CN112029696B - 一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌及其应用 - Google Patents

一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌及其应用；所述大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌H4‑S18株，其基因序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，所述杀鱼爱德华氏菌H4‑S18株并以保藏号为CCTCC NO:M 2020450被保藏。本发明还涉及所述的大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌在制备疫苗中的应用。本发明所提供的杀鱼爱德华氏菌是从发病的大菱鲆中筛选获得的，是国内首次筛选携带耐药基因的大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌，并且首次应用携带耐药基因的大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌制备疫苗，从而有效提高大菱鲆对耐药杀鱼爱德华氏菌的免疫保护率。

Description

一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌及其应用
技术领域
本发明属于病原微生物筛选领域；尤其涉及一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌及其应用。
背景技术
大菱鲆营养丰富、经济价值高，是冷水性底栖海水鱼类，原产于欧洲，1992年引入我国，成为我国北方地区重要的经济养殖鱼类。但随着规模化不断发展，养殖集约化程度的提高，养殖期间大菱鲆病害频频发生，造成的经济损失巨大，在已报道的大菱鲆疾病中，细菌性疾病发生的频次最高、损失也较严重。大菱鲆对爱德华氏菌的感染率和致死率均较高，爱德华氏菌是危害大菱鲆健康养殖的主要病害。爱德华属的杀鱼爱德华氏菌是大菱鲆的致病菌，2013年从迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）中分离出来重新归类为爱德华氏菌的新种，据报道该菌能引发大菱鲆患腹水病、红体病、白便病等疾病。
大菱鲆爱德华氏菌疾病的频发，随着时间推移和环境变化，以及长期使用抗菌药物，耐药菌株逐渐出现，加强对耐药菌株的研究显得尤为重要。
疫苗的使用可提高鱼类特异性免疫水平，使鱼体产生抵抗特定病原微生物感染的免疫力，且注射后无污染、无残留，是鱼类病害防控的主流研究方向。针对耐药的菌株制备灭活疫苗，能有效提高鱼类对耐药菌株的免疫水平的同时，能有效减少药物投放，解决药物防治形成耐药菌株、造成药物残留等恶性循环问题。因此针对大菱鲆的耐药菌株开展疫苗研发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供了一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌及其应用。本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌，所述大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌H4-S18株，其基因序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，本发明所提供的杀鱼爱德华氏菌H4-S18（Edwardsiella piscicida H4-S18）于2020年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:M2020450。
本发明还涉及所述大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌在制备疫苗中的应用，所述疫苗为灭活疫苗。
本发明具有以下优点：
（1）本发明所提供的杀鱼爱德华氏菌是从发病的大菱鲆中筛选获得的，是国内首次筛选携带耐药基因的大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌，并且首次应用携带耐药基因的大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌制备疫苗，从而有效提高大菱鲆对耐药杀鱼爱德华氏菌的免疫保护率。
（2）本发明所提供的杀鱼爱德华氏菌可用于制备灭活疫苗。
附图说明
图1为杀鱼爱德华氏菌H4-S18菌株的耐药基因PCR检测结果效果图；
图2为杀鱼爱德华氏菌H4-S18菌株的毒力基因PCR检测结果效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1
本实施例涉及杀鱼爱德华氏菌的分离及其鉴定，所述大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌H4-S18株，其基因序列如SEQ ID No.1所示。
具体步骤如下：
