CN108676761B - 一株防治植物线虫的蜡样芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株防治植物线虫的蜡样芽孢杆菌及其应用。本发明提供的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus的名称为MH61‑63‑03，保藏编号为CGMCC No.15616。实验结果表明：蜡样芽孢杆菌MH61‑63‑03发酵滤液对植物寄生线虫的二龄幼虫具有很高的毒杀活性；接种禾谷孢囊线虫二龄幼虫7d后，用MH61‑63‑03发酵滤液处理的小麦根内线虫数量有所减少，虫口减退率为26.82％；接种禾谷孢囊线虫二龄幼虫65d后，用MH61‑63‑03发酵滤液处理的小麦平均每株的孢囊数目也显著减少。本发明的生物药剂在植物寄生线虫防治中具有良好的应用开发前景。

Description

一株防治植物线虫的蜡样芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株防治植物线虫的蜡样芽孢杆菌及其应用。

背景技术

目前已知的25000多种线虫中，植物寄生线虫约有4100余种，占已知线虫总数的15％左右，每年给全世界农业生产造成的损失估计达1570亿美元。植物寄生线虫的种类较多，主要包括根结线虫属(Meloidogyne)、粒线虫属(Anguina)、茎线虫属(Ditylenchus)、异皮线虫属(Heterodera)、拟滑刃线虫属(Aphelenchoides)和根外寄生线虫等。其中根结线虫和孢囊线虫是农业生产上造成危害非常严重的两类植物寄生线虫，在蔬菜和粮食作物上发病会造成比较重大的经济损失。

目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但化学杀线虫剂的品种少，且多为高毒、高残留，严重污染和破坏环境。随着人们环保意识的提高和对安全农产品需求的增长，符合现代农业可持续发展战略理念的生物防治产品日益受到重视。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株用于防治植物寄生线虫的生防细菌-蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MH61-63-03。

本发明提供的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MH61-63-03来源于黑龙江漠河所采土样，其保藏编号为CGMCC No.15616。

本发明提供的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MH61-63-03的分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus，该菌株于2018年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

本发明的另一个目的是提供蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus或其发酵滤液或其菌剂或其菌悬液或其代谢液或其培养液的新用途。

本发明提供了蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus或其发酵滤液或其菌剂或其菌悬液或其代谢液或其培养液在防治植物寄生线虫中的应用。

本发明还提供了蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus或其发酵滤液或其菌剂或其菌悬液或其代谢液或其培养液在制备防治植物寄生线虫的产品中的应用。

本发明还提供了蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus或其发酵滤液或其菌剂或其菌悬液或其代谢液或其培养液在促进植物生长中的应用。

本发明还提供了蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus或其发酵滤液或其菌剂或其菌悬液或其代谢液或其培养液在制备促进植物生长的产品中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种用于防治植物寄生线虫或促进植物生长的产品。

本发明提供的用于防治植物寄生线虫或促进植物生长的产品的活性成分为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus或其发酵滤液或其菌剂或其菌悬液或其代谢液或其培养液。

本发明的最后一个目的是提供一种防治植物寄生线虫或促进植物生长的方法。

本发明提供的防治植物寄生线虫或促进植物生长的方法包括用蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus或其发酵滤液或其菌剂或其菌悬液或其代谢液或其培养液处理植物的步骤。

上述应用或产品或方法中，所述植物寄生线虫为根结线虫或孢囊线虫。所述根结线虫具体为南方根结线虫；所述孢囊线虫具体为禾谷孢囊线虫。

上述应用或产品或方法中，所述促进植物生长体现为提高植物地上部分鲜重和/或地下部分鲜重。

上述应用或产品或方法中，所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MH61-63-03CGMCC No.15616。

上述应用或产品或方法中，所述蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus发酵滤液的制备方法如下：将蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus MH61-63-03CGMCC No.15616接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；将所述发酵液离心，收集上清液，用滤膜进行过滤后，得到发酵滤液。该发酵滤液可作为生物药剂进行植物寄生线虫的防治。

