CN109844606A - 试样观察装置及试样观察方法 - Google Patents

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Abstract

试样观察装置(1)具备：照射光学***(3)，其对试样(S)照射面状光(L2)；扫描部(4)，其相对于面状光(L2)的照射面(R)扫描试样(S)；成像光学***(5)，其具有相对于照射面(R)倾斜的观察轴(P2)，将通过面状光(L2)的照射而在试样(S)产生的观察光(L3)成像；图像取得部(6)，其多次取得与由成像光学***(5)成像的观察光(L3)的光像的一部分对应的部分图像数据；图像生成部(8)，其基于由图像取得部(6)生成的多个部分图像数据而生成试样(S)的观察图像数据。

Description

试样观察装置及试样观察方法
技术领域
本发明涉及一种试样观察装置及试样观察方法。
背景技术
已知有SPIM(Selective Plane Illumination Microscopy(选择性平面照明显微镜))作为观察细胞等具有三维立体结构的试样的内部的方法之一。例如，专利文献1中记载的断层像观察装置公开了SPIM的基本的原理，将面状光照射于试样，使在试样的内部产生的荧光或散射光在成像面成像并取得试样内部的观察图像数据。
作为使用了面状光的其他的试样观察装置，例如可举出专利文献2中记载的SPIM显微镜。在该现有的SPIM显微镜中，对试样的配置面具有一定的倾斜角地照射面状光，通过具有相对于面状光的照射面正交的观察轴的观察光学***对来自试样的观察光进行摄像。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开昭62-180241号公报
专利文献2:日本特开2014-202967号公报
发明内容
发明所要解决的课题
在上述的专利文献2中记载的试样观察装置中，通过对观察光学***的聚焦面的整个面照射面状光，可以通过1次的摄像取得观察轴方向的断层面的图像。因此，为了取得试样的三维信息，需要沿观察轴方向扫描试样，取得观察轴方向的多个断层面的图像。在这种现有的试样观察装置中，直到取得全部的断层面的图像为止，需要反复取得图像的断层面的选择(试样的扫描及停止)和图像取得。另外，在存在有观察对象的区域比摄像区域宽的情况下，除了取得观察轴方向的截面图像的动作以外，还需要向与观察轴方向不同的方向移动平台来选择摄像视野的动作等。因此，直到取得观察图像数据为止需要时间成为技术问题。
实施方式的目的在于，提供一种试样观察装置及试样观察方法。
解决课题的技术手段
实施方式的一方面所涉及的试样观察装置具备：照射光学***，其对试样照射面状光；扫描部，其相对于面状光的照射面扫描试样；成像光学***，其具有相对于照射面倾斜的观察轴，将通过面状光的照射而在试样产生的观察光成像；图像取得部，其多次取得与通过成像光学***成像的观察光的光像的一部分对应的部分图像数据；图像生成部，其基于通过图像取得部生成的多个部分图像数据而生成试样的观察图像数据。
在该试样观察装置中，相对于面状光的照射面扫描试样，另外，相对于面状光的照射面，成像光学***的观察轴倾斜。因此，在图像取得部中，能够依次取得面状光的光轴方向上的断层面的部分图像数据，在图像生成部中，能够基于多个部分图像数据生成试样的观察图像数据。在该试样观察装置中，不需要视野选择动作，可以同时进行试样的扫描和图像取得，因此，能够实现直到取得观察图像数据为止的吞吐量的提高。
另外，也可以是试样由具有面状光的输入面的试样容器保持，照射光学***的面状光的光轴以相对于试样容器的输入面正交的方式配置。在该情况下，可以利用试样容器一次扫描多个试样。另外，通过使面状光的光轴相对于试样容器的输入面正交，不需要由图像取得部取得的部分图像数据的位置修正等，能够将观察图像数据的生成处理容易化。
另外，扫描部也可以沿相对于照射光学***的面状光的光轴正交的方向扫描试样。在该情况下，不需要由图像取得部取得的部分图像数据的位置修正等图像处理，能够将观察图像数据的生成处理容易化。
另外，成像光学***的观察轴相对于面状光的照射面的倾斜角度也可以成为10°～80°。在该范围内，能够充分确保观察图像的分辨率。
另外，成像光学***的观察轴相对于面状光的照射面的倾斜角度也可以为20°～70°。在该范围内，能够进一步充分确保观察图像的分辨率。另外，能够抑制视野相对于观察轴的角度变化量的变化，能够确保视野的稳定度。
另外，成像光学***的观察轴相对于面状光的照射面的倾斜角度也可以成为30°～65°。在该范围内，能够进一步更适宜地确保观察图像的分辨率及视野的稳定度。
另外，图像取得部也可以包含二维摄像装置而构成，从自二维摄像装置输出的数据中提取与观察光的光像的一部分对应的图像数据来作为部分图像数据。通过这种结构，能够精度良好地取得部分图像数据。
另外，图像取得部也可以包含对观察光的光像的一部分进行摄像，并输出部分图像数据的线传感器。通过这种结构，能够精度良好地取得部分图像数据。
另外，图像取得部也可以包含使观察光的光像的一部分通过的狭缝和检测通过了狭缝的光像的光检测器，基于从光检测器输出的数据生成部分图像数据。通过这种结构，能够精度良好地取得部分图像数据。
