具体实施方式
实施例1本发明丹参面膜的制备
取丹参总酚酸(9.8g),PVA(44.8g),CMC-Na(15.6g),甘油(58.7g);
无水乙醇(97.8g),Vc(0.5g),氮酮(9.8g),山梨酸钠(2.0g)
蒸馏水(761.0g)。
制成1000g丹参护肤面膜。
制备方法:
称取处方量的聚乙烯醇加入10倍量蒸馏水,另称取处方量的羧甲基纤维素钠加入20倍量蒸馏水,溶胀半小时后,分别于95℃水浴加热和静置使其溶解。将溶解后的聚乙烯醇溶液和羧甲基纤维素钠溶液混合,依次加入维生素C、丹参总酚酸和山梨酸钠,搅拌。最后加入甘油、乙醇、氮酮,搅拌,静置,即得。
实施例2本发明面膜原料丹参总酚酸的制备
仪器:Shimadu LC-20AT型高效液相色谱仪(配有SPD-M20AT检测器,LCSolution工作站,日本岛津公司);紫外可见分光广度仪(日本岛津);R-201型旋转蒸发仪(上海申顺生物技术有限公司);BP211D电子天平(德国Sartorius公司);DL-360超声波清洗器;W201恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司),ALPHR1-4LSC冷冻干燥仪(CHRIST)。
材料:丹参(产于四川中江,购于国际商贸城中药材专业市场);丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检验所,批号:111562-200807);NaNO2(AR);Al(NO3)3(AR);NaOH(AR),HPD100树脂(沧州宝恩公司),DA201树脂,HPD722树脂,D101树脂,乙醇(AR)。
根据预试验,将药材打粉,过一号筛提取效果最好,故本实验将药材打粉,过一号筛,备用。
1、提取方法的优选
1.1提取方法的设计
从中药丹参中提取丹参总酚酸常用的提取方法有超声法、回流法、温浸法等,本试验以水为溶剂,以丹酚酸B含量、干膏收率和总酚酸含量为评价指标,分别采用超声、回流和温浸法提取丹参总酚酸提取物,考察比较三种提取方法。
超声提取法:称取丹参粉末100g,加8倍量水,称定重量,超声提取30min,过滤,提取两次,合并滤液,备用。
回流提取法:称取丹参粉末100g,加8倍量水,称定重量,回流提取1.5h,放冷,再称定重量,用蒸馏水补足减失的重量,过滤,提取两次,合并滤液,备用。
温浸提取法:称取丹参粉末100g,加8倍量水,称定重量,温浸提取1.5h(80℃),过滤,提取两次,合并滤液,备用。
1.2评价指标的测定方法
(1)丹酚酸B含量的测定方法
参照《中国药典》2010年版一部丹参项下相关规定和一部附录VID高效液相色谱法测定。
①色谱条件的选择
色谱柱:Diamonsil TM(钻石)C18柱(200×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59);柱温:30℃;流速:1ml/min;检测波长286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000。
②对照品溶液的制备
取丹酚酸B对照品适量,精密称定,加75%甲醇制成每ml含0.147mg的溶液,即得。
③供试品溶液的制备
精密吸取不同提取方法下制备得到的丹参提取液的续滤液1ml,加蒸馏水定容至25ml的容量瓶中,用0.45μm微孔滤膜滤过,即得。
④标准曲线的制备
精密吸取对照品溶液(0.147mg/ml)10μl、12μl、14μl、16μl、18μl、20μl,注入液相色谱仪,记录峰面积,以进样量(X,μg)对峰面积值(Y)回归,得到线性方程Y=106*X-225177,R2=0.9999,进样量在1.47μg~2.94μg内线性关系良好。