患病大菱鲆样品采集自山东烟台大菱鲆养殖场，个体质量205g至518 g之间，平均体重436±5 g，平均体长29±2cm。患病大菱鲆表现为摄食能力减弱，行动迟缓，鱼体腹部膨胀，***红肿，吻部、鳍条及基部充血发红等特征。剖检可见腹腔内有淡黄色腹水，肠肿大、肠壁薄内有淡黄色液体，肝充血。
取典型症状的濒死个体，无菌解剖内脏，取肝、肾、脾、心等组织，无菌水冲洗、研磨后于BHI琼脂平板划线，30℃倒置培养24-48 h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养物。
将分离获得的纯培养物在BHI平板上扩大培养，用0.9%的无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液，采用比浊法将菌株浓度定为7.8×109CFU/mL，腹腔注射。
选取与患病大菱鲆规格相近的健康大菱鲆作为实验用鱼，人工感染。实验用鱼暂养一周后，随机分为4组，其中3组注射0.1mL菌悬液，1组注射无菌生理盐水作为对照。养殖水温18±1℃，全天充气，日换水30%，每天观察记录死亡数量及发病症状。取发病个体再次分离病原菌。
通过对分离的菌株进行耐药基因检测，其效果见图1所示：筛选到了携带了TEM、tet(A)、mcr-1、ant(3")-Ⅰ等4种耐药基因的H4-S18菌株。
对H4-S18菌株进行毒性分析。其效果见图2所示分离到可引起90%实验大菱鲆死亡的菌株，且死亡个体出现与患病大菱鲆一致的临床症状。证实分离的菌株是引起大菱鲆红体、腹水的病原，且在感染患病个体中可再次分离到该种菌。经过16S rRNA检测及管家基因rpoB（其基因序列见SEQ ID No.2所示）和gyrB（其基因序列见SEQ ID No.3所示）检测，BLAST比对分析，以及特异性引物PCR检测，鉴定该分离菌种为杀鱼爱德华氏菌。
检测到该菌携带fimA、fimB、fimC、fimD、sodB、citC、esrB、godB、mukF、katB等10种毒力基因。与已报道的杀鱼爱德华氏菌有明显区别。
实施例2
本实施例涉及使用杀鱼爱德华氏菌制备灭活疫苗，所述大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌H4-S18株，其基因序列如SEQ ID No.1所示。
具体步骤如下：
将杀鱼爱德华氏菌H4-S18菌株接种到营养琼脂培养基（NA）平板上，37℃培养24~48h进行复苏；挑取上述病原菌到NB培养基中，37℃震荡培养24h，收集培养液在4℃条件下5000rpm离心10min，将离心后的沉积菌体用pH=7.2的PBS缓冲液冲洗3遍后，用无菌生理盐水（含2% NaCl）制成浓度为109cfu/mL的菌悬液原液；加入37%的***溶液至甲醛终浓度为0.2%，在37℃、140r/min条件下进行灭活，分别取灭活12h和24h的菌液进行灭活情况检测，观察灭活情况。将灭活的菌液在4℃条件下5000rpm离心10min，将离心后的沉积菌体用pH=7.2的PBS缓冲液冲洗3遍后，用无菌生理盐水（含2% NaCl）制成浓度为109cfu/mL的灭活菌悬液；将杀鱼爱德华氏菌H4-S18灭活菌悬液、天蚕素抗菌肽（华北制药福分有限公司）、弗氏不完全佐剂（SIGMA公司）按照2:1:3的比例混合均匀，制成灭活疫苗；
实施例3
本实施例涉及疫苗的效果检测，所述大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌H4-S18株。
其基因序列如SEQ ID No.1所示。
按照步骤2制备疫苗的步骤，将杀鱼爱德华氏菌（ET883）作为抗原制备成疫苗。
将2种灭活疫苗浓度调整至OD600为0.1±0.01，腹腔注射免疫大菱鲆，每尾注射0.1mL，对照组注射同等剂量的无菌生理盐水。每组免疫20尾，设置3个重复、1个对照。养殖水温18±1℃，全天充气，日换水30%；免疫30天后用杀鱼爱德华氏菌对其进行攻毒，每尾注射浓度为8.9×1010 CFU/mL的菌液0.1mL；每天观察并记录各实验组死亡数量，计算2种灭活疫苗对杀鱼爱德华氏菌的免疫保护率。
结果表明，注射生理盐水组的鱼体在攻毒后第6天开始出现死亡，并在8-10天出现死亡高峰，攻毒后第12天死亡率达93.5%；攻毒受感的鱼体出现吻部及鳍条充血发红、腹部膨大等典型症状，并能从受感死亡个体再次分离到该菌。而2种疫苗免疫组的死亡率显著低于对照组，在实施例2中使用H4-S18菌株制备的灭活疫苗的免疫组在攻毒H4-S18菌株的死亡率明显低于ET883菌株制备的疫苗见表1，表1为2种菌株制备的疫苗的免疫保护测试结果表。
表1
Figure 288342DEST_PATH_IMAGE002
注：表示存活数/攻毒总数
由上述结果表明本发明所筛选获得菌株较已报道的杀鱼爱德华氏菌发生了变异，基于该菌株制备的灭活疫苗具有较高的免疫保护率，可为大菱鲆杀鱼爱德华氏菌引起的疾病提供一定程度的免疫保护。
本发明所提供的杀鱼爱德华氏菌是从发病的大菱鲆中筛选获得的，是国内首次筛选携带耐药基因的大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌，并且首次应用携带耐药基因的大菱鲆源杀鱼爱德华氏菌制备疫苗，从而有效提高大菱鲆对耐药杀鱼爱德华氏菌的免疫保护率。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
序列表
<110> 烟台市海洋经济研究院（烟台市海洋科学技术研究所、烟台市渔业技术推广站、烟台市水生动物疫病防控中心）