另外，图像生成部也可以基于多个部分图像数据，生成与面状光的光轴正交的面上的试样的观察图像数据。由此，能够得到抑制了背景的影响的试样的截面图像来作为观察图像。
另外，试样观察装置也可以还具备解析观察图像数据，并生成解析结果的解析部。由于通过解析部解析由图像生成部生成的观察图像数据，因此，也能够提高解析的吞吐量。
另外，实施方式的一方面所涉及的试样观察方法具备：对试样照射面状光的照射步骤；相对于面状光的照射面扫描试样的扫描步骤；使用具有相对于照射面倾斜的观察轴的成像光学***，将通过面状光的照射而在试样产生的观察光成像的成像步骤；多次取得与由成像光学***成像的观察光的光像的一部分对应的部分图像数据的图像取得步骤；基于多个部分图像数据生成试样的观察图像数据的图像生成步骤。
在该试样观察方法中，相对于面状光的照射面扫描试样，另外，使用观察轴相对于面状光的照射面倾斜的成像光学***。因此，在图像取得步骤中，能够依次取得面状光的光轴方向上的断层面的部分图像数据，在图像生成步骤中，基于多个部分图像数据，能够生成试样的观察图像数据。在该试样观察方法中，不需要视野选择动作，能够同时进行试样的扫描和图像取得，因此，能够实现直到得到观察图像数据为止的吞吐量的提高。
发明的效果
根据该试样观察装置及试样观察方法，实现了直到获得观察图像数据为止的吞吐量的提高。
附图说明
图1是表示试样观察装置的一个实施方式的概略结构图。
图2是表示试样的附近的主要部分放大图。
图3是表示图像取得部的一个例子的图。
图4是表示使用了试样观察装置的试样观察方法的一个例子的流程图。
图5是表示图像生成部所进行的观察图像数据的生成的一个例子的图。
图6是表示比较例中的图像取得的情况的图。
图7是表示实施例中的图像取得的情况的图。
图8是表示试样观察装置的视野的计算例的图。
图9是表示观察轴的倾斜角度和分辨率的关系的图。
图10是表示观察轴的倾斜角度和视野的稳定度的关系的图。
图11是表示观察轴的倾斜角度和来自试样的观察光的透过率的关系的图。
图12是表示成像光学***的变形例的图。
具体实施方式
以下，参照附图，对试样观察装置及试样观察方法的优选的实施方式进行详细的说明。
[试样观察装置的结构]
图1是表示试样观察装置的一个实施方式的概略结构图。该试样观察装置1是将面状光L2照射于试样S，使在试样S的内部产生的荧光、散射光、扩散反射光的至少一者在成像面上成像并取得试样S内部的观察图像数据的装置。作为这种试样观察装置1，具有取得保持于载玻片的试样S的图像并显示的滑动扫描仪、或取得保持于微板的试样S的图像数据并解析图像数据的平板阅读器等。如图1所示，试样观察装置1具备光源2、照射光学***3、扫描部4、成像光学***5、图像取得部6、计算机7而构成。
作为成为观察对象的试样S，例如，可举出人或动物的细胞、组织、脏器、动物或植物本身、植物的细胞、组织等。另外，试样S也可以包含于溶液、凝胶、或折射率与试样S不同的物质。
光源2是输出照射于试样S的光L1的光源。作为光源2，例如，可举出激光二极管、固体激光光源等的激光光源。另外，光源2也可以是发光二极管、超辐射发光二极管、灯类光源。从光源2输出的光L1向照射光学***3导光。
照射光学***3是将从光源2输出的光L1整形成面状光L2，使整形的面状光L2沿着光轴P1对试样S照射的光学***。在以下的说明中，有时也将照射光学***3的光轴P1称为面状光L2的光轴。照射光学***3例如包含柱透镜、圆锥透镜、或空间光调制器等光整形元件而构成，相对于光源2光学结合。照射光学***3也可以包含物镜而构成。由照射光学***3形成的面状光L2照射于试样S。在被照射面状光L2的试样S中，在面状光L2的照射面R产生观察光L3。观察光L3例如是由面状光L2激发的荧光、面状光L2的散射光、面状光L2的扩散反射光的至少一个。
在沿试样S的厚度方向进行观察的情况下，考虑分辨率，面状光L2优选为厚度2mm以下的薄的面状光。另外，在试样S的厚度非常小的情况下，即，在观察下述的Z方向分辨率以下的厚度的试样S的情况下，面状光L2的厚度不影响分辨率。因此，也可以使用超过厚度2mm的面状光L2。
扫描部4是相对于面状光L2的照射面R扫描试样S的机构。在本实施方式中，扫描部4由使保持试样S的试样容器11移动的移动台12构成。试样容器11是例如微板、载玻片、皿等。在本实施方式中，例示微板。如图2所示，试样容器11具有配置有试样S的多个孔(well)13呈一直线状(或阵列状)排列的板状的主体部14和在主体部14的一面侧以堵塞孔13的一端侧的方式设置的板状的透明部件15。
试样S配置于孔13内时，孔13内也可以由水等介质填充。透明部件15具有相对于配置于孔13内的试样S的面状光L2的输入面15a。只要透明部件15的材质是相对于面状光L2具有透明性的部件就没有特别限定，但例如是玻璃、石英、或合成树脂。试样容器11以输入面15a与面状光L2的光轴P1正交的方式相对于移动台12配置。此外，孔13的另一端侧成为向外部开放的状态。试样容器11也可以相对于移动台12固定。