(2)丹参总酚酸的测定方法
①对照品溶液的制备
取丹酚酸B对照品适量,精密称定,加蒸馏水制成每ml含0.167mg的溶液,分别吸取0ml,0.31ml,0.63ml,1.25ml,2.5ml,4ml上述溶液,加入蒸馏水定容至5ml。分别吸取各浓度的对照品溶液2ml置于试管中,加入显色剂(5ml 0.5%NaNO2,0.5ml 10%Al(NO3)3,5ml 1mol/L NaOH溶液),备用。
②供试品溶液的制备
采用不同提取方法提取100g丹参粉末,精密吸取续滤液4ml,加蒸馏水定容至250ml的容量瓶中,移取2ml上述溶液至试管中,按对照品制备方法加入适量显色剂,即得。
③测定波长的选择
取丹酚酸B对照品溶液置于锥形瓶中,加入显色剂(5ml 0.5%NaNO2溶液,0.5ml 10%Al(NO3)3溶液,5ml 1mol/L NaOH溶液),摇匀,采用全波长扫描,得到其最大吸收波长为499nm。
④标准曲线的制备
分别取2.4.1.2①项下不同浓度的对照品溶液,测定其吸光度,得到丹参总酚酸标准曲线Y=4.4432X-0.0226,R2=0.9981,丹参总酚酸浓度在0.0104mg/ml~0.1336mg/ml间线性关系良好。
(3)干膏收率的测定方法
精密量取各提取液25ml,置于干燥至恒重的蒸发皿中,水浴挥干,置烘箱中105℃烘干至恒重,移置干燥器中,冷却,称重,按照公式:干膏收率(%)=干膏重量(g)/药材取用量(g)×100%,计算干膏收率。
2提取方法考察结果
以丹酚酸B、丹参总酚酸和干膏收率为评价指标,采用加权评分法筛选最佳提取方法。评价指标中总酚酸和丹酚酸B含量较干膏收率重要,制定丹酚酸B、丹参总酚酸、干膏收率的权重系数分别为0.4、0.4、0.2,综合评分=40×(总酚酸含量/三种提取方法中总酚酸含量最大者+40×(丹酚酸B含量/三种方法中丹酚酸B含量最大者)+20×(干膏收率/三种方法中干膏收率最大者),结果见表1。
表1不同提取方法考察结果表
结论:温浸提取法提取率最高,且节约能源,故采用温浸法。
3温浸提取工艺的优化
根据上述提取方法考察结果,本论文采取温浸法提取丹参水溶性成分。根据预试验和文献研究,提取两次即可达到良好的提取效果,为丹参总酚酸提取工最佳提工艺取条件:溶媒用量11倍(水),温度65℃,提取两次,每次130min。
4丹参总酚酸纯化工艺
根据文献资料研究,丹参总酚酸提取物的制备多采用大孔树脂纯化技术。大孔树脂有吸附量大、解吸和再生容易等优点,具有富集中药有效成分的作用,广泛地应用于中药的分离纯化中,在本论文研究中对其纯化条件进行了***的研究。
本试验首先对树脂类型进行了考察,从径高比、上样药液浓度、洗脱剂的选择、洗脱溶媒用量的确定、吸附流速的考察、动态泄漏曲线等方面筛选优化纯化工艺条件。
4.1上样液的制备
称取丹参药材50g,加入11倍水,于65℃水浴温浸提取,提取2次,每次130min,第一次加水时补足吸水率320%,合并滤液,浓缩至0.2g/ml(以含生药量计),静置过夜,滤过,滤液作为上样液。
4.2树脂种类及型号的选择
目前国内外使用的大孔吸附树脂种类众多,不同型号的树脂由于其极性和官能团的差异,对各类成分的吸附性能也会有明显的差异。因此针对具体的分离纯化目的,首先需要选择适宜的大孔吸附树脂,以保证大孔吸附树脂对待分离组分的高选择性和高吸附性,从而满足分离纯化的要求,提高分离纯化的效率。
本实验以丹酚酸B的吸附量与解析率为评价指标,考察了四种不同极性的大孔树脂树脂在纯化丹参总酚酸成分方面的效果,以确定纯化富集丹参总酚酸的大孔吸附树脂类型,各型号大孔吸附树脂性能见表2。
