CN109825445B - 一种榆耳液体发酵培养基及发酵培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种榆耳液体发酵培养基及发酵培养方法，该方法选用合适的培养基和培养条件，通过中药桑叶、艾叶、马齿苋酶提取物促进榆耳菌丝体的生长，从而缩短榆耳液体发酵的时间，同时还增加了榆耳菌丝体的生物量及多糖物质的含量。
Description
技术领域
本发明涉及发酵培养技术领域，具体涉及一种榆耳液体发酵培养基以及榆耳液体发酵培养方法。
背景技术
榆耳( Gloeostereum incamatum S.Ito et Imai)学名为肉红胶韧革菌，别名榆蘑、肉蘑、胶韧革菌、肉质粘韧菌、肉红胶韧革菌、榆射脉菌、粘韧革菌、射脉菌。属于 担 子菌 亚 门 (Basidiomycotina)、 层 菌 纲(Hymenomycetes)、非 褶 菌 目(Aphyllophorales)、付革菌科(Corticiaceae)、胶 韧 革 菌 属(Gloeostereum)药食兼用的真菌。多生长在榆（Ulmus pumila）、春榆（U.propinqua）的树干、树桩、枯枝或树洞处，也可生长在糖槭树上。主要分布于辽宁、黑龙江、吉林等地以及日本的北海道区域。
榆耳子实体含有丰富的蛋白质，其蛋白质含量介于动物和植物之间，是一种高蛋白、低脂肪食品。人工栽培榆耳的粗蛋白含量几乎达到了野生榆耳的 2倍，表明人工栽培榆耳是野生榆耳很好的替代品，具有较高的开发价值（张金霞，1988，食用菌，榆蘑的驯化）。榆耳发酵产物中除含有丰富的多糖外，还含有很多种成分，如：蛋白质、维生素、黄酮、三萜皂苷、生物碱、18 种氨基酸、无机盐以及微量元素等（李典忠，2002， 吉林农业大学，子实体及发酵液化学成分和药理活性研究）；子实体中含有 9 种化合物，发酵液中含有 6 种化合物（李典忠，2002，吉林农业大学博士论文，子实体及发酵液化学成分和药理活性研究）。
目前研究认为榆耳发酵产物具有抑菌活性强，抑菌谱很广的特点（李典忠，2002，吉林农业大学博士论文，子实体及发酵液化学成分和药理活性研究；马珊珊，2008，吉林农业大学研究生论文，榆耳（Gloeostereum incarnatum）的生药学研究；柳洪芳，2010，中国生化药物杂志，榆耳多糖的分离纯化、结构鉴定及抗肿瘤活性研究）。榆耳发酵上清液对大肠杆菌、福杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、炭疽杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌等多种细菌均有明显的抑制作用，榆耳发酵上清液对肠炎沙门氏杆菌的体外抑制作用最为明显，与红霉素、氯霉素和苯甲酸钠溶液的体外抑菌活性相当（陈颖，1990，中国食用菌，榆耳发酵液抑菌作用的探讨）。
传统榆耳栽培费时费力，应用液体深层发酵技术相比于传统的栽培技术可以快速、稳定、规模化地获取药用真菌菌丝体及具有活性的次级代谢产物，如今液体深层发酵生产已成为药用真菌资源开发的重要手段。
在榆耳发酵培养方面，发酵培养基对其质量具有十分重要的影响，因此，要想增加榆耳的产量及改善其质量，对其培养基进行改进十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种榆耳液体发酵培养基，该培养基中添加了中药酶提取液，通过桑叶、艾叶、马齿苋酶提取液对榆耳培养的促进作用，可以缩短榆耳的液体发酵时间，同时增加榆耳菌丝体的产量及多糖物质的含量。
本发明的另一个目的在于提供一种榆耳液体发酵培养方法，培养时通过在培养基中添加中药酶提取液，从而缩短榆耳的液体发酵时间，同时增加榆耳菌丝体的产量及多糖物质的含量。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种榆耳液体发酵培养基，所述培养基包括以下重量份的组分：土豆200份、葡萄糖20份、亚硝酸钠0.2份、磷酸二氢钾1份和中药酶提取液0.2-0.4份，其中所述中药酶提取液包括以下重量份的成分：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份。
