外泌肽-4与哺乳动物GLP-1共有广泛的同源性和功能，但具有治疗优势，因为它对DPP-4(DPP-IV)的降解具有抗性，这实现较长的药理学半衰期。毒蜥外泌肽-4的生物学特征导致考虑用作T2DM的治疗。
胰淀素(胰岛淀粉样多肽(IAPP))为37个氨基酸的肽激素，它与胰岛素一起从胰腺β-细胞共分泌。胰淀素通过减缓胃排空并促进饱腹感来在血糖调节中起作用。胰淀素(IAPP)是由89个氨基酸的肽加工的。前胰岛淀粉样多肽(proIAPP)是在胰腺β-细胞中从89个胺基酸的肽在切割出22个胺基酸的信号肽之后以67个胺基酸的肽的形式产生的。据信，proIAPP的加工受损可引起导致II型糖尿病的病症，因为缺乏胰淀素(IAPP)的产生可引起缺乏血糖控制。普兰林肽为一种胰淀素合成试剂(amylinomimetic agent)并且至少与人胰淀素一样有效。它是37个氨基酸的多肽并且氨基酸序列与人胰淀素的不同之处在于，在位置25(丙氨酸)、28(丝氨酸)和29(丝氨酸)处用脯氨酸替换氨基酸。脯氨酸是在大鼠胰淀素中发现的天然存在的变型。由于这些取代，普兰林肽是可溶的、非粘附并且非聚集的，从而克服了天然人胰淀素的许多物理化学倾向(Janes等，Diabetes 45(增刊2):235A(1996)；Young等，Drug Dev.Res.37:231-48(1996b))。
α-黑素细胞刺激素(α-MSH)为黑皮质素家族的内源性肽激素和神经肽。α-MSH是刺激黑素生成的黑素细胞刺激素(MSH)中最重要的，黑素生成是哺乳动物中引起头发和皮肤色素沉着的过程。α-MSH还在摄食行为、能量稳态、性活动以及针对局部缺血和再灌注损伤的保护中起作用。
***和安非他明调节转录物(CART)是在人体内由CARTPT基因编码的神经肽蛋白。CART肽、特别是CART(55-102)似乎在调节能量稳态中具有重要功能，因为CART肽与若干下丘脑食欲回路相互作用。CART表达受参与食欲调节的外周肽激素的调节，外周肽激素包括瘦蛋白、胆囊收缩素和生长素释放肽。CART和胆囊收缩素对食欲调节具有协同作用。据信，CART肽在由酒精戒断诱导的焦虑样行为中起作用；调节精神兴奋药的运动、条件性位置偏爱和***自身施用作用；抑制食物摄取；并且参与恐惧和惊恐始行为。下丘脑中的CART活动减退与饮食过度和体重增加相关联，并且CART被认为在调节自然奖励过程的阿片样中脑边缘多巴胺回路中起作用。
神经肽Y(NPY)在体内有许多作用，包括例如控制摄食行为、皮质神经活动、心脏活动和情绪调节。NPY还涉及若干人类疾病，包括肥胖症、酗酒和抑郁症。此外，使用抗NPY抗体、针对NPY的反义寡脱氧核苷酸和NPY受体拮抗剂阻断NPY的中枢作用导致能量匮乏动物的食物摄取减少。特别是，已显示神经肽Y受体Y5(NPY5)和神经肽Y受体Y1(NPY1)刺激不同的摄食期(Br J Pharmacol.2003年8月；139(8):1433-40)。因此，NPY5和NPY1拮抗剂可有效治疗肥胖症和其它相关代谢疾病。
神经降压素是13个氨基酸的神经肽，它涉及***和催乳素释放的调节并且与多巴胺能***具有显著的相互作用。神经降压素遍布于中枢神经***，其中最高水平位于下丘脑、扁桃体和伏隔核中。神经降压素可以诱导多种作用，包括止痛、体温降低、增加的自主活动，并且参与多巴胺途径的调节。
神经肽B(NPB)为短的生物活性肽，它的前体由NBP基因编码。NPB可以通过称为神经肽B/W受体1和2(NPBWR1和NPBWR2)的两种G蛋白偶联受体起作用。据信神经肽B与摄食、神经内分泌***、记忆、学习和传入疼痛途径的调节有关。
神经肽W(NPW)以两种形式存在，由23个(NPW23)或30个(NPW30)氨基酸组成。这些神经肽结合两种G蛋白偶联受体NPBWR1(也被称为GPR7)和NPBWR2(也被称为GPR8)并且可以通过这两种G蛋白偶联受体起作用。已经显示NPW可以抑制食物摄取和体重并且增加产热量和体温，这表明NPW作为内源性分解代谢信号传导分子起作用。
生长素释放肽(也被称为ienomorelin(INN))是一种肽激素，由胃肠道中的生长素释放肽能的细胞产生，在中枢神经***中起神经肽的作用。生长素释放肽在调节食欲、调节能量分布和使用率、调节多巴胺神经元的奖励感知方面起作用。生长素释放肽由GHRL基因编码并且被认为是由前生长素释放肽原的切割产生的，前生长素释放肽原被切割以产生生长素释放肽原，生长素释放肽原得到28个氨基酸的生长素释放肽。与其它内源性肽不同，生长素释放肽能够跨过血脑屏障，从而为外源性施用生长素释放肽提供独特的临床潜力。
蛙皮素样受体3(BRS3)是一种G蛋白偶联受体，它仅与已知的天然存在的蛙皮素相关肽以低亲和力相互作用，并且由于它没有高亲和力配体，所以BRS3被分类为孤儿受体。
甘丙肽是由GAL基因编码的神经肽。甘丙肽广泛表达于人大脑、脊髓和肠道以及其他动物中。甘丙肽的功能尚未完全分类；然而，甘丙肽主要参与神经元中动作电位的调节和抑制。甘丙肽涉及许多生物学多样的功能，包括但不限于伤害感受、清醒和睡眠调节、认知、摄食、情绪调节和血压调节。甘丙肽经常与经典神经递质诸如乙酰胆碱、5-羟色胺和去甲肾上腺素共定位，并且还与神经调节因子诸如神经肽Y、P物质和血管活性肠肽共定位。
胆囊收缩素(CCK)是一种胃肠***的肽激素，负责刺激脂肪和蛋白质的消化。CCK由小肠中的肠内分泌细胞合成和分泌，并且它的存在导致胰腺和胆囊中的消化酶和胆汁的释放。CCK在消化、饱腹感和焦虑中起作用。
食欲素(也被称为hypocretin)是一种神经肽，它调节唤醒、觉醒和食欲。有两种类型的食欲素：食欲素A和B(hypocretin-1和hypocretin-2)，长度分别为33和28个氨基酸。主要认为食欲素***与食物摄取的刺激有关，并且除上述作用外，食欲素还调节能量消耗并调节内脏功能。
黑色素聚集素(MCH)是一种环状19个氨基酸的促食欲下丘脑肽，据信它参与调节摄食行为、情绪、睡眠-清醒周期和能量平衡。MCH表达神经元位于外侧下丘脑和未定带(zona increta)内，并且尽管这种分布有限，但MCH神经元在整个大脑中广泛投射。
催产素是一种肽激素和神经肽，通常由下丘脑的室旁核产生并且由垂体后叶释放。据信催产素在社交联系、有性繁殖以及分娩期间和之后起作用。催产素受体是一种G蛋白偶联受体，它需要镁和胆固醇并且属于G蛋白偶联受体的视紫红质型(I类)组。
人顶压素(h-SCP)是一种40个氨基酸的肽，它为促皮质素释放激素(CRH)多肽家族的成员。CRH多肽家族的生物学作用由两个7次跨膜G蛋白偶联受体，即CRH受体1型(CRHR1)和CRH受体2型(CRHR2)引发。虽然这些受体具有高度序列同源性，但CRH多肽家族的不同成员在其相对结合亲和力、受体活化程度和对这两个受体的选择性方面表现出显著的差异。与很多CRH家族成员不同，h-SCP表现出对CRHR2更强的选择性并且作为介导因子在辅助减弱生理应激的引发和保持过程中起作用。除了在生理应激中的明显作用之外，另据报道，h-SCP可引发多种其他生理作用。它对内分泌、中枢神经、心血管、肺、胃肠、肾、骨骼肌和炎症***发挥作用。CRHR2活性还涉及骨骼肌损耗疾病诸如肌少症、运动活动和食物摄取，参与心脏保护作用并且表达支气管舒张和抗炎活性。此外，已识别出顶压素模拟物，顶压素模拟物可用于治疗由促肾上腺皮质激素释放激素受体2活性介导的医学适应症，参见例如美国专利申请号20100130424。
半衰期延长部分
除本发明抗体或其抗原结合片段之外，本发明缀合物可例如通过共价相互作用并入一个或多个其它部分以延长药物活性部分的半衰期。示例性其它半衰期延长部分包括但不限于白蛋白、白蛋白变体、白蛋白-结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物。可并入到本发明缀合物中的另外半衰期延长部分包括例如聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、碳水化合物(右旋糖酐、纤维素、寡糖或多糖)，以便获得期望的特性。这些部分可与蛋白质支架编码序列直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术产生。另选地，熟知的化学偶联方法可用于将这些部分连接到本发明重组和化学制备的缀合物。
可通过使用熟知的方法将半胱氨酸残基结合到分子的C-端并将pegyl基团连接到半胱氨酸来将pegyl部分例如添加到本发明肽分子。
可通过多种熟知的测定法来比较并入有另外部分的本发明肽分子的功能性。例如，单独或以根据本发明缀合物的形式的感兴趣的治疗性肽的生物或药代动力学活性可使用已知的体外或体内测定进行测定并进行比较。
药物组合物
在另一个总的方面中，本发明涉及一种药物组合物，包含本发明缀合物和药学上可接受的载体。本文所用，术语“药物组合物”是指包含本发明缀合物连同药学上可接受的载体的产品。本发明缀合物和包含它们的组合物也可用于制造本文提及的治疗应用的药物。
如本文所用，术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊、或本领域公知用于药物制剂的其他材料。应当理解，载体、赋形剂或稀释剂的特征将取决于具体应用的施用途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。根据具体实施方案，根据本公开，适用于抗体药物组合物的任何药学上可接受的载体均可用于本发明。
用于本发明的药学上可接受的酸式盐/阴离子盐包括且不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘液酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、双羟萘酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐和三乙碘化物。有机酸或无机酸还包括其不限于氢碘酸、过氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、甲磺酸、羟基乙磺酸、草酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、糖精酸或三氟乙酸。
药学上可接受的碱式盐/阳离子盐包括且不限于铝、2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(也称为三(羟甲基)氨基甲烷、三羟甲基氨基甲烷(tromethane)或“TRIS”)、氨、苄星、叔丁胺、钙、氯普鲁卡因、胆碱、环己胺、二乙醇胺、乙二胺、锂、L-赖氨酸、镁、葡甲胺、N-甲基-D-葡糖胺、哌啶、钾、普鲁卡因、奎宁、钠、三乙醇胺或锌。
在本发明一些实施方案中，提供药物制剂，包含以约0.001mg/ml至约100mg/ml、约0.01mg/ml至约50mg/ml或约0.1mg/ml至约25mg/ml的量的本发明缀合物。药物制剂可具有约3.0至约10，例如约3至约7、或约5至约9的pH。制剂还可包含至少一种选自由以下项组成的组的成分：缓冲***、防腐剂、张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。
药物活性成分与药学上可接受的载体的制剂为本领域中已知的，例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy(例如第21版(2005)以及任何后续版本)。另外成分的非限制性示例包括：缓冲剂、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可用于配制本发明药物组合物。
在本发明一个实施方案中，药物组合物是液体制剂。液体制剂的优选示例是含水制剂，即包含水的制剂。液体制剂可包括溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等等。含水制剂通常包含至少50重量％的水，或至少60重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％或至少95重量％的水。
在一个实施方案中，药物组合物可以配制成可以例如通过注射器或输注泵注射的注射剂。例如，注射可以皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内递送。
在另一个实施方案中，药物组合物是固体制剂，例如冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，它可以按原样使用，或者医师或患者在使用前向其中加入溶剂和/或稀释剂。固体剂型可包括片剂诸如压片和/或包衣片以及胶囊(例如，硬或软明胶胶囊)。例如，药物组合物还可以是以小药囊、糖衣丸、粉剂、颗粒剂、锭剂或重构用粉剂的形式。
剂型可以是立即释放的，在这种情况下它们可以包含水溶性或可分散的载体，或者它们可以是延迟释放、持续释放或改性释放的，在这种情况下它们可以包含调节剂型在胃肠道中的溶解速率的水不溶性的聚合物。
在其它实施方案中，药物组合物可以鼻内、口内或舌下递送。
含水制剂中的pH可以在pH 3和pH 10之间。在本发明一个实施方案中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明另一个实施方案中，制剂的pH为约3.0至约7.0。
在本发明另一个实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的非限制性示例包括：精氨酸、天冬氨酸、N,N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、富马酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、马来酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸、酒石酸、麦黄酮和三(羟甲基)-氨基甲烷以及其混合物。缓冲剂可以单独或以聚集体的形式存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定缓冲剂中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
