JPH07135969A - ナチュラルキラー細胞の前駆細胞及びその分化増殖法 - Google Patents
ナチュラルキラー細胞の前駆細胞及びその分化増殖法Info
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- JPH07135969A JPH07135969A JP5312573A JP31257393A JPH07135969A JP H07135969 A JPH07135969 A JP H07135969A JP 5312573 A JP5312573 A JP 5312573A JP 31257393 A JP31257393 A JP 31257393A JP H07135969 A JPH07135969 A JP H07135969A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞の前駆細胞及
びその製造方法の提供。ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖
剤及びＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法の提供。 【構成】 ヒト骨髄由来の細胞より得られるＮＫ細胞の
前駆細胞。例えば、抗ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒ
トＣＤ３４抗体陽性であるＮＫ細胞の前駆細胞。抗ヒト
ＣＤ３３抗体陽性でかつ抗ヒトＣＤ３４抗体陽性である
ＮＫ細胞の前駆細胞。ヒト骨髄由来の細胞から抗ヒトＣ
Ｄ３４抗体陽性を指標としてＮＫ細胞の前駆細胞を分離
するＮＫ細胞の前駆細胞の製造方法。インターロイキン
２及び幹細胞増殖因子を含むＮＫ細胞の前駆細胞の分化
増殖剤。インターロイキン３及び幹細胞増殖因子を含む
ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖剤。インターロイキン
２、インターロイキン３及び幹細胞増殖因子を含むＮＫ
細胞の前駆細胞の分化増殖剤。前記分化増殖剤を用いた
ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法。
びその製造方法の提供。ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖
剤及びＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法の提供。 【構成】 ヒト骨髄由来の細胞より得られるＮＫ細胞の
前駆細胞。例えば、抗ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒ
トＣＤ３４抗体陽性であるＮＫ細胞の前駆細胞。抗ヒト
ＣＤ３３抗体陽性でかつ抗ヒトＣＤ３４抗体陽性である
ＮＫ細胞の前駆細胞。ヒト骨髄由来の細胞から抗ヒトＣ
Ｄ３４抗体陽性を指標としてＮＫ細胞の前駆細胞を分離
するＮＫ細胞の前駆細胞の製造方法。インターロイキン
２及び幹細胞増殖因子を含むＮＫ細胞の前駆細胞の分化
増殖剤。インターロイキン３及び幹細胞増殖因子を含む
ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖剤。インターロイキン
２、インターロイキン３及び幹細胞増殖因子を含むＮＫ
細胞の前駆細胞の分化増殖剤。前記分化増殖剤を用いた
ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ナチュラルキラー細胞
（以下、ＮＫ細胞と呼ぶことがある）の前駆細胞、ＮＫ
細胞の前駆細胞の製造方法、ＮＫ細胞の前駆細胞の分化
増殖剤、及びＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法に関す
る。さらに詳しくは、本発明の分化増殖剤及び分化増殖
方法は、インターロイキン２、インターロイキン３及び
幹細胞増殖因子（以下、ＳＣＦと称することがある）を
利用したものである。
（以下、ＮＫ細胞と呼ぶことがある）の前駆細胞、ＮＫ
細胞の前駆細胞の製造方法、ＮＫ細胞の前駆細胞の分化
増殖剤、及びＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法に関す
る。さらに詳しくは、本発明の分化増殖剤及び分化増殖
方法は、インターロイキン２、インターロイキン３及び
幹細胞増殖因子（以下、ＳＣＦと称することがある）を
利用したものである。
【０００２】
【背景技術及び発明が解決しようとする課題】ＮＫ細胞
は免疫担当細胞の一種であり、初期の抗癌作用に重要な
働きを果たすことが知られている。従って、癌患者の抹
消血からＮＫ細胞を分離して増やし、元の患者に戻すこ
とができれば癌治療の有力な方法になり得る。しかる
に、後述するように、ＮＫ細胞等の特定の血液細胞を分
離、増殖することは非常に難しいことも知られている。
は免疫担当細胞の一種であり、初期の抗癌作用に重要な
働きを果たすことが知られている。従って、癌患者の抹
消血からＮＫ細胞を分離して増やし、元の患者に戻すこ
とができれば癌治療の有力な方法になり得る。しかる
に、後述するように、ＮＫ細胞等の特定の血液細胞を分
離、増殖することは非常に難しいことも知られている。
【０００３】特に、ＮＫ細胞はこれまで増殖させる手段
がなく、単に血液から分離することのみ可能であった。
ＮＫ細胞の分離は、適当な蛍光色素を結合させた抗ヒト
ＮＫ１．１１抗体等のＮＫ細胞に特異的な表面抗原に対
する抗体と白血球を混合して氷水中で結合させた後、蛍
光自動細胞分離装置に流し、抗体が結合した細胞を選り
分けることにより行われている〔Shibuya A. et.al. "I
nhibitory effect ofgranurocyte-macrophage colony-s
timulating factor therapy on the generation of nat
ural killer cells" Blood 12(1991)p3124-3247または
星野孝夫 セル・ソーティング−細胞分離の原理と実際
−FACS− 太田和雄監修「フローサイトメトリー」蟹書
房 １４７−１５５参照〕。しかし、この方法により得
られる細胞数は非常に少ない。しかも、血液細胞からＮ
Ｋ細胞のような特定の種類の細胞を取り出すことは、技
術的に高度な熟練を要する。そのため、血液細胞からＮ
Ｋ細胞の分離は、日本国内でも数箇所でしかできないの
が現状である。
がなく、単に血液から分離することのみ可能であった。
ＮＫ細胞の分離は、適当な蛍光色素を結合させた抗ヒト
ＮＫ１．１１抗体等のＮＫ細胞に特異的な表面抗原に対
する抗体と白血球を混合して氷水中で結合させた後、蛍
光自動細胞分離装置に流し、抗体が結合した細胞を選り
分けることにより行われている〔Shibuya A. et.al. "I