上述榆耳液体发酵培养基的制备方法为：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.2-0.4份，定容成1000mL，即得，自然pH值。
进一步地，所述中药酶提取液的制备方法为：将中药桑叶、艾叶和马齿苋按照以下重量份：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份放入酶解罐中，加入蒸馏水得到药水混合物，中药和蒸馏水的重量比为1:10，然后加入纤维素降解酶和蛋白降解酶，纤维素降解酶加入量为药水混合物总重量的1-1.5%，蛋白质降解酶加入量为药水混合物总重量的0.5-1%，再在恒温50℃下降解24小时，最后取出过滤得滤液即为中药酶提取液。
本发明还公开了利用上述榆耳发酵培养基对榆耳进行液体发酵培养的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）榆耳菌种复壮培养：
首先配制榆耳斜面固体培养基：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.2-0.4份，琼脂20份，融化后，定容成1000mL，即得，自然pH值；然后将榆耳斜面固体培养基分装、灭菌、冷却、接种和培养后，将长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种挑选出；
（2）榆耳液体发酵培养基的分装和灭菌：
将榆耳液体发酵培养基分装至500mL的三角瓶中，每个三角瓶中装250mL；封口，在121℃条件下，灭菌20min；
（3）液体原种制备：
将选出的长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种在无菌操作下接种到榆耳液体发酵培养基上，在温度为20℃、转速为120-150r/min的摇床中培养140-145h后取出，进行液体菌种发酵质量的检查，选择长势好的榆耳液体菌种；
具体地，液体菌种发酵质量的检查包括：
A.生物质量检查：根据菌丝球的大小和菌量来判断，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养；
B.感官分析：成熟的菌丝球具有榆耳的味道，其发酵液澄清透明，如有细菌则具有酸、臭味道，说明发酵失败；
C.显微镜观察：发酵过程定时取样在显微镜下观察，如有异常说明菌种生长不良。
（4）榆耳液体发酵培养
将榆耳液体菌种在无菌操作下接种到液体发酵培养基上，在温度为22-25℃、转速为120-150r/min的摇床中培养140-145h，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养，取出过滤烘干即得。
发酵培养的榆耳可以作为提取榆耳多糖或者作为保健食品的原材料。
其中，进一步地，步骤（1）中榆耳斜面固体培养基分装和灭菌的方法为：将配制好的榆耳斜面固体培养基分装于18mm×180mm试管中，封口，在121℃条件下，灭菌20min。
进一步地，步骤（1）中榆耳斜面固体培养基接种和培养的方法具体为：灭完菌后取出榆耳斜面固体培养基，自然冷却至20℃-30℃，在无菌条件下，接入在0-4℃保存的榆耳菌种；将接好种的榆耳斜面固体培养基置于恒温培养箱里，25℃培养8天。
进一步地，步骤（4）所述榆耳液体发酵培养基装入容量为500mL的三角瓶中，每瓶250mL，然后121℃灭菌30min、冷却接种，每瓶接液体菌种20mL。
优选地，榆耳液体发酵培养的条件为：置于恒温振荡培养箱里，25℃条件下，转速为130r/min的摇床中培养140h。
本发明具有如下优点：
本发明在榆耳的发酵培养基上添加了中药酶提取液，其中中药桑叶、艾叶、马齿苋酶提取物能够促进榆耳菌丝体的生长，从而缩短榆耳液体发酵的时间，同时提高榆耳多糖含量，得到的榆耳可以作为中药原料药及食品原料。
传统的榆耳培养方法其子实体生长时间从接种到采收需60天以上，生长周期长投资大，难以满足中药生产需求。本发明在榆耳液体培养基中添加中药酶提取液，可以大大缩短发酵时间，其中，普通榆耳发酵方法需要160-180小时，榆耳菌丝体的生物量最高可以达到16.4g/L，其多糖含量最高可以达到15.44%。而采用本发明的方法其发酵时间可以缩短到140h-145h，榆耳菌丝体生物量和多糖含量分别可以达到18.52g/L和17.36%。本发明的方法和传统的榆耳发酵方法相比，榆耳液体发酵时间缩短了约24个小时，但其生物量和多糖含量却分别提高了12.92%和12.43%。