在本发明另一个实施方案中，药物组合物包含防腐剂。缓冲剂的非限制性示例包括：苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、溴硝醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯甘醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、咪脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯基乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫代甲醇及其混合物。防腐剂可以单独或以聚集体的形式存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定防腐剂中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
在本发明另一个实施方案中，药物组合物包含等渗剂。实施方案的非限制性示例包括盐(诸如氯化钠)、氨基酸(诸如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、糖醇(诸如甘油、1,2-丙二醇丙二醇)、1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。等渗剂的另一个示例包括糖。糖的非限制性示例可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α-HPCD和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个示例是糖醇，其中术语“糖醇”定义为具有至少一个—OH基团的C(4-8)烃。糖醇的非限制性示例包括甘露糖醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、己六醇、木糖醇和***糖醇。包含本段中列出的每种等渗剂的药物组合物构成本发明的另选实施方案。等渗剂可以单独或以聚集体的形式存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定等渗剂中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
在本发明另一个实施方案中，药物组合物包含螯合剂。螯合剂的非限制性示例包括柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)盐及其混合物。螯合剂可以单独或以聚集体的形式存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定螯合剂中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
在本发明另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的非限制性示例包括一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
在本发明另一个实施方案中，药物组合物包含稳定剂，其中所述稳定剂是羧基-/羟基纤维素及其衍生物(诸如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲硫基乙醇、聚乙二醇(诸如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐(诸如氯化钠)、含硫物质诸如硫代甘油)或巯基乙醇酸。稳定剂可以单独或以聚集体的形式存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定稳定剂中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
在本发明的其它实施方案中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选地一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指包含水溶性(亲水性)部分和脂溶性(亲脂性)部分的任何分子或离子。表面活性剂可以例如选自由以下项组成的组：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可以单独或以聚集体的形式存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定表面活性剂中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，诸如像EDTA(乙二胺四乙酸)和/或苯甲脒盐酸(HCl)。蛋白酶抑制剂可以单独或以聚集体的形式存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
本发明药物组合物可包含足以在组合物储存期间减少多肽的聚集体形成的量的氨基酸碱。术语“氨基酸碱基”是指一种或多种氨基酸(诸如甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)或其类似物。任何氨基酸均可以以其游离碱形式或以其盐形式存在。可以存在氨基酸碱的任何立体异构体(即，L、D或其混合物)。氨基酸碱可以单独或以与其它氨基酸碱组合的形式存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定氨基酸碱中的每一种的药物组合物均构成本发明的另选实施方案。
对于本领域的技术人员还将显而易见的是，本发明的缀合物或其药物组合物的治疗有效剂量将根据期望的效果而变化。因此，本领域技术人员可容易地确定待施用的最佳剂量，并且最佳剂量将随所使用的具体缀合物、给药方式、制剂强度和疾病症况的进展而变化。另外，与接受治疗的具体受治疗者相关的因素，包括受治疗者年龄、体重、饮食和给药时间，将导致需要将剂量调整至适当的治疗水平。
对于所有适应症，本发明缀合物优选以每天约1μg至约5mg的剂量以单剂量或分剂量(例如，单剂量可被分为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个亚剂量)的形式，或者以每剂量约0.01μg/kg至约500μg/kg、更优选地约0.05μg/kg至约250μg/kg、最优选地低于约50μg/kg外周施用。当然，在这些范围内的剂量将随每种激动剂的效力而变化，并且容易由本领域的技术人员确定。因此，上述剂量为一般情况的示例。当然，可能会存在其中应使用较高或较低剂量范围的个别情况，并且这类情况也在本发明的范围内。
在某些实施方案中，本发明缀合物是在约1μg至约5mg的剂量下、或在约0.01μg/kg至约500μg/kg的剂量下、更优选地在约0.05μg/kg至约250μg/kg的剂量下、最优选地在低于约50μg/kg的剂量下与剂量在约1μg/kg至约5mg的剂量下、或在约0.01μg/kg至约500μg/kg的剂量下、更优选地在约0.05μg/kg至约250μg/kg的剂量下、最优选地在低于约50μg/kg的剂量下的第二治疗剂(例如，利拉鲁肽)一起施用。
本发明缀合物的药学上可接受的盐包括由无机或有机的酸或碱形成的常规无毒盐或季铵盐。此类酸加成盐的示例包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、十二烷基硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、草酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐和酒石酸盐。碱盐包括铵盐、碱金属盐诸如钠盐和钾盐、碱土金属盐诸如钙盐和镁盐、有机碱盐诸如二环己胺盐以及氨基酸诸如精氨酸的盐。另外，可以将碱性含氮基团用例如烷基卤进行季铵化。
本发明的药物组合物可以通过能实现其预期目的的任何方式施用。示例包括通过肠胃外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内、透皮、口腔或眼等途径给药。可通过口服途径施用。适用于肠胃外给药的制剂包括水溶性形式的活性缀合物(例如，水溶性盐)的水溶液、酸性溶液、碱性溶液、右旋糖水溶液、等渗碳水化合物溶液以及环糊精包合配合物。
本发明还涵盖一种制备药物组合物的方法，该方法包括将药学上可接受的载体与本发明缀合物中的任一种混合。另外，本发明包括通过将一种或多种药学上可接受的载体与本发明缀合物中的任一种混合而制备的药物组合物。
此外，本发明的缀合物可具有一种或多种多晶型物或无定形结晶形式，并因此旨在被包括在本发明的范围内。此外，这些缀合物可以与例如水形成溶剂化物(即水合物)或与常用有机溶剂形成溶剂化物。本文所用的术语“溶剂化物”意指本发明的缀合物与一个或多个溶剂分子的物理缔合。该物理缔合涉及不同程度的离子键合和共价键合，包括氢键合。在某些情况下，溶剂化物将能够在例如一个或多个溶剂分子掺入在结晶固体的晶格中时分离出来。术语“溶剂化物”旨在既涵盖溶液相溶剂化物又涵盖可分离的溶剂化物。合适的溶剂化物的非限制性示例包括乙醇化物、甲醇化物等。
本发明旨在将本发明缀合物的多晶型物和溶剂化物包括在其范围内。因此，在本发明的治疗方法中，术语“施用”应涵盖用于利用本发明的缀合物或者其多晶型物或溶剂化物治疗、改善或预防本文所述的综合征、障碍或疾病的方式，其虽然没有被具体公开，但将明显包括在本发明的范围之内。
在另一个实施方案中，本发明涉及用作药物的本发明缀合物。
本发明在其范围内包括本发明缀合物的前药。一般来讲，此类前药将是缀合物的功能衍生物，其可容易地在体内转化成所需的缀合物。因此，在本发明的治疗的方法中，术语“施用”应涵盖使用具体公开的缀合物或未具体公开的缀合物来治疗所述的多种障碍，而该未具体公开的缀合物可在向患者施用后，在体内转化为指定缀合物。选择和制备适宜前药衍生物的常规方法描述于例如“Design of Prodrugs”H.Bundgaard编辑，Elsevier,1985中。
此外，在本发明的范围内，任何元素(尤其是当针对本发明缀合物而提及时)意在应当以其天然丰度或以其同位素富集形式而包含所述元素的全部同位素或同位素混合物(天然存在的或合成制备的)。例如，对氢的标引在其范围内包括1H、2H(D)和3H(T)。相似地，对碳和氧的标引在其范围内分别包括12C、13C和14C以及16O和18O。所述同位素可为放射性的或非放射性的。放射性标记的本发明缀合物可包括选自3H、11C、18F、122I、123I、125I、131I、75Br、76Br、77Br和82Br的放射性同位素。优选地，放射性同位素选自3H、11C和18F。
本发明的一些缀合物可以阻转异构体的形式存在。阻转异构体为由围绕单键受阻旋转而获得的立体异构体，其中旋转的空间应变障碍足够高，以使得构象异构体分离。应当理解，所有此类构象异构体以及它们的混合物涵盖于本发明的范围内。
当根据本发明的缀合物具有至少一个立体中心时，它们可作为对映异构体或非对映异构体相应地存在。应当理解，所有的此类异构体及其混合物涵盖在本发明的范围内。
如果用于制备根据本发明的缀合物的方法产生立体异构体的混合物，则这些异构体可通过常规技术如制备色谱来分离。缀合物可以外消旋形式制备，或者可通过对映体特异性合成或通过拆分来制备单独的对映体。例如，可通过标准技术，如通过与光学活性酸(诸如(-)-二对甲苯酰-D-酒石酸和/或(+)-二对甲苯酰-L-酒石酸)形成盐来形成非对映体对，然后分级结晶并再生游离碱，来将缀合物拆分成它们的组分对映体。缀合物也可通过形成非对映体酯或酰胺，然后进行色谱分离并除去手性助剂来拆分。另选地，缀合物可以使用手性柱通过高效液相色谱(HPLC)或SFC来拆分。在一些情况下，可存在缀合物的旋转异构体，其可通过1H NMR观察，从而导致在1H NMR光谱中复杂的多重峰和峰一体化。
在用于制备本发明缀合物的任何方法中，可能必需和/或期望保护任何有关分子中的敏感基团或反应性基团。这可通过常规保护基团来实现，诸如Protective Groups inOrganic Chemistry，J.F.W.McOmie,Plenum Press,1973；和T.W.Greene&P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,1991，它们各自出于所有目的全文以引用方式并入本文。可使用本领域已知的方法在方便的后续阶段除去保护基团。
使用方法
本发明还提供一种对有需要的受试者的障碍、疾病或病症或者所述障碍、疾病或病症的任何一个或多个症状进行预防、治疗、延迟其发作或改善的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。
根据具体实施方案，疾病、障碍或病症可以是可以用能够与本发明单克隆抗体平台偶联的肽或化合物治疗的任何疾病、障碍或病症。在某些实施方案中，疾病、障碍或病症选自由以下项组成的组：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征(即，X综合征)、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量降低(例如，葡萄糖不耐受)、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由先天性高胰岛素血症(CHI)引起的高血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病和其它心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或脂质水平相关的心血管危险因素、骨质疏松、炎症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾病和/或湿疹。
