CN109868237B

CN109868237B - 一种巨大芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN109868237B
Application number: CN201910117339.2A
Authority: CN
Inventors: 丁中; 叶姗
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2019-02-15
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2039-02-15
Also published as: CN109868237A

Abstract

本发明提供了一株巨大芽孢杆菌菌株(Bacillus megaterium)D45，保藏编号为：CGMCC No.15119，属于植物线虫生物防治技术领域，所述巨大芽孢杆菌D45的发酵产物具有优良的杀线虫活性，能够用于防治拟禾本科根结线虫和旱稻孢囊线虫。经过验证，巨大芽孢杆菌D45的发酵液稀释2倍、5倍后对拟禾本科根结线虫的根结抑制率分别为67.3％和62.6％，防治效果分别为53.1％和56.3％；D45菌株发酵液2倍稀释液对旱稻孢囊线虫的防治效果为60％。

Description

一种巨大芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及植物线虫生物防治技术领域，尤其涉及一种巨大芽孢杆菌及其在防治水稻线虫中的应用。

背景技术

寄生在水稻根部的植物线虫是引起水稻根部病害的一类重要病原线虫，通常可导致水稻减产10％以上。危害我国水稻的线虫主要有拟禾本科根结线虫(Meloidogynegraminicola)，旱稻孢囊线虫(Heteroderaelachista)、水稻干尖线虫(Aphlenchoidesbesseyi)和潜根线虫(Hirschmanniellaspp.)等，其中拟禾本科根结线虫(M.graminicola)被认为是对水稻具有严重威胁的植物寄生线虫。

拟禾本科根结线虫多分布在热带和亚热带地区，在我国广东、广西、海南、云南、福建等地均有发生。近年来，该线虫病害在湖南省益阳、常德、衡阳、岳阳、株洲和长沙等市频繁发生，对水稻生产造成了严重威胁，被危害的水田其损失最高可达87％；因缺乏抗病品种、气候条件和播种方式的改变等原因，导致拟禾本科根结线虫的危害日益严重并已成为中国水稻主产区产量的重要制约因素。

现有技术中多使用有机磷或氨基甲酸酯类等非熏蒸性杀线虫剂，如克百威、灭线磷等毒性高、残留时间长、容易污染环境的杀线虫药剂来防治水稻线虫。随着高毒农药在我国的禁用，亟需开发绿色环保、安全的生防菌来防治水稻根结线虫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌及其应用，该菌株对水稻寄生线虫有显著的防治效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株巨大芽孢杆菌菌株D45，保藏编号为：CGMCCNo.15119。

本发明提供了一种防治水稻线虫的制剂，所述制剂包括上述方案所述巨大芽孢杆菌菌株D45的发酵产物。

本发明还提供了所述制剂的制备方法，步骤为：将巨大芽孢杆菌D45接种至发酵培养基进行发酵，得到制剂。

优选的，所述发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基。

优选的，所述发酵的温度为25～30℃；所述发酵的时间为36～72h。

本发明还提供了上述方案所述的巨大芽孢杆菌菌株D45在防治水稻线虫中的应用。

优选的，所述水稻线虫包括拟禾本科根结线虫和旱稻孢囊线虫。

本发明的有益效果：本发明提供了一株巨大芽孢杆菌菌株(Bacillusmegaterium)D45，保藏编号为：CGMCCNo.15119；所述巨大芽孢杆菌D45的发酵产物具有优良的杀线虫活性，能够用于防治拟禾本科根结线虫和旱稻孢囊线虫。经过验证，巨大芽孢杆菌D45的发酵液稀释2倍、5倍后对拟禾本科根结线虫的根结抑制率分别为67.3％和62.6％，防治效果分别为53.1％和56.3％；D45菌株发酵液2倍稀释液对旱稻孢囊线虫的防治效果为60％。

生物保藏说明

巨大芽孢杆菌菌株(Bacillusmegaterium)D45，于2017年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.15119。