附图说明
图1是本发明不同发酵培养基配方对榆耳生物量及多糖含量的影响；
图2是不同发酵培养基配方在不同发酵时间生物量含量的变化；
图3是不同发酵培养基配方在不同发酵时间多糖含量的变化。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明所采用的各种试剂、试验材料均能够从市场上购买得到。
实施例1
一种中药酶提取液的制备方法为：将中药桑叶、艾叶和马齿苋按照以下重量份：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份放入酶解罐中，加入蒸馏水得到药水混合物，中药和蒸馏水的重量比为1:10，然后加入纤维素降解酶和蛋白降解酶，纤维素降解酶加入量为药水混合物总重量的1%，蛋白质降解酶加入量为药水混合物总重量的0.5%，再在恒温50℃下降解24小时，最后取出过滤得滤液即为中药酶提取液。
实施例2
一种中药酶提取液的制备方法为：将中药桑叶、艾叶和马齿苋按照以下重量份：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份放入酶解罐中，加入蒸馏水得到药水混合物，中药和蒸馏水的重量比为1:10，然后加入纤维素降解酶和蛋白降解酶，纤维素降解酶加入量为药水混合物总重量的1.5%，蛋白质降解酶加入量为药水混合物总重量的1%，再在恒温50℃下降解24小时，最后取出过滤得滤液即为中药酶提取液。
实施例3
一种中药酶提取液的制备方法为：将中药桑叶、艾叶和马齿苋按照以下重量份：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份放入酶解罐中，加入蒸馏水得到药水混合物，中药和蒸馏水的重量比为1:10，然后加入纤维素降解酶和蛋白降解酶，纤维素降解酶加入量为药水混合物总重量的1.2%，蛋白质降解酶加入量为药水混合物总重量的0.8%，再在恒温50℃下降解24小时，最后取出过滤得滤液即为中药酶提取液。
实施例4
一种中药酶提取液的制备方法为：将中药桑叶、艾叶和马齿苋按照以下重量份：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份放入酶解罐中，加入蒸馏水得到药水混合物，中药和蒸馏水的重量比为1:10，然后加入纤维素降解酶和蛋白降解酶，纤维素降解酶加入量为药水混合物总重量的1.5%，蛋白质降解酶加入量为药水混合物总重量的0.5%，再在恒温50℃下降解24小时，最后取出过滤得滤液即为中药酶提取液。
实施例5
一种榆耳液体发酵培养基，所述培养基包括以下重量份的组分：土豆200份、葡萄糖20份、亚硝酸钠0.2份、磷酸二氢钾1份和中药酶提取液0.3份，其中所述中药酶提取液包括以下重量份的成分：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份。
上述榆耳液体发酵培养基的制备方法为：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.3份，定容成1000mL，即得，自然pH值。
实施例6
一种榆耳液体发酵培养基，所述培养基包括以下重量份的组分：土豆200份、葡萄糖20份、亚硝酸钠0.2份、磷酸二氢钾1份和中药酶提取液0.2份，其中所述中药酶提取液包括以下重量份的成分：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份。
上述榆耳液体发酵培养基的制备方法为：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.3份，定容成1000mL，即得，自然pH值。
实施例7
一种榆耳液体发酵培养基，所述培养基包括以下重量份的组分：土豆200份、葡萄糖20份、亚硝酸钠0.2份、磷酸二氢钾1份和中药酶提取液0.4份，其中所述中药酶提取液包括以下重量份的成分：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份。