根据具体实施方案，治疗有效量是指足以实现以下作用中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减小或改善所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的严重性；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状消退；(v)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展或发作；(vi)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可根据各种因素而变化，诸如所治疗的疾病、障碍或病症、施用方式、靶位点、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)、受试者是人还是动物、施用的其它药物以及治疗是预防性还是治疗性。最佳地滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
如本文所用，术语“治疗”和“处理”均旨在意指与疾病、障碍或病症有关的至少一种可测量物理参数的改善或逆转，其不一定是受试者中可识别的，但能够在受试者中识别。术语“处理”和“治疗”也可指导致消退，预防发展，或至少延缓疾病、障碍或病症发展。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指减轻、预防发展或发作，或缩短与疾病、障碍或病症相关的一种或多种症状的持续时间。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指防止疾病、障碍或病症的复发。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指患有疾病、障碍或病症的受试者的存活提高。在一个特定实施方案中，“处理”和“治疗”是指受试者中疾病、障碍或病症的消除。
在一个实施方案中，本发明提供一种对有需要的受试者的肥胖症或肥胖症的任何一个或多个症状进行预防、治疗、延迟其发作或改善的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，相对于在施用本文所述的本发明任何缀合物、药物组合物、形式或药物之前的受试者体重，或者与未接受本文所述的任何本发明缀合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者比较，受试者的体重减少例如在约0.01％至约0.1％之间、在约0.1％至约0.5％之间、在约0.5％至约1％之间、在约1％至约5％之间、在约2％至约3％之间、在约5％至约10％之间、在约10％至约15％之间、在约15％至约20％之间、在约20％至约25％之间、在约25％至约30％之间、在约30％至约35％之间、在约35％至约40％之间、在约40％至约45％之间或在约45％至约50％之间。
在一些实施方案中，体重减少维持例如约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年或约20年。
本发明提供一种对有需要的受试者的综合征、障碍或疾病或者所述综合征、障碍或疾病的任何一个或多个症状进行预防、治疗、延迟其发作或改善的方法，其中所述综合征、障碍或疾病选自由以下项组成的组：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征(即，X综合征)、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量降低(例如，葡萄糖不耐受)、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病和其它心血管危险因素诸如与未管理的胆固醇和/或脂质水平相关的高血压和心血管危险因素、骨质疏松、炎症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾病和湿疹，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。
如本文所用，代谢综合征是指具有以下中的任何一种或多种的受试者：高血糖(例如，高空腹血糖)、高血压、异常的胆固醇水平(例如，低HDL水平)、异常三甘油酯水平(例如，高三甘油酯)、大腰线(即，腰围)、增加的腹部区域脂肪、胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、升高的C反应蛋白水平(即，促炎状态)和增加的血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1和纤维蛋白原水平(即，血栓前状态)。
本发明提供一种减少有需要的受试者的食物摄取的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，相对于在施用本文所述的本发明任何缀合物、组合物、形式、药物或组合之前的受试者的食物摄取，或者与未接受本文所述的任何本发明缀合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者比较，受试者的食物摄取减少例如在约0.01％至约0.1％之间、在约0.1％至约0.5％之间、在约0.5％至约1％之间、在约1％至约5％之间、在约2％至约3％之间、在约5％至约10％之间、在约10％至约15％之间、在约15％至约20％之间、在约20％至约25％之间、在约25％至约30％之间、在约30％至约35％之间、在约35％至约40％之间、在约40％至约45％之间或在约45％至约50％之间。
在一些实施方案中，食物摄取减少维持例如约1周、约2周、约3周、约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约1年、约1.5年、约2年、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约15年或约20年。
本发明提供一种减少有需要的受试者的糖化血红蛋白(A1C)的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，相对于在施用本文所述的本发明任何缀合物、组合物、形式、药物或组合之前的受试者的A1C，或者与未接受本文所述的任何本发明缀合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者比较，受试者的A1C减少例如在约0.001％和约0.01％之间、在约0.01％和约0.1％之间、在约0.1％和约0.2％之间、在约0.2％和约0.3％之间、在约0.3％和约0.4％之间、在约0.4％和约0.5％之间、在约0.5％和约1％之间、在约1％和约1.5％之间、在约1.5％和约2％之间、在约2％和约2.5％之间、在约2.5％和约3％之间、在约3％和约4％之间、在约4％和约5％之间、在约5％和约6％之间、在约6％和约7％之间、在约7％和约8％之间、在约8％和约9％之间或在约9％和约10％。
在其它实施方案中，提供用于减少有需要的受试者的空腹血糖水平的方法，这些方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。相对于在施用本文所述的本发明任何缀合物、组合物、形式、药物或组合之前的受试者的空腹血糖水平，或者与未接受本文所述的任何本发明缀合物、组合物、形式、药物或组合的对照受试者比较，空腹血糖水平可减少至小于约140至约150mg/dL、小于约140至约130mg/dL、小于约130至约120mg/dL、小于约120至约110mg/dL、小于约110至约100mg/dL、小于约100至约90mg/dL或小于约90至约80mg/dL。
本发明提供一种调节有需要的受试者的Y2受体活性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。如本文所用，“调节”是指增加或降低受体活性。
在一些实施方案中，每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每天六次、每天七次或每天八次向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或其形式、组合物或药物。在其它实施方案中，每隔一天一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每月两次、每月三次或每月四次向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或其形式、组合物或药物。
本发明的另一个实施方案包括一种对有需要的受试者的疾病、障碍或综合征或者所述疾病、障碍或综合征中的任一种的一个或多个症状进行预防、治疗、延迟其发作或改善的方法，该方法包括以组合疗法的形式向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物。在某些实施方案中，组合疗法为第二治疗剂。在某些实施方案中，组合疗法为外科疗法。
如本文所用，在将两种或更多种疗法施用于受试者的情形中，术语“联合”是指使用多于一种疗法。
如本文所用，组合疗法是指与有效量的本发明缀合物或其形式、组合物或药物同时地向有需要的受试者施用一种或多种另外的治疗剂、或一种或多种外科疗法。在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂或外科疗法可以与有效量本发明缀合物同一天施用，并且在其它实施方案中，一种或多种另外的治疗剂或外科疗法可以在与有效量的本发明缀合物同一周或同一月施用。
在某些实施方案中，在这些实施方案中疾病或障碍选自由以下项组成的组：肥胖症、II型糖尿病、代谢综合征、胰岛素抵抗和血脂异常，第二治疗剂可以是抗糖尿病剂。在某些实施方案中，抗糖尿病剂可以是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体调节剂。
本发明还考虑用组合疗法对有需要的受试者的任何疾病、障碍、综合征或症状进行预防、治疗、延迟其发作或改善，包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物以及以下治疗剂中的一种或多种：二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂(例如，西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、阿格列汀(alogliptin)等)；GLP-1受体激动剂(例如，短效GLP-1受体激动剂，诸如艾塞那肽和利西拉肽(lixisenatide)；中效GLP-1受体激动剂，诸如利拉鲁肽；长效GLP-1受体激动剂，诸如艾塞那肽缓释剂、阿必鲁肽(albiglutide)、杜拉鲁肽(dulaglutide))；钠-葡萄糖共转运蛋白-2(SGLT-2)抑制剂(例如，卡格列净(canaglifozin)、达格列净(dapaglifozin)、恩格列净(empaglifozin)等)；胆汁酸多价螯合剂(例如，考来维仑(colesevelam)等)；多巴胺受体激动剂(例如，溴麦角环肽速释剂)；双胍类(例如，二甲双胍等)；胰岛素；胃泌酸调节素；磺酰脲类(例如，氯磺丙脲、格列美脲、格列吡嗪、格列苯脲(glyburide)、格列本脲(glibenclamide)、格列波脲(glibornuride)、格列派特(glisoxepide)、格列吡脲(glyclopyramide)、妥拉磺脲(tolazamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、乙酰己酰胺、氨磺丁脲(carbutamide)等)；和噻唑烷二酮类(例如，吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)、洛贝格列酮(lobeglitazone)、环格列酮(ciglitazone)、达格列酮(darglitazone)、恩格列酮(englitazone)、萘格列酮(netoglitazone)、利格列酮(rivoglitazone)、曲格列酮(troglitazone)等)。在一些实施方案中，当与本发明缀合物组合给予时，减少另外的治疗剂的剂量。在一些实施方案中，当与本发明缀合物组合使用时，另外的治疗剂可以以低于各自单独使用时的剂量使用。
在某些实施方案中，在这些实施方案中疾病或障碍选自由以下项组成的组：肥胖症、I型或II型糖尿病、代谢综合征(即，X综合征)、胰岛素抵抗、葡萄糖耐量降低(例如，葡萄糖不耐受)、高血糖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、由先天性高胰岛素血症(CHI)引起的高血糖、血脂异常、动脉粥样硬化、糖尿病性肾病和其它心血管危险因素诸如高血压和与未管理胆固醇和/或脂质水平相关的心血管危险因素、骨质疏松、炎症、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肾病和湿疹，第二治疗剂可以是利拉鲁肽。
本发明还考虑用组合疗法对有需要的受试者的任何疾病、障碍、综合征或症状进行预防、治疗、延迟其发作或改善，包括向有需要的受试者施用有效量的本发明缀合物或药物组合物以及外科疗法。在某些实施方案中，外科疗法可以是减肥手术(例如，胃旁路手术，诸如Roux-en-Y胃旁路手术；袖状胃切除术；可调节胃束带手术；胆胰分流十二指肠开关术(biliopancreatic diversion with duodenal switch)；胃内水球(intragastricballoon)；胃折叠术(gastric plication)；以及它们的组合)。
在一种或多种另外的治疗剂与有效量的本发明缀合物同一天施用的实施方案中，本发明缀合物可以在另外的治疗剂之前、之后或同时施用。使用的术语“联合”并不限制疗法施用于受试者的次序。例如，第一疗法(例如，本文所述的组合物)可在第二疗法施用于受试者之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以前)，同时，或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周以后)施用。
