CN113527323A - 一种从白桐树中提取酚类化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从白桐树中提取酚类化合物的方法，所述方法包括提取、浓缩、萃取、聚酰胺柱层析、C18柱层析、凝胶柱层析、半制备型高效液相色谱法等步骤，采用本发明方法首次从白桐树中分离得到cleomiscosin C、cleomiscosinA、莨菪亭、6‑姜酚和6‑姜烯酚5个酚类化合物，且化合物纯度均可达98％以上。该方法操作简单，易于实现，且柱层析所用填料均可重复利用，经济高效。
Description
技术领域
本发明涉及天然植物化学成分提取分离领域技术领域，具体涉及一种从白桐树中提取酚类化合物的方法。
背景技术
白桐树Claoxylon indicum(Reinw.ex Bl.)Hassk.，又名丢了棒、刁了棒、追风棍、咸鱼头大叶大青、赶风债、赶风柴、追风根、美巧怀，为大戟科(Euphorbiac eae)白桐树属(Claoxylon A.Juss.)植物，主产于广东、海南、广西、云南等地，味辛微苦，有小毒，性平，归脾、肾经，功效祛风除湿，消肿止痛，《生草药性备要》记载其“祛风湿脚痛，敷跌打，消肿痛”，可用于风湿类风湿性关节炎，腰腿痛，跌打肿痛，脚气水肿，还可以用于治烧、烫伤，外伤出血，作为一种壮族药物，在民间多用于风湿类风湿骨病的治疗。《中国药典》(1977年版)、《广西壮族自治区壮药质量标准》、《湖南中药饮片炮制规范》(2010年版)、《甘肃省中药饮片炮制规范》(1980年版)等法定规范中均有收载白桐树作为临床药物使用，在治疗风湿类风湿性关节炎及其骨病方面白桐树均有使用，如中华跌打丸(中国药典2010年版一部)、中华跌打酒(***药品标准中药成方制剂第十九册)、伤筋正骨酊(国家中成药标准汇编骨伤科分册)、新力正骨喷雾剂(国家中成药标准汇编骨伤科分册)、驳骨水(***药品标准中药成方制剂第十一册)等多种中成药处方及许多壮族药方都运用了白桐树这味药。
目前关于白桐树的化学研究报道很少，文献调研结果表明，白桐树属植物含酚类、生物碱、二萜、三萜、皂苷等化学成分，其中酚类(主要是木脂素、新木脂素、香豆素)是该属植物特征性成分，且具有抗癌、调节免疫等多种活性。目前，关于白酮树酚类成分的研究较少，并未有明确的方法来提取白桐树植物中的酚类成分，这严重制约了常用壮族药白桐树的广泛临床应用，因此研究开发一种白桐树植物中酚类化合物的提取分离方法，以便简单、快速的从白桐树中制备得到多种酚类化合物，对于壮药白桐树资源的充分开发和利用具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明目的在于提供一种从白桐树中提取酚类化合物的方法，本发明所述提取方法可以简单、快速从白桐树中提取分离纯出cleomiscosin C(1)、cleomiscosin A(2)、莨菪亭(3)、6-姜酚(4)和6-姜烯酚(5)5个酚类化合物，其化学结构式见图1。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种从白桐树中提取酚类化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1：将白桐树植物原料加入溶剂进行提取获得提取液，提取液减压浓缩获得浸膏，所述溶剂为甲醇、乙醇或水中的任意一种或至少两种的组合；
步骤2：将步骤1所得浸膏加水分散至相对密度1.05～1.20(室温时测定值)得水分散液，加入石油醚萃取，收集水相部分，再用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；
步骤3：将步骤2所得乙酸乙酯萃取物经聚酰胺柱层析分离纯化得白桐树总多酚粗品；
步骤4：将步骤3所得白桐树总多酚粗品经C18柱层析分离纯化得柱层析样品I；
步骤5：将步骤4所得柱层析样品I经凝胶柱层析分离纯化得目标I段组分、目标II段组分和目标Ⅲ段组分；
步骤6：将目标I段组分和目标II段组分分别经半制备型高效液相色谱法分离纯化得酚类化合物cleomiscosin C、cleomiscosin A、6-姜烯酚和6-姜酚，所述半制备型高效液相色谱的分离条件为：色谱柱为耐酸性C18色谱柱，以0.1wt％～0.3wt％的磷酸水溶液和乙腈为流动相，检测波长300～365nm，流速2～5ml/min，分别收集对应于目标成分的色谱图特征峰的洗脱液，浓缩干燥既得所述酚类化合物；
将目标Ⅲ段组分经重结晶得酚类化合物莨菪亭，所述重结晶溶剂为甲醇、乙醇、氯仿中的任意一种或至少两种的组合。
作为本发明的优先方案，本发明中步骤1中白桐树植物原料在提取前还包括前处理步骤，所述前处理为取白桐树植物原料，烘干或晒干，粉碎至20～80目；所述白桐树植物原料为白桐树根、杆或枝中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤1提取中白桐树植物原料与溶剂的质量体积比为1:8～20，进一步优选为1:8～13，单位为g/ml，所述原料与溶剂的质量体积比是指原料的质量与溶剂的体积之比，例如，每g原料采用8～20ml的溶剂进行提取。