上述榆耳液体发酵培养基的制备方法为：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.3份，定容成1000mL，即得，自然pH值。
实施例8
一种榆耳进行液体发酵培养的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）榆耳菌种复壮培养：
A、首先配制榆耳斜面固体培养基：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.3份，琼脂20份，融化后，定容成1000mL，即得，自然pH值；
B、将榆耳斜面固体培养基分装、灭菌；
将配制好的榆耳斜面固体培养基分装于18mm×180mm试管中，封口，在121℃条件下，灭菌20min；
C、冷却、接种和培养：
灭完菌后取出榆耳斜面固体培养基，自然冷却至20℃，在无菌条件下，接入在0-4℃保存的榆耳菌种；将接好种的榆耳斜面固体培养基置于恒温培养箱里，25℃培养8天；
D、冷却、接种和培养后，将长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种挑选出。
（2）榆耳液体发酵培养基的分装和灭菌：
将实施例5所述的榆耳液体发酵培养基分装至500mL的三角瓶中，每个三角瓶中装250mL；封口，在121℃条件下，灭菌20min。
（3）液体原种制备：
将选出的长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种在无菌操作下接种到榆耳液体发酵培养基上，在温度为20℃、转速为120r/min的摇床中培养145h后取出，进行液体菌种发酵质量的检查，选择长势好的榆耳液体菌种；
具体地，液体菌种发酵质量的检查包括：
A.生物质量检查：根据菌丝球的大小和菌量来判断，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养；
B.感官分析：成熟的菌丝球具有榆耳的味道，其发酵液澄清透明，如有细菌则具有酸、臭味道，说明发酵失败；
C.显微镜观察：发酵过程定时取样在显微镜下观察，如有异常说明其菌种生长不良。
（4）榆耳液体发酵培养
将榆耳液体菌种在无菌操作下接种到液体发酵培养基上，然后将榆耳液体发酵培养基装入容量为500mL的三角瓶中，每瓶250mL，然后121℃灭菌30min、冷却接种，每瓶接液体菌种20mL。再在温度为25℃、转速为130r/min的摇床中培养160h，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养，取出过滤烘干即得。
实施例9
一种榆耳进行液体发酵培养的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）榆耳菌种进行斜面固体培养基菌种培养：
A、首先配制榆耳斜面固体培养基：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.2份，琼脂20份，融化后，定容成1000mL，即得，自然pH值；
B、将榆耳斜面固体培养基分装、灭菌；
将配制好的榆耳斜面固体培养基分装于18mm×180mm试管中，封口，在121℃条件下，灭菌20min；
C、冷却、接种和培养
灭完菌后取出榆耳斜面固体培养基，自然冷却至20℃，在无菌条件下，接入在0-4℃保存的榆耳菌种；将接好种的榆耳斜面固体培养基置于恒温培养箱里，25℃培养8天；
D、冷却、接种和培养后，将长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种挑选出。
（2）榆耳液体发酵培养基的分装和灭菌：
将实施例6所述的榆耳液体发酵培养基分装至500mL的三角瓶中，每个三角瓶中装250mL；封口，在121℃条件下，灭菌20min。
（3）液体原种制备：
将选出的长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种在无菌操作下接种到榆耳液体发酵培养基上，在温度为20℃、转速为150r/min的摇床中培养140h后取出，进行液体菌种发酵质量的检查，选择长势好的榆耳液体菌种；