nhibitory effect ofgranurocyte-macrophage colony-s
timulating factor therapy on the generation of nat
ural killer cells" Blood 12(1991)p3124-3247または
星野孝夫 セル・ソーティング−細胞分離の原理と実際
−FACS− 太田和雄監修「フローサイトメトリー」蟹書
房 １４７−１５５参照〕。しかし、この方法により得
られる細胞数は非常に少ない。しかも、血液細胞からＮ
Ｋ細胞のような特定の種類の細胞を取り出すことは、技
術的に高度な熟練を要する。そのため、血液細胞からＮ
Ｋ細胞の分離は、日本国内でも数箇所でしかできないの
が現状である。
【０００４】前記のように、従来の技術では、ＮＫ細胞
を分離することはできても、得られる細胞数は限られて
いる。一方、ＮＫ細胞の利用に際しては、分離した細胞
数より多くのＮＫ細胞が必要となる。そのため、何らか
の方法でＮＫ細胞を増殖させる必要がある。未熟な段階
の細胞を分離し、かつ分化増殖させればよいのである
が、ＮＫ細胞がどのような前駆細胞から分化成熟するか
についてはまったく知られていない。同様にＮＫ細胞の
前駆細胞を試験官内で分化増殖させる方法も未知であっ
た。
を分離することはできても、得られる細胞数は限られて
いる。一方、ＮＫ細胞の利用に際しては、分離した細胞
数より多くのＮＫ細胞が必要となる。そのため、何らか
の方法でＮＫ細胞を増殖させる必要がある。未熟な段階
の細胞を分離し、かつ分化増殖させればよいのである
が、ＮＫ細胞がどのような前駆細胞から分化成熟するか
についてはまったく知られていない。同様にＮＫ細胞の
前駆細胞を試験官内で分化増殖させる方法も未知であっ
た。
【０００５】そこで、本発明の目的は、ＮＫ細胞の前駆
細胞及びその製造方法を提供することにある。
細胞及びその製造方法を提供することにある。
【０００６】さらに本発明の目的は、ＮＫ細胞の前駆細
胞の分化増殖剤及びＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法
を提供することにある。
胞の分化増殖剤及びＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖方法
を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、鋭意研究
した結果、骨髄由来の細胞中にＮＫ細胞の前駆細胞が存
在すること、及び該前駆細胞は、インターロイキン２及
びＳＣＦ又はインターロイキン２、インターロイキン３
及びＳＣＦの存在下で分化増殖させることができること
を見出して本発明を完成した。
した結果、骨髄由来の細胞中にＮＫ細胞の前駆細胞が存
在すること、及び該前駆細胞は、インターロイキン２及
びＳＣＦ又はインターロイキン２、インターロイキン３
及びＳＣＦの存在下で分化増殖させることができること
を見出して本発明を完成した。
【０００８】以下、本発明について順次説明する。ＮＫ細胞の前駆細胞 本発明は、ヒト骨髄由来の細胞より得られるＮＫ細胞の
前駆細胞に関する。本発明の前駆細胞の具体例として
は、抗ヒトＣＤ３３抗体陰性（以下、ＣＤ３３-と略記
することがある）でかつ抗ヒトＣＤ３４陽性（以下、Ｃ
Ｄ３４+ と略記することがある）であるＮＫ細胞の前駆
細胞（以下、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ と略記することがあ
る）を挙げることかできる。
前駆細胞に関する。本発明の前駆細胞の具体例として
は、抗ヒトＣＤ３３抗体陰性（以下、ＣＤ３３-と略記
することがある）でかつ抗ヒトＣＤ３４陽性（以下、Ｃ
Ｄ３４+ と略記することがある）であるＮＫ細胞の前駆
細胞（以下、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ と略記することがあ
る）を挙げることかできる。
【０００９】また、別の具体例として、抗ヒトＣＤ３３
抗体陽性（以下、ＣＤ３３+ と略記することがある）で
かつ抗ヒトＣＤ３４抗体陽性（ＣＤ３４+ ）であるＮＫ
細胞の前駆細胞（以下、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ と略記す
ることがある）を挙げることができる。
抗体陽性（以下、ＣＤ３３+ と略記することがある）で
かつ抗ヒトＣＤ３４抗体陽性（ＣＤ３４+ ）であるＮＫ
細胞の前駆細胞（以下、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ と略記す
ることがある）を挙げることができる。
【００１０】ＣＤ３３- ＣＤ３４+ であるＮＫ細胞の前
駆細胞は、図１中の図Ａ（縦軸：ＣＤ３４−ＡＰＣ、横
軸：ＣＤ３４−ＦＩＴＣ）中のａで示される骨髄細胞中
表面抗原としてＣＤ３４を持つ細胞群の中で、同図中ｂ
で示されるＣＤ３３抗原を有しない細胞群である。ま
た、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞
は、図１中の図Ａ中のａで示される骨髄細胞中表面抗原
としてＣＤ３４を持つ細胞群の中で、同図中ｃで示され
るＣＤ３３抗原を有する細胞群である。
駆細胞は、図１中の図Ａ（縦軸：ＣＤ３４−ＡＰＣ、横
軸：ＣＤ３４−ＦＩＴＣ）中のａで示される骨髄細胞中
表面抗原としてＣＤ３４を持つ細胞群の中で、同図中ｂ
で示されるＣＤ３３抗原を有しない細胞群である。ま
た、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞
は、図１中の図Ａ中のａで示される骨髄細胞中表面抗原
としてＣＤ３４を持つ細胞群の中で、同図中ｃで示され
るＣＤ３３抗原を有する細胞群である。
【００１１】尚、図２に示すように、ＣＤ３３- ＣＤ３
４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞は、未熟な段階の細胞で
あり、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞
は、やや分化した細胞であると考えられる（Ema H. et.
al."target cells for granulocyte colony-stimulatin
g factor, Interleukin-3, and Interleukin-5 in diff
erentiation pathways of neutrophils and eosinophil
s" Blood 76(1990)1956-1961 ）。
４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞は、未熟な段階の細胞で
あり、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞
は、やや分化した細胞であると考えられる（Ema H. et.