优选地，步骤1所述提取中溶剂为70vol％～100vol％的甲醇或乙醇水溶液；
优选地，步骤1中所述提取方法选自热回流提取、超声提取或超声辅助热回流提取中的一种或至少两种的组合；
优选地，所述超声提取，超声功率为20KHz～40KHz，优选为20KHz～30KHz，超声时间为1～3h，优选为1.5～2.5h，提取次数为1～4次；
优选地，所述热回流提取，温度为50～100℃，时间1～3h，优选2～3h,提取1～4次；
优选地，所述超声辅助热回流提取，超声功率为20KHz～40KHz，优选为20KHz～30KHz，超声时间为1～3h，优选为1.5～2h，温度为50～100℃，提取次数为1～4次。
优选地，步骤1中，所述减压浓缩为浓缩至无有机溶剂气味且相对密度在1.20以下(室温时测定值)。
优选地，步骤2中，所述石油醚萃取中，水分散液与石油醚的体积比为1:1～3，进一步优选为1:1，经石油醚萃取可以除去大部分小极性脂溶性杂质成分。
优选地，步骤2中，所述乙酸乙酯萃取中，水相部分与乙酸乙酯的体积比为1:1～3，进一步优选为1:1，经乙酸乙酯萃取保留酚类成分，水溶性强极性杂质成分则留在水层而被除去。
优选地，步骤3中，所述聚酰胺柱为粒径为30～200目的聚酰胺，优选60～100目；所述乙酸乙酯萃取物与聚酰胺填料的质量比为1:50～100，如55倍、60倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍或95倍等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用；所述聚酰胺柱的高径比为5～10:1，如6:1、7:1、8:1或9:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤3所述聚酰胺柱层析分离纯化用洗脱溶剂为乙醇水溶液，洗脱流速为5～20ml/min，洗脱方式为梯度洗脱：先用25vol％～30vol％乙醇洗脱5～8个柱体积除去杂质，再用60vol％～75vol％乙醇洗脱3～6个柱体积，收集洗脱液，最后用95vol％乙醇冲洗柱子。
优选地，步骤4所述洗脱在5～20bar的中低压色谱条件下进行。
聚酰胺填料中氨基与白桐树酚类成分的酚羟基之间形成氢键而吸附，吸附的强度主要取决于化合物中羟基的数目与位置、以及溶剂与化合物或溶剂与聚酰胺之间形成氢键的缔合能力大小。通过步骤3聚酰胺柱层析可以快速除去无羟基类成分杂质，有效富集白桐树中酚类化合物。且经95vol％乙醇冲洗柱子后，聚酰胺填料可再生，而重复使用。
优选地，步骤4中所述C18柱填料为RP-C18，孔径
粒径40～63μm,例如为MerckLichroprep RP-C18；所述白桐树总多酚粗品与C18填料的质量比为1：100～150，如105倍、110倍、120倍、130倍、140倍、140倍等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用；所述C18柱的高径比为20～40:1，如22:1、25:1、30:1、35:1或38:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤4所述C18柱层析分离纯化用洗脱溶剂为甲醇水溶液，洗脱流速为5～20ml/min，洗脱方式为：先用25vol％～30vol％甲醇洗脱4～8个柱体积去除杂质，再用60vol％～70vol％甲醇洗脱4～8个柱体积，收集洗脱液，最后用95vol％～100vol％甲醇冲洗柱子，冲洗后C18柱可以重复利用。
优选地，步骤4所述洗脱在5～20bar的中低压色谱条件下进行。
经C18柱层析分离纯化，可以有效除去与目标酚类化合物极性相差较大的其它成分。
优选地，步骤5中所述凝胶柱填料为交联度≤25的交联葡聚糖凝胶及其衍生物，进一步优选为SephadexG-25、Sephadex G-10、Sephadex LH-20中的任意一种。葡聚糖凝胶具有分子筛作用，通过葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，可以将不同分子量的化合物分开，选用交联度≤25的交联葡聚糖凝胶及其衍生物可以将样品中极性与白桐树中酚类化合物相似但分子量不一样的其它成分分开。
优选地，步骤5中所述柱层析样品I与凝胶填料的质量比为1：1500～2000，如1:1600、1:1700、1:1800、1:1900等；凝胶柱高径比为50～120:1，如60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选地，步骤5中所述凝胶柱层析分离纯化用洗脱溶剂为氯仿甲醇混合溶剂，氯仿和甲醇的体积比为1:0.2～5，优选为1:1，洗脱流速为3～5秒/滴，分段收集洗脱液，每0.1～0.5个柱体积为一个流份，洗脱完后经硅胶薄层板检测，合并成分相同的洗脱液，减压浓缩得目标I段组分、目标II段组分和目标Ⅲ段组分。
