CN109837323A - 一种乳酸菌的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物筛选技术领域，具体为一种乳酸菌的筛选方法。本发明方法包括：先将样品进行研磨处理，然后进行扩大培养；之后用倾注法使其在培养基上进行生长以便分出乳酸菌单菌落；将单菌落点菌接于有指示菌的MRS平板上，并用MRS软琼脂进行覆盖；挑选出有抑菌效果的菌株进行单菌落纯化及保存；最后再进行验证。用该方法分离筛选出来的菌株不仅可以减少前期其它杂菌的影响，同时也可以排除无抑菌效果的乳酸菌，这样不仅可以减少工作量同时也可以更加针对性的筛选出所需抑制病原菌的菌株。
Description
技术领域
本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种乳酸菌的筛选方法。
背景技术
近年来，随着我国经济的不断发展，人们的饮食结构发生了很大的改变，合理饮食、营养均衡成为了人们主要的关心因素。水产动物品种多样，是营养物质含量非常均衡的一类食物，它们不仅含有人体易于吸收的丰富蛋白，而且脂肪含量低，同时还具有人体所需的各种维生素和矿物质，深得广大人们的喜爱，所以近些年我国水产行业发展非常迅猛。为得到高产，人们把水产养殖业逐渐向高密度、高度集约化方向发展，但这就面临着水体富营养化，水生环境复杂，从而导致了病害的日趋严重。抗生素对水产致病菌具有极好的疗效，同时也伴随着菌株耐药性等问题的日趋凸显，所以用绿色无污染的物质替代抗生素成为了热门话题。
乳酸菌是一类利用发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。乳酸菌在生长过程中会代谢产生有机酸、细菌素、特殊酶类及过氧化氢等物质，这些代谢产物可杀死或抑制病原菌的生长，此种方法不会使细菌产生耐药性，因此被人们认为是可替代抗生素的一类天然无污染的菌株。
目前有许多科研工作者从事乳酸菌的筛选工作，但目前的筛选方法多为先大批量筛选，然后测理化性质，初步确定为乳酸菌后进行16s测序，确定其菌种名称，然后在进行抑菌实验，在此过程中大批量的筛选就已经很耗费工作量，而之后进行的理化性质确定不仅耗时耗力，同时也是一种成本的浪费。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种对致病菌有抑制作用的乳酸菌的筛选方法，其中该方法可以减少由非乳酸菌以及无抑菌效果的乳酸菌所带来的工作量，增加有抑菌效果的乳酸菌的识别量。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种乳酸菌的筛选方法，包括步骤：
1)取样本，研磨至粉碎后，加入到MRS肉汤中，静置培养；
2)取步骤1)培养所得的菌液稀释后，与带指示剂的MRS培养基混匀，冷凝后，培养；
3)制备指示菌液；
4)挑取步骤2)中培养所得的单菌落，点菌于MRS平板上，倾倒步骤3)制得的指示菌液，冷凝后，恒温培养；
5)点取步骤4)中培养得到的有明显抑菌圈的菌株，接种于另一新的带有指示剂的MRS平板中，培养；
6)挑取步骤5)培养得到的单菌落划线于MRS平板上，培养后；再挑取所得单菌落于MRS肉汤中培养，保藏待用。
进一步的，所述筛选方法还包括步骤7)：验证步骤6)中培养后的菌株是否存在抑菌效果。
进一步的，所述步骤1)中，样品先用生理盐水研磨(玻璃匀浆器)，然后将处理后的样品加入到MRS肉汤中，样品占MRS肉汤体积的10％左右，可用15ml离心管，静置培养8-10h。
进一步的，所述步骤2)中所用MRS培养基带有的指示剂为1-2％溴甲酚紫溶液，30℃或37℃恒温培养16-18h。
进一步的，所述步骤3)中指示菌的制备方法包括：将指示菌三区划线，过夜培养；挑取单菌落于TSB肉汤中，180rpm 37℃8-10h；再1-3％接种量转接TSB肉汤中培养8-10h至对数中期，测其OD595值，将菌液OD595值稀释至1.0；取1ml加入到已灭菌冷却至50℃左右的TSB培养基中混匀。
进一步的，所述步骤3)中使用的指示菌必须有较强的活力，即经过反复活化后生长至对数中后期的菌株。