进一步的，所述发酵培养基的溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度具体如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，NaCl 10g/L。

所述发酵培养条件为28℃，160r/min震荡培养72h。

所述离心的条件为10000rpm/min离心5min。

所述滤膜为孔径为0.22μm有机滤膜。

实验结果表明，蜡样芽孢杆菌MH61-63-03发酵滤液对植物寄生线虫的二龄幼虫具有很高的毒杀活性，用MH61-63-03发酵72h后的发酵滤液处理24h后，其5倍稀释液对南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率可达60％左右，发酵滤液原液对禾谷孢囊线虫二龄幼虫的校正死亡率可达70％左右；小麦的温室盆栽试验证明，接种禾谷孢囊线虫二龄幼虫7d后，用MH61-63-03发酵滤液处理的小麦根内线虫数量有所减少，虫口减退率为26.82％；在植物促生作用上，用MH61-63-03发酵滤液处理的小麦地上部鲜重与空白培养基对照相比提高了15％左右，地下部鲜重与空白培养基对照相比提高了55.74％。接种线虫65d后，用MH61-63-03发酵滤液处理的小麦平均每株的孢囊数目为25个/株，显著低于对照47.91个/株。本发明的生物药剂在植物寄生线虫防治中具有良好的应用开发前景。

附图说明

图1为MH61-63-03与GenBank Accession No.KU179332.1序列比对的结果。

图2为MH61-63-03发酵滤液对南方根结线虫及禾谷孢囊线虫的致死作用。

图3为小麦盆栽实验7天各处理侵染线虫数。

图4为小麦盆栽实验7天各处理地上部鲜重。

图5为小麦盆栽实验7天各处理地下部鲜重。

图6为小麦盆栽实验65天各处理孢囊数。

保藏说明

菌种名称：蜡样芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus cereus

菌株编号：MH61-63-03

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年04月16日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15616

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的LB固体培养基溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度具体如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，NaCl 10g/L，琼脂15-20g/L。

下述实施例中的发酵培养基溶剂为蒸馏水，溶质及其浓度具体如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，NaCl 10g/L。

下述实施例中的南方根结线虫Meloidogyne incognita采自中国农业大学植物线虫实验室试验温室中被南方根结线虫Meloidogyne incognita侵染的空心菜的病根。

实施例1、菌株MH61-63-03的分离、纯化及鉴定

一、菌株MH61-63-03的分离、纯化

菌株MH 61-63-03是从黑龙江漠河所采土样中分离得到的。具体步骤如下：称取5g的土样，加入到含有45mL无菌水的三角瓶中，将三角瓶在转速为200rpm/min的摇床中震荡培养30min，配成10^-1的土壤稀释液。在超净工作台中进行逐级稀释，配成一系列相应梯度的土壤稀释液。用移液枪吸取适量土壤稀释液于LB平板上，然后用涂布器涂布均匀，每个浓度重复3次。放置于28℃恒温培养箱中培养24h，观察平板上菌落生长情况，挑取平板上单菌落，将其命名为MH 61-63-03菌株，并在固体LB平板上三区划线进行纯化，获得纯培养。

二、菌株MH61-63-03的鉴定

提取MH61-63-03菌株的总DNA，采用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增，扩增得到MH61-63-03菌株的16S rDNA序列。引物序列如下：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

对MH61-63-03菌株的16S rDNA序列进行测序，结果表明：MH61-63-03菌株的16SrDNA序列如序列1所示。

将MH61-63-03菌株的16S rDNA序列与GenBank Accession No.KU179332.1进行序列比对，结果表明：两者同源性可达99％以上，具体的序列比对结果如图1所示。

三、MH61-63-03菌株的保藏

根据鉴定结果和分析，菌株MH61-63-03的分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus，该菌株于2018年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15616。