表2各型号大孔吸附树脂性能
4.2.1树脂静态吸附量的考察
称取经预处理后的4种树脂1g(以干树脂计)至150ml具塞锥形瓶中,分别加入上样液75ml,静置24h(前7小时每半小时振摇一次),滤过,测定滤液中丹参总酚酸的含量,计算各干树脂的静态吸附容量和吸附率,各型号大孔树脂的吸附容量见表3。
表3各型号大孔树脂的吸附容量
4.2.2树脂解吸率的考察
将上述吸附饱和的大孔吸附树脂,用水洗至水洗液无色,去除树脂表面残留的溶液,各树脂分别依次用20%、30%、50%、70%、90%乙醇浸泡洗脱2次,每次10mL、每次浸泡2h,每1h振摇1次,收集各不同乙醇浓度的洗脱液,合并,测定洗脱液中丹酚酸B的浓度,根据吸附量计算解吸率(%)。解吸率=C·V/Q,式中C为滤液中丹酚酸B的浓度(mg/g),V为滤液的体积(ml),Q为树脂的吸附量(mg/g),见表4。
表4各型号树脂解析率
4.2.3树脂优选及结果
以丹酚酸B的静态吸附量与解析率为评价指标,采用综合加权评分法进行考察,因静态吸附量与解析率在树脂考察中均为重要,故按公式:综合评分=树脂吸附率/4种树脂中最大吸附率*50+解吸率/4种树脂中最大解吸率*50计算,结果见表5。
表5树脂筛选结果
结论:树脂HPD722解吸率明显优于其他树脂,静态吸附率较高,综合评分最高,故选HPD722树脂。
3大孔树脂吸附条件的筛选
3.1径高比的考察
上样柱直径2cm,分别考察装柱8cm,10cm,13cm 3种不同高度HPD722树脂的比吸附量。比吸附量=(上样液中总酚酸量-剩余液中总酚酸量)/树脂干重。结果如表6。
表6径高比对树脂吸附量的影响
结论:径高比为2/13时,比吸附量最大,故采用径高比2/13。
3.2上样浓度的考察
称取丹参粉末(过一号筛)200g,加入11倍量水,于65℃水浴提取2次,每次130min,第一次加水时补足吸水率320%,合并滤液,浓缩至0.2g/ml(以含生药量计),静置,滤过,加水稀释成浓度分别为0.25g/ml、0.20g/ml、0.15g/ml(以含生药量计)3份溶液,通过径高比为2/13的HPD722的树脂,考察其吸附量,结果如表7。
表7上样浓度对树脂吸附量的影响
结论:上样浓度为0.2g/ml(以含生药量计)时,吸附量最大。
3.3吸附流速的考察
将0.2g/ml(以含生药量计)的丹参上柱液分别以2ml/min,3ml/min,4ml/min的流速通过树脂柱,测定流出液中丹酚酸B的浓度,计算未吸附丹酚酸B含量占上样液中丹酚酸B含量比例,考察最佳流速。结果见表8。
表8吸附流速的考察
结论:当流速为2ml/min时,未吸附丹酚酸B含量最少,未吸附丹酚酸B含量占上样液中丹酚酸B含量比例最少,故选用流速2ml/min。
3.4最大上样量的考察
将浓度为0.2g/ml(以含生药量计)的丹参提取液以2ml/min流速通过树脂柱,每10ml收集一次流出液,测定其中丹酚酸B浓度,计算其泄露百分数。
丹参总酚酸泄漏率(%)=(流出液中丹酚酸B浓度/上柱液中丹酚酸B浓度)×100%,结果见表9。
表9最大上样量考察结果
从泄露曲线可以看出:第16份残留液丹酚酸B含量明显增大,说明上样至第16份时丹酚酸B开始泄露,故确定丹参提取液的最大上样量为150ml。
3.5洗脱剂的选择
量取7份丹酚酸B浓度为0.2g/ml(以含生药量计)的药液,分别通过7根树脂柱进行动态吸附,先用蒸馏水洗,除去水溶性杂质(多为糖类),洗至Molish反应(糖的显色反应--α萘酚浓硫酸反应)为阴性,再分别用10%乙醇,20%乙醇,30%乙醇,40%乙醇,50%乙醇,70%乙醇,95%乙醇各200ml洗脱,并按以下公式计算洗脱率:洗脱率(%)=洗脱成分质量/(上样液成分质量-过柱流出液成分质量-水洗脱部分成分质量)*100%,结果见表10。