实施方案
本发明还提供一些非限制性实施方案。
实施方案1为一种分离抗体或其抗原结合片段，该分离抗体或其抗原结合片段包含具有完全人Ig种系V基因序列的轻链可变区和具有除具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的HCDR3之外的完全人Ig种系V基因序列的重链可变区，其中该抗体或其抗原结合片段在体内不特异性结合任何人抗原。
实施方案2为根据实施方案1所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该分离单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:16、17、18、19、20和21的多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3
实施方案3为根据实施方案2所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该分离单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变结构域(VH)和具有SEQ IDNO:14的多肽序列的轻链可变结构域(VL)。
实施方案4为根据实施方案1-3中任一项所述的分离单克隆抗体，该分离单克隆抗体还包含Fc部分。
实施方案5为根据实施方案4所述的分离单克隆抗体，其中该Fc部分还包含来源于人IgG4Fc区的Fc区。
实施方案6为根据实施方案5所述的分离单克隆抗体，其中该人IgG4Fc区具有消除效应子功能的取代。
实施方案7为根据实施方案6所述的分离单克隆抗体，其中该单克隆抗体还包含修饰人IgG4Fc区，该修饰人IgG4Fc区包含至少一个选自由以下项组成的组的取代：在残基233处用脯氨酸取代谷氨酸、在残基234处用丙氨酸或缬氨酸取代苯丙氨酸、在残基235处用丙氨酸或谷氨酸取代亮氨酸、在残基297处用丙氨酸取代天冬氨酸。
实施方案8为根据实施方案6或7所述的分离单克隆抗体，其中该人IgG4Fc区包含在位置228处丝氨酸向脯氨酸的取代。
实施方案9为根据实施方案4-8中任一项所述的分离单克隆抗体，该分离单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:13的多肽序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:15的多肽序列的轻链(LC)。
实施方案10为一种分离核酸，该分离核酸编码实施方案1-9中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
实施方案11为一种载体，该载体包含实施方案10所述的分离核酸。
实施方案12为一种宿主细胞，该宿主细胞包含实施方案11所述的载体。
实施方案13为一种产生分离单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在产生该单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养实施方案12所述的宿主细胞，以及从该细胞或培养物回收该抗体或其抗原结合片段。
实施方案14为根据实施方案1-9中任一项所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，还包含至少一个与之缀合的药理学活性部分。
实施方案15为根据实施方案14所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该药理学活性部分为治疗性肽。
实施方案16为根据实施方案15所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该治疗性肽缀合在SEQ ID NO:18的半胱氨酸残基处。
实施方案17为根据实施方案15或16中任一项所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该治疗性肽通过接头缀合至该抗体或其抗原结合片段。
实施方案18为根据实施方案17所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该接头包括肽接头、烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头或由PEG和嵌入杂环组成的杂交接头。
实施方案19为根据实施方案15-18中任一项所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该治疗性肽选自由以下项组成的组：胃泌酸调节素、胰高血糖素样肽1(GLP1)、酪酪肽(PYY)、毒蜥外泌肽(艾塞那肽)、胰淀素(普兰林肽)、α-黑色素细胞刺激素(MSH)、***和安非他明调节转录物(CART)、神经肽Y受体Y1(NPY1)拮抗剂、神经肽Y受体Y5(NPY5)拮抗剂、神经降压素S、神经肽B、神经肽W、生长素释放肽、蛙皮素样受体3(BRS3)、甘丙肽、胆囊收缩素(CCK)、食欲素、黑色素聚集素(MCH)、催产素和顶压素。
实施方案20为根据实施方案19的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该治疗性肽为包含SEQ ID NO:24的多肽序列的胃泌酸调节素。
实施方案21为一种缀合物，包含偶联至胃泌酸调节素治疗性肽的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该缀合物具有如图11所示的SEQ ID NO:27的结构，其中mAb表示根据实施方案1-9中任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，并且]2表示胃泌酸调节素治疗性肽中的一个或两个共价缀合至该mAb。
实施方案22为一种产生实施方案15-21中任一项所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括将引入至该治疗性肽的侧链上的亲电体、优选地溴代乙酰胺或马来酰亚胺与该单克隆抗体或其抗原结合片段的SEQ ID NO:18的半胱氨酸残基的巯基基团反应，从而在该治疗性肽和该单克隆抗体或其抗原结合片段之间形成共价键。
实施方案23为一种药物组合物，包含实施方案14-21中任一项所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
实施方案24为一种产生包含实施方案14-21中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，该方法包括将该单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得该药物组合物。
实施方案25为一种试剂盒，包含实施方案1-9和14-21中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
实施方案26为一种增加治疗性肽在受试者内的半衰期的方法，该方法包括将该治疗性肽与单克隆抗体或其抗原结合片段缀合，该单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:16、17、18、19、20和21的多肽序列的重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中将该治疗性肽在SEQ ID NO:18的Cys残基处缀合至该单克隆抗体或其抗原结合片段。
实施方案27为根据实施方案26所述的方法，其中该治疗性肽选自由以下项组成的组：胃泌酸调节素、胰高血糖素样肽1(GLP1)、酪酪肽(PYY)、毒蜥外泌肽(艾塞那肽)、胰淀素(普兰林肽)、α-黑色素细胞刺激素(MSH)、***和安非他明调节转录物(CART)、神经肽Y受体Y1(NPY1)拮抗剂、神经肽Y受体Y5(NPY5)拮抗剂、神经降压素S、神经肽B、神经肽W、生长素释放肽、蛙皮素样受体3(BRS3)、甘丙肽、胆囊收缩素(CCK)、食欲素、黑色素聚集素(MCH)、催产素和顶压素。
实施方案28为根据实施方案27所述的方法，其中该治疗性肽为胃泌酸调节素。
实施方案29为根据权利要求28所述的方法，其中该胃泌酸调节素具有SEQ ID NO:24的多肽序列。
实施方案30为根据实施方案25-29中任一项所述的方法，其中该单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变结构域(VH)。
实施方案31为根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中该单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:13的多肽序列的重链(HC)。
实施方案32为根据实施方案25-31中任一项所述的方法，其中该单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变结构域(VL)。
实施方案33为根据实施方案25-32中任一项所述的方法，其中该单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:15的多肽序列的轻链(LC)。
实施方案34为包含有包含SEQ ID NO:18的重链互补决定区3的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该分离单克隆抗体或其抗原结合片段能够偶联至治疗性肽。
实施例
实施例1：mAb MSCB97的鉴定和产生
选择PH9L3 VL和PH9H5VH作为工程化的起始V区
选择命名为PH9L3(SEQ ID NO:3(Teplyakov等，“Structural diversity in ahuman antibody germline library,”mAbs 8月-9月8(6):1045-63(2016)))的抗体轻链可变区(VL)和命名为PH9H5(SEQ ID NO:4)(Teplyakov等，“Structural diversity in ahuman antibody germline library,”mAbs 8月-9月8(6):1045-63(2016))的抗体重链可变区(VH)作为起始可变区，从它们开始工程化能够进行肽缀合的mAb。PH9L3完全由人Ig种系V基因序列构成并且因此不包含将导致高亲和力、抗原特异性结合的来自体内亲和力成熟过程的任何序列突变。PH9H5的CDR3是VH中唯一不包含人种系V基因序列的区段。PH9H5的CDR3(SEQ ID NO:5)与作为中和CCL2抗体的抗人CCL2抗体CNTO 888相同，参见例如US20100074886 A1，CNTO 888的相关公开全文以引用的方式并入。产生包含PH9H5/PH9L3 VH/VL对的Fab。
将与这些最相似的PH9L3、PH9H5和人Ig种系V区和J区序列进行比对以确定与种系序列的序列同一性或相似性。将PH9H5与人Ig种系基因IGHV3-23*01(PubMed ID:M99660)(SEQ ID NO:7)和人IGHJ1*01(PubMed ID:J00256)(SEQ ID NO:8)的串联(concatenation)(SEQ ID NO:6)进行比对，其中PH9H5氨基酸序列和串联的人IGHV3-23*01-IGHJ1*01序列之间的唯一差异在VH CDR3处，对于PH9H5其为SEQ ID NO:5。
将PH9L3与人Ig种系基因IGKV3-11*01(PubMed ID:X01668)(SEQ ID NO:10)和IGKJ1*01(PubMed ID:J00242)(SEQ ID NO:11)的串联(SEQ ID NO:9)进行比对，其中唯一差异为V基因/J基因接界(junction)的一个偏差。
PH9H5和PH9L3的Cys取代变体的设计和生成
设计、生成在V区的所有三个CDR中挑选的CDR残基处包含单一Cys取代的PH9H5VH变体并且以具有人IgG1恒定区的完整重链的形式克隆到哺乳动物宿主表达载体中。PH9H5/PH9L3Fab结构用于帮助选择看起来更容易进行缀合的CDR残基以用于取代，并且在一些变体中，将另外的甘氨酸(Gly)残基***在引入的Cys残基的任一侧，以潜在地增加Cys对于缀合的可及性。设计并生成相似的PH9L3VL变体，除了这些变体以具有人κ恒定区的完整轻链的形式克隆到表达载体中。生成总计24种PH9H5单一Cys变体的表达构建体和22种PH9L3单一Cys变体的表达构建体。在PH9H5_VH(SEQ ID NO:4)内和在PH9L3_VL(SEQ ID NO:3)内选择用于取代的残基汇总在图2中。
通过瞬时地共转染每个基于PH9H5的HC Cys变体构建体与野生型PH9L3LC构建体或共转染每个基于PH9L3的LC Cys变体构建体与野生型PH9H5HC构建体，将生成的表达构建体用于表达Cys变体。初始测试转染使用HEK来源的Expi293作为表达宿主并且是在20ml规模下进行。基于培养上清液的变体蛋白质定量，大部分HC和LC Cys变体表达良好。
在750ml规模下将五种初始HC Cys变体MSCB33-MSCB37在Expi293中表达并且纯化变体蛋白质。纯化变体的纯化产率和质量特性非常相似并且对于在初始肽缀合反应中使用纯化蛋白质来说是足够的。
与基于PH9H5的HCCys变体的肽缀合的评估
MSCB33蛋白和其它变体蛋白的分析性质量确定指示在工程化用于缀合的Cys处存在半胱氨酸加合物，每个mAb有两个，并且去除了HC C-端Lys残基，这通常见于重组产生的mAb中。为了制备用于缀合的变体mAb，通过被开发以维持mAb内的原生二硫键的还原过程来去除加合物(参见实施例3)。使用马来酰亚胺化学对所有五种HC Cys变体mAb进行用人胃泌酸调节素(OXM)肽类似物(GCG Aib2,Gly16,24,Arg20,Leu27,Lys30(PEG12)-NH2)的初始测试缀合。mAb变体之间的缀合效率不同，其通过缀合反应产物和各自的相对百分比来定性地估计。相比于包含侧接Gly残基的其它I102C变体，如通过最大百分比的同源二聚体产物所测量，在MSCB33的情况下观察到最大效率，并且在Y103C变体MSCB35或MSCB37的情况下观察到很少缀合或没有缀合。