如图1所示，移动台12根据来自计算机7的控制信号沿着事先设定的方向扫描试样容器11。在本实施方式中，移动台12沿着与面状光L2的光轴P1正交的平面内的一方向扫描试样容器11。在以下的说明中，将面状光L2的光轴P1方向称为Z轴，将移动台12的试样容器11的扫描方向称为Y轴，将在与面状光L2的光轴P1正交的平面内与Y轴正交的方向称为X轴。相对于试样S的面状光L2的照射面R成为XZ平面内的面。
成像光学***5是将通过面状光L2的照射而在试样S产生的观察光L3成像的光学***。如图2所示，成像光学***5例如包含物镜16及成像透镜等而构成。成像光学***5的光轴成为观察光L3的观察轴P2。该成像光学***5的观察轴P2相对于试样S中的面状光L2的照射面R具有倾斜角度θ而倾斜。倾斜角度θ也与朝向试样S的面状光L2的光轴P1和观察轴P2所成的角一致。倾斜角度θ成为10°～80°。从提高观察图像的分辨率的观点考虑，倾斜角度θ优选为20°～70°。另外，从观察图像的分辨率的提高及视野的稳定性的观点考虑，倾斜角度θ进一步优选为30°～65°。
如图1所示，图像取得部6是多次取得与由成像光学***5成像的观察光L3的光像的一部分对应的部分图像数据的装置。图像取得部6例如包含对观察光L3的光像进行摄像的摄像装置而构成。作为摄像装置，例如，可举出CMOS图像传感器、CCD图像传感器等的区域图像传感器。这些区域图像传感器配置于成像光学***5的成像面，例如通过全局快门或卷帘快门对光像进行摄像，将二维图像的数据输出到计算机7。
关于观察光L3的光像的部分图像数据的取得方法，可以采用各种方式。例如如图3(A)所示，也可以在区域图像传感器21的摄像面上设定子阵列。在区域图像传感器中的子阵列读取中，能够仅读取全像素列中设定的像素列，能够提高帧频率。因此，在该情况下，由于仅读取子阵列中包含的像素列21a，因此，能够对观察光L3的光像的一部分进行摄像并取得部分图像数据。另外，如图3(B)所示，也可以将区域图像传感器21的全部的像素列设为读取区域，通过之后的图像处理提取二维图像的一部分并取得部分图像数据。
再有，如图3(C)所示，也可以使用线传感器22代替区域图像传感器21，将摄像面本身限定为一个像素列并取得部分图像数据。另外，如图3(D)所示，也可以将仅使观察光L3的一部分透过的狭缝23配置于区域图像传感器(光检测器)21的前面，取得与狭缝23对应的像素列21a的图像数据来作为部分图像数据。另外，在使用狭缝23的情况下，也可以使用光电倍增管等点传感器代替区域图像传感器21。
计算机7在物理上具备RAM、ROM等存储器、及CPU等处理器(运算电路)、通信接口、硬盘等存储部、显示器等显示部而构成。作为该计算机7，例如可举出个人计算机、云服务器、智能设备(智能手机、平板终端等)、微计算机等。计算机7通过由计算机***的CPU执行存储于存储器的程序，作为控制光源2及移动台12的动作的控制器、生成试样S的观察图像数据的图像生成部8、及解析观察图像数据的解析部10而发挥作用(参照图1)。
作为控制器的计算机7接受用户的测定开始操作的输入，并同步地驱动光源2、移动台12、及图像取得部6。在该情况下，计算机7也可以在移动台12的试样S的移动中，以光源2连续地输出光L1的方式控制光源2，也可以按照图像取得部6的摄像控制光源2的光L1的输出的开启/关断(ON/OFF)。另外，在照射光学***3具备光快门(未图示)的情况下，计算机7也可以通过该光快门的控制使向试样S的面状光L2的照射开启/关断。
另外，作为图像生成部8的计算机7基于由图像取得部6生成的多个部分图像数据生成试样S的观察图像数据。图像生成部8基于从图像取得部6输出的多个部分图像数据而生成例如与面状光L2的光轴P1正交的面(XY面)上的试样S的观察图像数据。图像生成部8根据用户的规定的操作，执行生成的观察图像数据的存储、向监视器等的显示等。
作为解析部10的计算机7基于由图像生成部8生成的观察图像数据执行解析，并生成解析结果。解析部10根据用户的规定的操作，执行生成的解析结果的存储、向监视器等的显示等。此外，也可以不进行由图像生成部生成的观察图像数据的向监视器等的显示，在监视器等上仅显示由解析部10生成的解析结果。
[试样观察方法]
图4是表示使用了试样观察装置的试样观察方法的一个例子的流程图。如该图所示，该试样观察方法具备照射步骤(步骤S01)、扫描步骤(步骤S02)、成像步骤(步骤S03)、图像取得步骤(步骤S04)、图像生成步骤(步骤S05)、及解析步骤(步骤S06)。
在照射步骤S01中，对试样S照射面状光L2。当由用户输入测定开始的操作时，基于来自计算机7的控制信号驱动光源2，从光源2输出光L1。从光源2输出的光L1通过照射光学***3整形而成为面状光L2，并照射于试样S。
在扫描步骤S02中，相对于面状光L2的照射面R扫描试样S。当通过用户输入测定开始的操作时，基于来自计算机7的控制信号，与光源2的驱动同步地驱动移动台12。由此，试样容器11沿着Y轴方向以一定的速度直线地驱动，并相对于面状光L2的照射面R扫描孔13内的试样S。
在成像步骤S03中，使用具有相对于照射面R倾斜的观察轴P2的成像光学***5，将通过面状光L2的照射而在试样S产生的观察光L3相对于图像取得部6的成像面成像。在图像取得步骤S04中，多次取得与由成像光学***5成像的观察光L3的光像的一部分对应的部分图像数据。部分图像数据从图像取得部6依次输出到图像生成部8。