具体地，液体菌种发酵质量的检查包括：
A.生物质量检查：根据菌丝球的大小和菌量来判断，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养；
B.感官分析：成熟的菌丝球具有榆耳的味道，其发酵液澄清透明，如有细菌则具有酸、臭味道，说明发酵失败；
C.显微镜观察：发酵过程定时取样在显微镜下观察，如有异常说明其菌种生长不良。
（4）榆耳液体发酵培养
将榆耳液体菌种在无菌操作下接种到液体发酵培养基上，然后将榆耳液体发酵培养基装入容量为500mL的三角瓶中，每瓶250mL，然后121℃灭菌30min、冷却接种，每瓶接液体菌种20mL。再在温度为22℃、转速为120r/min的摇床中培养145h，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养，取出过滤烘干即得。
实施例10
一种榆耳进行液体发酵培养的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）榆耳菌种复壮培养：
A、首先配制榆耳斜面固体培养基：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.3份，琼脂20份，融化后，定容成1000mL，即得，自然pH值；
B、将榆耳斜面固体培养基分装、灭菌；
将配制好的榆耳斜面固体培养基分装于18mm×180mm试管中，封口，在121℃条件下，灭菌20min；
C、冷却、接种和培养
灭完菌后取出榆耳斜面固体培养基，自然冷却至20℃，在无菌条件下，接入在0-4℃保存的榆耳菌种；将接好种的榆耳斜面固体培养基置于恒温培养箱里，25℃培养8天；
D、冷却、接种和培养后，将长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种挑选出。
（2）榆耳液体发酵培养基的分装和灭菌：
将实施例7所述的榆耳液体发酵培养基分装至500mL的三角瓶中，每个三角瓶中装250mL；封口，在121℃条件下，灭菌20min。
（3）液体原种制备：
将选出的长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种在无菌操作下接种到榆耳液体发酵培养基上，在温度为20℃、转速为150r/min的摇床中培养140h后取出，进行液体菌种发酵质量的检查，选择长势好的榆耳液体菌种；
具体地，液体菌种发酵质量的检查包括：
A.生物质量检查：根据菌丝球的大小和菌量来判断，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养；
B.感官分析：成熟的菌丝球具有榆耳的味道，其发酵液澄清透明，如有细菌则具有酸、臭味道，说明发酵失败；
C.显微镜观察：发酵过程定时取样在显微镜下观察，如有异常说明其菌种生长不良。
（4）榆耳液体发酵培养
将榆耳液体菌种在无菌操作下接种到液体发酵培养基上，然后将榆耳液体发酵培养基装入容量为500mL的三角瓶中，每瓶250mL，然后121℃灭菌30min、冷却接种，每瓶接液体菌种20mL。再在温度为22-25℃、转速为150r/min的摇床中培养170h，当菌丝球浓度达到80%以上，菌丝球大小达到1毫米以上结束培养，取出过滤烘干即得。
为了进一步的证明本发明的有益效果，发明人还进行了如下试验，具体如下：
将榆耳在不同的培养基进行培养，除了培养基不同外，其余的发酵培养条件均相同，具体的培养基配方分别为：
配方1：麦芽糖12.96g/L、黄豆粉11.68g/L、VB61.59g/L，pH 5.5;
配方2：蔗糖10g/L 、玉米淀粉50g/L、 麸皮23g/L、脱脂蛋白粉34g/L、KH2PQ4 3.5g/L、 MgSO4 2.3g/L、VB10.1g/L，pH 5.5；
配方3： 玉米淀粉46g/L、黄豆粉16g/L、硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.1g/L、0.001%硫酸锌0.01g/L、 硫酸锰0.01g/L、VB10.1g/L，pH 5.5；