<120> 一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌及其应用
<141> 2020-08-31
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1163
<212> DNA
<213> 杀鱼爱德华氏菌(H4-S18Edwardsiella piscicida H4-S18)
<400> 1
cgcaggccgg gcaggcaacc agcaagcgag cggagcaggg agaaagcgcc ccgcgacgag 60
cggcggacgg ggagaagcgg ggacgccgag gagggggaaa cacggaaacg gagcaaaccg 120
caaacgcgca agaccaaagg ggggacccgg gcccagccac agagaaccca gagggaagca 180
gaggggggaa ggccaccagg cgacgaccca gcggcgagag gagaccagcc acacggaacg 240
agacacggcc agacccacgg gaggcagcag ggggaaagca caagggcgca agccgagcag 300
ccagccgcgg agaagaaggc ccggggaaag accagaggga ggaaggggaa cgaaagcgcc 360
acaagacgac cacagaagaa gcaccggcaa cccggccagc agccgcggaa acggaggggc 420
aagcgaacgg aaacgggcga aagcgcacgc aggcgggaag ggaggaaacc ccgggcaacc 480
gggaacgcac caagacggca agcagagccg agagggagga gaaccaggga gcgggaaagc 540
gagagacgga ggaaaccggg gcgaaggcgg ccccggacga agacgacgcc agggcgaaag 600
cgggggagca aacaggaaga acccggagcc acgcgaaacg agcgaggagg ggcccgaggc 660
gggcccgaag caacgcgaaa cgaccgccgg ggagacggcc gcaaggaaaa ccaaagaaga 720
cgggggcccg cacaagcggg gagcagggaa cgagcaacgc gaagaaccac caccgacacc 780
agcgaaccga gagaacggga ggcccgggaa cgcgagacag ggcgcaggcg cgcagccggg 840
gaaaggggaa gcccgcaacg agcgcaaccc accggccagc ggcggccggg aaccaaagga 900
gacgccagga aaacggagga aggggggaga cgcaagcaca ggcccacgag agggcacaca 960
cggcacaagg cgaacaaaga gaagcgaacc gcgagagcaa gcggacccaa aagacgcgag 1020
ccggaggagc gcaaccgacc cagaagcgga acgcagaacg ggacagaagc cacgggaaac 1080
gcccgggccg acacaccgcc cgcacaccag ggagggggca aaagaagagg agcaacccgg 1140
gagggccgca cccaccgagc cgg 1163
<210> 2
<211> 1202
<212> DNA
<213> 杀鱼爱德华氏菌(H4-S18Edwardsiella piscicida H4-S18)
<400> 2
ccgggggtgt tgacgatact cctataaggt ctccggcggc ctgcacggcg tgggggtttc 60
cgtggtgaac gccctgtctg aaaagctgga gctggtgatc cgtcgcgacg gccatgtcca 120
tgagcaaatc taccgacacg gtgtgccggc ggcgccgctg aaagtggttg gcgacaccga 180
gcagaccggt actcgcgtgc gtttctggcc gagcatggag accttcagca atgtggtcga 240
attccagtat gacattctgg ctaagcgcct gcgcgaactc tctttcctga actccggcgt 300
ctccatccgc ctgcgcgata aacgcaacga tcgcgaagat catttccact atgagggtgg 360
gattaaggcg tttgtcgagt atctgaacaa gaacaaaacg ccaatccatc cgaacgtgtt 420
ttacttttcg accatgaagg atgatatcgg cgtagaagtg gcgctgcagt ggaacgatgg 480
cttccaggag aatatctact gctttaccaa taacatcccg cagcgcgacg gcgggaccca 540