所述硅胶薄层板检测方法为：正相硅胶薄层高效预制板，展开剂为氯仿甲醇混合溶剂，氯仿和甲醇的体积比为10～2：1，如9:1、8:1，7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。显色方法：以5vol％～15vol％的硫酸乙醇溶液为显色剂，105～115℃加热显色，根据目标化合物对照品的斑点的Rf值和颜色进行合并。
优选地，步骤6中所述半制备型高效液相色谱用色谱柱为规格10mm×250mm，10μm的耐酸性C18色谱柱，可商购获得，例如可以为Waters X-Bridge C18或Waters SunfireC18。
优选地，步骤6中，所述0.1wt％～0.3wt％的磷酸水溶液为流动相A，所述乙腈为流动相B，洗脱方式为等度洗脱：20％～23％流动相B，余量均用流动相A补足至100％，时间20～30min。
白桐树酚类成分呈弱酸性，呈酸性流动相可以抑制其电离，改善色谱峰峰型，更利于分离。
优选地，步骤6中，所述半制备型高效液相色法分离中，上样样品浓度为10～100mg/ml(甲醇溶液)，优选30～50mg/ml，每次上样量为10～100μml，优选30～50μml。
上述半制备型高效液相色谱法分离目标成分的色谱图特征峰分别以相同色谱条件下目标化合物对照品出峰时间为准。
优选地，步骤6中所述目标Ⅲ段组分重结晶为在0～4℃条件下静置，使溶剂缓慢挥发，析出晶体。
本发明中上述步骤所述减压浓缩的温度均为50～65℃，如50℃、55℃、60℃或65℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用；所述减压浓缩的真空度均为-0.08～-0.1Mpa，如-0.08Mpa、-0.085Mpa、-0.09Mpa或-0.095Mpa等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
利用本发明提供的方法首次简单、快速的从白桐树中同时提取分离得到cleomiscosin C、cleomiscosin A、6-姜烯酚、6-姜酚、莨菪亭等酚类化合物。本发明所述提取方法总多酚提取率高，可以有效的从植物原料中提取多酚类化合物；先后利用石油醚和乙酸乙酯萃取，可以快速除去提取物浸膏中大部分小极性的脂溶性成分和大极性水溶性杂质；后将聚酰胺、C18、葡聚糖凝胶等具有不同分离原理的柱层析结合，可以简便、快速将白桐树中酚类化合物与其它成分分离开，最后经半制备新高新液相色谱或重结晶进一步精制即可得到cleomiscosin C、cleomiscosin A、6-姜烯酚、6-姜酚和莨菪亭5个单体化合物，并且纯度均≥98％以上的，柱层析所用填料均可重复利用，经济高效。
附图说明
图1为本发明所制备得到5个酚类化合物的化学结构式
图2为实施例1中目标I段组分的半制备型高效液相色谱图
图3为实施例1中目标II段组分的半制备型高效液相色谱图
图4为实施例1所制备化合物1的1H NMR图谱
图5为实施例1所制备化合物1的13C NMR图谱
图6为实施例1所制备化合物2的1H NMR图谱
图7为实施例1所制备化合物2的13C NMR图谱
图8为实施例1所制备化合物3的1H NMR图谱
图9为实施例1所制备化合物3的13C NMR图谱
图10为实施例1所制备化合物4的1H NMR图谱
图11为实施例1所制备化合物4的13C NMR图谱
图12为实施例1所制备化合物5的1H NMR图谱
图13为实施例1所制备化合物5的13C NMR图谱
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
白桐树原料购自昆明植分生技术有限公司。
本申请实施例中样品的检测分析方法如下：
1、步骤5中凝胶柱层析时，用于检测洗脱液成分的TCL(薄层色谱法)检测方法如下：正相硅胶薄层高效预制板，展开剂为氯仿甲醇混合溶剂体积比8:1。显色方法：以10vol％的硫酸乙醇溶液为显色剂，105℃加热显色，根据目标化合物对照品的斑点的Rf值和颜色进行合并。
2、本申请的实施例中化合物样品结构鉴定方法如下：
利用氢谱1H NMR和碳谱13C NMR分析，分析仪器为Bruker DPX 400型核磁共振波谱仪，溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6，sigma)或氘代氯仿(CDCl3,sigma)。
3、本申请的实施例中化合物样品纯度测定方法如下：
利用高效液相色谱法测定各化合物样品的纯度，色谱条件如下：
分析型色谱柱为Zorbax Eclipse XDB-C18(Agilent，4.6cm×150cm)，流动相色谱甲醇水溶液，梯度洗脱5％-95％，0-30min检测波长300nm,采用峰面积归一化法计算各化合物的纯度，计算公式为：