表10洗脱剂的考察
结论:采用20%乙醇洗脱对丹酚酸B有较好的洗脱效果。
3.6洗脱剂用量的考察
量取1份丹酚酸B浓度为0.2g/ml(以含生药量计)的药液60ml,分别通过树脂柱进行动态吸附,先用蒸馏水洗,除去水溶性杂质,洗至molish反应为阴性,再分别用20%乙醇以2ml/min流速洗脱,每20min收集一次流份,测定流份中丹酚酸B含量,计算洗脱率,结果见表11。
表11洗脱剂用量的考察
结论:当加入第八份洗脱剂时,即洗脱液20%乙醇的用量约为上柱液的6倍时,可使洗脱率达90%以上,洗脱效果较好。
3.7验证实验
按照上述实验确定的最佳工艺参数进行试验,重复3批,按以下公式计算纯度和收率:纯度(%)=提取物中丹酚酸B含量(g)/干膏重*100%,结果见表12。
表12验证实验结果
结果表明,丹参经大孔树脂纯化后,有效成分纯度显著提高,说明试验所确定的除杂工艺合理可行。
4冷冻干燥法制备丹参总酚酸
将经提取纯化后的丹参总酚酸提取液置于冷冻干燥机中,冷冻干燥36小时,得到丹参总酚酸固体提取物。
综上所述,本发明丹参总酚酸的最佳提取工艺为:提取温度65℃,提取两次,每次130min,加11倍量水。大孔树脂最佳优化条件为:径高比2/13,上样浓度0.2g/ml(以含生药量计),吸附流速2ml/min,最大上样量150ml,6倍量20%乙醇洗脱。以上吸附和解析的试验条件均在室温下进行。最后对纯化工艺进行验证,结果表明,在最佳工艺条件下,丹参总酚酸的纯度大大提高,杂质含量大大降低。
实施例3本发明丹参面膜中基质筛选试验
1成膜材料的选择
①成膜材料类型的选择
通过文献查询,面膜制备中,聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖、海藻酸钠应用较广泛。其中,聚乙烯醇是一种水溶性高分子化合物,成膜性、柔软性和吸湿性均良好,是最为广泛应用的成膜材料之一,同时根据预试验验证,优选出聚乙烯醇作为成膜材料。
②成膜材料型号的选择
PVA常用的型号有PVA-0588,PVA-1788,PVA-1799,试验中采用不同型号的PVA(包括粉末与颗粒)进行试验,分别将PVA在85%乙醇溶液中醇解2次后,每次24小时,滤过,晾干。称取醇解后晾干的PVA适量,加入适量蒸馏水浸泡半小时后,加热使其溶解。考察其溶解时间,黏稠度,成膜性能,柔韧性,均匀性,手捻舒适度等,结果见表13。
表13不同型号PVA的考察
结论:PVA-1788溶解时间较短,易溶解,黏稠度、成膜性、柔韧性、均匀性、手捻舒适度均较好,故本实验采用PVA-1788作为成膜材料。
③成膜材料浓度的考察
分别称取醇解后干燥的PVA-1788颗粒适量,溶解于100ml蒸馏水中,配成不同浓度的PVA溶液,考察其成膜性,黏稠度,以及加入5%CMC-Na后的粘稠后,见表14。
表14不同浓度PVA的考察
结论:10%PVA成膜性能好,黏稠度适中,故选用其作为成膜浓度。
2增稠剂的选择
根据文献调查研究,与PVA配合使用,效果最佳者为CMC-Na。CMC-Na无毒、无刺激,是医药、化妆品行业常用的辅料。通过预试验证明,CMC-Na作为增稠剂能达到均匀的增稠效果,故本研究采用其作为增稠剂。
精密称定CMC-Na适量,加入100ml水中,静置半小时待其充分溶胀后,置水浴加热,直至完全溶解,配成3%,5%,8%浓度的CMC-Na溶液,其黏稠度和涂抹延展性见表15。
表15CMC-Na浓度的考察