tttggccggt ttccgtgcgg cgatgacccg tacgctgaac agctacatgg aaaacgaagg 600
ctataccaag aagagcaaaa tctccgctac cggtgacgac gcgcgtgagg ggctgattgc 660
cgtggtgtcc gtgaaggtgc cggaccccaa gttctcctct cagaccaagg ataagctggt 720
ctcttcggag gtgaaatccg ccgttgagtc gctgatgaac gagcgtctgg ctgaatacct 780
gctggaaaac cccagtgatg ccaaaatcgt cgtcggcaaa atcatcgacg cggcccgcgc 840
acgtgaagcc gcgcgtaagg cccgtgagat gacccgccgc aagggtgcgc tggatctggc 900
cggcctgccg ggcaagctgg cggactgcca ggagcgcgac cccgcccact cagagcttta 960
cttagtggaa ggggactccg cgggcggctc tgccaagcag ggacgtaacc gtaagaatca 1020
ggccatcctg ccgctgaagg ggaaaatcct caacgtcgag aaggcgcgct tcgacaagat 1080
gctctcctcg caggaggtcg cgaccctgat caccgcgctg ggctgcggca ttggccggga 1140
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cc 1202
<210> 3
<211> 950
<212> DNA
<213> 杀鱼爱德华氏菌(H4-S18Edwardsiella piscicida H4-S18)
<400> 3
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cgggcgccct gtgatcggta cggattcgag tgcttactcg tcttccagct cgatgttgat 180
gcccagcgag cggatttctt tcaacagtac gttgaaggat tccggcatgc ctggttccat 240
ctgatggctg ccatccacga tgttcttata catcttggta cggccgttca cgtcatcaga 300
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ttccatctcc ccgaagcgct gaccaccgaa ctgcgcctta ccacccagcg gctgctgggt 420
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cttcagcatg tacatgtaac ccacggttac ctgacgctcg aaacgctcac cggtacgacc 540
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ttcgcgctct ttagcaccgt cgaacaccgg cgttgcaacc ggcagacctt tcttcaggtt 660
ttcggccaga cgcaggactt cttcgtcggt gaaggtgttc agatccacct gctgacgggt 720
gtgatcaccc agatcgtagg ctttctggat aaactcacgc agcttggcca cttcctgctg 780
ctgcttaagc atggcgttga tcttatcgcc gatacctttc gccgccatac ccagatgggt 840
ttccaggatc tgaccaatgt tcatacgcga cggtacgccc agcgggttca gtacgatgtc 900
gaccggagtc ccgttctcat cgtaaggcat atctcgatcg ggtgatctaa 950

Claims (3)

1.一种大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌，其特征在于，所述大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌为杀鱼爱德华氏菌H4-S18株，分类命名为杀鱼爱德华氏菌H4-S18（Edwardsiella piscicida H4-S18），于2020年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:M 2020450。
2.如权利要求1所述的大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌在制备针对大菱鲆杀鱼爱德华氏菌疫苗中的应用。
3.如权利要求2所述的大菱鲆来源的杀鱼爱德华氏菌在制备针对大菱鲆杀鱼爱德华氏菌疫苗中的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。
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