附图说明：

图1表示实施例2中巨大芽孢杆菌D45培养性状；

图2表示实施例2中巨大芽孢杆菌D45的PCR产物电泳图；

图3表示实施例2中巨大芽孢杆菌D45的***发育树状图。

具体实施方式

本发明提供了一株巨大芽孢杆菌菌株(Bacillusmegaterium)D45，保藏编号为：CGMCCNo.15119；所述巨大芽孢杆菌菌株D45从湖南省浏阳大围山森林公园里的土壤土样中分离、鉴定获得，本发明对所述分离的方法没有特殊限定，采用本领域常规菌株分离方法即可；所述鉴定的方法包括形态学鉴定、生理生化测定和分子生物学鉴定；所述巨大芽孢杆菌菌株D45的菌落特征为：菌落形态不规则，边缘褶皱，粗糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色；在光学显微镜下观察，D45菌株菌体呈杆状，端圆，鞭毛周身；革兰氏反应为阳性。

本发明提供了一种防治水稻线虫的制剂，所述制剂包括上述方案所述巨大芽孢杆菌菌株D45的发酵产物；所述制剂优选的还包括巨大芽孢杆菌D45菌体和发酵培养基；所述制剂中巨大芽孢杆菌D45的有效活菌数优选为1×10⁹～1×10¹¹CFU/mL，更优选为1×10¹⁰CFU/mL。

本发明中，所述发酵培养基优选为牛肉膏蛋白胨液体培养基；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基以1L计，优选的包括以下重量份的组分：牛蛋白胨4～6g、葡萄糖18～22g、牛肉膏2～4g和余量的双蒸水，更优选的包括以下重量份的组分：牛蛋白胨5g、葡萄糖20g、牛肉膏3g和余量的双蒸水；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH优选为7～8，更优选为7.5；

本发明中，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基优选的采用以下方法制备获得：将牛蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏和双蒸水混合，灭菌，得到牛肉膏蛋白胨液体培养基；本发明对所述混合的方法没有特殊限制，以混合均匀为准；所述灭菌的方式优选为高温高压灭菌；所述灭菌的温度优选为121℃；所述灭菌的时间根据培养液的体积优选为20～30min。

本发明还提供了上述方案所述制剂的制备方法，步骤为：将巨大芽孢杆菌D45接种至发酵培养基进行发酵，得到制剂。本发明中对所述巨大芽孢杆菌D45的接种量没有特殊限制；所述发酵的温度优选为25～30℃，更优选为26～29℃，最优选为27～28℃；所述发酵的时间优选为36～72h，更优选为48h；所述发酵的方式优选为摇床发酵；所述摇床的转速优选为150～200r/min，更优选为180r/min。

本发明中，在发酵后，优选的还包括对所述发酵获得的发酵液进行离心；所述离心的转速优选为5000～10000r/min，更优选为8000r/min；所述离心的时间优选为8～15min，更优选为10～12min。

本发明还提供了上述方案所述的巨大芽孢杆菌菌株D45或上述方案所述制剂在防治水稻线虫中的应用；所述水稻线虫包括拟禾本科根结线虫和旱稻孢囊线虫。

下面结合实施例对本发明提供的一种巨大芽孢杆菌及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1巨大芽孢杆菌菌株(Bacillusmegaterium)D45(CGMCC15119)的分离培养

采用等比稀释法制备土壤样品稀释液。称取2g土壤倒入装有30mL无菌水烧杯中，震荡后，梯度(10^-1-10^-7)稀释，将最后三个稀释梯度试管中的稀释液分别取100μL涂布于牛肉膏蛋白胨培养平板上，在超净工作台上吹干，将涂布的平板在28℃下恒温黑暗培养2d。

将分离出的细菌单菌落用灭菌牙签挑至培养基上进行纯化，获得分离纯化的细菌。将分离纯化的细菌用灭菌牙签转接入圆底玻璃试管(20×200mm)中，在28℃、180r/min培养48h，获得发酵液。