进一步的，所述步骤3)中所用TSB培养基必须为软琼脂培养基，琼脂含量为0.7％。
进一步的，所述步骤4)中点菌于MRS平板上后静置1-2h，再倾倒步骤3)的指示菌液，冷凝后，倒置培养于30℃或37℃恒温培养箱中，培养16-18h。
进一步的，所述步骤5)点取菌落时，可***培养基内进行挑取，如指示菌长满平板，请将整个平板倒扣出来，再次点取单菌落即可。
进一步的，所述步骤5)接种好后30℃或37℃培养，16-18h。
进一步的，所述步骤6)中扩大培养后的菌落20％甘油管(采用60％甘油(以水配置)：菌液＝2:1制得)于-80℃保藏。
进一步的，所述步骤7)中使用滤纸片法或牛津杯法进行进一步验证。
本发明有益效果：
本发明是在基础的乳酸菌筛选方法上，将抑菌实验增加至菌株筛选的过程中同时进行，使菌株筛选的针对性更强，避免人力和物资的浪费，增加目的乳酸菌的筛选准确性。
本方法是通过溴甲酚紫显色法确定产酸菌株，然后通过挑取单菌落点菌于指示菌板上，同时为保证乳酸菌生长上层应覆有MRS培养基，待筛选出有抑制指示菌的菌株后，再使用常规的点菌、三区划线、富集等方法获得所需单菌株，最后通过滤纸片法用其上清液做抑菌实验，已达到验证的作用。
附图说明
图1.本发明的乳酸菌的筛选方法主要阶段状态图；其中：1.用倾注的方法培养样品；2.点变黄色的细菌于MRS平板上，并覆盖一层指示菌；3.挑有抑菌效果的细菌点菌于带指示剂的MRS培养基上；4.挑取颜色变黄的菌株三区划线于MRS培养基上；5.液体扩大培养；6.滤纸片法验证。
图2以V.h做为指示菌的点菌平板；底层平板为MRS培养基，在平板后面划好方格，在每一个方格内都点有一个单菌落，静置1h后倾倒指示菌，倒置培养，如果在点菌周围出现透明圈，则表示该菌株对V.h有抑制效果，挑选出来进行下一步研究。
图3以V.p做为指示菌的点菌平板；底层平板为MRS培养基，在平板后面划好方格，在每一个方格内都点有一个单菌落，静置1h后倾倒指示菌，倒置培养，如果在点菌周围出现透明圈，则表示该菌株对V.p有抑制效果，挑选出来进行下一步研究。
图4以S.a做为指示菌的点菌平板。底层平板为MRS培养基，在平板后面划好方格，在每一个方格内都点有一个单菌落，静置1h后倾倒指示菌，倒置培养，如果在点菌周围出现透明圈，则表示该菌株对S.a有抑制效果，挑选出来进行下一步研究。
图5以A.h做为指示菌的点菌平板。底层平板为MRS培养基，在平板后面划好方格，在每一个方格内都点有一个单菌落，静置1h后倾倒指示菌，倒置培养，如果在点菌周围出现透明圈，则表示该菌株对A.h有抑制效果，挑选出来进行下一步研究。
图6用V.h做指示菌的验证实验；该平板为V.h指示菌平板，将滤纸片贴于平板上，再点10μl的乳酸菌菌株上清液，过夜培养，如出现明显抑菌效果，即表示该菌株为可抑制V.h的乳酸菌。
图7用V.p做指示菌的验证实验；该平板为V.p指示菌平板，将滤纸片贴于平板上，再点10μl的乳酸菌菌株上清液，过夜培养，如出现明显抑菌效果，即表示该菌株为可抑制V.p的乳酸菌。
图8用S.a做指示菌的验证实验；该平板为S.a指示菌平板，将滤纸片贴于平板上，再点10μl的乳酸菌菌株上清液，过夜培养，如出现明显抑菌效果，即表示该菌株为可抑制S.a的乳酸菌。
图9用A.h做指示菌的验证实验；该平板为A.h指示菌平板，将滤纸片贴于平板上，再点10μl的乳酸菌菌株上清液，过夜培养，如出现明显抑菌效果，即表示该菌株为可抑制A.h的乳酸菌。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
1.实施例所用培养基及试剂配方：
1)实施例所用MRS培养基：
蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0mL、柠檬酸氢二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、K2HPO4 2.0g、MnSO4·H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、琼脂15g、蒸馏水1.0L，用NaOH调节pH至6.5。
2)实施例所用带指示剂的MRS培养基：
蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0mL、柠檬酸氢二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、K2HPO4 2.0g、MnSO4·H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、琼脂7g、蒸馏水1.0L，加1ml 2％溴甲酚紫溶液。
3)实施例所用溴甲酚紫的配制
用95％乙醇与溴甲酚紫配制10-20g/L的溴甲酚紫溶液，即1-2％的溴甲酚紫溶液。
4)实施例所用MRS肉汤培养基：
蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温-80 1.0mL、柠檬酸氢二铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、K2HPO4 2.0g、MnSO4·H2O 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、蒸馏水1.0L。
5)实施例所用TSB培养基：
胰蛋白胨17.0g、植物蛋白胨3.0g、NaCl 5.0g、K2HPO4 2.0g、葡萄糖2.5g、琼脂粉15g、蒸馏水1L。
6)实施例所用TSB肉汤培养基：
胰蛋白胨17.0g、植物蛋白胨3.0g、NaCl 5.0g、K2HPO4 2.0g、葡萄糖2.5g，蒸馏水1L。
7)实施例所用TSB软琼脂培养基：
胰蛋白胨17.0g、植物蛋白胨3.0g、NaCl 5.0g、K2HPO4 2.0g、葡萄糖2.5g、琼脂粉7g、蒸馏水1L。
2.筛选方法
实验方法过程如图1
1)取1g水产动物肠道样品，加入1ml生理盐水，用组织研磨器研磨至粉碎，将粉碎后的样品加入到放有14ml MRS肉汤的15ml离心管中，静置培养8-10h；其中处理后的样品与培养基应填满离心管。
2)取1ml步骤1)菌液用生理盐水用10倍稀释法稀释八管，取最后三管溶液各1ml分别加入到培养皿中，用倾注法倾倒已冷却至55℃的已灭菌的带指示剂的MRS培养基，混匀，待冷凝后，倒置培养于30℃恒温培养箱中，16-18h。
3)指示菌准备：将指示菌在TSB培养基(TSB平板)上三区划线，过夜培养；挑取单菌落于TSB肉汤中，180rpm 37℃8h；再1％接种量转接TSB肉汤中培养8h至对数中期，测其OD595值，将菌液OD595值稀释至1.0；取1ml加入到100ml已灭菌冷却至50℃的TSB软琼脂培养基(琼脂含量0.7％)中混匀；
4)用牙签挑取步骤2)中平板上的单菌落，点菌于MRS平板上，静置1h，倾倒步骤3)已混有指示菌的TSB培养基8ml-10ml，待冷凝后，倒置培养于37℃恒温培养箱中，16-18h；
5)另取一新的带有指示剂的MRS平板，用已灭菌的牙签点取有明显抑菌圈的菌株接种于该带有指示剂的MRS平板中，30℃培养，16-18h；
6)挑取步骤5)单菌落三区划线于MRS平板上，37℃过夜培养后，挑取单菌落于MRS肉汤中，37℃培养16h，所得菌液20％甘油管-80℃保藏；
7)扩大培养后的菌株用滤纸片法验证是否存在抑菌效果。
实施例1：
用哈维氏弧菌(Vibrio harveyi，V.h)作为指示菌筛选有抑菌效果的菌株，将其倾倒于已点有细菌的MRS培养基上培养16h，实验结果如图2，分离出单菌落后用滤纸片验证结果如图6。
实施例2：
用副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus，V.p)作为指示菌筛选有抑菌效果的菌株，将其倾倒于已点有细菌的MRS培养基上培养16h，实验结果如图3，分离出单菌落后用滤纸片验证结果如图7。
实施例3：
用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.a)作为指示菌筛选有抑菌效果的菌株，将其倾倒于已点有细菌的MRS培养基上培养16h，实验结果如图4，分离出单菌落后用滤纸片验证结果如图8。
实施例4：