配方4：本发明实施例5中所述的榆耳液体发酵培养基；
配方5：本发明实施例6中所述的榆耳液体发酵培养基；
配方6：本发明实施例7中所述的榆耳液体发酵培养基；
发酵条件：同实施例8中所述的方法，发酵完成后过滤烘干测定其生物量。之后对烘干菌丝体进行研磨，然后采用蒽酮法测定其多糖含量，结果如图1，从图中可以看出常规培养基（配方1-3）和本发明所采用的培养基（配方4-6）在相同的发酵条件下，本发明配方6的生物量得率最高，其次是本发明配方4，5，其生物量比常规发酵方法（配方2）高出12.97%。多糖含量最高的为本发明所采用的配方4和配方6，多糖含量比常规发酵多糖含量最高的配方1提高了12.43%。从图2，3中可以看出发酵140h后，配方4-6在相同的发酵温度和转速情况下，其生物量达到最高，同时其多糖含量也达到最高量，比其他配方（1-3）从发酵时间上缩短了24h左右，但其生物量和多糖含量均高于配方（1-3）。
Claims (6)
1.一种榆耳液体发酵培养基，其特征在于，其制备方法为：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.2-0.4份，定容成1000mL，即得，自然pH值；
所述中药酶提取液的制备方法为：将中药桑叶、艾叶和马齿苋按照以下重量份：桑叶30份、艾叶40份和马齿苋30份放入酶解罐中，加入蒸馏水得到药水混合物，中药和蒸馏水的重量比为1:10，然后加入纤维素降解酶和蛋白降解酶，纤维素降解酶和蛋白质降解酶的加入量分别为药水混合物总重量的1-1.5％和0.5-1％，再在恒温50℃下降解24小时，最后取出过滤得滤液即是中药酶提取液。
2.一种利用权利要求1所述的榆耳液体发酵培养基对榆耳液体发酵培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)榆耳菌种复壮培养：
首先配制榆耳斜面固体培养基：将按照重量份计的200份土豆切成0.8-1.2cm的小块，在沸水中煮20分钟，然后进行过滤，取汁，后加入葡萄糖20份，亚硝酸钠0.2份，磷酸二氢钾1份，中药酶提取液0.2-0.4份，琼脂20份，融化后，定容成1000mL，即得，自然pH值；然后将榆耳斜面固体培养基分装、灭菌、冷却、接种和菌种培养后，将长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种挑选出；
(2)榆耳液体发酵培养基的分装和灭菌：
将榆耳液体发酵培养基分装至500mL的三角瓶中，每个三角瓶中装250mL；封口，在121℃条件下，灭菌20min；
(3)液体原种制备：
将选出的长势好没有出现退化现象的榆耳固体菌种在无菌操作下接种到榆耳液体发酵培养基上，在温度为20℃、转速为120-150r/min的摇床中培养140-145h后取出，选择长势好的榆耳液体菌种；
(4)榆耳液体发酵培养
将榆耳液体菌种在无菌操作下接种到液体发酵培养基上，在温度为22-25℃、转速为120-150r/min的摇床中培养160-180h，当菌丝球浓度达到80％以上，菌丝球大小达到1毫米以上，结束培养，取出过滤烘干即得。
3.根据权利要求2所述的榆耳液体发酵培养的方法，其特征在于，步骤(1)中榆耳斜面固体培养基分装和灭菌的方法为：将配制好的榆耳斜面固体培养基分装于18mm×180mm试管中，封口，在121℃条件下，灭菌20min。
4.根据权利要求2所述的榆耳液体发酵培养的方法，其特征在于，步骤(1)中榆耳斜面固体培养基接种和菌种培养的方法具体为：灭完菌后取出榆耳斜面固体培养基，自然冷却至20℃-30℃，在无菌条件下，接入在0-4℃保存的榆耳菌种；将接好种的榆耳斜面固体培养基置于恒温培养箱里，25℃培养8天。
5.根据权利要求2所述的榆耳液体发酵培养的方法，其特征在于，步骤(4)所述榆耳液体发酵培养基装入容量为500mL的三角瓶中，每瓶250mL，然后121℃灭菌30min、冷却接种，每瓶接液体菌种20mL。
6.根据权利要求2所述的榆耳液体发酵培养的方法，其特征在于，榆耳液体发酵培养的条件为：置于恒温振荡培养箱里，25℃条件下，转速为130r/min的摇床中培养140h。
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