实施例2：对实施例1中获得的纯化的菌种进行鉴定

(1)形态特征

在牛肉膏蛋白胨培养基上25℃±1℃培养24h的菌落形态不规则，边缘褶皱，粗糙不透明，表面干燥，呈乳白色或米黄色，参见图1。在光学显微镜下观察，D45菌株菌体呈杆状、端圆，鞭毛周身。

(2)生理生化实验

生防细菌D45的生理生化特性表现为革兰氏反应为阳性，可水解淀粉，能与硝酸盐产生还原反应，甲基红试验为阴性反应，能利用过氧化氢酶，不产硫化氢，具备分解明胶的能力，乙酰甲基甲醇试验为阳性。

(3)16SrDNA测序及序列分析

提取细菌基因组DNA，采用细菌通用引物8f(序列如SEQIDNO.1所示，具体为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492r(序列如SEQIDNO.2所示，具体为：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行16SrDNA的PCR扩增。

反应体系：10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)5μL，dNTPMixtue(10mmol/L)4μL，引物(10μmol/L)各2μL，TaqDNA聚合酶(5U/uL)0.4μL，DNA模板2μL，灭菌ddH₂O补足至50μL。

PCR扩増条件：95℃预变性2.5min，94℃变性30S，55℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。

获得大小约1500bp的特异性片段，参见图2。序列经Blast同源序列检索并分别下载GenBank等数据库中同源性的16SrDNA序列。选取与之同源性较高的菌株，利用软件MAGA5.0进行***发育分析并构建菌株D45的16SrDNA***发育树。发现菌株D45与巨大芽孢杆菌均具有99％的同源性参见图3。

实施例3：菌株D45CGMCC15119的室内杀线虫活性

以马铃薯腐烂茎线虫和拟禾本科根结线虫为靶标，采用直接触杀法进行筛选，将实施例1中纯化的细菌菌株(菌株D45CGMCC15119)，用NB液体培养基在28℃、180r/min培养48h，8000r/min离心发酵液10min，取2mL上清液到直径5cm的玻璃培养皿中，加入线虫悬液100μL(约100条)，每个处理重复3次，以无菌NB培养液处理为对照，用封口膜密封后置于25℃±1℃恒温培养箱，观察记录处理后24h、48h线虫的致死率及线虫表现，计算校正死亡率。结果参见表1、表2。

校正死亡率(％)＝[(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)]×100

表1菌株D45CGMCC15119发酵液对马铃薯腐烂茎线虫的致死率

表2土壤细菌发酵液对拟禾本科根结线虫二龄幼虫的致死率

由表1、2可知，菌株D45的发酵上清液稀释2倍、5倍后对马铃薯腐烂茎线虫和拟禾本科根结线虫均具有优良的杀线虫活性。

实施例4：D45菌株发酵液熏蒸毒力测定

将实施例1中5mL的发酵液加入细胞板的一个孔中，另两个孔中分别加入一层水-琼脂培养基(0.8％水琼脂，厚度5mm)。在水-琼脂培养基的表面上，分别添加了约200条马铃薯腐烂茎线虫。用保鲜膜将细胞板封好，以防止挥发物的挥发。在25℃下培养24h后，通过在显微镜下计数，分别记录活动的和不动的幼虫。将那些不动的线虫转移到无菌水后12小时内不恢复的时候被视为已经死亡。在对照板中，用等体积的双蒸水代替发酵液。

熏蒸毒力测定结果参见表3，结果表明，菌株D45发酵液挥发物对马铃薯腐烂茎线虫有一定的杀虫活性。处理48h后线虫的致死率达50％以上。

表3菌株D45发酵液挥发物对马铃薯腐烂茎线虫致死率(％)