式中Ai为待化合物的的峰面积，A总为在保留时间在5-30min内总有色谱峰峰面积之和。(注若无明显杂质峰，则定义纯度≥98％)
实施例1
本实施例提供一种从白桐树中提取酚类化合物的方法，具体包括以下步骤：
(1)白桐树干燥枝7.6kg，加100L水100℃热回流提取，时间为2h，提取3次，合并提取液，减压浓缩(温度55℃、压力-0.09MPa)回收溶剂得浸膏(226g)。
(2)将步骤(1)所得浸膏加水分散至相对密度1.09(测定温度27℃)得水分散液，加入1倍体积石油醚萃取脱脂，收集水相部位，在用1倍体积乙酸乙酯萃取，萃取5次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩(温度55℃、压力-0.09MPa)得乙酸乙酯萃取物(83.3g)；
(3)将步骤(2)所得乙酸乙酯萃取物通过聚酰胺柱层析(乙酸乙酯萃取物与聚酰胺填料的质量比为1:80，型号60-100目，柱高径比为10：1)，压力5～10ba，流速5ml/min，以乙醇-水溶液梯度洗脱，先用30vol％乙醇洗脱6个柱体积，再用70vol％乙醇水溶液洗脱5个柱体积，最后用95vol％乙醇冲洗柱子，收集70vol％乙醇洗脱液，减压浓缩(温度55℃、压力-0.09MPa)回收溶剂得白桐树总多酚粗品(16.9g)；
(4)将步骤(3)所得白桐树总多酚粗品通过C18柱层析(C18为Merck LichroprepRP-18，孔径
粒径40～63μm,所述柱层析样品I与C18填料的质量比为1：100所述C18柱的高径比为20:1)，以甲醇-水溶液，按照以下程序梯度洗脱，30vol％、70vol％、95vol％，每个梯度洗脱6个柱体积，收集70vol％甲醇洗脱液，减压回收溶剂后得柱层析样品I(8.9g)；
(5)将实施例1中步骤(4)所得柱层析样品I，取100mg进行Sephadex HP-20凝胶柱层析(样品I与凝胶填料的质量比为1:2000，凝胶柱高径比为120:1)，以氯仿甲醇(1：1)洗脱，流速为3-5秒/滴，分段收集洗脱液，每10ml一份，洗脱完后经TLC检测，合并成分相同的洗脱液减压浓缩得目标I段组分、目标II段组分和目标Ⅲ段组分；
(6)将目标I段组分通过半制备型高效液相色谱纯化(Waters X-Bridge C18,10mm×250mm，10μm)，采用乙腈-0.1wt％磷酸水溶液体系以4ml/min的流速洗脱，洗脱程序为(以体积百分比计)：0.1wt％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，等度洗脱：22％流动相B，余量均用流动相A补足至100％，时间30min；检测器为DAD检测器，检测波长为300nm，分别收集20.8min和25.4min色谱峰洗脱液(色谱图见图2)，减压浓缩干燥得化合物1(11.8mg，纯度98％)和化合物2(8.6mg，纯度≥98％)；
将目标II段组分通过半制备型高效液相色法分离纯化，色谱条件同上述目标I段组分，分别收集23.8min和25.6min色谱峰洗脱液(色谱图见图3)，减压浓缩干燥得化合物4(10.5mg，纯度≥98％)和化合物5(16.5mg，纯度≥98％)，纯度为峰面积归一化法测定；
将目标Ⅲ段组用甲醇溶解后，置于无色透明硬质高硼硅西林瓶中，用封口膜封口后，在封口处用0.5mm毛细管刺孔5个，再放置于4度冰箱，使溶剂缓慢挥发，制得化合物3晶体(13.6mg,纯度≥98％)。
化合物1-5的结构鉴定：
化合物(1)：白色粉末，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH:9.20(1H,br s,OH-4′),7.97(1H,d,J＝9.6Hz,H-4),6.84(1H,s,H-5),7.03(1H,d,J＝1.6Hz,H-2′),6.88(1H,dd,J＝8.4,1.6Hz,H-6′),6.84(1H,s,H-5),6.83(1H,d,J＝8.4Hz,H-5′),6.34(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),5.10(1H,br s,OH-9′),4.99(1H,d,J＝8.0Hz,H-7′),4.25(1H,m,H-8′),3.82(3H,s,OCH3-6),3.81(3H,s,OCH3-3′),3.45(1H,m,H-9′a),3.78(1H,m,H-9′b),0.89(3H,t,J＝6.8Hz,H-10).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:160.0(C-2),113.2(C-3),144.8(C-4),100.7(C-5),145.2(C-6),137.0(C-7),131.7(C-8),138.0(C-9),111.2(C-10),126.2(C-1′),112.0(C-2′),147.6(C-3′),147.2(C-4′),115.3(C-5′),120.8(C-6′),76.2(C-7′),77.8(C-8′),59.8(C-9′),55.7(OCH3-6),55.8(OCH3-5′)。