结论:5%浓度的CMC-Na黏稠度和涂抹延展性均较好,故本试验采用5%浓度。
3星点设计-效应面法优化处方主要基质
结合预试验和面膜中主要基质的常用用量,已能筛选得到主要基质的使用用量范围,故本部分试验研究主要仅采用星点设计-效应面法。
3.1星点设计因素与水平
根据文献和预试验研究表明,影响膜剂外观质量和成膜效果的主要因素为PVA1788与CMC-Na的用量比(A)、甘油用量(B)和无水乙醇的加入量(C),因此本试验设计重点考察这3个因素,每个因素根据预试验设计了水平范围,如表16。
表16影响因素与水平
3.2试验方法
按星点试验设计称取附加剂,按丹参护肤面膜制备工艺制备,制得丹参护肤面膜。试验以成膜时间和膜外观评价为指标,成膜时间为取2g基质,均匀地涂布于人体手臂内侧3cm×3cm的皮肤上形成可揭薄膜的时间,膜外观评价包括成膜完整度、均匀性、脱膜性等。试验结果采用以下方法评价:OD(总评分)=4×Di(成膜时间)+6×Di(外观评价),其中成膜时间在大于25min的范围内越小越好,可接受的最大值为45min,由于成膜时间均大于25min,故成膜时间采用归一化法处理:Di=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin);膜外观评价分值越大越好,故采用归一化法处理:Di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)。试验安排表和结果如表17,其中15~20#为重复试验各指标的结果的均值表示。
表17星点试验设计与结果
3.3模型拟合
利用Design expert 7.0软件,将总体评分(OD)分别对CMC-Na的用量比(A)、甘油用量(B)和乙醇的加入量(C)进行多元线性回归和二项式拟合,结果如下。
多元线性回归拟合结果:OD=+1.93245+2.99302×A+0.054436×B
-7.88307×10-3×C(P=0.0096,r=0.7951),虽然能通过t检验,但拟合度较低。
多元非线性拟合结果:OD=+17.83295+2.39902×A-3.57156×B-0.80538×C+0.73800×AB-0.24750×AC+0.19750×BC(P=0.0028,r=0.9362),能通过t检验,但拟合度不够高。
二项式拟合结果:OD=+11.66233+6.88699×A-2.10070×B-0.77761×C+0.73800×AB-0.24750×AC+0.19750×BC-1.92342×A2-0.13371×B2-9.92063×10-4×C2(P=0.0238,r=0.9618),拟合度较高,但是P>0.01,去掉P值较高的C2项,得到拟合方程:
OD=+11.98777+6.80970×A-2.14119×B-0.80538×C+0.73800×AB-0.24750×AC+0.19750×BC-1.89030×A2-0.13003×B2(P=0.0071,r=0.9618),P<0.01,能通过t检验,且拟合度好,预测性好。
3.4效应面绘制
根据拟合方程,绘制指标OD随因素变化的效应面图和等高图。优选出PVA1788:CMC-Na(1.4~2),甘油用量(5%~8%)为佳;优选出PVA1788:CMC-Na(1.4~2),无水乙醇用量(8%~14%)为佳;优选出甘油用量(3%~6%),无水乙醇用量(8%~11%)或甘油用量(6%~8%),无水乙醇用量(17%~20%)为佳。将上述范围重叠,预测各因素的最佳范围为PVA1788:CMC-Na(1.4~2),甘油用量(5.5%~6%),无水乙醇用量(8%~11%),结合实际操作和制剂目的,最终选择PVA1788:CMC-Na=1.5,甘油用量为6%,无水乙醇用量为10%作为处方用量。