在图像生成步骤S05中，基于多个部分图像数据生成试样S的观察图像数据。在本实施方式中，如图1及图2所示，相对于试样S的面状光L2的照射面R为XZ平面内的面，相对于试样S沿着Y轴方向扫描照射面R。因此，在图像生成部8中，如图5(A)所示，通过沿着Y轴方向多次取得作为部分图像数据的XZ截面图像数据31，积累试样S的三维信息。在图像生成部8中，使用多个XZ截面图像而再构建数据，例如如图5(B)所示，在试样S中的Z轴方向的任意位置具有任意的厚度的XY截面图像作为抑制了背景的观察图像数据32而生成。
在解析步骤S06中，由解析部10解析观察图像数据，并生成解析结果。例如在药物开发筛选中，在试样容器11放入试样S及试药，取得观察图像数据。然后，解析部10基于观察图像数据评价试药，生成评价数据作为解析结果。
[作用效果]
如图6(A)所示，比较例所涉及的试样观察装置100具有相对于面状光L2的照射面R正交的观察轴P2。在该试样观察装置100中，通过对观察光学***的聚焦面的整个面照射面状光L2，可以通过1次的摄像取得试样S中的与观察轴P2方向正交的断层面的图像。因此，为了取得试样S的三维信息，需要沿着观察轴P2方向扫描试样S，取得与观察轴P2方向正交的多个断层面的图像。在这种比较例所涉及的试样观察装置100中，如图6(B)所示，直到取得全部的断层面的图像为止，需要反复取得图像的断层面的选择(试样S的扫描及停止)和图像取得。另外，在存在有观察对象的区域比摄像宽的情况下，除了取得观察轴P2方向的截面图像的动作之外，还需要通过向与观察轴方向不同的方向移动平台来选择摄像视野的动作等。
相对于此，在实施例所涉及的试样观察装置1中，如图7(A)所示，一边相对于面状光L2的照射面R扫描试样S一边由图像取得部6进行图像取得，另外，使成像光学***5的观察轴P2相对于面状光L2的照射面R倾斜。因此，在图像取得部6中，能够依次取得面状光L2的光轴P1方向(Z轴方向)上的断层面的部分图像数据，在图像生成部8中，能够基于多个部分图像数据，生成试样S的观察图像数据32。
在该试样观察装置1中，如图7(B)所示，能够一边扫描试样S一边依次进行图像取得。在比较例所涉及的试样观察装置100的动作中，在每次移动台12的驱动及停止时，由惯性的影响等产生时间上的损失。另一方面，在试样观察装置1中，通过减少移动台12的驱动及停止的次数，并同时进行试样S的扫描动作和图像取得，实现了直到得到观察图像数据32为止的吞吐量的提高。
另外，在试样观察装置1中，如图2所示，试样S由具有面状光L2的输入面15a的试样容器11保持，以照射光学***3的面状光L2的光轴P1相对于试样容器11的输入面15a正交的方式配置。再有，在试样观察装置1中，扫描部4沿着相对于照射光学***3的面状光L2的光轴P1(Z轴方向)正交的方向(Y轴方向)扫描试样S。由此，不需要图像取得部6中获得的部分图像数据的位置修正等的图像处理，能够将观察图像数据的生成处理容易化。
另外，在试样观察装置1中，成像光学***5的观察轴P2相对于试样S中的面状光L2的照射面R的倾斜角度θ为10°～80°，优选为20°～70°，更优选为30°～65°。以下，对该点进行考察。
图8是表示试样观察装置中的视野的计算例的图。在该图所示的例子中，成像光学***位于折射率n1的介质A中，面状光的照射面位于折射率n2的介质B中。在将成像光学***中的视野设为V，将照射面设为V’，将观察轴相对于照射面的倾斜角度设为θ，将在介质A、B的边界面的折射角设为θ’，将视野V的倾斜角度θ时的介质A和介质B的在界面的距离设为L的情况下，以下的式(1)～(3)成立。
(数1)
L＝V/cosθ…(1)
(数2)
sinθ’＝(n1/n2)sinθ…(2)
(数3)
V’＝L/tanθ’…(3)
图9是表示观察轴的倾斜角度和分辨率的关系的图。在该图中，将横轴设为观察轴的倾斜角度θ，将纵轴设为视野的相对值V’/V。于是，将介质A的折射率n1设为1(空气)，将使介质B的折射率n2从1.0以0.1刻度变化至2.0时的V’/V的值相对于倾斜角度θ进行绘制。表示V’/V的值越小则试样的深度方向的分辨率(以下，称为“Z方向分辨率”)越高，越大则Z方向分辨率越低。
从图9所示的结果可以看出，在介质A的折射率n1和介质B的折射率n2相等的情况下，V’/V的值相对于倾斜角度θ成反比例。另外，在介质A的折射率n1和介质B的折射率n2不同的情况下，可以看出V’/V的值相对于倾斜角度θ描绘抛物线。从该结果可以看出，能够通过试样的配置空间的折射率、成像光学***的配置空间的折射率、及观察轴的倾斜角度θ控制Z方向分辨率。于是，可以看出在倾斜角度θ为10°～80°的范围内，与倾斜角度θ低于10°及超过80°的范围相比，可得到良好的Z方向分辨率。
另外，从图9所示的结果可以看出，具有Z方向分辨率成为最大的倾斜角度θ随着折射率n1和折射率n2的差变大而变小的趋势。在折射率n2为1.1～2.0的范围内，Z方向分辨率成为最大的倾斜角度θ成为约47°～约57°的范围。例如折射率n2为1.33(水)的情况下，Z方向分辨率成为最大的倾斜角度θ估计约为52°。另外，例如折射率n2为1.53(玻璃)的情况下，Z方向分辨率成为最大的倾斜角度θ估计约为48°。