上述数据与文献(Kan S,Chen G Y,HanC R,et al.Chemical constituents from the roots of Xanthium sibiricum[J].Natural Product Research,2011,25(13):1243–1249.)对照一致，故化合物(1)鉴定为Cleomiscosin C，结构式见图1(1)，1H NMR和13C NMR谱图见图4-5。
化合物(2)：白色粉末，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δH:8.50(1H,s,OH-4′),7.88(1H,d,J＝9.6Hz,H-4),6.74(2H,s,H-2′,6′),6.81(1H,s,H-5),6.28(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),5.12(1H,br s,OH-9′),5.00(1H,d,J＝8.0Hz,H-7′),4.25(1H,m,H-8′),3.83(3H,s,OCH3-6),3.82(6H,s,OCH3-3′,5′),3.78(1H,m,H-9′b),3.45(1H,m,H-9′a),3.51(1H,s,).13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:160.0(C-2),114.0(C-3),144.8(C-4),100.7(C-5),145.2(C-6,4′),137.0(C-7),131.6(C-8),138.0(C-9),111.2(C-10),125.7(C-1′),105.6(C-2′,6′),147.9(C-3′,5′),136.2(C-4′),76.5(C-7′),77.8(C-8′),59.8(C-9′),55.8(OCH3-6),56.4(OCH3-3′,5′)。上述数据与文献(Ray AB,Chattophdhyay S K.Structure of Cleomiscosin A,acoumarinolignoid of Cleome viscose seeds[J].Tetrahedron Letters,1980,21:4477–4480.)对照一致，故化合物(2)鉴定为Cleomiscosin A，结构式见图1(2)，1H NMR和13C NMR谱图见图6-7。
化合物(3)：白色粉末，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH:3.95(3H,s,7-OCH3),6.27(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),6.85(1H,s,H-8),6.92(1H,s,H-5),7.61(1H,d,J＝9.5Hz,H-4).13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC:161.5(C-2),113.4(C-3),143.3(C-4),107.5(C-5),149.7(C-6),150.3(C-7),103.2(C-8),144.0(C-9),111.5(C-10),56.4(6-OCH3)，上述数据与文献(Wang Z Y,He W J,Zhou W B,et al.Two new phenylpropanoids from Micromelum integerrimum[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2014,12(8):619-622.)对照一致，故化合物(3)鉴定为莨菪亭(Scoploetin)，结构式见图1(3)，1H NMR和13C NMR谱图见图8-9。
化合物(4)：无色透明油状物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH:6.82(1H,dt,J＝16.0,8.0Hz,H-4),6.81(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.70(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.68(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6′),6.09(1H,dt,J＝16.0,1.6Hz,H-5),3.84(3H,s,-OCH3),2.82(2H,m,H-1),2.72(2H,m,H-2),2.53(2H,m,H-4),1.23～1.56(8H,m,H-6,H-7,H-8,H-9),0.89(3H,t,J＝6.8Hz,H-10).13C-及DEPT NMR(100MHz,CDCl3)δC:29.9(C-1),42.0(C-2),199.9(C-3),130.3(C-4),147.9(C-5),32.5(C-6),23.8(C-7),31.3(C-8),22.4(C-9),14.0(C-10),133.2(C-1′),111.1(C-2′),146.4(C-3′),143.9(C-4′),114.3(C-5′),120.8(C-6′),55.9(-OCH3)，上述数据与文献(包磊，邓安珺，李志宏，等.