al."target cells for granulocyte colony-stimulatin
g factor, Interleukin-3, and Interleukin-5 in diff
erentiation pathways of neutrophils and eosinophil
s" Blood 76(1990)1956-1961 ）。
【００１２】本発明のＮＫ細胞の前駆細胞は、ヒト骨髄
由来の細胞から抗ヒトＣＤ３４抗体陽性を指標として分
離することにより製造することができる。特に、ＣＤ３
３-ＣＤ３４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞は、ヒト骨髄
由来の細胞から抗ヒトＣＤ３４抗体陽性を指標として抗
ヒトＣＤ３４抗体陽性の前駆細胞を分離し、さらに分離
された前駆細胞を抗ヒトＣＤ３３抗体陰性を指標として
分離することで製造できる。また、ＣＤ３３+ ＣＤ３４
+ であるＮＫ細胞の前駆細胞は、ヒト骨髄由来の細胞か
ら抗ヒトＣＤ３４抗体陽性を指標として抗ヒトＣＤ３４
抗体陽性の前駆細胞を分離し、さらに分離された前駆細
胞を抗ヒトＣＤ３３抗体陽性を指標として分離すること
で製造できる。
由来の細胞から抗ヒトＣＤ３４抗体陽性を指標として分
離することにより製造することができる。特に、ＣＤ３
３-ＣＤ３４+ であるＮＫ細胞の前駆細胞は、ヒト骨髄
由来の細胞から抗ヒトＣＤ３４抗体陽性を指標として抗
ヒトＣＤ３４抗体陽性の前駆細胞を分離し、さらに分離
された前駆細胞を抗ヒトＣＤ３３抗体陰性を指標として
分離することで製造できる。また、ＣＤ３３+ ＣＤ３４
+ であるＮＫ細胞の前駆細胞は、ヒト骨髄由来の細胞か
ら抗ヒトＣＤ３４抗体陽性を指標として抗ヒトＣＤ３４
抗体陽性の前駆細胞を分離し、さらに分離された前駆細
胞を抗ヒトＣＤ３３抗体陽性を指標として分離すること
で製造できる。
【００１３】これら本発明のＮＫ細胞の前駆細胞は、ヒ
ト骨髄由来の細胞、例えば骨髄細胞又は末梢血を含む胎
盤血、を常法（Shibuya A. et.al. "Inhibitory effect
ofgranurocyte-macrophage colony-stimulating facto
r therapy on the generation of natural killer cell
s" Blood 12(1991)p3124-3247参照）により採取した
後、フローサイトメトリー法（Shibuya A. et.al. "Inh
ibitory effect of granurocyte-macrophage colony-st
imulating factor therapy on the generation of natu
ral killer cells" Blood 12(1991)p3124-3247または星
野孝夫 セル・ソーティング−細胞分離の原理と実際−
FACS− 太田和雄監修「フローサイトメトリー」蟹書房
１４７−１５５参照）、免疫磁気ビーズ細胞分離法
（GaudernackG et.al. "Isolation of pure functional
ly active ＣＤ８＋Ｔ Cells. Positive selection w
ith monoclonal antibodies directly conjugated to m
onosized magnetic microspheres" J. Immunol. meetho
ds 90(1986)179-87参照）等を用いることにより分画す
ることができる。例えばヒト骨髄細胞より得られるＣＤ
３４+ でかつＣＤ３３- である分画（ＣＤ３３- ＣＤ３
４+ ）は、ヒト骨髄細胞を常法により採取した後、フロ
ーサイトメトリー法、免疫磁気ビーズ細胞分離法などを
用いることにより分画することができる。また、同様に
してＣＤ３３+ ＣＤ３４+ である分画もヒト骨髄細胞よ
り得ることができる。尚、一般にＣＤ３３- ＣＤ３４+
細胞群の方が、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞群より試験官
内での増殖能が盛んである。
ト骨髄由来の細胞、例えば骨髄細胞又は末梢血を含む胎
盤血、を常法（Shibuya A. et.al. "Inhibitory effect
ofgranurocyte-macrophage colony-stimulating facto
r therapy on the generation of natural killer cell
s" Blood 12(1991)p3124-3247参照）により採取した
後、フローサイトメトリー法（Shibuya A. et.al. "Inh
ibitory effect of granurocyte-macrophage colony-st
imulating factor therapy on the generation of natu
ral killer cells" Blood 12(1991)p3124-3247または星
野孝夫 セル・ソーティング−細胞分離の原理と実際−
FACS− 太田和雄監修「フローサイトメトリー」蟹書房
１４７−１５５参照）、免疫磁気ビーズ細胞分離法
（GaudernackG et.al. "Isolation of pure functional
ly active ＣＤ８＋Ｔ Cells. Positive selection w
ith monoclonal antibodies directly conjugated to m
onosized magnetic microspheres" J. Immunol. meetho
ds 90(1986)179-87参照）等を用いることにより分画す
ることができる。例えばヒト骨髄細胞より得られるＣＤ
３４+ でかつＣＤ３３- である分画（ＣＤ３３- ＣＤ３
４+ ）は、ヒト骨髄細胞を常法により採取した後、フロ
ーサイトメトリー法、免疫磁気ビーズ細胞分離法などを
用いることにより分画することができる。また、同様に
してＣＤ３３+ ＣＤ３４+ である分画もヒト骨髄細胞よ
り得ることができる。尚、一般にＣＤ３３- ＣＤ３４+
細胞群の方が、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞群より試験官
内での増殖能が盛んである。
【００１４】前駆細胞の分化増殖 また、前記の本発明のＮＫ細胞の前駆細胞は、図２に示
すように、前駆細胞の種類により、インターロイキン３
（ＩＬ−３）、インターロイキン２（ＩＬ−２）および
ＳＣＦを適当な組み合せで、適当量添加した培地にて、
適当な期間培養することにより、ＮＫ細胞に分化増殖さ
せることができる。
すように、前駆細胞の種類により、インターロイキン３
（ＩＬ−３）、インターロイキン２（ＩＬ−２）および
ＳＣＦを適当な組み合せで、適当量添加した培地にて、
適当な期間培養することにより、ＮＫ細胞に分化増殖さ
せることができる。
【００１５】前駆体細胞の分化増殖のための培養は、動
物細胞の一般的な培養条件である、例えば３７℃、５％
炭酸ガス、１００％湿度で行うことができる。培養期間
は、例えば１日から５０日間であるが、分化の度合を測
定しながら適宜決定することができる。
物細胞の一般的な培養条件である、例えば３７℃、５％
炭酸ガス、１００％湿度で行うことができる。培養期間
は、例えば１日から５０日間であるが、分化の度合を測
定しながら適宜決定することができる。
【００１６】分化増殖に用いられるインターロイキン
３、インターロイキン２およびＳＣＦは天然または遺伝
子組み換え技術により製造したものであることができ
る。また、その製造方法や製造に用いられる細胞や宿主
は特に限定されるものではない。さらに、これらのイン
ターロイキン３、インターロイキン２およびＳＣＦは、
これらの活性をもつ天然または遺伝子工学により製造さ
れる変異体も含まれる。
３、インターロイキン２およびＳＣＦは天然または遺伝
子組み換え技術により製造したものであることができ