实施例2、MH61-63-03菌剂的制备

1、平板菌种的培养

将实施例1分离得到的MH61-63-03菌株接种于LB固体培养基平板上，28℃培养24h，挑取单菌落，获得平板菌种。

2、液体发酵培养

将步骤1获得的平板菌种接种到装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃条件下，以160r/min摇床转速发酵培养72h，获得含有MH61-63-03及其代谢产物的发酵液，将发酵液10000rpm/min离心5min，获取上清液，并用孔径为0.22μm的有机滤膜进行过滤，得到发酵滤液，将其命名为MH61-63-03菌剂。

用无菌水对制备的MH61-63-03菌剂进行5倍稀释，得到MH61-63-03菌剂5倍稀释液。

实施例3、MH61-63-03菌剂在防治植物线虫中的应用

一、MH61-63-03菌剂对植物寄生线虫二龄幼虫的杀线虫活性试验

1、南方根结线虫Meloidogyne incognita二龄幼虫的获得

取接种南方根结线虫二龄幼虫60-90天的空心菜根，用自来水将根部土清洗干净，在放大镜下用镊子挑取成熟饱满的卵块置于孵化筛中，将盛有大量卵块的孵化筛置于培养皿中，培养皿中加入蒸馏水至稍没过卵块，在25℃恒温培养箱中孵化，为保证所孵化线虫的出齐率，弃掉第一天孵出的二龄幼虫；为保证孵化后的二龄幼虫的活性，每隔24h收集1次，收集2-5天的二龄幼虫，并置于4℃冰箱暂存。

2、南方根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备

(1)将步骤1收集到的南方根结线虫二龄幼虫转移到1.5mL的离心管中，加入0.05％的吐温(以利于线虫沉淀富集)，8000rpm/min离心1min，弃上清液。

(2)完成步骤(1)后，在富集的线虫溶液中先加入无菌水定容至0.5mL，再加入1％次氯酸钠至1mL，使次氯酸钠浓度为0.5％，处理5min，8000rpm/min离心1min，弃上清液。

(3)完成步骤(2)后，用无菌水清洗3遍，每次清洗完后，10000rpm/min离心1min，弃上清液。

(4)完成步骤(3)后，用适量无菌水稀释，得到南方根结线虫二龄幼虫悬浮液。在体式显微镜下观察线虫密度，确定加入24孔细胞培养板中的体积，保证每孔100条左右线虫。

上述步骤除离心和计数线虫密度外，其它操作均在超净工作台内进行。

3、禾谷孢囊线虫Heterodera avenae二龄幼虫的获得

①挖取病土：从禾谷孢囊线病发生严重的地块，用小铁铲挖取大量小麦根际土。

②淘洗-过筛法获取富含孢囊的混合物：将取回的病土用铁铲破碎，取适量已破碎的土样置于水桶中，加水至距桶上边缘5cm左右，浸泡数秒，手持木棍充分搅拌使土样与水充分混合，然后静置45-60秒，将桶内的上清液倒入20目-60目嵌套的网筛上(上层20目，下层60目)，用水反复冲洗20目网筛上的杂物使附着在其上的孢囊充分落在下层60目网筛上，然后倒掉20目网筛上的杂物。用相同的方法将桶内的混合物淘洗过筛3-4次，以提高分离效率，收集更多的孢囊。最后收集60目网筛上的滞留物置于干净容器中，获得富含孢囊的混合物，注意收集之前要用自来水反复冲洗60目网筛上的滞留物，以弃掉更多的细泥沙。

③在体视镜下用挑针及镊子挑取上述混合物中的孢囊于装有蒸馏水的1.5mL(或2mL)离心管中，挑取大量孢囊后置于4℃冰箱备用。

④将孢囊放入孵化筛中，放入17℃恒温培养箱中进行孵化，经过分子鉴定获得禾谷孢囊线虫二龄幼虫。分子鉴定的引物为HaF2：ATAATACGAAACAAACAGGAGTT和HaR2：CCAAATGGAATAGTCGAAAATGA，目的条带的大小为452bp。