图10是表示观察轴的倾斜角度和视野的稳定度的关系的图。在该图中，将横轴设为观察轴的倾斜角度θ，将纵轴设为视野的稳定度。稳定度由相对于倾斜角度θ中的V’/V的倾斜角度θ+1中的V’/V和倾斜角度θ-1中的V’/V的差分值的比例表示，基于下述式(4)计算。稳定度越接近0％，则视野相对于倾斜角度的变化的变化越小，能够评价为视野稳定。在该图10中，与图9同样，将介质A的折射率n1设为1(空气)，绘制使介质B的折射率n2从1.0以0.1刻度变化至2.0时的稳定度。
(数4)
稳定度(％)＝((V’/V)θ+1-(V’/V)θ-1)/(V’/V)θ…(4)
从图10所示的结果可以看出，在倾斜角度θ低于10°及超过80°的范围内，稳定度超过±20％，且难以控制视野。另一方面，倾斜角度θ在10°～80°的范围内，稳定度成为±20％以下，且能够控制视野。再有，倾斜角度θ在20°～70的范围，稳定度成为±10％以下，且容易控制视野。
图11是表示观察轴的倾斜角度和来自试样的观察光的透过率的关系的图。在该图中，将横轴设为观察轴的倾斜角度θ，将左侧的纵轴设为视野的相对值，将右侧的纵轴设为透过率。在该图11中，考虑试样容器中的试样的保持状态，将介质A的折射率n1设为1(空气)，将介质B的折射率n2设为1.53(玻璃)，将介质C的折射率n3设为1.33(水)，透过率的值为介质B、C的界面及介质A、B的界面的透过率的积。在图11中，绘制有P波的透过率、S波的透过率、及它们的平均值的角度依赖性。另外，在图11中，一并绘制有介质C的视野的相对值。
从图11所示的结果可以看出，通过使观察轴的倾斜角度θ变化，从试样到达成像光学***的观察光的透过率可变。可以看出倾斜角度θ在80°以下的范围内，能够得到至少50％以上的透过率。另外，可以看出倾斜角度θ在70°以下的范围内，能够得到至少60％以上的透过率，倾斜角度θ在65°以下的范围内，可以得到至少75％以上的透过率。
从以上的结果可以看出，在要求试样的Z方向分辨率的情况下，优选从30°～65°的范围选择倾斜角度θ以使例如作为视野的相对值的V’/V的值为3以下，稳定度低于5％，且观察光的透过率(P波及S波的平均值)成为75％以上。另外，在不要求试样的Z方向分辨率的情况下，只要从10°～80°的范围适当选择倾斜角度θ即可，从确保每1像素的视野的范围的观点考虑，优选从10°～30°或65°～80°的范围选择。
试样观察装置及试样观察方法不局限于上述实施方式。例如面状光L2的光轴P1和试样容器11的输入面15a也可不必正交，面状光L2的光轴P1和扫描部4的试样S的扫描方向也可不必正交。
另外，例如，上述实施方式中，在试样容器11中以堵塞孔13的一端侧的方式设置有透明部件15，从透明部件15的输入面15a输入面状光L2，但也可以作为从孔13的另一端侧输入面状光L2的结构。在该情况下，折射率不同的介质的界面的数量减少，能够减少观察光L3的折射次数。再有，也可以代替试样容器11而在凝胶等固形物保持试样S，也可以如流式细胞仪那样在透明容器内流动鞘液等流体而使试样S移动。在流式细胞仪的情况下，利用流动池，使包含含有作为试样S的检体的液的鞘液流动。由此，因为检体一边排列一边移动，所以能够使流动池对准扫描部。
另外，也可以配置多对成像光学***5及图像取得部6。在该情况下，除了能够放大观察范围之外，还能够观察多个不同的波长的观察光L3。另外，也可以相对于一个成像光学***5配置多个图像取得部6，也可以相对于多个成像光学***5配置一个图像取得部6。多个图像取得部6也可以组合不同种类的光检测器或摄像装置。光源2也可以由输出波长不同的光的多个光源构成。在该情况下，能够对试样S照射波长不同的激发光。
另外，为了像散的缓和，也可以在成像光学***5配置棱镜。在该情况下，例如如图12所示，也可以在物镜16的后段侧(物镜16和图像取得部6之间)配置棱镜41。为了散焦对策，也可以相对于观察轴P2使图像取得部6中的摄像装置的摄像面倾斜。除此之外，例如也可以设为在成像光学***5和图像取得部6之间配置分色镜或棱镜进行观察光L3的波长分离的结构。
另外，如上所述，作为观察光L3，考虑由面状光L2激发的荧光、面状光L2的散射光、或面状光L2的扩散反射光等，因此，图像取得部6也可以取得不同种类的观察光L3的图像数据。在该情况下，能够将由面状光L2激发的荧光、面状光L2的散射光、面状光L2的扩散反射光中的至少两个种类的观察光设为对象。
符号的说明
1…试样观察装置、3…照射光学***、4…扫描部、5…成像光学***、6…图像取得部、8…图像生成部、10…解析部、11…试样容器、15a…输入面、21…区域图像传感器(摄像装置)、22…线传感器、23…狭缝、31…部分图像数据、32…观察图像数据、L2…面状光、L3…观察光、P2…观察轴、R…照射面、S…试样、θ…倾斜角度。

Claims (12)

1.一种试样观察装置，其中，
具备：
照射光学***，其对试样照射面状光；
扫描部，相对于所述面状光的照射面扫描所述试样；
成像光学***，其具有相对于所述照射面倾斜的观察轴，将通过所述面状光的照射而在所述试样产生的观察光成像；
图像取得部，其多次取得与由所述成像光学***成像的所述观察光的光像的一部分对应的部分图像数据；以及