姜的化学成分研究[J].中国中药杂志，2010，35(5):598-601)对照一致，并通过DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等1D、2D NMR技术对其所有NMR信号进行详细解析和全归属，故化合物(4)鉴定为6-姜酚，结构式见图1(4)，1HNMR和13C NMR谱图见图10-11。
化合物(5):无色透明油状物，1H NMR(400MHz,CDCl3)δH:6.81(1H,d,J＝8.0Hz,H-5′),6.70(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.68(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6′),3.86(3H,s,-OCH3),2.81～2.89(4H,m,H-1,H-2),2.19(2H,dt,J＝7.2,1.4Hz,H-6),1.44(2H,m,H-4),1.23～1.36(4H,m,H-8,H-9),0.89(3H,t,J＝6.8Hz,H-10).13C-NMR(100MHz,CDCl3)δC:36.4(C-1),31.7(C-2),211.5(C-3),49.3(C-4),67.7(C-5),45.4(C-6),25.1(C-7),29.2(C-8),22.6(C-9),14.0(C-10),132.6(C-1′),111.1(C-2′),146.6(C-3′),144.0(C-4′),114.5(C-5′),120.7(C-6′),55.8(-OCH3)。上述数据与文献(孙凤娇，李振麟，钱士辉，等.干姜化学成分研究[J].中国野生植物资源，2016,35(5):20-24,60)对照一致，并通过DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等1D、2D NMR技术对其所有NMR信号进行详细解析和全归属，故化合物(5)鉴定为6-姜烯酚，结构式见图1(5)，1H NMR和13C NMR谱图见图12-13。
实施例2
本实施例提供一种从白桐树中提取酚类化合物的方法，具体包括以下步骤：
(1)白桐树干燥枝8.0kg，加105L70 vol％甲醇水溶液超声辅助热回流提取，提取时间为1h，超声功率为20KHz,提取温度85℃，提取3次，合并提取液，减压浓缩(温度60℃、压力-0.08MPa)回收溶剂得浸膏290.5g。
(2)将步骤(1)所得浸膏加水分散至相对密度1.13(测定温度26℃)得水分散液，加入1倍体积石油醚萃取脱脂，收集水相部位，在用2倍体积乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩(温度60℃、压力-0.085MPa)得乙酸乙酯萃取物(89.9g)；
(3)将步骤(2)所得乙酸乙酯萃取物通过聚酰胺柱层析(乙酸乙酯萃取物与聚酰胺填料的质量比为1:60，型号60-100目，柱高径比为8：1)，压力5～15ba，流速15ml/min，以乙醇-水溶液梯度洗脱，先用25vol％乙醇洗脱5个柱体积，再用65vol％乙醇水溶液洗脱6个柱体积，最后用95vol％乙醇冲洗柱子，收集65vol％乙醇洗脱液，减压浓缩(温度60℃、压力-0.085MPa)回收溶剂得白桐树总多酚粗品；
(4)将步骤(3)所得白桐树总多酚粗品通过C18柱层析(C18为Merck LichroprepRP-18，孔径
粒径40～63μm,所述柱层析样品I与C18填料的质量比为1：150所述C18柱的高径比为35:1)，以甲醇-水溶液，按照以下程序梯度洗脱，25vol％、65vol％，每个梯度洗脱6个柱体积，最后用100vol％甲醇冲洗柱子，收集65vol％甲醇洗脱液，减压回收溶剂后得柱层析样品I(9.2g)；
(5)将步骤(4)所得柱层析样品I，取100mg进行SephadexG-10凝胶柱层析(柱层析样品I与凝胶填料的质量比为1：1700，高径比为80:1)，以氯仿甲醇(1：1)洗脱，流速为3～5秒/滴，分段收集洗脱液，每15ml一份，洗脱完后经TLC检测，合并成分相同的洗脱液减压浓缩得目标I段组分、目标II段组分和目标Ⅲ段组分；