る。また、その製造方法や製造に用いられる細胞や宿主
は特に限定されるものではない。さらに、これらのイン
ターロイキン３、インターロイキン２およびＳＣＦは、
これらの活性をもつ天然または遺伝子工学により製造さ
れる変異体も含まれる。
【００１７】分化増殖には、一般的に骨髄由来細胞を培
養するために用いられる培地をそのまま用いることがで
きる。例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Morton H.J.In
virto 6 (1970) 89 Moore G.E. et.al. J.Natl.Cancer
Insitute 36(1966)519（大日本製薬 RPMI1640 製品番号
110-601-20 参照）〕、ＤＭＥＭ培地、完全培地等が挙
げられる。これらの培地に含まれるインターロイキン
３、インターロイキン２およびＳＣＦの濃度は、例え
ば、インターロイキン３が５〜５００Ｕ／ｍｌの範囲で
あり、インターロイキン２が５０〜５０００Ｕ／ｍｌの
範囲であり、ＳＣＦが５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲とす
ることが適当である。
養するために用いられる培地をそのまま用いることがで
きる。例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地〔Morton H.J.In
virto 6 (1970) 89 Moore G.E. et.al. J.Natl.Cancer
Insitute 36(1966)519（大日本製薬 RPMI1640 製品番号
110-601-20 参照）〕、ＤＭＥＭ培地、完全培地等が挙
げられる。これらの培地に含まれるインターロイキン
３、インターロイキン２およびＳＣＦの濃度は、例え
ば、インターロイキン３が５〜５００Ｕ／ｍｌの範囲で
あり、インターロイキン２が５０〜５０００Ｕ／ｍｌの
範囲であり、ＳＣＦが５〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲とす
ることが適当である。
【００１８】より具体的には、例えばＣＤ３３+ ＣＤ３
４+ 分画細胞においては、インターロイキン２およびＳ
ＣＦを添加した培地、例えば１０％牛胎児血清、５００
Ｕ／ｍｌインターロイキン２および５０ｍｇ／ｍｌのＳ
ＣＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で、３７℃５％炭酸
ガス１００％湿度の条件で２０〜４０日間培養すること
により、抗ＣＤ５６抗体陽性（ＣＤ５６+ ）で特徴づけ
られるＮＫ細胞が得られる。
４+ 分画細胞においては、インターロイキン２およびＳ
ＣＦを添加した培地、例えば１０％牛胎児血清、５００
Ｕ／ｍｌインターロイキン２および５０ｍｇ／ｍｌのＳ
ＣＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で、３７℃５％炭酸
ガス１００％湿度の条件で２０〜４０日間培養すること
により、抗ＣＤ５６抗体陽性（ＣＤ５６+ ）で特徴づけ
られるＮＫ細胞が得られる。
【００１９】また、例えばＣＤ３３- ＣＤ３４+ 分画細
胞においては、インターロイキン３、インターロイキン
２およびＳＣＦを含む培地、例えば１０％牛胎児血清、
５００Ｕ／ｍｌインターロイキン３、５００Ｕ／ｍｌイ
ンターロイキン２、および５０ｍｇ／ｍｌのＳＣＦを含
むＲＰＭＩ１６４０培地内で、３７℃５％炭酸ガス１０
０％湿度の条件で２０〜４０日間培養することにより、
抗ＣＤ５６抗体陽性で特徴づけられるＮＫ細胞が得られ
る。または、インターロイキン３およびＳＣＦを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地内で同様の条件で５〜１０日間培養
した後、さらにインターロイキン２、インターロイキン
３およびＳＣＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で同様の
条件で１５〜３０日間培養することによっても、同様に
ＮＫ細胞を得ることができる。
胞においては、インターロイキン３、インターロイキン
２およびＳＣＦを含む培地、例えば１０％牛胎児血清、
５００Ｕ／ｍｌインターロイキン３、５００Ｕ／ｍｌイ
ンターロイキン２、および５０ｍｇ／ｍｌのＳＣＦを含
むＲＰＭＩ１６４０培地内で、３７℃５％炭酸ガス１０
０％湿度の条件で２０〜４０日間培養することにより、
抗ＣＤ５６抗体陽性で特徴づけられるＮＫ細胞が得られ
る。または、インターロイキン３およびＳＣＦを含むＲ
ＰＭＩ１６４０培地内で同様の条件で５〜１０日間培養
した後、さらにインターロイキン２、インターロイキン
３およびＳＣＦを含むＲＰＭＩ１６４０培地内で同様の
条件で１５〜３０日間培養することによっても、同様に
ＮＫ細胞を得ることができる。
【００２０】分化増殖剤 さらに本発明は、ナチュラルキラー細胞の前駆細胞の分
化増殖剤に関し、インターロイキン３、インターロイキ
ン２およびＳＣＦから選ばれた少なくとも１つを含む。
より具体的には、第１の態様は、インターロイキン２及
び幹細胞増殖因子を含むナチュラルキラー細胞の前駆細
胞の分化増殖剤である。この分化増殖剤は、ナチュラル
キラー細胞の前駆細胞が、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ である
前駆細胞又はＣＤ３３+ ＣＤ３４+ である前駆細胞であ
る場合に、有用である。
化増殖剤に関し、インターロイキン３、インターロイキ
ン２およびＳＣＦから選ばれた少なくとも１つを含む。
より具体的には、第１の態様は、インターロイキン２及
び幹細胞増殖因子を含むナチュラルキラー細胞の前駆細
胞の分化増殖剤である。この分化増殖剤は、ナチュラル
キラー細胞の前駆細胞が、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ である
前駆細胞又はＣＤ３３+ ＣＤ３４+ である前駆細胞であ
る場合に、有用である。
【００２１】第２の態様は、インターロイキン３及び幹
細胞増殖因子を含むナチュラルキラー細胞の前駆細胞の
分化増殖剤である。この分化増殖剤は、ナチュラルキラ
ー細胞の前駆細胞が、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ である前駆
細胞である場合に有用である。
細胞増殖因子を含むナチュラルキラー細胞の前駆細胞の
分化増殖剤である。この分化増殖剤は、ナチュラルキラ
ー細胞の前駆細胞が、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ である前駆
細胞である場合に有用である。
【００２２】第３の態様は、インターロイキン２、イン
ターロイキン３及び幹細胞増殖因子を含むナチュラルキ
ラー細胞の前駆細胞の分化増殖剤である。この分化増殖
剤は、ナチュラルキラー細胞の前駆細胞がＣＤ３３- Ｃ
Ｄ３４+ である前駆細胞である場合に有用である。
ターロイキン３及び幹細胞増殖因子を含むナチュラルキ
ラー細胞の前駆細胞の分化増殖剤である。この分化増殖
剤は、ナチュラルキラー細胞の前駆細胞がＣＤ３３- Ｃ
Ｄ３４+ である前駆細胞である場合に有用である。
【００２３】本発明の分化増殖剤は、例えば、前述のよ
うな培養細胞の培地に添加して利用することができる。
本発明の分化増殖剤の培地への添加量は、ナチュラルキ
ラー細胞の前駆細胞の種類や培養条件等により異なる
が、例えばインターロイキン３は５〜５００Ｕ／ｍｌ、
ＳＣＦは５〜５００ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン２は
５０〜５０００Ｕ／ｍｌの範囲とすることが適当であ
る。
うな培養細胞の培地に添加して利用することができる。
本発明の分化増殖剤の培地への添加量は、ナチュラルキ
ラー細胞の前駆細胞の種類や培養条件等により異なる
が、例えばインターロイキン３は５〜５００Ｕ／ｍｌ、