图像生成部，其基于由所述图像取得部生成的多个部分图像数据而生成所述试样的观察图像数据。
2.根据权利要求1所述的试样观察装置，其中，
所述试样由具有所述面状光的输入面的试样容器保持，
所述照射光学***的所述面状光的光轴以相对于所述试样容器的所述输入面正交的方式配置。
3.根据权利要求1或2所述的试样观察装置，其中，
所述扫描部沿着相对于所述照射光学***的所述面状光的光轴正交的方向扫描所述试样。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的试样观察装置，其中，
所述成像光学***的所述观察轴相对于所述面状光的照射面的倾斜角度成为10°～80°。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的试样观察装置，其中，
所述成像光学***的所述观察轴相对于所述面状光的照射面的倾斜角度成为20°～70°。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的试样观察装置，其中，
所述成像光学***的所述观察轴相对于所述面状光的照射面的倾斜角度成为30°～65°。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的试样观察装置，其中，
所述图像取得部包含二维摄像装置，从自所述二维摄像装置输出的数据提取与所述观察光的光像的一部分对应的图像数据来作为所述部分图像数据。
8.根据权利要求1～6中任一项所述的试样观察装置，其中，
所述图像取得部包含对所述观察光的光像的一部分进行摄像，并输出所述部分图像数据的线传感器。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的试样观察装置，其中，
所述图像取得部包含使所述观察光的光像的一部分通过的狭缝和检测通过了所述狭缝的光像的光检测器，基于从所述光检测器输出的数据而生成所述部分图像数据。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的试样观察装置，其中，
所述图像生成部基于所述多个部分图像数据，生成与所述面状光的光轴正交的面上的所述试样的观察图像数据。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的试样观察装置，其中，
还具备：解析部，其解析所述观察图像数据，并生成解析结果。
12.一种试样观察方法，其中，
具备：
照射步骤，对试样照射面状光；
扫描步骤，相对于所述面状光的照射面扫描所述试样；
成像步骤，使用具有相对于所述照射面倾斜的观察轴的成像光学***，将通过所述面状光的照射而在所述试样产生的观察光成像；
图像取得步骤，多次取得与由所述成像光学***成像的所述观察光的光像的一部分对应的部分图像数据；以及
图像生成步骤，基于所述多个部分图像数据而生成所述试样的观察图像数据。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7207860B2 (ja) * 2018-04-09 2023-01-18 浜松ホトニクス株式会社 試料観察装置
JPWO2021240960A1 (zh) 2020-05-27 2021-12-02
WO2021246021A1 (ja) * 2020-06-01 2021-12-09 浜松ホトニクス株式会社 試料観察装置及び試料観察方法
EP4321917A1 (en) 2021-07-26 2024-02-14 Hamamatsu Photonics K.K. Sample observation device and sample observation method
JP2024093375A (ja) 2022-12-27 2024-07-09 浜松ホトニクス株式会社 試料観察装置及び試料観察方法
JP2024093373A (ja) 2022-12-27 2024-07-09 浜松ホトニクス株式会社 試料観察装置及び試料観察方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010054391A (ja) * 2008-08-29 2010-03-11 Nano Photon Kk 光学顕微鏡、及びカラー画像の表示方法
US20100067103A1 (en) * 2008-09-16 2010-03-18 Yokogawa Electric Corporation Microscope device
US20150177506A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Olympus Corporation Microscope device and microscope system
CN105283791A (zh) * 2013-06-11 2016-01-27 浜松光子学株式会社 图像取得装置及图像取得装置的聚焦方法