(6)将目标I段组分通过半制备型高效液相色谱纯化(Waters Sunfire C18,10mm×250mm，10μm)，采用乙腈-0.1wt％磷酸水溶液体系以5ml/min的流速洗脱，洗脱程序为(以体积百分比计)：0.1wt％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，等度洗脱：20％流动相B，余量均用流动相A补足至100％，时间30min；检测器为DAD检测器，检测波长为300nm，分别收集19.6min和25.8min色谱峰洗脱液，减压浓缩干燥得化合物1(11.3mg，纯度≥98％)和化合物2(9.0mg,纯度≥98％)；
目标II段组分通过半制备型高效液相色法分离纯化，色谱条件同上述目标I段组分，分别收集23.5min和26.3min色谱峰洗脱液，减压浓缩干燥得化合物4(9.8mg，纯度≥98％)和化合物5(14.2g,纯度≥98％)；
目标Ⅲ段组分按实施例1方法处理，得化合物3(11.9mg,纯度≥98％)。
经测定，化合物1-5的1H NMR和13C NMR数据与实施例1一致。
实施例3
本实施例提供一种从白桐树中提取酚类化合物的方法，具体包括以下步骤：
(1)白桐树干燥枝8.0kg，加65L75％乙醇提超声提取，提取时间为2h，超声功率为30KHz,提取4次，合并提取液，减压浓缩(温度60℃、压力-0.095MPa)回收溶剂得浸膏269.4g。
(2)将步骤(1)所得浸膏加水分散至相对密度1.15(测定温度26℃)得水分散液，加入1倍体积石油醚萃取脱脂，收集水相部位，在用3倍体积乙酸乙酯萃取，萃取1次，合并乙酸乙酯部分，减压浓缩(温度60℃、压力-0.090MPa)得乙酸乙酯萃取物浸膏(73.2g)；
(3)将步骤(2)所得乙酸乙酯萃取物通过聚酰胺柱层析(乙酸乙酯萃取物与聚酰胺填料的质量比为1:100，型号60-100目，柱高径比为：10：1)，压力5～15ba，流速10ml/min，以乙醇-水溶液梯度洗脱，先用28vol％乙醇洗脱8个柱体积，再用60vol％乙醇洗脱3个柱体积，最后用95％乙醇冲洗柱子，收集60vol％乙醇洗脱液，减压浓缩(温度60℃、压力-0.090MPa)回收溶剂得白桐树总多酚粗品(15.3g)；
(4)将步骤(3)所得白桐树总多酚粗品通过C18柱层析(C18为Merck LichroprepRP-18，孔径
粒径40～63μm,所述柱层析样品I与C18填料的质量比为1：150所述C18柱的高径比为40:1)，，以甲醇-水溶液，按照以下程序梯度洗脱，28vol％、60vol％、95vol％甲醇，每个梯度洗脱6个柱体积，收集60vol％甲醇洗脱液，减压回收溶剂后得柱层析样品I(7.39g)；
(5)将步骤(4)所得柱层析样品I，取100mg进行SephadexG-25凝胶柱层析(样品I与凝胶填料的质量比为1：1500，高径比为60:1)，以氯仿甲醇(1：1)洗脱，流速为3～5秒/滴，分段收集洗脱液，每8min一份，洗脱完后经TLC检测，合并成分相同的洗脱液减压浓缩得目标I段组分、目标II段组分和目标Ⅲ段组分。
(6)将目标I段组分通过半制备型高效液相色谱纯化(Waters X-Bridge C18,10mm×250mm，10μm)，采用乙腈-0.1wt％磷酸水溶液体系以3ml/min的流速洗脱，洗脱程序为(以体积百分比计)：0.1wt％的磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，等度洗脱：24％流动相B，3余量均用流动相A补足至100％，时间30min；检测器为DAD检测器，检测波长为300nm，分别收集21.1min和26.2min色谱峰洗脱液，减压浓缩干燥得化合物1(10.7mg,纯度≥98％)和化合物2(8.3mg,纯度≥98％)；
目标II段组分通过半制备型高效液相色法分离纯化，色谱条件同上述目标I段组分，分别收集23.6min和25.1min色谱峰洗脱液，减压浓缩干燥得化合物4(8.2mg，纯度≥98％)和化合物5(14.9g，纯度≥98％)；
目标Ⅲ段组分按实施例1方法处理，得化合物3(10.1mg，纯度≥98％))。
经测定，化合物1-5的1H NMR和13C NMR数据与实施例1一致。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Claims (10)
1.一种从白桐树中提取酚类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1：将白桐树植物原料加入溶剂进行提取获得提取液，提取液减压浓缩获得浸膏，所述溶剂为甲醇、乙醇或水中的任意一种或至少两种的组合；
步骤2：将步骤1所得浸膏加水分散至相对密度1.05～1.20(室温时测定值)，得水分散液，加入石油醚萃取，收集水相部分，再用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯部分，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；