ＳＣＦは５〜５００ｎｇ／ｍｌ、インターロイキン２は
５０〜５０００Ｕ／ｍｌの範囲とすることが適当であ
る。
【００２４】さらに、また、本発明の分化増殖剤は、ヒ
ト等のほ乳動物に直接非経口的（例えば静注）および経
口的に投与することにより、ほ乳動物のＮＫ細胞の分化
増殖を促進させることもできる。本発明の分化増殖剤の
投与量は、患者の症状、体重等を考慮して決められる
が、例えば１日あたり、インターロイキン３は５〜５０
０ｋＵ、ＳＣＦは５〜５００μｇ、インターロイキン２
は５０〜５０００ｋＵの投与量とし、例えば１〜３日に
分けて投与することができる。
ト等のほ乳動物に直接非経口的（例えば静注）および経
口的に投与することにより、ほ乳動物のＮＫ細胞の分化
増殖を促進させることもできる。本発明の分化増殖剤の
投与量は、患者の症状、体重等を考慮して決められる
が、例えば１日あたり、インターロイキン３は５〜５０
０ｋＵ、ＳＣＦは５〜５００μｇ、インターロイキン２
は５０〜５０００ｋＵの投与量とし、例えば１〜３日に
分けて投与することができる。
【００２５】尚、本発明の分化増殖剤は、インターロイ
キン２、インターロイキン３及び／又は幹細胞増殖因子
以外に、必要により、種々の成分を含むことができる。
例えば、有効成分であるインターロイキン２、インター
ロイキン３及び／又は幹細胞増殖因子に対する賦形剤
（例えば、生理食塩水）、安定化剤（例えば、アルブミ
ン、糖類）等をさらに含むことができる。
キン２、インターロイキン３及び／又は幹細胞増殖因子
以外に、必要により、種々の成分を含むことができる。
例えば、有効成分であるインターロイキン２、インター
ロイキン３及び／又は幹細胞増殖因子に対する賦形剤
（例えば、生理食塩水）、安定化剤（例えば、アルブミ
ン、糖類）等をさらに含むことができる。
【００２６】
【実施例】以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。 実施例１ ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞の分画 健康なヒトの胸骨から骨髄（ＢＭ）４ｍｌを採取し、即
座にヘパリン含有ＨＢＳＳ（Hank's balanced salt sol
ution; Hanks J.H. et.al. Proc.Soc.Exp.Biol.Med.71
(1949)196-200（大日本製薬 ＨＢＳ 製品番号 17-10
1））１５ｍｌ中に希釈した。得られた細胞懸濁液を３
％牛胎児血清および０．０２％アジ化ナトリウム加リン
酸緩衛生理食塩水（染色培地；以下ＳＭと記す）で約３
倍に希釈したのち３ｍｌのフィコールコンレイをあらか
じめ入れた１５ｍｌ遠心管に重層する。これを１８℃１
５００回転３０分遠心分離して単核球の層を分離し、Ｂ
Ｍ単核細胞（ＭＮＣ）を得た。
する。 実施例１ ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞の分画 健康なヒトの胸骨から骨髄（ＢＭ）４ｍｌを採取し、即
座にヘパリン含有ＨＢＳＳ（Hank's balanced salt sol
ution; Hanks J.H. et.al. Proc.Soc.Exp.Biol.Med.71
(1949)196-200（大日本製薬 ＨＢＳ 製品番号 17-10
1））１５ｍｌ中に希釈した。得られた細胞懸濁液を３
％牛胎児血清および０．０２％アジ化ナトリウム加リン
酸緩衛生理食塩水（染色培地；以下ＳＭと記す）で約３
倍に希釈したのち３ｍｌのフィコールコンレイをあらか
じめ入れた１５ｍｌ遠心管に重層する。これを１８℃１
５００回転３０分遠心分離して単核球の層を分離し、Ｂ
Ｍ単核細胞（ＭＮＣ）を得た。
【００２７】このようにして得られたＢＭ単核細胞は、
アロフィコサイアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉ
ｎ；ＡＰＣ）結合抗ヒトＣＤ３４抗体（４Ａ１（１
６）；ＩｇＧ１）、リネージマーカー（すでにＮＫ細胞
に分化した細胞が持つ表面抗原）としてフィコエリスリ
ン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）を結合したＣ
Ｄ３（Ｌｅｕ４；ＩｇＧ１）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ１１
ｃ；ＩｇＧ１）及びＣＤ５６（ＮＫＨ−１；ＩｇＧ
１）、並びにフルオレッセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ
ｎ；ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＣＤ３３抗体（Ｍｙ９；Ｉｇ
Ｇ２ｂ）と４℃で３０分間インキュベートし、次いで２
回洗浄した。
アロフィコサイアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉ
ｎ；ＡＰＣ）結合抗ヒトＣＤ３４抗体（４Ａ１（１
６）；ＩｇＧ１）、リネージマーカー（すでにＮＫ細胞
に分化した細胞が持つ表面抗原）としてフィコエリスリ
ン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）を結合したＣ
Ｄ３（Ｌｅｕ４；ＩｇＧ１）、ＣＤ１６（Ｌｅｕ１１
ｃ；ＩｇＧ１）及びＣＤ５６（ＮＫＨ−１；ＩｇＧ
１）、並びにフルオレッセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉ
ｎ；ＦＩＴＣ）結合抗ヒトＣＤ３３抗体（Ｍｙ９；Ｉｇ
Ｇ２ｂ）と４℃で３０分間インキュベートし、次いで２
回洗浄した。
【００２８】しかる後、これらの細胞の分類（セルソー
ト）を４８８ｎｍアルゴンレーザーと５９９ｎｍ色素レ
ーザー付き蛍光自動細胞分離装置（ＦＡＣＳｔａｒPLUS
（ベックマンディキンソン））を用いて行った。ＣＤ３
４+ 細胞のＣＤ３３分画については、ソートゲートはＡ
−ａ（全ＣＤ３４+ 細胞）、Ａ−ｂ（ネガティブ３０
％）、（ブライテスト５０％）であった。パーセンテー
ジは３回の独立した実験における結果から得た概算値で
ある。このようにして、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏ
ｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）陰性、フルオレッセイン（Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＦＩＴＣ）陰性、アロフィコサ
イアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎ；ＡＰＣ）陽性
の細胞集団（Ｌｉｎ- （＝ＣＤ３- 、ＣＤ１６- 、ＣＤ
５６- ）ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 分画）を得た。
ト）を４８８ｎｍアルゴンレーザーと５９９ｎｍ色素レ
ーザー付き蛍光自動細胞分離装置（ＦＡＣＳｔａｒPLUS
（ベックマンディキンソン））を用いて行った。ＣＤ３
４+ 細胞のＣＤ３３分画については、ソートゲートはＡ
−ａ（全ＣＤ３４+ 細胞）、Ａ−ｂ（ネガティブ３０
％）、（ブライテスト５０％）であった。パーセンテー
ジは３回の独立した実験における結果から得た概算値で
ある。このようにして、フィコエリスリン（ｐｈｙｃｏ
ｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）陰性、フルオレッセイン（Ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＦＩＴＣ）陰性、アロフィコサ
イアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎ；ＡＰＣ）陽性
の細胞集団（Ｌｉｎ- （＝ＣＤ３- 、ＣＤ１６- 、ＣＤ
５６- ）ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 分画）を得た。