按PVA1788:CMC-Na=1.5,甘油用量为6%,无水乙醇用量为10%的组成制备3批样品,进行验证试验,验证结果吻合,预测性好。见表18。
3.5优化处方验证
表18验证试验(n=3)
*为偏差=(预测值-实测值)/预测值×100%
4主药含量的确定
按PVA1788:CMC-Na=1.5,甘油用量为6%,无水乙醇用量为10%的比例配制空白基质5份,分别加入0.5%,1%,2%,3%不同比例的丹参总酚酸固体物(丹参水溶性提取物),观察现象见表19。
表19加药量考察
*离心转速为12000r/min,10min
结论:0.5%,1%加药量均可达到保持面膜稳定性的效果,但0.5%加药量太小,故采用1%加药量。
5其他辅料的考察
在其他辅料的考察中,为了方便计算,本试验设计以处方中的主要基质(包括PVA,CMC-Na,无水乙醇和甘油)的总量为参考,以此量为基础计算加入其他的辅料的量。
5.1皮肤促透剂的考察
药物通过皮肤或粘膜的吸收而发挥疗效,常加入渗透促进剂以促进有效成分的吸收,常用的透皮吸收促进剂有氮酮、油酸、丙二醇等。其中氮酮因其无毒、无刺激性、促透作用强的特性最为常用,本试验加入氮酮后色泽变为乳白色,更加均匀,而且没有气泡,故考虑采用氮酮作为皮肤促透剂。考察加入不同剂量氮酮:0.1%,0.5%,1%,2%,3%。加入2%、3%氮酮的样品出现油滴样物质浮面,较不稳定,氮酮作为促透剂常用剂量为1%~3%,故采用1%氮酮作为皮肤促透剂。
5.2抗氧化剂的考察
丹参总酚酸成分易氧化变质,故需加入抗氧化剂。维生素常作为抗氧化剂,本试验采用水溶性维生素C,能达到良好的抗氧化效果。考察维生素C(Vc)加入量:0.01%,0.05%,0.1%,0.2%。观察现象见表20。
表20Vc加入量考察
结论:加入0.05%Vc后,样品颜色无变化,且未变稀,抗氧化效果较好。
5.3防腐剂的选择
丹参护肤面膜中乙醇含量低于20%,不具有防腐效果,故在丹参护肤面膜中常加入防腐剂以抑制细菌和霉菌生长。苯甲酸钠、尼泊金乙酯、山梨酸钠是最常用的防腐剂,但是本样品含有吐温,吐温易和尼泊金乙酯发生络合影响防腐效果,而山梨酸钠在吐温作用下增强,故采用山梨酸钠作为防腐剂。考察加入0.1%,0.2%,0.3%不同剂量的山梨酸钠后的防腐效果。样品放置1个月后,加入0.1%山梨酸钠的样品出现霉变,而加入0.2%和0.3%剂量的山梨酸钠均出现霉变,故采用0.2%用量。
5.4最终制剂处方
丹参总酚酸(9.8g),PVA(44.8g),CMC-Na(15.6g),甘油(58.7g);
无水乙醇(97.8g),Vc(0.5g),氮酮(9.8g),山梨酸钠(2.0g)
蒸馏水(761.0g)。
制成1000g丹参护肤面膜。
实施例4丹参护肤面膜体外释放度考察
1体外释放度评价方法
本试验采用Franz扩散池法研究药物的体外释药情况,分为两部分:供给室与接收室,有效扩散面积为3.14cm2,接收池容积为14ml。在接收室内加入电磁搅拌子(长0.9cm2,宽0.4cm2)和14ml生理盐水,并及时排出气泡,将25mm醋酸纤维素膜固定在扩散室接收室之间,置于水浴温度35℃~37℃、300rpm的恒温磁力搅拌器上,于40min后取样,用HPLC法测定丹酚酸B浓度,计算单位面积透过量。
色谱柱:Diamonsil TM(钻石)C18柱(200*4.6mm,5μm);流动相:甲醇-乙腈-磷酸-水(30∶10∶1∶59);流速1.0ml/min;检测波长:286nm,柱温30℃;理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000。