将在各种CDR中具有工程化半胱氨酸取代(在PH9H5_VH(SEQID NO:129)中T28C、S30C和S54C取代，并且在PHpL3_VL(SEQ ID NO:128)中S30C和S92C取代)的若干其它HC和LCCys变体以大规模在Expi293中表达。通过还原从这些纯化蛋白质去除Cys加合物是有挑战性的并且这些变体不再进一步继续。由于在大多数Cys变体的情况下观察到挑战并且在I102C PH9H5变体mAb MSCB33的情况下观察到初始良好的缀合效率，所以过程开发和进一步工程化努力聚焦这种具体变体。
MSCB33的Fc工程化
MSCB33被重新工程化成包含沉默的人IgG4_PAA Fc以减少体内Fc功能。人IgG4_PAA在人IgG4同种异型nG4m(a)上具有突变S228P/F234A/L235A(基于IGHG4*01等位基因，如IMGT中所定义)。生成具有融合至IgG4_PAA Fc的MSCB33的VH的表达构建体并且将它连同用于MSCB33表达的相同LC表达构建体一起用于产生MSCB33的IgG4_PAA变体，命名为MSCB97。MSCB97VH、HC、VL和LC的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:12、13、14和15提供。
在20ml规模下在Expi293细胞中瞬时地进行MSCB97的测试表达，并且这种mAb变体表达良好。从大规模Expi293表达操作纯化出MSCB97。MSCB97的纯化产率为264.53mg/L，并且质量确定为85％单体物质。随后的大规模表达操作和纯化的产率和质量相似或更好并且指示可以产生这种mAb的一致性。
与MSCB97的肽缀合和缀合反应可扩展性的评估
IgG1和IgG4同种型之间的LC-HC二硫键连接不同，所以测试还原和马来酰亚胺缀合并且确认可以使用上文所述的OXM-马来酰亚胺测试肽的TCEP还原和缀合从IgG1mAbMSCB33翻译到IgG4_PAA mAb MSCB97。已知由马来酰亚胺缀合引起的键合是潜在可逆的，所以基于起始的MSCB97在10mg规模下成功地采用并且实现了溴代乙酰胺缀合化学，其产生更稳定的键合。
对通过溴代乙酰胺化学生成的OXM类似物GCG Aib2,Glu16,24,Arg20,Leu27,Lys30-ε-(PEG12)-NH2的MSCB97缀合物(化合物2—“化合物2”和“缀合物2”可在本文互换使用)(MSCB97缀合至H-Aib-QGTFTSDYSKYLDERRARDFVEWLLNTK-(COCH2CH2(OCH2CH2)12NHCOCH2Br)-NH2(SEQ ID NO:24)以形成化合物2(图11；SEQ ID NO:27)进行测定以确定体外GLP-1R和GCGR效力。相对于参考肽和参考非结构化肽缀合物的效力是适当的并且类似于用相同肽与MSCB33(IgG1)生成的缀合物。这证明MSCB97(IgG4_PAA)和同种型MSCB33(IgG1)之间的单一差异对包含相同肽的缀合物的效力没有影响。另外，这些数据显示，在用溴乙酰胺化学生成的肽-mAb缀合物中可以保留期望的体外效力，溴乙酰胺化学产生在体内稳定的键合。还将其他OXM类似物与MSCB97缀合，并且测定这些缀合物的体外效力。这些缀合物具有与化合物2类似的GLP-1R和GCGR效力，突出了将多种肽与MSCB97缀合的能力，同时保留了肽效力。
结合至人CCL2的肽-MSCB97缀合物的评估
虽然MSCB97被选择并且工程化成缺乏特异性抗原结合，但是基于VH CDR3起源，这种mAb可结合的最可能的抗原(如果有的话)是人CCL2。使用两种肽-MSCB97缀合物，用OXM肽类似物(化合物2)或PYY肽类似物(化合物1—“化合物1”和“缀合物1”可在本文互换使用)评估MSCB97是否展示任何特异性CCL2结合。
通过表面等离振子共振(SPR)直接测量潜在的CCL2结合，其中使用抗Fc捕获方法将缀合物表面固定。可商购获得的抗CCL2小鼠mAb用作阳性对照，并且两种非特异性人抗体CNTO 9412和HH3B33用作阴性对照。将所有对照组类似地表面固定，并且将重组人CCL2在高达400nM的浓度下流过固定的缀合物和对照组。基于预先建立的测定标准，在阳性对照的情况下看到CCL2累积，指示特异性抗原结合，但是在阴性对照和任一肽-MSCB97缀合物(化合物1或2)的情况下看不到。这确认，以肽-mAb缀合物的相关治疗形式的MSCB97缺乏人CCL2结合。
SPR结合方法：使用ProteOn XPR36***(BioRad)执行使用表面等离振子共振(SPR)的结合测量。通过使用制造商针对胺偶联化学的说明，将抗人IgG Fc(Jackson目录号109-005-098)和抗小鼠IgG Fc(Jackson目录号315-005-046)的混合物与GLC芯片(BioRad，目录号176-5011)的修饰藻酸盐聚合物层表面偶联来制备生物传感器表面。将大约5700RU(应答单位)的mAb固定。在25℃下在运行缓冲液(DPBS；0.01％P20；100μg/ml BSA)中执行结合实验。为了执行结合动力学实验，捕获样品(化合物2、化合物1以及mAb阳性和阴性对照组)，之后进行在5种浓度下(以4倍连续稀释的形式)重组人CCL2(Thermo，目录号RMCP120)的注射。
将结合相在50μL/min下监测3分钟，然后进行5分钟的缓冲液流动(解离相)。在100μL/min下，用100mM H3PO4(Sigma，目录号7961)的两个18秒的脉冲，使芯片表面再生。
使用ProteOn Manager软件处理采集的数据。首先，利用区间(inter-spots)对数据进行背景校正。然后，对于分析物注射，使用缓冲液注射来实施数据的双基准减法。用于确定化合物2、化合物1和阳性对照组与CCL2的特异性可检测结合的预先建立的测定标准需要在最高浓度下>10RU信号的剂量成比例应答，并且阴性对照应答信号<10RU。基于测定标准，将每个样品的结果报告为是或否与人CCL2剂量-应答结合。
实施例2：mAb的表达和纯化
全人单克隆抗体(mAb)可以在哺乳动物表达宿主中重组表达，并且使用本领域中已知的标准方法从细胞培养上清液中纯化。例如，可以使用标准分子生物学方法，将编码mAb的轻链(LC)和重链(HC)的cDNA序列，各自包括引起分泌的适当单一肽，克隆到分开的哺乳动物表达载体或单一表达载体中。所用的表达载体可以是可商购获得的载体诸如pEE12.4、pcDNATM3.1(+)或pIRESpuro3或者具有类似功能的任何定制表达载体。在此类载体中，mAb的重链和轻链的转录各自由任何已知的有效启动子诸如hCMV-MIE启动子驱动。使用标准方法诸如QIAGEN Plasmid Midi试剂盒，制备分开的LC和HC表达构建体或表达LC和HC的单一构建体的转染级质粒DNA。
根据制造商的说明书，制备用基于脂质的转染试剂诸如FreestyleTMMax转染试剂进行转染的纯化质粒DNA，然后将纯化质粒DNA转染到标准哺乳动物表达宿主细胞系诸如CHO-S或HEK 293-F中。如果mAb LC和HC是通过分开的表达构建体编码的，那么同时转染两个构建体。在转染之前和之后，根据标准细胞培养方法培养用于维持或用于mAb表达的哺乳动物细胞，由此通过利用的特定哺乳动物宿主细胞系确定维持的细胞密度范围、使用的培养基和遵循的其它细胞培养条件。这些参数通常由获得细胞系的供应商或在科学文献中提供记录。例如，将CHO-S细胞在CHO FreestyleTM培养基中维持悬浮，在设定为37℃和8％CO2的潮湿孵育箱中以125RPM振荡，并且当细胞浓度在每毫升1.5和2.0×106之间个细胞时进行***。
在转染后若干天收获表达mAb的瞬时转染哺乳动物细胞的细胞培养上清液，通过离心进行澄清并且过滤。CHO-S细胞的表达持续时间通常为四天，但是可以调整，并且对于不同的哺乳动物宿主细胞系可以不同。使用诸如Centramate的浓缩器将大规模转染(>10升)浓缩10倍。使用蛋白A亲和柱诸如HiTrap MabSelect Sure，利用用于将mAb与蛋白A树脂结合、洗涤树脂并且使用低pH缓冲液洗脱蛋白质的标准方法，从澄清的上清液纯化出mAb。通过洗脱到包含pH 7缓冲液的管中来立即中和蛋白级分，并且将峰级分合并，过滤并在4℃下用pH 7.2磷酸盐缓冲盐水(PBS)渗析过夜。渗析之后，再次将mAb过滤(0.2μ过滤器)，并且通过在280nm下的吸光度确定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和分析性尺寸排阻色谱HPLC评估纯化mAb蛋白的质量，并且使用鲎阿米巴样细胞裂解物(LAL)测定来测量内毒素水平。将纯化的mAb在4℃下保存。
瞬时转染CHO细胞的MSCB97的表达和纯化
根据制造商的推荐，通过用MSCB97表达构建体的纯化质粒DNA瞬时转染细胞，将MSCB97在ExpiCHO-STM细胞(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA；目录号A29127)中表达。简而言之，在设定为37℃、8％CO2和125RPM的振荡孵育箱中将ExpiCHO-STm细胞在ExpiCHOTm表达培养基(ThermoFisher Scientific，目录号A29100)中维持悬浮。使细胞传代，使得在转染当天，可以实现稀释至每毫升6.0×106个细胞，维持细胞活力为98％或更好。使用ExpiFectamineTmCHO转染试剂盒(ThermoFisher Scientific目录号A29131)进行瞬时转染。对于每毫升待转染的稀释细胞，使用一毫克质粒DNA并且稀释到OptiPROTmSFM复合培养基中。在1:3比率(v/v，DNA：试剂)下使用ExpiFectamineTmCHO试剂，并且也稀释到OptiPROTm中。将稀释DNA和转染试剂合并一分钟，允许DNA/脂质复合物形成，然后添加到细胞。在孵育过夜之后，将ExpiCHOTm进料和ExpiFectamineTmCHO增强子添加至细胞。在32℃下振荡的情况下培养细胞五天，之后收获培养上清液。
通过离心(30min，6000rpm)澄清，之后进行过滤(0.2μPES膜，Corning)，收获瞬时转染ExpiCHO-STm细胞的培养上清液。使用颇尔Centramate切向流过滤***(PallCentramate Tangential Flow Filtration system)首先将大规模转染(5至20升)浓缩10倍。将10x杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)pH7.2添加至上清液中达到1x最终浓度，之后使用AKTA FPLC色谱***，在每毫升树脂约20mg蛋白质的相对浓度下加载到平衡的(DPBS，pH7.2)HiTrap MabSelect Sure蛋白A柱(GE Healthcare；Little Chalfont,UnitedKingdom)上。加载之后，用10倍柱体积的DPBS pH 7.2洗涤柱。用10倍柱体积的0.1M乙酸钠pH 3.5洗脱蛋白质。通过在20％洗脱级分体积下洗脱到包含2.0M三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)pH 7的管中来立即中和蛋白质级分。将峰级分合并并且需要时用另外的Tris将pH调节至约5.5。过滤纯化蛋白质(0.2μ)，并且在BioTek SynergyHTTM分光光度计上通过在280nm下的吸光度来确定浓度。通过SDS-PAGE和分析性尺寸排阻HPLC(Dionex HPLC***)来评估纯化的蛋白质的质量。使用浊度法LAL测定(-T,Associates ofCape Cod)测量内毒素水平。
实施例3：mAb和环状PYY肽的缀合
方法A：用TCEP部分还原mAb
用3当量的TCEP处理10mg/mL mAb在tris-乙酸盐缓冲液(20mL，1mM在EDTA中)中的溶液。将溶液调节至pH 6并且在室温(rt)下1小时后联用质谱仪的高压液相色谱法(LCMS)显在位置C102处的二硫化物加合物已被完全还原。通过蛋白A吸附和洗脱(4CV 100mM乙酸)纯化还原mAb，得到180mg还原mAb。
还原mAb和环状PYY肽的缀合
将冻干的肽(5当量，相对于mAb)添加到上文所述的还原mAb。添加EDTA直到最终浓度1mM并且将pH调节到7。将浓度调节到8mg/mL，并且在室温下使反应在温和搅拌的情况下进行16小时。添加TCEP(0.5当量，相对于mAb)，并且在rt下使反应在温和搅拌的情况下进一步进行4小时，在这之后高分子量(MW)物质减少到小于3％。
将反应混合物调节至pH 5.5，并且通过离子交换色谱法，在CaptoSP树脂上，使用梯度100％A(100mM TRIS-乙酸盐，pH 5.5)至100％B(100mM TRIS-乙酸盐，pH 5.5；0.5MNaCl)在20CV上进行纯化。将包含期望的缀合物的级分合并，并且回收140mg缀合物，与少量未反应的肽共洗脱。通过蛋白A吸附和洗脱(4CV 100mM乙酸)进行最终纯化。将产物的pH调节至6，以得到在>90％纯度与<3％高MW物质下的120mg缀合物(60％产率)。
方法B
mAb的疏水相互作用色谱法(HIC)纯化
将20mg/mL mAb在tris-乙酸盐缓冲液中的溶液加载于疏水相互作用柱(TOSOHTSKgel phenyl 7.5x21cm)并且用线性梯度(0-70％B/A，溶剂A：5％iPrOH，1M(NH4)2SO4，100mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0；溶剂B：20％iPrOH，100mM磷酸盐缓冲液)进行洗脱。将mAb单体峰合并，浓缩(5-10mg/mL)并且用3-(N-***)丙磺酸(MOPS)缓冲液(100mM，pH 5.5)渗析。
用TCEP的部分还原和还原mAb与肽类似物的缀合