【００２９】実施例２ ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞の分
化増殖 ５００Ｕ／ｍｌのリコビナントヒトＩＬ−２、５０ｎｇ
／ｍｌのリコビナントヒトＳＣＦを含む完全培地２００
μｌを９６穴丸底マイクロプレートに入れた。５００個
の実施例１で得たＬｉｎ- ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 分画細
胞を、各ウエルに添加し、３７℃５％炭酸ガス１００％
湿度の条件下で２８日間培養し、出現したＮＫ細胞の表
面抗原であるＣＤ５６陽性細胞の数を計測した（実験
３）。
化増殖 ５００Ｕ／ｍｌのリコビナントヒトＩＬ−２、５０ｎｇ
／ｍｌのリコビナントヒトＳＣＦを含む完全培地２００
μｌを９６穴丸底マイクロプレートに入れた。５００個
の実施例１で得たＬｉｎ- ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 分画細
胞を、各ウエルに添加し、３７℃５％炭酸ガス１００％
湿度の条件下で２８日間培養し、出現したＮＫ細胞の表
面抗原であるＣＤ５６陽性細胞の数を計測した（実験
３）。
【００３０】比較のために、ＩＬ−２を含まない（実験
２）か、または培養期間の一部にのみ添加した場合（実
験６及び７）、及びＳＣＦを含まない（実験１）か、ま
たは培養期間の一部にのみ添加した場合（実験４及び
５）についても同様に培養を行い、ＣＤ５６陽性細胞の
数を計測した。結果を表１に示す。
２）か、または培養期間の一部にのみ添加した場合（実
験６及び７）、及びＳＣＦを含まない（実験１）か、ま
たは培養期間の一部にのみ添加した場合（実験４及び
５）についても同様に培養を行い、ＣＤ５６陽性細胞の
数を計測した。結果を表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】表１に示すように、ＩＬ−２及びＳＣＦの
いずれか一方のみを含む培地中ではＣＤ５６陽性細胞は
得られず（実験１及び２）、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞
の分化増殖には、ＩＬ−２及びＳＣＦの両者が必要であ
ることが分かる（実験３）。さらに、ＳＣＦは、培養開
始から一定時期に存在することが、ＣＤ３３+ ＣＤ３４
+ 細胞の分化増殖に必要であり、培養の後期には必ずし
もなくても分化増殖は可能であることが分かる（実験４
及び５）。また、ＩＬ−２は培養開始から一定期間存在
しなくても、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖は進
行し、むしろ培養の後期には存在しないと分化増殖が進
行しにくいことが分かる（実験６及び７）。
いずれか一方のみを含む培地中ではＣＤ５６陽性細胞は
得られず（実験１及び２）、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞
の分化増殖には、ＩＬ−２及びＳＣＦの両者が必要であ
ることが分かる（実験３）。さらに、ＳＣＦは、培養開
始から一定時期に存在することが、ＣＤ３３+ ＣＤ３４
+ 細胞の分化増殖に必要であり、培養の後期には必ずし
もなくても分化増殖は可能であることが分かる（実験４
及び５）。また、ＩＬ−２は培養開始から一定期間存在
しなくても、ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖は進
行し、むしろ培養の後期には存在しないと分化増殖が進
行しにくいことが分かる（実験６及び７）。
【００３３】実施例３ ＮＫ細胞の活性検定 実施例２で得られたＣＤ５６陽性細胞がＮＫ細胞として
の性質を有することを以下の方法により検定した。
の性質を有することを以下の方法により検定した。
【００３４】ＮＫ様細胞の活性について、Ｋ５６２細胞
をターゲットとするＮＫ活性測定法で検定した。即ち、
Ｋ５６２細胞を５％ＦＣＳ含むＲＰＭＩ１６４０倍地に
懸濁した。Ｋ５６２ターゲット細胞を３７℃で２時間か
けて５０μＣｉの51Ｃｒでラベルし、使用前に充分洗浄
した。１０μｌの培地中に懸濁したターゲット細胞（５
×１０3 ）と１０μｌの培地中に懸濁した前記ＣＤ５６
陽性細胞とを、種々の比率（２０：１、１０：１、５：
１または２．５：１）でマイクロタイターウエル中で混
合した。３７℃で４時間培養した後、上澄み液を回収
し、ガンマカウンタで放射能を計測した。溶解されたタ
ーゲット細胞により放出された51Ｃｒの量から細胞毒性
を決定した。51Ｃｒの放出量は、以下の式：１００×
（〔実験ウエル中のｃｐｍ〕−〔ターゲット細胞単独の
ウエル中のｃｐｍ〕）／（ターゲット細胞に含ませたｃ
ｐｍ）から求めた。
をターゲットとするＮＫ活性測定法で検定した。即ち、
Ｋ５６２細胞を５％ＦＣＳ含むＲＰＭＩ１６４０倍地に
懸濁した。Ｋ５６２ターゲット細胞を３７℃で２時間か
けて５０μＣｉの51Ｃｒでラベルし、使用前に充分洗浄
した。１０μｌの培地中に懸濁したターゲット細胞（５
×１０3 ）と１０μｌの培地中に懸濁した前記ＣＤ５６
陽性細胞とを、種々の比率（２０：１、１０：１、５：
１または２．５：１）でマイクロタイターウエル中で混
合した。３７℃で４時間培養した後、上澄み液を回収
し、ガンマカウンタで放射能を計測した。溶解されたタ
ーゲット細胞により放出された51Ｃｒの量から細胞毒性
を決定した。51Ｃｒの放出量は、以下の式：１００×
（〔実験ウエル中のｃｐｍ〕−〔ターゲット細胞単独の
ウエル中のｃｐｍ〕）／（ターゲット細胞に含ませたｃ
ｐｍ）から求めた。
【００３５】１分解単位（ＬＵ）は、５×１０3 個のタ
ーゲット細胞から１５％の51Ｃｒ放出が起こるＮＫ活性
と定義した。１０5 細胞当たりのＬＵは、細胞溶解パー
セントの回帰曲線から各サンプルついて決定した。ウエ
ル当たりのＮＫ活性は、以下のように計算した。ＬＵ／
１０5 細胞×（１／１０5 ）×全生存細胞カウント／ウ
エル。ＮＫ活性の分析は、分類細胞の開始培養後１４、
２１及び２８日に行った。ＮＫ活性の結果を図３に示
す。図３から、実施例２の実験３で得た細胞は、相応の
ＮＫ活性を示すことが分かる。
ーゲット細胞から１５％の51Ｃｒ放出が起こるＮＫ活性
と定義した。１０5 細胞当たりのＬＵは、細胞溶解パー
セントの回帰曲線から各サンプルついて決定した。ウエ
ル当たりのＮＫ活性は、以下のように計算した。ＬＵ／
１０5 細胞×（１／１０5 ）×全生存細胞カウント／ウ
エル。ＮＫ活性の分析は、分類細胞の開始培養後１４、
２１及び２８日に行った。ＮＫ活性の結果を図３に示
す。図３から、実施例２の実験３で得た細胞は、相応の
ＮＫ活性を示すことが分かる。
【００３６】実施例４ ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分
画 実施例１と同様にしてフィコエリスリン陰性、フルオレ
ッセイン陰性及びアロフィコサイアニン陽性の細胞集団
（Ｌｉｎ- ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 分画）を得た。
画 実施例１と同様にしてフィコエリスリン陰性、フルオレ
ッセイン陰性及びアロフィコサイアニン陽性の細胞集団
（Ｌｉｎ- ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 分画）を得た。
【００３７】実施例５ ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分
化増殖 ５００Ｕ／ｍｌのリコビナントヒトＩＬ−２、１００Ｕ
／ｍｌのリコビナントヒトＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍｌの
リコンビナントヒトＳＣＦを含む完全培地２００μｌを
９６穴丸底マイクロプレートに入れた。５００個の実施
例４で得たＬｉｎ- ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 分画細胞を、