2标准曲线的制备
取丹酚酸B对照品适量,精密称定,加75%甲醇制成每1ml含0.146mg的溶液,即得丹酚酸B对照品溶液。按上述色谱条件,分别自动进样3μl,5μl,7μl,9μl,11μl,记录峰面积,以丹酚酸B进样量X(μg)为横坐标,峰面积Y(A)为纵坐标,作图并进行线性回归,得到回归方程为y=370875x-197690,R2=0.9999,结果表明,丹酚酸B的进样量在0.146μg~1.606μg范围内线性关系良好。
3精密度试验
精密吸取10μl丹酚酸B对照品溶液,连续进样6次,记录峰面积,结果见表21。
表21精密度考察结果
结论:RSD<2%,表明进样及色谱检测精密度良好。
4稳定性考察
吸取扩散池接收池中的样品,以0.45μm微孔滤膜滤过后,分别于0h,1h,2h,4h,6h,8h后进样测定,记录丹酚酸B峰面积,结果见表22。
表22稳定性考察表
结论:RSD<3%,表明样品在8h内稳定。
5加样回收率考察
取已知含量的丹参护肤面膜约0.5g(丹酚酸B含量0.189%)6份,精密称定,分别精密加入0.146mg/ml的丹酚酸B对照品6ml,加75%甲醇至25ml,超声30分钟提取,滤过,测其丹酚酸B含量。结果如表23。
表23加样回收测定结果表(n=6)
结论:加样回收率在95%~105%之间,平均回收率98.8%,RSD值为1.35%,符合含量测定的要求。
6体外释放度结果
平行制备三份样品,测定40min后扩散池中的浓度,计算出40min后单位面积丹酚酸B透过量,求得平均值,结果见表24。
表24体外释放度考察结果
7小结
本发明首先采用单因素法筛选出主要的成膜材料种类、成膜材料浓度、增稠剂,筛选出采用10%PVA-1788和5%CMC-Na,成膜效果最好,且膜柔韧度、脱膜性良好;然后采用星点设计-效应面法以膜外观质量和成膜效果为评价指标筛选主要基质辅料PVA1788与CMC-Na的用量比(A)、甘油用量(B)和无水乙醇的加入量(C),优选出最佳参数:PVA1788:CMC-Na=1.5,甘油为6%,乙醇为10%,筛选出处方主要基质后,通过单因素考察筛选出其他附加剂,确定了制剂处方:丹参总酚酸(9.8g),PVA(44.8g),CMC-Na(15.6g),甘油(58.7g),无水乙醇(97.8g),Vc(0.5g),氮酮(9.8g),山梨酸钠(2.0g),蒸馏水(761.0g),最后对该面膜进行体外释放度评价,体外释放度良好。
实施例5本发明面膜的质量控制
丹参护肤面膜由中药丹参水溶性提取物制成,具有具有较强改善微循环障碍、抗脂质过氧化、清除自由基、抗氧化、抗炎、增强免疫力等作用,丹酚酸B是其主要有效成分之一,结合文献研究,选择丹酚酸B作为控制本品质量的指标成分。
1色谱条件
色谱柱:Diamonsil TM(钻石)C18柱(200*4.6mm,5μm);流动相:甲醇-乙腈-磷酸-水(30∶10∶1∶59);流速1.0ml/min;检测波长:286nm,柱温30℃;理论塔板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000。
2对照品溶液的制备
取丹酚酸B对照品适量,精密称定,加75%甲醇制成每1ml含0.146mg的溶液,即得丹酚酸B对照品溶液。
3供试品溶液的制备
取样品1g,精密称定,加入75%甲醇溶液定容至25ml,超声处理30分钟,滤过,以0.45μm微孔滤膜滤过,即得。
4专属性考察