WO2016102200A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Koninklijke Philips N.V. Method for simultaneous capture of image data at multiple depths of a sample

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62180241A (ja) 1986-02-04 1987-08-07 Hamamatsu Photonics Kk 断層像観察装置
JPH03172815A (ja) 1989-12-01 1991-07-26 Fuji Photo Film Co Ltd 共焦点走査型顕微鏡
JPH11211439A (ja) 1998-01-22 1999-08-06 Takaoka Electric Mfg Co Ltd 表面形状計測装置
JP3736213B2 (ja) 1999-07-15 2006-01-18 横河電機株式会社 共焦点光スキャナ
DE10257423A1 (de) * 2002-12-09 2004-06-24 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Mikroskop
US7009172B2 (en) * 2003-03-06 2006-03-07 Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada, Reno Method and apparatus for imaging using continuous non-raster patterns
US7345814B2 (en) * 2003-09-29 2008-03-18 Olympus Corporation Microscope system and microscope focus maintaining device for the same
JP4621866B2 (ja) 2004-03-16 2011-01-26 学校法人日本大学 燃料の燃焼伝播解析及び火炎燃え広がりの測定装置、及び該装置を用いた燃料の火炎伝播モードの試験方法
US20050280892A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-22 Nobuyuki Nagasawa Examination method and examination apparatus
JP4538633B2 (ja) 2005-03-29 2010-09-08 国立大学法人浜松医科大学 Ｄｌｐ式スリット光走査顕微鏡
JP4890096B2 (ja) * 2006-05-19 2012-03-07 浜松ホトニクス株式会社 画像取得装置、画像取得方法、及び画像取得プログラム
US8564792B2 (en) * 2007-12-21 2013-10-22 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction limit image resolution in three dimensions
WO2010014244A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 The Regents Of The University Of California, San Francisco Multidirectional selective plane illumination microscopy
GB0814039D0 (en) 2008-07-31 2008-09-10 Imp Innovations Ltd Optical arrangement for oblique plane microscopy
JP5311195B2 (ja) * 2008-09-16 2013-10-09 横河電機株式会社 顕微鏡装置
US8743195B2 (en) * 2008-10-24 2014-06-03 Leica Biosystems Imaging, Inc. Whole slide fluorescence scanner
JP2011180442A (ja) * 2010-03-02 2011-09-15 Sony Corp サンプル像取得装置、サンプル像取得方法及びサンプル像取得プログラム
US8711211B2 (en) 2010-06-14 2014-04-29 Howard Hughes Medical Institute Bessel beam plane illumination microscope
WO2013010151A1 (en) 2011-07-14 2013-01-17 Howard Hughes Medical Institute Microscopy with adaptive optics
WO2013053454A1 (de) 2011-10-11 2013-04-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und verfahren zur spim mikroskopie