各ウエルに添加し、３７℃５％炭酸ガス１００％湿度の
条件下で２８日間培養し、出現したＮＫ細胞の表面抗原
であるＣＤ５６陽性細胞の数を計測した（実験６）。結
果を表２に示す。
化増殖 ５００Ｕ／ｍｌのリコビナントヒトＩＬ−２、１００Ｕ
／ｍｌのリコビナントヒトＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍｌの
リコンビナントヒトＳＣＦを含む完全培地２００μｌを
９６穴丸底マイクロプレートに入れた。５００個の実施
例４で得たＬｉｎ- ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 分画細胞を、
各ウエルに添加し、３７℃５％炭酸ガス１００％湿度の
条件下で２８日間培養し、出現したＮＫ細胞の表面抗原
であるＣＤ５６陽性細胞の数を計測した（実験６）。結
果を表２に示す。
【００３８】比較のために、ＩＬ−２を含まない（実験
２及び３）か、または培養期間の一部にのみ添加した場
合（実験７）、ＩＬ−３を含まない（実験１、２及び
４）か、または培養期間の一部にのみ添加した場合（実
験６、７及び８）、及びＳＣＦを含まない（実験１、
３、５及び８）か、または培養期間の一部にのみ添加し
た場合（実験７）についても同様に培養を行い、ＣＤ５
６陽性細胞の数を計測した。結果を表２に示す。
２及び３）か、または培養期間の一部にのみ添加した場
合（実験７）、ＩＬ−３を含まない（実験１、２及び
４）か、または培養期間の一部にのみ添加した場合（実
験６、７及び８）、及びＳＣＦを含まない（実験１、
３、５及び８）か、または培養期間の一部にのみ添加し
た場合（実験７）についても同様に培養を行い、ＣＤ５
６陽性細胞の数を計測した。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】表２に示すように、ＩＬ−２、ＩＬ−３及
びＳＣＦのいずれか１つ又は２つのみを含む培地中では
ＣＤ５６陽性細胞は得られず（実験１〜５及び８）、Ｃ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖には、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−３及びＳＣＦの３つが必要であることが分かる（実
験６）。さらに、ＩＬ−３は、培養開始から一定時期に
存在することが、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖
に必要であり、培養の後期には必ずしもなくても分化増
殖は可能であることが分かる（実験６及び７）。また、
ＳＣＦは、培養開始から一定時期に存在することが、Ｃ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖に必要であり、培養
の後期には必ずしもなくても分化増殖は可能であること
が分かる（実験６及び７）。
びＳＣＦのいずれか１つ又は２つのみを含む培地中では
ＣＤ５６陽性細胞は得られず（実験１〜５及び８）、Ｃ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖には、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−３及びＳＣＦの３つが必要であることが分かる（実
験６）。さらに、ＩＬ−３は、培養開始から一定時期に
存在することが、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖
に必要であり、培養の後期には必ずしもなくても分化増
殖は可能であることが分かる（実験６及び７）。また、
ＳＣＦは、培養開始から一定時期に存在することが、Ｃ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 細胞の分化増殖に必要であり、培養
の後期には必ずしもなくても分化増殖は可能であること
が分かる（実験６及び７）。
【００４１】実施例６ 形態的特性の検討 実施例１で得られたＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞（２００
μｌの培地中、０．５〜１×１０3 個）を８００ｒｐｍ
で３分間顕微鏡スライド上で遠心分離した。遠心分離
後、即座に風乾し、ライト染色した。ライト染色した細
胞を撮影した図４の写真に示す。実施例４で得られたＣ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 細胞も上記と同様にライト染色した
細胞を撮影して図５の写真に示す。図４の写真から、Ｃ
Ｄ３３+ ＣＤ３４+ 細胞はサイズが大きく細胞質に細か
い顆粒を有する。一方、図５の写真からＣＤ３３- ＣＤ
３４+ 細胞は小から中サイズの好塩基性細胞質（basoph
iliccytoplasm) を伴うリンパ芽球様細胞であった。こ
れらのことは、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞は、ＣＤ３３
+ ＣＤ３４+ 細胞より原始的であることを示唆する。
μｌの培地中、０．５〜１×１０3 個）を８００ｒｐｍ
で３分間顕微鏡スライド上で遠心分離した。遠心分離
後、即座に風乾し、ライト染色した。ライト染色した細
胞を撮影した図４の写真に示す。実施例４で得られたＣ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 細胞も上記と同様にライト染色した
細胞を撮影して図５の写真に示す。図４の写真から、Ｃ
Ｄ３３+ ＣＤ３４+ 細胞はサイズが大きく細胞質に細か
い顆粒を有する。一方、図５の写真からＣＤ３３- ＣＤ
３４+ 細胞は小から中サイズの好塩基性細胞質（basoph
iliccytoplasm) を伴うリンパ芽球様細胞であった。こ
れらのことは、ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞は、ＣＤ３３
+ ＣＤ３４+ 細胞より原始的であることを示唆する。
【００４２】実施例２の実験３で得た細胞（０．５〜１
×１０5 個）についても、上記と同様にしてライト染色
した細胞を撮影し、図６の写真に示す。図６の写真に示
す細胞は、大型で顆粒を有するリンパ球様を示した。こ
の形態は、ＮＫ細胞の形態と類似している。尚、これ以
外に顆粒球、貧食大細胞、肥満細胞も共存していた。
×１０5 個）についても、上記と同様にしてライト染色
した細胞を撮影し、図６の写真に示す。図６の写真に示
す細胞は、大型で顆粒を有するリンパ球様を示した。こ
の形態は、ＮＫ細胞の形態と類似している。尚、これ以
外に顆粒球、貧食大細胞、肥満細胞も共存していた。
【００４３】
【発明の効果】本発明により、ＮＫ細胞の前駆細胞及び
その製造方法を提供することができる。さらに本発明に
より、ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖剤及びＮＫ細胞の
前駆細胞の分化増殖方法を提供することができ、多数の
ＮＫ細胞を得ることが可能になった。また本発明の方法
を用いることにより、癌患者からＮＫ前駆細胞を分離し
て試験官内で増殖させてのち、患者体内に移植して癌の
治療を行う方法の開発を可能にした。
その製造方法を提供することができる。さらに本発明に
より、ＮＫ細胞の前駆細胞の分化増殖剤及びＮＫ細胞の
前駆細胞の分化増殖方法を提供することができ、多数の
ＮＫ細胞を得ることが可能になった。また本発明の方法
を用いることにより、癌患者からＮＫ前駆細胞を分離し
て試験官内で増殖させてのち、患者体内に移植して癌の
治療を行う方法の開発を可能にした。
【図１】実施例で行ったセルソート（細胞分類）結果を
示す。Ｌｉｎ- の分画（ａ）の内、図Ａ中の（ｂ）がＣ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 分画であり、（ｃ）がＣＤ３３+ Ｃ
Ｄ３４+ 分画である。
示す。Ｌｉｎ- の分画（ａ）の内、図Ａ中の（ｂ）がＣ