用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，A.h)作为指示菌筛选有抑菌效果的菌株，将其倾倒于已点有细菌的MRS培养基上培养16h，实验结果如图5，分离出单菌落后用滤纸片验证结果如图9。
用此种方法在初始步骤时就可以减少没有抑菌效果菌株的分离，不仅减少了工作量，同时还可以增加筛选的准确率，为之后的进一步实验提供可靠依据。
本实施方式中仅以水产动物肠道样本为例，并不说明本发明筛选方法只能用于对水产动物肠道菌群中的乳酸菌的筛选。本发明的筛选方法还可用于不同样本中具有抑菌效果的乳酸菌的筛选，将步骤1)中的起始样本更换即可。其他样本包括畜禽等动物肠道、蔬菜、水果、土壤等样本均可行。
本发明筛选方法还可通过选用不同的指示菌，筛选对具体菌种有抑菌效果的乳酸菌，并不限于本实施方式所例举的指示菌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种乳酸菌的筛选方法，包括步骤：
1)取样本，粉碎后，加入到MRS肉汤中，静置培养；
2)取步骤1)培养所得的菌液稀释后，与带指示剂的MRS培养基混匀，冷凝后，培养；
3)制备指示菌液；
4)挑取步骤2)中的单菌落，点菌于MRS平板上，倾倒步骤3)制得的指示菌液，冷凝后，培养；
5)点取步骤4)中培养得到的有明显抑菌圈的菌株，接种于带有指示剂的MRS平板中，培养；
6)挑取步骤5)培养得到的单菌落划线于MRS平板上，培养后；再挑取所得单菌落于MRS肉汤中培养，即得。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法还包括步骤7)：验证步骤6)中培养后的菌株的抑菌效果。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤7)中使用滤纸片法或牛津杯法进行进一步验证。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中，样品先用生理盐水研磨，然后将处理后的样品加入MRS肉汤中，样品占MRS肉汤体积的10％，静置培养8-10h。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法步骤2)和步骤5)中所用MRS培养基带有的指示剂为1-2％溴甲酚紫溶液；培养条件为：30℃或37℃培养16-18h。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中指示菌的制备方法包括：将指示菌三区划线，过夜培养；挑取单菌落于TSB肉汤中，180rpm 37℃ 8-10h；再1-3％接种量转接于TSB肉汤中培养8-10h至对数中期，测其OD595值，将菌液OD595值稀释至1.0；取1ml加入到已灭菌冷却至50℃的TSB培养基中混匀。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)中使用的指示菌为反复活化后生长至对数中后期的菌株。
8.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法步骤3)中所用TSB培养基为软琼脂培养基，琼脂含量为0.7％。
9.根据权利要求1-3任意一项所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤4)中点菌于MRS平板上后静置1-2h，再倾倒步骤3)的指示菌液，冷凝后，倒置培养于30℃或37℃培养箱中，培养16-18h。
10.根据权利要求1-3任意一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤6)中培养后的菌落采用20％甘油管-80℃保藏。
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| CN114854624A (zh) * | 2022-04-15 | 2022-08-05 | 湖州师范学院 | 一种低丰度土壤土著乳酸菌的高效筛选方法 |
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