JP2013156286A (ja) 2012-01-26 2013-08-15 Olympus Corp 撮像装置
DE102012110077A1 (de) 2012-10-23 2014-06-26 Karlsruher Institut für Technologie Mikroskop mit mindestens einem Beleuchtungsstrahl in Form einer Lichtscheibe
JP6086366B2 (ja) 2013-04-05 2017-03-01 国立研究開発法人理化学研究所 顕微鏡、焦準器具、流体保持器具、及び光学ユニット
DE102013107297A1 (de) * 2013-07-10 2015-01-15 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
US10061111B2 (en) * 2014-01-17 2018-08-28 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for three dimensional imaging
DE102014102215A1 (de) 2014-02-20 2015-08-20 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren und Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
JP2016033620A (ja) * 2014-07-31 2016-03-10 キヤノン株式会社 画像取得装置
JP6605269B2 (ja) * 2015-09-24 2019-11-13 オリンパス株式会社 倒立顕微鏡及び倒立顕微鏡用遮光装置
JP2017191228A (ja) * 2016-04-14 2017-10-19 オリンパス株式会社 ライトシート顕微鏡およびサンプル観察方法
US10409052B2 (en) * 2016-09-28 2019-09-10 University Of Washington Inverted light-sheet microscope
EP3610313B1 (en) * 2017-04-11 2022-03-02 Calico Life Sciences LLC Fluorescence microscopy system and methods based on stimulated emission
WO2019217846A1 (en) * 2018-05-10 2019-11-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Line excitation array detection microscopy
DE102019100184A1 (de) * 2019-01-07 2020-07-09 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Hochauflösende Scanning-Mikroskopie

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010054391A (ja) * 2008-08-29 2010-03-11 Nano Photon Kk 光学顕微鏡、及びカラー画像の表示方法
US20100067103A1 (en) * 2008-09-16 2010-03-18 Yokogawa Electric Corporation Microscope device
US9116353B2 (en) * 2008-09-16 2015-08-25 Yokogawa Electric Corporation Microscope device
CN105283791A (zh) * 2013-06-11 2016-01-27 浜松光子学株式会社 图像取得装置及图像取得装置的聚焦方法
US20150177506A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Olympus Corporation Microscope device and microscope system
WO2016102200A1 (en) * 2014-12-22 2016-06-30 Koninklijke Philips N.V. Method for simultaneous capture of image data at multiple depths of a sample

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Publication number Publication date
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