4、禾谷孢囊线虫悬浮液的制备

按照步骤2中的南方根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备方法制备得到禾谷孢囊线虫悬浮液。

5、杀线虫活性试验

在无菌的24孔细胞培养板中加入MH61-63-03菌剂或其5倍稀释液900μL。然后在24孔细胞培养板中再加入上述制备的禾谷孢囊线虫二龄幼虫的悬浮液或南方根结线虫二龄幼虫的悬浮液(约含100条线虫)，用无菌水补足至1mL。放入25℃培养箱中培养24h，然后在解剖镜下计数各孔内线虫总数和死亡数，以线虫僵直不动视为死亡。以空白培养基处理为对照，按照下述公式计算线虫死亡率和校正死亡率(即杀线虫活性)：线虫死亡率(％)＝(死亡线虫数/供试线虫数)×100％，校正死亡率(％)＝【(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)】×100％。实验设三次重复。

结果如图2所示。结果表明，对照南方根结线虫死亡率为5％，MH61-63-03菌剂5倍稀释液对南方根结线虫二龄幼虫的校正死亡率可达60％左右；对照禾谷孢囊线虫死亡率为6％，MH61-63-03菌剂原液对禾谷孢囊线虫二龄幼虫的校正死亡率可达70％左右。MH61-63-03菌剂对南方根结线虫二龄幼虫和禾谷孢囊线虫二龄幼虫具有良好的毒杀活性。

二、MH61-63-03菌剂的温室防效试验

1、取田园土壤与建筑沙，分别过孔径为4mm的5目筛，然后按沙土和壤土(v/v)3:1混合，180℃干热灭菌3h，得到消毒的小麦土，备用。

2、将直径为5cm的PVC塑料管(山承伟业有限公司)截成长为15cm的小段，用封口膜将PVC管的一端封住，并用皮筋绑紧，用竹签在封口膜上扎4-6个小孔，将消毒的小麦土装入PVC塑料培养管中，土壤表面距管上部边缘2cm左右，置于塑料托盘中备用。

3、将感病品种百农矮抗58小麦种子用质量分数为0.2％的NaClO水溶液消毒3-5min，之后用蒸馏水反复冲洗至无刺激性气味；消毒后浸种1h，然后将小麦种子置于铺有滤纸并将滤纸浸润的培养皿中，于25℃条件下进行催芽，待芽长为0.5-1cm时挑选发芽势基本一致种子的进行播种，每个PVC管播种1粒发芽种子并覆细沙土，每个处理15管，定植后的小麦在20℃，14h光照/10h黑暗的温室内培育。

用MH61-63-03菌剂对小麦种子进行催芽浸种和出苗后灌根，并以空白培养基、蒸馏水和药剂阿维菌素作为对照，每处理15株，各处理浸种时间均为1h，各处理如下：

(1)麦种经蒸馏水浸种催芽，出芽后每管1粒播种于PVC管中，出苗后每株小麦灌4mL蒸馏水(清水)；

(2)麦种经1.8％阿维菌素乳油(爱福丁1号，北京中农大技术股份有限公司)稀释1000倍浸种后催芽，出芽后每管1粒播种于PVC管中，出苗后每株小麦灌4mL稀释1000倍的阿维菌素药液(阿维菌素)；

(3)麦种经LB培养基浸种催芽，出芽后每管1粒播种于PVC管中，出苗后每株小麦灌4mL LB培养基(空白培养基对照，空白LB)；

(4)麦种经MH61-63-03菌剂浸种催芽，出芽后每管1粒播种于PVC管中，出苗后每株小麦灌4mL MH61-63-03菌剂(MH61-63-03)。

4、待小麦幼苗长至两叶一心期开始接种禾谷孢囊线虫二龄幼虫。接种方法如下：先用细玻璃棒在小麦苗根部附近插3-5cm深的小孔，在每株小麦根附近插2个小孔，同时将已制备好的禾谷孢囊线虫二龄幼虫悬浮液注入小孔内，接种量为400条J2/株，接种完毕后将孔覆细沙土。接种线虫后，适时浇水使土壤保持湿润，以利于线虫侵染。