步骤3：将步骤2所得乙酸乙酯萃取物经聚酰胺柱层析分离纯化得白桐树总多酚粗品；
步骤4：将步骤3所得白桐树总多酚粗品经C18柱层析分离纯化得柱层析样品I；
步骤5：将步骤4所得柱层析样品I经凝胶柱层析分离纯化得目标I段组分、目标II段组分和目标Ⅲ段组分；
步骤6：将目标I段组分和目标II段组分分别经半制备型高效液相色谱法分离纯化得酚类化合物cleomiscosin C、cleomiscosin A、6-姜烯酚和6-姜酚，所述半制备色谱的分离条件为：色谱柱为耐酸性C18色谱柱，以0.1～0.3wt％的磷酸水溶液和乙腈为流动相，检测波长300～365nm，流速2～5ml/min，分别收集对应于目标成分的色谱图特征峰的洗脱液，浓缩干燥既得所述酚类化合物；
将目标Ⅲ段组分经重结晶得酚类化合物莨菪亭，所述重结晶溶剂为甲醇、乙醇、氯仿中任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1中所述提取中白桐树植物原料与溶剂的质量体积比为1:8～20，单位为g/ml；所述提取方法为热回流提取、超声提取或超声辅助热回流提取中的任意一种或至少两种的组合；提取次数为1～4次，合并多次提取液，减压浓缩回收溶剂得浸膏；
优选地，所述超声提取，超声功率为20KHz～40KHz，超声时间为1～3h；
优选地，所述热回流提取，温度为50～100℃，时间为1～3h；
优选地，所述超声辅助热回流提取，超声功率为20KHz～40KHz，超声时间为1～3h，温度为50～100℃；
优选地，所述减压浓缩为浓缩至无有机溶剂气味且相对密度在1.20以下(室温时测定值)。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2中所述石油醚萃取中水分散液与石油醚的体积比为1:1～3；所述乙酸乙酯萃取中，水相部分与乙酸乙酯的体积比为1:1～3。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤3中所述聚酰胺柱填料为粒径30～200目的聚酰胺；柱层析洗脱溶剂为乙醇水溶液，洗脱流速为5～20ml/min，洗脱方式为梯度洗脱：先用25vol％～30vol％乙醇洗脱5～8个柱体积除去杂质，再用60vol％～75vol％乙醇洗脱3～6个柱体积，收集洗脱液，最后用95vol％乙醇冲洗柱子；
优选地，所述洗脱在5～20bar的中低压色谱条件下进行。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤3中所述乙酸乙酯萃取物与聚酰胺填料的质量比为1:50～100；所述聚酰胺柱的高径比为5～10:1。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤4中所述C18柱填料为RP-C18，孔径
粒径40～63μm；柱层析洗脱溶剂为甲醇水溶液，洗脱流速为5～20ml/min，洗脱方式为：先用25vol％～30vol％甲醇洗脱4～8个柱体积去除杂质，再用60vol％～70vol％甲醇洗脱4～8个柱体积，收集洗脱液，最后用95vol％～100vol％甲醇冲洗柱子；
优选地，所述洗脱在5～20bar的中低压色谱条件下进行；
优选地，所述白桐树总多酚粗品与C18填料的质量比为1：100～150，所述C18柱的高径比为20～40:1。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5中所述凝胶柱填料为交联度≤25的交联葡聚糖凝胶及其衍生物；洗脱溶剂为氯仿甲醇混合溶剂，氯仿和甲醇的体积比为1:0.2～5；洗脱流速为3～5秒/滴；
优选地，所述柱层析样品I与凝胶填料的质量比为1：1500～2000，所述凝胶柱高径比为50～120:1。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述凝胶柱填料为SephadexG-25、SephadexG-10、Sephadex LH-20中的任意一种。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤6中，所述0.1wt％～0.3wt％的磷酸水溶液为流动相A，所述乙腈为流动相B，洗脱方式为等度洗脱：20％～23％流动相B，余量均用流动相A补足至100％。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤6中所述目标Ⅲ段组分重结晶为在0～4℃条件下静置，使溶剂缓慢挥发，析出晶体。
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| GR01 | Patent grant | ||
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