取不含药的样品1g,精密称定,加入75%甲醇溶液定容至25ml,超声处理30分钟,滤过,以0.45μm微孔滤膜滤过,进样。结果表明,阴性无干扰。
5标准曲线的制备
按上述色谱条件,分别自动进样3μl,5μl,7μl,9μl,11μl,记录峰面积,以丹酚酸B进样量X(μg)为横坐标,峰面积Y(A)为纵坐标,作图并进行线性回归,得到回归方程为y=370875x-197690,R2=0.9999,结果表明,丹酚酸B的进样量在0.146μg~1.606μg范围内线性关系良好。
6精密度试验
精密吸取10μl丹酚酸B对照品溶液,连续进样6次,记录峰面积,结果见表25。
表25精密度考察结果
结论:RSD<2%,表明进样及色谱检测精密度良好。
7稳定性考察
将0.45μm微孔滤膜滤过后的样品,分别于0h,1h,2h,4h,6h,8h后进样测定,记录丹酚酸B峰面积,结果见表26。
表26稳定性考察表
8加样回收率考察
取已知含量的丹参护肤面膜约0.5g(丹酚酸B含量0.189%)6份,精密称定,分别精密加入0.146mg/ml的丹酚酸B对照品溶液6ml,加75%甲醇至25ml,超声处理30分钟提取,滤过,测其丹酚酸B含量。结果见表27。
表27加样回收测定结果表(n=6)
结论:加样回收率在95%~105%之间,平均回收率98.8%,RSD值为1.35%,符合含量测定的要求。
9样品测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,依上述色谱条件测定,测定结果见表28。
表28十批样品含量测定结果表
结论:丹酚酸B平均含量为2.18mg/g,综合考虑各种因素,暂定本品丹酚酸B含量不低于平均含量的80%左右,即不低于1.75mg/g。
实施例6本发明面膜的丹参护肤面膜的初步稳定性研究
参照《中国药典》2010年版二部附录XIXC药物稳定性试验指导原则,对三批样品100801,100802,100803进行初步稳定性考察。
1试验仪器、材料
仪器:PH测定仪,Shimadu LC-20AT型高效液相色谱仪(配有SPD-M20AT检测器,LC Solution工作站,日本岛津公司);德国Sartorius公司BP211D电子天平;DL-360超声波清洗器;冰箱,恒温恒湿箱。
材料:3批实验室放大量生产样品;丹酚酸B对照品。
2考察项目及方法
根据丹参护肤面膜剂型为涂膜剂,对温度比较敏感特点,参照《中国药典》2010版二部附录XI XC项下相关要求,对丹参护肤面膜进行了外观性状、分层现象、含量测定、成膜性、微生物等项目的检查,结果见表29,30。
3长期试验考察
参照《中国药典》2010年版二部附录XI XC项下相关要求,对丹参护肤面膜进行长期稳定性试验考察。
取塑料瓶包装的三批丹参护肤面膜样品分别置于温度6℃±2℃,湿度60%±10%下,定期在0、1、2、3月取样测定,结果见表29。
表29三批样品的常温稳定性考察结果
4加速试验考察
取塑料瓶包装的三批丹参护肤面膜样品,分别于25℃±2℃,湿度60%±10%下放置,定期在0、1、2、3月取样测定,结果见表30。
表30三批样品的加速稳定性试验结果
结论:丹参护肤面膜样品在25℃±2℃,湿度60%±10%条件下,放置3个月后,样品在外观、分层现象、含量、成膜性等方面稳定,符合要求。
5小结
通过考察3个月的长期试验和加速试验探讨丹参护肤面膜的初步稳定性,结果表明面膜的外观性状、分层现象、有关物质及含量、成膜性等检查结果与初始相比,无明显变化,微生物限度检查合格。
且发明人通过对家兔进行急性皮肤刺激性试验和眼睛刺激性试验,结果表明对皮肤和眼睛均无刺激性。
综上所述,本发明丹参面膜是剥离型面膜,使用安全、稳定,可广泛用于保健护肤。