Ｄ３３- ＣＤ３４+ 分画であり、（ｃ）がＣＤ３３+ Ｃ
Ｄ３４+ 分画である。
【図２】本発明のＮＫ細胞の前駆細胞（ＣＤ３３- ＣＤ
３４+ 及びＣＤ３３+ ＣＤ３４+ ）のＮＫ細胞（ＣＤ５
６+ ）への分化のステップを示すスキームである。
３４+ 及びＣＤ３３+ ＣＤ３４+ ）のＮＫ細胞（ＣＤ５
６+ ）への分化のステップを示すスキームである。
【図３】ＮＫ活性の検定結果を示す。図Ａはカウントさ
れた全細胞数、図ＢはＣＤ５６+ の細胞数、図ＣはＮＫ
活性をそれぞれ示す。尚、実線は、ＣＤ３３+ ＣＤ３４
+ Ｌｉｎ- の分画についての結果であり、破線は、ＣＤ
３３- ＣＤ３４+ Ｌｉｎ - の分画についての結果であ
る。
れた全細胞数、図ＢはＣＤ５６+ の細胞数、図ＣはＮＫ
活性をそれぞれ示す。尚、実線は、ＣＤ３３+ ＣＤ３４
+ Ｌｉｎ- の分画についての結果であり、破線は、ＣＤ
３３- ＣＤ３４+ Ｌｉｎ - の分画についての結果であ
る。
【図４】ＣＤ３３+ ＣＤ３４+ 細胞をライト染色した細
胞（生物）の形態を示す図面に代わる写真である。
胞（生物）の形態を示す図面に代わる写真である。
【図５】ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞をライト染色した細
胞（生物）の形態を示す図面に代わる写真である。
胞（生物）の形態を示す図面に代わる写真である。
【図６】ＣＤ３３- ＣＤ３４+ 細胞を分化増殖させた細
胞をライト染色した細胞（生物）の形態を示す図面に代
わる写真である。
胞をライト染色した細胞（生物）の形態を示す図面に代
わる写真である。
Claims (15)
- 【請求項１】 ヒト骨髄由来の細胞より得られるナチュ
ラルキラー細胞の前駆細胞。 - 【請求項２】 抗ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒトＣ
Ｄ３４抗体陽性である請求項１記載の前駆細胞。 - 【請求項３】 抗ヒトＣＤ３３抗体陽性でかつ抗ヒトＣ
Ｄ３４抗体陽性である請求項１記載の前駆細胞。 - 【請求項４】 ヒト骨髄由来の細胞から抗ヒトＣＤ３４
抗体陽性を指標としてナチュラルキラー細胞の前駆細胞
を分離するナチュラルキラー細胞の前駆細胞の製造方
法。 - 【請求項５】 ヒト骨髄由来の細胞から抗ヒトＣＤ３３
抗体陰性を指標としてナチュラルキラー細胞の前駆細胞
を分離する請求項４記載の製造方法。 - 【請求項６】 ヒト骨髄由来の細胞から抗ヒトＣＤ３３
抗体陽性を指標としてナチュラルキラー細胞の前駆細胞
を分離する請求項４記載の製造方法。 - 【請求項７】 インターロイキン２及び幹細胞増殖因子
を含むナチュラルキラー細胞の前駆細胞の分化増殖剤。 - 【請求項８】 ナチュラルキラー細胞の前駆細胞が、抗
ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒトＣＤ３４抗体陽性で
ある前駆細胞又は抗ヒトＣＤ３３抗体陽性でかつ抗ヒト
ＣＤ３４抗体陽性である前駆細胞である請求項７記載の
分化増殖剤。 - 【請求項９】 インターロイキン３及び幹細胞増殖因子
を含むナチュラルキラー細胞の前駆細胞の分化増殖剤。 - 【請求項１０】 ナチュラルキラー細胞の前駆細胞が抗
ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒトＣＤ３４抗体陽性で
ある前駆細胞である請求項９記載の分化増殖剤。 - 【請求項１１】 インターロイキン２、インターロイキ
ン３及び幹細胞増殖因子を含むナチュラルキラー細胞の
前駆細胞の分化増殖剤。殖剤。 - 【請求項１２】 ナチュラルキラー細胞の前駆細胞が抗
ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒトＣＤ３４抗体陽性で
ある前駆細胞である請求項１１記載の分化増殖剤。 - 【請求項１３】 抗ヒトＣＤ３３抗体陽性でかつ抗ヒト
ＣＤ３４抗体陽性であるナチュラルキラー細胞の前駆細
胞を、インターロイキン２及び幹細胞増殖因子を含む培
地中で培養することを特徴とするナチュラルキラー細胞
の前駆細胞を分化増殖させる方法。 - 【請求項１４】 抗ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒト
ＣＤ３４抗体陽性であるナチュラルキラー細胞の前駆細
胞を、インターロイキン２、インターロイキン３及び幹
細胞増殖因子を含む培地中で培養することを特徴とする
ナチュラルキラー細胞の前駆細胞を分化増殖させる方
法。 - 【請求項１５】 抗ヒトＣＤ３３抗体陰性でかつ抗ヒト
ＣＤ３４抗体陽性であるナチュラルキラー細胞の前駆細
胞を、インターロイキン３及び幹細胞増殖因子を含む培
地中で培養し、次いでインターロイキン２、インターロ
イキン３及び幹細胞増殖因子を含む培地中で培養するこ
とを特徴とするナチュラルキラー細胞の前駆細胞を分化
増殖させる方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5312573A JPH07135969A (ja) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | ナチュラルキラー細胞の前駆細胞及びその分化増殖法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5312573A JPH07135969A (ja) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | ナチュラルキラー細胞の前駆細胞及びその分化増殖法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07135969A true JPH07135969A (ja) | 1995-05-30 |
Family
ID=18030844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5312573A Pending JPH07135969A (ja) | 1993-11-18 | 1993-11-18 | ナチュラルキラー細胞の前駆細胞及びその分化増殖法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07135969A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007526246A (ja) * | 2004-01-20 | 2007-09-13 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 幹細胞からナチュラルキラー細胞（ｎｋ細胞）への分化調節用遺伝子を有効成分として含む分化調節剤 |
| JP2019519486A (ja) * | 2016-05-07 | 2019-07-11 | セルラリティ インコーポレイテッド | ナチュラルキラー細胞を使用して急性骨髄性白血病および多発性骨髄腫を処置する方法 |
-
1993
- 1993-11-18 JP JP5312573A patent/JPH07135969A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007526246A (ja) * | 2004-01-20 | 2007-09-13 | コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 幹細胞からナチュラルキラー細胞（ｎｋ細胞）への分化調節用遺伝子を有効成分として含む分化調節剤 |
| JP2019519486A (ja) * | 2016-05-07 | 2019-07-11 | セルラリティ インコーポレイテッド | ナチュラルキラー細胞を使用して急性骨髄性白血病および多発性骨髄腫を処置する方法 |
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