对本次温室盆栽试验进行2次病情调查，分别于接种线虫7d、65d进行，调查不同处理侵染小麦根部线虫数量和根部形成孢囊数目。具体调查方法如下：

第1次调查：接种线虫7d后，每个处理各取7株小麦，调查每个处理地上部鲜重和地下部鲜重，并计算平均增加单株重，平均增加单株重(％)＝【(处理区单株重-对照区单株重)/对照区单株重】×100％。将根组织内线虫染色，在解剖镜下统计根内线虫侵染数，并计算虫口减退率，虫口减退率(％)＝【(对照单株虫口数-处理单株虫口数)/对照单株虫口数】×100％。

结果如图3、图4和图5所示。结果表明，用MH61-63-03菌剂处理的小麦平均每株侵染线虫的数量(38.2)与空白培养基对照(52.2)相比有所降低(图3)，虫口减退率为26.82％；地上部鲜重MH61-63-03(0.23g)与空白培养基对照(0.20g)相比提高了15％左右(图4)；地下部鲜重(0.0409g)与空白培养基对照(0.0263g)相比提高了55.74％。

第2次调查：在接种禾谷孢囊线虫二龄幼虫65d后，每个处理取7株小麦，统计每株小麦根上孢囊数和根部土壤中的孢囊数，并计算孢囊减退率。统计方法如下：将每个麦株根系连同土壤从塑料管中捅出，统计每株附在根部与脱落在土中孢囊数量，小麦根上孢囊可在放大镜下观察并计数、脱落在土中孢囊可先采用淘洗-过筛法收集，然后在解剖镜下计数。孢囊减退率的计算方法如下：孢囊减退率(％)＝【(对照单株孢囊数-处理单株孢囊数)/对照单株孢囊数】×100％。

结果如图6所示。结果表明，用MH61-63-03菌剂处理的小麦平均每株的孢囊数为25个，空白培养基对照的小麦平均每株的孢囊数为29.67个，与空白培养基对照相比孢囊减退率为18.68％。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一株防治植物线虫的蜡样芽孢杆菌及其应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>949

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

ggggggggtg ctataatgca gtcgagcgaa tggattgaga gcttgctctc aagaagttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccataa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggata acattttgaa ctgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc 180

ggctgtcact tatggatgga cccgcgtcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa 420

caagtgctag ttgaataagc tggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt 540

aaagcgcgcg caggtggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg 600

gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatatgg aggaacacca gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact 720

gacactgagg cgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaac 949

Claims (8)

1.一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)MH61-63-03，其保藏编号为CGMCC No.15616。

2.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或其菌剂或其菌悬液在防治植物寄生线虫中的应用；

或，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或其菌剂或其菌悬液在制备防治植物寄生线虫的产品中的应用；

所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.15616的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物寄生线虫为根结线虫或孢囊线虫。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述根结线虫为南方根结线虫；所述孢囊线虫为禾谷孢囊线虫。

5.蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或其菌剂或其菌悬液在促进植物生长中的应用；

或，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或其菌剂或其菌悬液在制备促进植物生长的产品中的应用；

所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.15616的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述促进植物生长体现为提高植物地上部分鲜重和/或地下部分鲜重。

7.一种用于防治植物寄生线虫或促进植物生长的产品，其活性成分为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或其菌剂或其菌悬液；

所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.15616的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

8.一种防治植物寄生线虫或促进植物生长的方法，包括用蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)或其菌剂或其菌悬液处理植物的步骤；

所述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)为权利要求1所述的保藏编号为CGMCCNo.15616的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

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