实施例5：D45菌株发酵液防治水稻拟禾本科根结线虫的盆栽试验

将实施例1中纯化的D45菌株接种于NB液体培养基中，28℃、180r/min培养48h，取发酵液备用。将带有水稻拟禾本科根结线虫的病土混匀，分装于高15cm直径10cm的苗盆，每盆250g。每盆浇灌50mL发酵液，待水分落干后将催芽露白的水稻种子种入苗盆，每盆种5粒，4次重复。空白对照组浇灌等量清水。20天后观察根系根结数，计算根结抑制率。结果参见表4。

根结抑制率＝(1-处理组根结数/对照组根结数)×100％

从表4可知，菌株D45发酵液对水稻拟禾本科根结线虫的盆栽防治效果较高。

表4菌株D45发酵液对水稻拟禾本科根结线虫的盆栽防治效果

实施例6：D45菌株发酵液对拟禾本科根结线虫的田间防治效果

将实施例1中的D45菌株发酵液分别稀释2倍、5倍、10倍，采用洒水壶均匀洒施。空白对照洒施等量清水。于播种当天、播种后7天喷施，共两次。最后1次施药后30天检查。每小区按照五点取样法，每个点取5株水稻，共检查25株水稻的根结数和根结分级。

根结分级标准采用0-10级的分级标准：0级，健康，无根结；1级，根结小且数量极少，不易观察；；2级，根结小，根结数量稍多，易观察；3级，根结小，数量较多且盘绕，根系功能未受影响；4级根结数量较多，有较大根结，大部分根系功能健康，；5级，25％-49％的根系上有根结，根系功能未受影响；6级，50％-74％的根系上有根结，根系正常功能受到影响；7级，75％以上根系有根结，失去根系功能；8级，无健康根系，植株仍存活；9级，整个根系出现腐烂，植株趋于死亡；10级，植株死。按下面的计算公式计算根结抑制率、根结指数和根结指数防治效果，结果参见表5。

根结抑制率＝(1-处理组根结数/对照组根结数)×100％

根结指数＝∑(各级病株数×相应级数值)/(调查总株数×最高病级数)×100

防治效果(％)＝(1-处理组根结指数/对照组根结指数)×100

从表5可知，菌株D45发酵液对水稻拟禾本科根结线虫具有显著的控制效果，其发酵液稀释2倍、5倍后对拟禾本科根结线虫的根结抑制率分别为67.3％和62.6％，防治效果分别为53.1％和56.3％。

表5菌株D45发酵液对水稻拟禾本科根结线虫的田间防治效果

实施例7：D45菌株发酵液对旱稻孢囊线虫的田间防治效果

将D45菌株发酵液分别稀释2倍、5倍后采用洒水壶均匀洒施。空白对照洒施等量清水。于播种当天、播种后30天喷施，共两次。收获后每小区随机5点采集水稻稻兜及根际土壤，混匀后采用蔗糖离心法分离1L土的孢囊并计数。结果参见表6。从表6可知，D45菌株发酵液2倍稀释液对旱稻孢囊线虫的防治效果较好，为60％。

防治效果(％)＝{(对照组孢囊数-处理组孢囊数)/对照组孢囊数}×100

表6菌株D45发酵液对旱稻孢囊线虫的田间防治效果

由以上实施例可知，本发明提供了一株巨大芽孢杆菌菌株(Bacillusmegaterium)D45(CGMCC15119)，D45菌株的发酵液能够用于防治水稻拟禾本科根结线虫和旱稻孢囊线虫。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南农业大学

<120> 一种巨大芽孢杆菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一株巨大芽孢杆菌菌株D45，保藏编号为：CGMCC No.15119。

2.一种防治水稻线虫的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1所述巨大芽孢杆菌菌株D45的发酵产物。

3.权利要求2所述制剂的制备方法，步骤为：将巨大芽孢杆菌D45接种至发酵培养基进行发酵，得到制剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的温度为25～30℃；所述发酵的时间为36～72h。

6.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株D45在防治水稻线虫中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述水稻线虫包括拟禾本科根结线虫和旱稻孢囊线虫。