向纯化的mAb(27mL，9.28mg/mL)中添加4当量TCEP，接着添加EDTA(1mM)。在室温下2小时之后，LCMS显示在位置C102处的二硫化物加合物被完全还原。用Zebra脱盐离心柱(7×10mL，7K MWCO，用MOPS 100mM pH 5.5预平衡)处理还原mAb以除去释放的半胱氨酸/GSH。向还原mAb的合并级分(28mL)中加入环状PYY肽在Milli Q级水(6.5当量，相对于mAb，15-20mg/mL)中的溶液，之后加入EDTA(1mM)。通过逐滴添加1N NaOH将反应的pH调节至7.2至7.4。使反应物在室温下在温和搅拌的情况下进行18小时。在加入另外的0.5当量TCEP之后，再继续反应12小时，以还原在反应过程中形成的mAb-mAb二聚体，并允许转化成期望的mAb同源二聚体。通过加入2M乙酸将反应的pH降至pH 5.5，并且将粗缀合物通过疏水相互作用色谱法进行纯化并用线性梯度(0-100％B/A，溶剂A：5％iPrOH、1M(NH4)2SO4、100mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0；溶剂B：20％iPrOH，100mM磷酸盐缓冲液)进行洗脱。通过蛋白A吸附(PBS)和洗脱(NaOAc，pH 3.5)进行最终纯化。将产物的pH调节至6并用PBS渗析，得到最终样品(56％)。
另选地，用GSH和/或Cys还原mAb。在通过切向流过滤(TFF)除去还原剂后，任选地在0.2-0.5当量的TCEP存在下，将过量的肽加入到还原mAb中。
实施例4：体外研究
评估化合物1(SEQ ID NO:2)，与环状PYY肽偶合的单克隆抗体(图3)，在表达人、大鼠、小鼠和恒河猴Y2受体以及人Y1、Y4和Y5受体的克隆细胞(HEK或CHO)中体外激活NPY受体的能力。PYY3-36、NPY和PP被包括在这些测定中作为研究对照组。
细胞系
开发出表达NPY受体的稳定转染克隆细胞系以用于cAMP测定。简而言之，使用Lipofectamine 2000试剂盒(Invitrogen)，根据其方案，用携带人Y2受体(目录号：NM_000910.2)、人Y5受体(目录号：NM_006174.2)、小鼠Y2受体(目录号：NM_008731)和恒河猴Y2受体(目录号：NM_001032832)的编码序列的表达质粒转染HEK293细胞系。在转染之后48小时，用选择培养基(具有10％胎牛血清(FBS)、50I.U.青霉素、50μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和600μg/ml G418的高葡萄糖DMEM)重新铺板细胞。将细胞保持在选择培养基中2周，之后使用有限稀释方法挑选出单克隆。随后通过在补充有10％胎牛血清、1％L-谷氨酰胺、1％丙酮酸钠、1％青霉素/链霉素和600μg/ml G418的DMEM-高葡萄糖培养基(Cellgro)中培养来维持转染细胞。
此外，CHO-K1细胞系获自DiscoverX Corporation，表达人Y1受体(目录号：93-0397C2)和人Y4受体(目录号：95-0087C2)。在补充有10％FBS的F12培养基(Gibco)中并且在G418选择(800μg/mL)下培养DiscoverX细胞。大鼠Y2受体在可购自Promega Corporation的Glo-Sensor CHO-K1系中表达。这些细胞用pGloSensorTM-23F cAMP质粒转染以用于基于发光的cAMP测定，但已经过测试和验证以用于Perkin-Elmer LANCE cAMP测定。使大鼠Y2细胞在补充有10％FBS和800μg/ml G418的F12培养基(Gibco)中生长。
将所有细胞系存放在小瓶(4×106个细胞/小瓶)中并保存在液氮中直至使用。在测定前一天，将小瓶解冻并加入到15ml适当的培养基中。将细胞在450×g下离心5min，抽出上清液，并且将细胞在0.2×106个细胞/毫升的密度下重新悬于不含G418的培养基中。将细胞分配(25μl/孔)到Biocoat涂布胶原的白色384孔板中至最终密度为5000个细胞/孔。将细胞板在37℃潮湿的组织培养孵育箱中、在5％CO2/90％O2气氛下孵育过夜。
实验方案
各种受体测定的cAMP测定是相同的。在所有实验中使用LANCE cAMP试剂盒(Perkin Elmer Corporation；Waltham,MA)以定量细胞内cAMP水平。在测定当天，从细胞中倾析出细胞培养基，并向孔中加入6μl肽(2X浓度)。在刺激缓冲液中将肽配制成11点剂量应答(在100nM或10μMCIA开始，连续1:3稀释)。刺激缓冲液由5mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、500μM IBMX和0.1％牛血清白蛋白(BSA)的HBSS溶液(Hank平衡盐溶液)组成。接下来，将6μl包含毛喉素(2X，5μM最终浓度)和LANCE cAMP抗体(1:100)的刺激缓冲液加入细胞中。在rt下孵育25分钟之后，向每个孔中加入12μl测定检测混合物。通过如用LANCE cAMP试剂盒所提供的将生物素-cAMP(1:750)和铕-W8044(1:2250)稀释在检测缓冲液中来制备检测混合物。将板在rt下孵育2小时，然后在Envision读板机上读取作为TR-FRET测定(激发320nm，发射615nm和665nm)。将通道1荧光(在615nm下的相对荧光单位)和通道2荧光(在665nm下的相对荧光单位)以及它们的比率输出到Excel文件中。
数据分析
将Envision读板机的数据表示为相对荧光单位(RFU)，计算为(615nm/665nm)×10,000。对所有样品均进行三次重复测量。使用由Eudean Shaw设计的Crucible内部数据分析软件分析数据。从每个平板内包含的已知cAMP浓度的参考标准内推每个孔内的未知cAMP浓度。通过在Janssen R&D的非临床统计和计算部门(Non-Clinical Statistics&Computing department)实现的R环境(开源http://cran.us.r-project.org/)内使用非线性加权最小二乘法应用对cAMP浓度值相对于与4-P模型拟合的对数化合物浓度进行绘图来推导出参数诸如EC50、Log(EC50)、希尔斜率(nH)、顶部和底部。
表1：体外数据
实施例5：药代动力学(PK)
DIO小鼠PK
雄性DIO C57BL/6N小鼠(20周龄，14周高脂肪饮食)可购自Taconic Laboratory。将小鼠在温度控制的房间中在12小时明/暗循环的情况下饲养为每个具有AlphaDri垫料的笼一只小鼠。允许小鼠随意饮水并维持高脂肪饮食(D12492，Research Diet)。
将小鼠皮下(s.c.)给药1mg/kg化合物1，在每个时间点杀死3只动物，并在t＝4、8、24、48、72、120和168小时收集血液。还收集3只初始动物的血液。在用70％CO2和30％O2混合物诱导的气体麻醉下的同时，在断头之后通过颈静脉收集每只动物的大约300μL血液。将血液样品(大约300μL)收集在涂布K3E(EDTA)的Sarstedt管中，这些管包含12μl(4％比率)的完全蛋白酶抑制剂溶液和3μL(1％比率)的DPP-IV抑制剂。将血液样品放置在湿冰上，之后在冷藏条件(约5℃)下以10,000rpm离心约4分钟，以实现在每个时间点的收集之后30分钟内除去细胞，并且将所有可用的血浆转移到96孔板。将孔板存放在干冰上直至将其放置在-80℃冰箱中。数据在表2和图4中示出。
大鼠PK
将化合物1在PBS(pH 7.0-7.6)中1.0mg/kg的剂量水平下皮下和静脉内施用给雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。通过隐静脉在每个时间点(给药后t＝1、4、24、48、72、96、168和240小时)收集三只动物的大约500μL血液。在用70％CO2和30％O2混合物诱导的气体麻醉下的同时，在断头之后通过颈静脉收集336小时给药后血液样品。将血液样品收集在涂布K3E(EDTA)的Sarstedt管中，这些管包含20μl(4％比率)的完全蛋白酶抑制剂溶液和5μL(1％比率)的DPPIV抑制剂。将血液样品放置在湿冰上，之后在冷藏条件(约5℃)下以10,000rpm离心约4分钟，以实现在每个时间点的收集之后60分钟内除去细胞，并且将所有可用的血浆转移到96孔板。使用下文所述的LCMS方法测量化合物1的水平。数据展示于表3中。
食蟹猴(Cyno)PK
使所有动物在给药前和通过血液样品收集的前四个小时禁食至少8小时。三只动物接受单次IV剂量的1mg/kg化合物1，并且三只动物接受单次SC剂量的1mg/kg化合物1。在给药前和给药后1、6、10、24、36、48、72、120、168、240、336、432和504小时收集血液。对于IV组，在给药后0.5小时收集另外的样品。将每只动物的大约1ml血液样品收集在涂布K3E(EDTA)的Sarstedt管中，这些管包含4％比率的完全蛋白酶抑制剂溶液和1％比率的DPPIV抑制剂。将血液样品放置于湿冰上，然后在每个时间点收集后30分钟内离心，并将所得血浆分成三份并转移到一式三份的96孔板中。将孔板存放在干冰上直至将其放置在-80℃冰箱中。数据在表4和图5中示出。
用于测定血浆水平的完整质谱测定
使用抗人Fc抗体通过免疫亲和捕获处理血浆样品，之后在三重TOF(飞行时间)质谱仪上进行反相LC-高分辨率全扫描MS分析。对原始MS光谱进行解卷积以阐明注射样品中组分的分子量。将完整缀合物的分子离子峰用于定量。通过在血浆中掺加参考标准品来制备标准曲线和质量控制样品，并使用与产生的样品相同程序同时的进行处理。DIO小鼠、大鼠和食蟹猴的PK数据分别显示在表2-4中。DIO小鼠和食蟹猴的PK数据也分别显示在图4和5中。
表2：DIO小鼠中的PK
表3：大鼠中的PK
途径 剂量(mg/kg) T<sub>1/2</sub>hr T<sub>max</sub>hr C<sub>max</sub>ng/mL AUC<sub>最后</sub>hr*ng/mL
IV 1.0 93.0 1 19.5 809.2
SC 1.0 88.7 48 4.2 602.0
表4：食蟹猴中的PK
途径 剂量(mg/kg) T<sub>1/2</sub>hr T<sub>max</sub>hr C<sub>max</sub>ng/mL AUC<sub>最后</sub>hr*ng/mL
IV 1.0 178.39 0.67 30290 1207.39
SC 1.0 104.32 10 5590 712.19
实施例6：体内功效研究
饮食诱导肥胖(DIO)小鼠的体重减轻：短期给药
在单剂量之后评估化合物1减少雄性DIO C57B1/6小鼠的食物摄取和体重的能力。雄性DIO C57BL/6N小鼠(20周龄，14周高脂肪饮食)可购自Taconic Laboratory。将小鼠在温度控制的房间中在12小时明/暗循环的情况下饲养为每个具有AlphaDri垫料的笼一只小鼠。允许小鼠随意饮水并维持高脂肪饮食(D12492，Research Diet)。在实验开始之前使动物适应设施至少一周。
在给药前一天，基于个体体重将小鼠分成8只动物的组群。在第二天的下午3:00-4:00，将动物称重并用溶媒(dPBS，pH7.2)、在0.1、0.3、1.0、3.0或7.5nmol/kg剂量下的化合物1或者在0.3nmol/kg下的杜拉鲁肽通过皮下(s.c.)施用来处理。在给药之后24小时、48小时和72小时测量体重和食物摄取，并计算体重减轻和食物摄取减少的百分比。在Prism中使用双向重复测量ANOVA与Tukey事后测试进行统计学分析。所有数据均表示为平均值±SEM(图6和图7)。
饮食诱导肥胖小鼠的体重减轻：长期给药
评估化合物1在8天的时间内在雄性DIO C57B1/6小鼠中重复给药时减少食物摄取量和体重并改善葡萄糖稳态的能力。雄性DIO C57BL/6N小鼠(20周龄，14周高脂肪饮食)可购自Taconic Laboratory。将小鼠在温度控制的房间中在12小时明/暗循环的情况下饲养为每个具有AlphaDri垫料的笼一只小鼠。允许小鼠随意饮水并维持高脂肪饮食(D12492，Research Diet)。在实验开始之前使动物适应设施至少一周。
在给药前一天，基于个体体重将小鼠分组。在接下来的8天中的每一天的下午3:00-4:00，称重动物和食物摄取。动物用溶媒(dPBS，pH7.2)、或每天通过皮下施用的在0.3nmol/kg下的杜拉鲁肽、或每三天通过皮下施用的在0.1、0.3、1.0、3.0nmol/kg下的剂量处的化合物1进行处理。8天后，将小鼠空腹5小时，然后在t＝0时口服给予2g/kg大剂量葡萄糖。在葡萄糖负荷(glucose challenge)之后的t＝0、30、60、90和120分钟时，测量血糖，并且在t＝0、30和90分钟时抽血以测量血浆胰岛素。在Prism中使用单向ANOVA或双向重复测量ANOVA与Tukey事后测试进行统计学分析。所有数据均表示为平均值±SEM(图8和9，以及表5-8)。
表5：在8天的处理中，化合物1对体重(g)的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
相对于溶媒，*p<0.05；双向ANOVARM、Tukey的多重比较检验
表6：在处理8天后，在OGTT期间化合物1对血糖(mg/dL)水平的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
相对于溶媒，*p<0.05；对葡萄糖值应用双向ANOVA RM、Tukey的多重比较检验；对AUC应用单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表7：在处理8天后，在OGTT期间化合物1对胰岛素(ng/mL)水平的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
相对于溶媒，*p<0.05；对葡萄糖值应用双向ANOVA RM、Tukey的多重比较检验；对AUC应用单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
表8：在处理8天后，化合物1对进食血糖(mg/dL)水平的影响
数值代表每组8只动物的每次数据的平均值±SEM
相对于溶媒，*p<0.05；单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
实施例7：制备mAb-胃泌酸调节素(mAb-OXM)化合物的合成策略
人胃泌酸调节素(OXM)是37个氨基酸的内源性肽(SEQ ID NO:23)，已显示它在患有II型糖尿病的患者中具有有益的药理学。药理学是GLP1R和GCGR的激动作用的结果。对OXM类似物的研究显示出一种肽变体，它在啮齿动物模型中显示出良好的葡萄糖控制和体重减轻。OXM的体内半衰期在人体中是大约几分钟。因此，对OXM进行了另外的设计，以使半衰期与每周一次给药相称。通过增加OXM肽对蛋白水解的稳定性，以及通过共价连接单克隆抗体(mAb)来增加肽的循环半衰期，实现半衰期的增加。通过在位置2处用氨基异丁酸(Aib)取代丝氨酸来减轻通过DPP4有效负载的肽的蛋白水解。通过引入从Q20R到S16E和Q24E的分叉型盐桥来稳定肽的螺旋拓扑，并且通过M27L变型来减轻潜在的氧化倾向。选择亲本mAbMSCB97(上文所述)以具有低内在抗原结合，并且重链的HCDR3(SEQ ID NO:18)区中异亮氨酸向半胱氨酸点突变(I102C)充当合成肽有效负载的连接点。通过使用IgG4PAA同种型沉默效应子功能。短的寡聚乙二醇间隔物并入在mAb和肽之间以确保肽无阻地进入GLP1R和GCGR。间隔物还赋予有利的水溶性，促进缀合化学。通过在乙二醇间隔物的远侧端部引入反应性溴代乙酰胺基团来实现肽-间隔物与mAb的连接。间隔物的近侧端部通过K30的侧链与OXM变体连接。胰高血糖素和OXM肽变体的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:22和24提供。缀合是通过硫醇官能团与mAb重链中的半胱氨酸点突变的反应完成的。mAb重链和轻链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15提供。
mAb-OXM化合物的化学合成
mAb-OXM化合物的产生的总体合成方案如图10所示。
胃泌酸调节素(OXM)肽变体的制备：使用标准的9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)氨基酸(除N-端His，Nα-Boc-His(Boc)-OH以及Lys30，Nα-Fmoc-Lys(ivDDE)-OH之外)在PAL-PEG-聚苯乙烯树脂上合成树脂结合的保护肽。始终使用标准氨基酸活化和Fmoc去保护策略。完成序列后，通过用稀无水肼的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液处理，选择性地使C-端赖氨酸的侧链去保护。使用二异丙基碳二亚胺(DIC)/乙基(羟基亚氨基)-氰基乙酸酯活化将Fmoc-dPEG12-CO2H与释放的胺偶联。除去Fmoc基团，并使用溴乙酸酐的DMF溶液将所得胺溴乙酰化。
通过用包含苯酚的三氟乙酸(TFA)、水和三异丙基硅烷作为清除剂进行处理来从树脂除去肽，同时将所有保护基脱保护。粗肽通过用***进行冷沉淀来分离，并且通过使用乙腈/水和0.1％v/v TFA作为洗脱液的反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化。冷冻干燥之后收集为蓬松白色固体形式的纯肽并在-80℃下存放。
单克隆抗体MSCB97的还原：分离单克隆抗体，其中工程化Cys102残基二硫键结合至从细胞溶胶或生长培养基清除的偶然半胱氨酸或谷胱甘肽残基。因此，在与OXM肽变体缀合之前，需要初步还原这些二硫化物，然后除去不需要的半胱氨酸。用固定在蛋白A树脂珠粒上的mAb实现还原。还原剂(三羧基乙烯膦，TCEP)在pH 5下循环通过柱直到还原完成(1小时)。在这些条件下TCEP作为还原剂的优点在于，虽然还原是有效的，但是在较低pH下二硫键的重新形成是忽略不计的。在洗去副产物之后，使用酸性缓冲液(在pH 3.5下的乙酸钠)从柱洗脱出还原的吸附蛋白。将还原mAb用在pH 5.5下的50mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)渗析两次。
通过在pH 5的溶液中用相对于mAb 2.5当量的TCEP进行还原来制备较小的探索批次。使还原在室温下进行2小时。通过凝胶过滤(PD10柱)除去小分子副产物，并且用10mMMOPS pH 5.5洗脱还原MSCB97。
mAb-OXM化合物的制备：将还原MSCB97的溶液加入到7.6倍过量的冻干OXM肽变体中。加入1mM EDTA溶液以保护反应性硫醇免受金属催化氧化，并且通过加入MOPS缓冲液(1M，pH 8.1)将反应溶液的pH升至7.3。使反应物在室温下在温和搅拌的情况下进行18小时。通过加入2M乙酸将pH调节至5.5来淬灭反应，并且通过在蛋白A上进行吸附，洗涤以除去过量的肽、未折叠的产物和副产物来纯化粗缀合物。洗脱产物(乙酸钠，pH3.6)，然后渗析到pH 5的乙酸盐缓冲液中。
以250mg、500mg和500mg的MSCB97开始执行三次独立合成，并且将产物合并成单一批。
mAb-OXM化合物的分析
使用(i)分析性疏水相互作用色谱(HIC)，(ii)通过液相色谱电喷雾电离质谱(LC-ESIMS)进行的完整质量测量，(iii)分析性尺寸排阻色谱法(SEC)以及(iv)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析制备的mAb-OXM化合物的特性。
在人和猴子血浆中的稳定性
OXM通过血浆肽酶快速代谢。为了确定mAb-OXM化合物(“化合物2”)(图11)在人和猴血浆中对酶促降解的抗性，评估了化合物2的离体稳定性。将化合物2在20nM下与新鲜(从未冷冻)的肝素化血浆在37℃下孵育长达168小时。使用基于功能细胞的生物测定法进行生物分析，这种生物测定法测量人GLP-1受体转染的HEK细胞中的cAMP产生。产生的cAMP的量与活性OXM类似物的浓度成正比，并且在这个测定中通过从已知浓度的参考标准内推来确定稳定性样品中活性OXM类似物的水平。这个测定用于相对于先前确定的更稳定的对照组(对照组1)和先前确定的较不稳定的对照组(对照组2)来对稳定性进行评级。数据用于对相对稳定性进行评级，并显示在图12和13中。
实施例8：体外研究：化合物2在人、小鼠、大鼠和食蟹猴GLP1以及胰高血糖素受体 处的体外效力。
感兴趣的化合物(包括化合物2)的效力和物种特异性在使用转染以稳定表达人、食蟹猴、大鼠或小鼠GLP1或GCG受体的HEK293细胞的测定中进行表征。对于每个受体测定，将克隆细胞以范围为每孔2000-5000个细胞的适当密度接种到384孔板中。将化合物在补充有5mM HEPES、0.1％BSA和0.5mM IBMX的HBSS中稀释，并加入到细胞中。根据细胞克隆将细胞板在室温下孵育5或10分钟，然后裂解以用于cAMP测量。使用具有EnVision读板机的LANCE cAMP试剂盒定量cAMP浓度。在每个测定板中包括标准曲线，用于反向计算cAMP浓度。分析剂量-应答曲线，并用Graphpad Prism或Crucible计算化合物EC50值。EC50数据汇总于表9-10中。
表9：人GLP1和胰高血糖素受体cAMP测定的EC50值(nM)的汇总。
值表示3-7次实验的平均值±SEM。
表10：小鼠、大鼠和食蟹猴GLP1和胰高血糖素受体cAMP测定的EC50值(nM)的汇总。
值表示3-8次实验的平均值±SEM。
实施例9：在其它相关GPCR下的效力
在使用表达若干B类GPCR的细胞的测定中评估化合物2的效力。使用表达CALCR、PTHR1、PTHR2、CRHR1、CRHR2和VIPR1的细胞，在一组六个体外cAMP测定中测试化合物2。根据供应商的标准操作程序执行测定，其中每个测试的受体均包括阳性对照。
另外，在表达人GIP受体的稳定细胞系中测试化合物2。将细胞接种到384孔板中并且24小时之后在室温下用化合物处理5分钟。使用CisBio HTRF cAMP试剂盒测量cAMP浓度，并且使用GraphPad Prism分析结果。数据示于表11-12中。
表11：cAMP测定中化合物2效力的汇总。
表12：在人GIP受体测定中化合物2的效力
实施例10：体内研究：DIO小鼠中的单剂量功效
在单剂量化合物2或GLP1R激动剂杜拉鲁肽后，评估在DIO小鼠中食物摄取、体重、葡萄糖耐受性和血浆FGF21水平。在给药前一天，将动物称重并按BW分组。通过皮下注射如所指示向小鼠给药。第二天上午，取出食物，并且开始6小时空腹。记录BW和食物重量(FW)。测量空腹血糖并在下午12:00收集血液以用于胰岛素测量。1小时之后，将小鼠腹膜内给药葡萄糖(1g/kg，20％葡萄糖，5mL/kg)。在10分钟时通过尾部出血收集另外20μL血液以针对血浆胰岛素。在葡萄糖负荷之后10、30、60和90分钟通过血糖仪测量血糖水平。然后用CO2使小鼠安乐死，并通过心脏穿刺收集末梢血样。数据示于表13-19中。
表13：处理之后18小时内DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对食物摄取(克)的影响
处理 给药前24小时 给药后18小时
溶媒 3.1±0.1 2.9±0.1
杜拉鲁肽(0.3nmol/kg) 3.1±0.1 1.5±0.1*^
化合物2(1.0nmol/kg) 3.2±0.1 2.5±0.1^#
化合物2(2.0nmol/kg) 3.4±0.1 2.2±0.1*^#
化合物2(4.0nmol/kg) 3.2±0.1 1.7±0.1*^
化合物2(8.0nmol/kg) 3.4±0.1 1.4±0.2*^
相对于溶媒(给药后18小时)，*p<0.01；相对于相应的给药前24小时，^p<0.001；相对于给药后18小时杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)，#p<0.0001
双向ANOVA、Sidak的多重比较检验
值表示每组8只动物的每个时间点数据的平均值±SEM，除了给药前24小时溶媒(n＝7)
表14：处理之后18小时DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对体重变化百分比的影响
处理 重量变化(％)
溶媒 -0.7±0.3
杜拉鲁肽(0.3nmol/kg) -4.1±0.3*
化合物2(1.0nmol/kg) -1.9±0.3*^
化合物2(2.0nmol/kg) -2.8±0.4*^
化合物2(4.0nmol/kg) -4.4±0.3*
化合物2(8.0nmol/kg) -5.2±0.3*^
相对于溶媒，*p<0.01；相对于杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)，^p<0.05
双向ANOVARM、Tukey的多重比较检验数据仅显示18小时时间点
在第0天(给药前)相对于体重计算重量变化百分比
值表示每组8只动物的数据的平均值±SEM
表15：处理之后24小时在IPGTT期间DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对血糖(mg/dL) 的影响
值表示每组8只动物的每个时间点数据的平均值±SEM
表16：治疗之后24小时DIO小鼠中在IPGTT期间的血糖净AUC
相对于溶媒，*p<0.05；相对于杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)和JNJ-64151789(4.0和8.0nmol/kg)，^p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值表示每组8只动物的数据的平均值±SEM
表17：治疗之后24小时DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对6小时空腹葡萄糖(mg/dL) 的影响
处理 血糖(mg/dL)
溶媒 215±9
杜拉鲁肽(0.3nmol/kg) 140±7*
化合物2(1.0nmol/kg) 169±6*
化合物2(2.0nmol/kg) 138±11*
化合物2(4.0nmol/kg) 114±8*
化合物2(8.0nmol/kg) 96±7*^
相对于溶媒，*p<0.05；相对于杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)，^p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值表示每组8只动物的数据的平均值±SEM
表18：在IPGTT期间葡萄糖负荷前(处理后24小时)和葡萄糖负荷之后10分钟DIO小 鼠中化合物2和杜拉鲁肽对血浆胰岛素水平(ng/ml)的影响
值表示每组8只动物的数据的平均值±SEM
表19：治疗之后26小时DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对血浆FGF21(ng/mL)的影响
处理 血浆FGF21(ng/mL)
溶媒 0.4±0.1
杜拉鲁肽(0.3nmol/kg) 0.8±0.2
化合物2(1.0nmol/kg) 0.7±0.1
化合物2(2.0nmol/kg) 1.5±0.3
化合物2(4.0nmol/kg) 2.1±0.4^
化合物2(8.0nmol/kg) 3.5±0.3*
相对于所有组，*p<0.0001；相对于除化合物2(2.0nmol/kg)之外的所有组，^p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值表示每组8只动物的数据的平均值±SEM
实施例11：体内研究：DIO小鼠中重复给药
在9天内重复给药期间监测DIO小鼠中GLP1R/GCGR双重激动剂化合物2和GLP1R激动剂杜拉鲁肽的作用。为了控制给药频率，将所有动物每天给药。基于DIO小鼠PK数据确定化合物2和杜拉鲁肽的给药频率。杜拉鲁肽组中的动物每天接受这种药物。溶媒处理的动物每天接受溶媒。在1.0、2.0或4.0nmol/kg下给予化合物2的那些动物每三天给药化合物并且在它们不注射化合物的那几天接受溶媒。在开始给药前一天，将动物称重并按体重分组。通过皮下注射在1-3PM之间如所指示向所有小鼠给药。在这些处理组中，每天在1-3PM之间监测食物摄取和体重。
在第一次给药之后24小时开始，将三组小鼠与1.0、2.0或4.0nmol/kg化合物2处理的动物配对喂养(PF)。调整配对喂养小鼠的料斗中食物的量以匹配与之匹配的化合物处理组中的小鼠在过去24小时内消耗的平均食物。所有PF组每天给药溶媒。在第9天(或配对喂养组的第10天)，将动物空腹6小时并测量体重和空腹葡萄糖。收集血液以用于测量胰岛素、FGF21和血浆脂质。食物摄取、体重、身体成分、空腹葡萄糖、空腹胰岛素、空腹FGF21和空腹血浆脂质数据示出于表20-26中。
表20：处理之后9天内DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对每天食物摄取(克)的影响
相对于溶媒，*p<0.05；相对于杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)，^p<0.05；相对于化合物2(4.0nmol/kg)，#p<0.05
双向ANOVA RM、Tukey的多重比较检验
所有PF组接受相应处理组的平均食物摄取量(数据未示出)。
值表示每组6-10只动物的每个时间点数据的平均值±SEM
表21：处理9天内DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对体重变化百分比的影响
T：处理；V：溶媒；1：杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)；2-3：化合物2(1.0nmol/kg)；4-5：化合物2(2.0nmol/kg)；6-7：化合物2(4.0nmol/kg)
相对于所有其他处理，*p<0.01；相对于杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)，^p<0.05；相对于相应的PF组，#p<0.05；相对于JNJ-64151789(1.0和2.0nmol/kg)，$p<0.05；相对于JNJ-64151789(2.0nmol/kg)，&p<0.05
双向ANOVA RM、Tukey的多重比较检验
在第0天(给药前)相对于体重计算重量变化％
值表示每组10只动物的每个时间点数据的平均值±SEM
表22：重复给药之后DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对身体组成(质量和体重百分 比)的影响
相对于溶媒，*p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值表示每组5只动物的数据的平均值±SEM
表23：重复给药之后DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对6小时空腹葡萄糖(mg/dL)的 影响
处理 血糖(mg/dL)
溶媒 170±5
杜拉鲁肽(0.3nmol/kg) 123±5*
化合物2(1.0nmol/kg) 164±5^
化合物2(1.0nmol/kg)PF 168±7^
化合物2(2.0nmol/kg) 140±7*
化合物2(2.0nmol/kg)PF 155±6^
化合物2(4.0nmol/kg) 98±4*#
化合物2(4.0nmol/kg)PF 133±6*
相对于溶媒，*p<0.05；相对于杜拉鲁肽(0.3nmol/kg)，^p<0.05；相对于JNJ-64151789(4.0nmol/kg)PF，#p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值表示每组10只动物的数据的平均值±SEM
表24：重复给药之后DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对6小时空腹血浆胰岛素(ng/ mL)的影响
处理 血浆胰岛素(ng/mL)
溶媒 3.0±0.4
杜拉鲁肽(0.3nmol/kg) 1.4±0.2*
化合物2(1.0nmol/kg) 2.0±0.3
化合物2(1.0nmol/kg)PF 2.0±0.1*
化合物2(2.0nmol/kg) 1.1±0.1*^
化合物2(2.0nmol/kg)PF 2.3±0.3
化合物2(4.0nmol/kg) 0.5±0.1*
化合物2(4.0nmol/kg)PF 1.2±0.1*
相对于溶媒，*p<0.05；相对于化合物2(2.0nmol/kg)PF，^p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值表示每组10只动物的数据的平均值±SEM
表25：重复给药之后DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对6小时空腹血浆FGF21(ng/ mL)的影响
相对于所有组，*p<0.05；相对于化合物2(4.0nmol/kg)PF，^p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值表示每组10只动物的数据的平均值±SEM，除了化合物2(1.0nmol/kg)和化合物2(4.0nmol/kg)PFPF，其中N＝9
表26：重复给药之后DIO小鼠中化合物2和杜拉鲁肽对血浆脂质的影响
相对于化合物2(4.0nmol/kg)PF，*p<0.05；相对于所有其它组，^p<0.05；相对于化合物2(1.0nmol/kg)和化合物2(2.0nmol/kg)PF，#p<0.05；相对于除杜拉鲁肽(0.3nmol//kg)之外的所有组，$p<0.05
单向ANOVA、Tukey的多重比较检验
值代表每组10只动物的游离脂肪酸、每组8-10只动物的游离甘油、每组9-10只动物的三甘油酯和总胆固醇的数据的平均值±SEM
实施例12：体内研究：食蟹猴中的单剂量功效
在处理前三周期间，每天监测生物学初始食蟹猴的食物摄取。在处理开始时，将动物分成四组以实现相似的平均体重(n＝8-9，每组平均体重为7.4-7.9kg)。每组动物接受对应于1、3、5或7.5nmol/kg化合物2的单次皮下剂量。再每天监测食物消耗14天。在给药当天和给药之后4、7、10、14和21天测量体重。通过将当天的食物摄取与给药前7天期间的平均每天食物摄取相比较，确定每天食物摄取的变化百分比。结果提供在图14和图15中。
实施例13：药代动力学(PK)、药代动力学(PK)/药效动力学(PD)分析DIO小鼠PK
评估DIO小鼠中化合物2的时程(表27)。动物(每个时间点n＝3)以10nmol/kg皮下给药。
表27：通过生物测定和免疫测定法测量的化合物2的血浆暴露(nM)的时程
值表示每组3只动物的每个时间点数据的平均值±SEM
大鼠PK
评估Sprague-Dawley大鼠中化合物2的药代动力学参数。为了确定药代动力学参数(表28)，使用在给药之后0、24、48、72、144、216、312、408和504小时收集的样品的生物测定确定的暴露。
表28：Sprague-Dawley大鼠中化合物2的药代动力学参数
数据为平均值+/-标准偏差，暴露生物测定
食蟹猴PK
评估食蟹猴中化合物2的药代动力学参数。动物以6.45nmol/kg i.v.或s.c.给药。为了确定药代动力学参数(表29)，使用在给药之后0、1、6、24、48、72、120、240、336、432和528小时收集的样品的生物测定确定的暴露。
表29：食蟹猴中化合物2的药代动力学参数
参数 皮下 静脉注射
C<sub>max</sub>(nM) 89.1±8.7 N/A
T<sub>max</sub>(小时) 56.0±13.9 N/A
AUC<sub>0-∞</sub>(nM*小时) 11,700±1380 14,700±5260
t<sub>1/2</sub>(小时) 51.9±6.2 55.9±41.7
值表示平均值±标准偏差
本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。
本文引用的所有文献均以引用方式并入本文。

Claims (20)

1.一种分离单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO: 16、17、18、19、20和21的多肽序列的重链互补决定区1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1 (LCDR1)、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的分离单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述分离单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:12的多肽序列的重链可变结构域(VH)和具有SEQ ID NO:14的多肽序列的轻链可变结构域(VL)。
3.根据权利要求1或2所述的分离单克隆抗体，所述分离单克隆抗体还包含Fc部分。
4.根据权利要求3所述的分离单克隆抗体，所述分离单克隆抗体包含具有SEQ ID NO:13的多肽序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:15的多肽序列的轻链(LC)。
5.一种分离核酸，所述分离核酸编码权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
6.一种载体，所述载体包含权利要求5所述的分离核酸。
7.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6所述的载体。
8.一种产生分离单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在产生所述单克隆抗体或其抗原结合片段的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，以及从所述细胞或培养物回收所述抗体或其抗原结合片段。
9.一种缀合物，所述缀合物包含权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和至少一种与之缀合的药物活性部分。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中所述药物活性部分是治疗性肽。
11.根据权利要求10所述的缀合物，其中所述治疗性肽在SEQ ID NO:18的半胱氨酸残基处缀合至所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求10或11所述的缀合物，其中所述治疗性肽通过接头缀合至所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的缀合物，其中所述接头包括肽接头、烃接头、聚乙二醇(PEG)接头、聚丙二醇(PPG)接头、多糖接头、聚酯接头或由PEG和嵌入杂环组成的杂交接头。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的缀合物，其中所述治疗性肽选自由以下项组成的组：胃泌酸调节素、胰高血糖素样肽1 (GLP1)、毒蜥外泌肽（艾塞那肽）、胰淀素（普兰林肽）、α-黑色素细胞刺激素(MSH)、***和安非他明调节转录物(CART)、神经肽Y受体Y1(NPY1)拮抗剂、神经肽Y受体Y5 (NPY5)拮抗剂、神经降压素S、神经肽B、神经肽W、生长素释放肽、蛙皮素样受体3 (BRS3)、甘丙肽、胆囊收缩素(CCK)、食欲素、黑色素聚集素(MCH)、催产素和顶压素。
15.根据权利要求14所述的缀合物，其中所述治疗性肽是包含SEQ ID NO:24的多肽序列的胃泌酸调节素。
16.一种产生权利要求10-15中任一项所述的缀合物的方法，所述方法包括将引入至所述治疗性肽的侧链上的亲电体、优选地溴代乙酰胺或马来酰亚胺与所述单克隆抗体或其抗原结合片段的SEQ ID NO:18的半胱氨酸残基的巯基基团反应，从而在所述治疗性肽和所述单克隆抗体或其抗原结合片段之间形成共价键。
17.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求9-15中任一项所述的缀合物和药学上可接受的载体。
18.一种产生包含权利要求9-15中任一项所述的缀合物的药物组合物的方法，所述方法包括将所述单克隆抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体组合以获得所述药物组合物。
19.一种增加治疗性肽在受试者内的半衰期的方法，所述方法包括将所述治疗性肽与单克隆抗体或其抗原结合片段缀合，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含分别具有SEQID NO: 16、17、18、19、20和21的多肽序列的重链互补决定区1 (HCDR1)、HCDR2、HCDR3以及轻链互补决定区1 (LCDR1)、LCDR2和LCDR3，其中将所述治疗性肽在SEQ ID NO:18的Cys残基处缀合至所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述治疗性肽选自由以下项组成的组：胃泌酸调节素、胰高血糖素样肽1 (GLP1)、毒蜥外泌肽（艾塞那肽）、胰淀素（普兰林肽）、α-黑色素细胞刺激素(MSH)、***和安非他明调节转录物(CART)、神经肽Y受体Y1 (NPY1)拮抗剂、神经肽Y受体Y5 (NPY5)拮抗剂、神经降压素S、神经肽B、神经肽W、生长素释放肽、蛙皮素样受体3 (BRS3)、甘丙肽、胆囊收缩素(CCK)、食欲素、黑色素聚集素(MCH)、催产素和顶压素。
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