CN109797160A - 一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于构建一种异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A重组毕赤酵母,具体步骤如：(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:固体诱导培养基获得菌丝体，试剂盒提取总RNA和cDNA；(2)目的基因的克隆:用合理引物PCR扩增出目的基因；(3)构建表达载体:以Ppic9k为载体,将目的基因***启动子AOX1下游,5'和3'端酶切位点分别为EcoRⅠ，NotⅠ；(4)获取重组菌株:以SalⅠ为线性化位点,实现表达载体线性化,电转，得到重组酵母；(5)重组菌株的诱导产酶：摇瓶发酵，用适当甲醇诱导产酶；(6)重组蛋白活性检测：利用SDS‑PAGE及刚果红‑CMC检测重组蛋白的表达量及活性。本方法构建的重组菌株能高效表达带his标签的蛋白，能得到高效单酶组分。

Description

一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A的构建 方法

技术领域

本发明涉及一种异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A的重组毕赤酵母***的构建,属于基因工程技术领域。

背景技术

木质纤维素生物质是地球上廉价且丰富的可再生资源，来源也广泛，包括常见的农作物秸秆、树木枝叶等。如果能实现木质纤维素的高效降解，通过生物转化来生产高附加值的产品，这将在一定程度上能够减少这类资源的浪费，这对于人类社会的可持续性发展具有积极的意义。传统纤维素酶的降解效率较低。传统纤维素酶由3类组成，即β-葡萄糖苷酶、内切葡聚糖酶以及外切葡聚糖酶。3类酶在纤维素水解过程中相互协同。但传统纤维素酶中只有外切葡聚糖酶能作用于难降解的纤维素结晶区，水解结晶纤维素。

就目前工业应用最为广泛的产纤维素酶真菌里氏木霉而言,其纤维素酶系中缺乏外切酶和一葡萄糖普酶,导致其纤维素酶系酶解效率低下。所以,优化定制纤维素酶,使各组分达到最佳配比,才能在最少酶用量时获得最优的水解效果。因此,为了优化定制纤维素酶,获得纤维素酶单酶组分十分关键。

近些年来,异源表达纤维素酶基因获得单酶组分是研究热点。可以实现翻译后修饰作用,如糖基化、二硫键形成,使蛋白可以进行正确折叠,并获得有活性的目标蛋白,另外,毕赤酵母并不产生内源性木质纤维素酶组分,且胞外蛋白成分并不复杂,重组毕赤酵母菌发酵上清液甚至可以不经过纯化直接作为单酶制剂进行使用,因此,以作为首选宿主菌,实现纤维素酶组分异源表达以获得高浓度和高纯度的纤维素酶蛋白组分,已成为研究热点。

发明内容

本发明的目的在于构建一种异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的重组毕赤酵母。

本发明提供的异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的毕赤酵母***具体步骤如：

(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:将里氏木霉QM9414培养出绿色孢子，接种于诱导培养基获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；

(2)目的基因的克隆:设计合理引物的同源臂，PCR扩增出目的基因；

(3)构建表达载体:采用同源重组的方法，以Ppic9k质粒为载体,将Cel6A,Cel7A基因***启动子AOX1下游,5'端酶切位点为EcoRⅠ,3'端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体；

(4)获取重组菌株:以bglⅠ为Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,通过电转化转入毕赤酵母，得到重组酵母；

(5)重组菌株的诱导产酶：通过摇瓶发酵，加入适当甲醇诱导产酶；

(6)重组蛋白活性检测：利用SDS-PAGE检测分泌的蛋白是否有目的蛋白以及刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶。

本发明的的积极意义

1.本发明采用同源重组的方法构建载体，较传统方法更为简便快速，大大缩短构建周期。

2.本发明优化了目的基因的引物序列,合理引入6个组氨酸(His)对应的密码子，以使得目的蛋白中含组氨酸，便于后续利用镍柱对其进行纯化。

3.本发明构建表达载体时,酶切***启动子AOX1的下游，合理的设计诱导剂甲醇的添加量，使诱导效果最好，提高重组毕赤酵母菌表达效率。

4.本发明检测重组蛋白是否具有纤维素酶降解作用时，采用刚果红-cmc的定性检测，相比DNS法更简洁迅速，误差少。

5.本发明获得提取里氏木霉QM9414总RNA时，采用固体诱导培养基(表面铺玻璃纸)培养菌丝，增大了成功率。

6.本发明实现了纤维素酶蛋白Cel6A,Cel7A在毕赤酵母中的异源表达,提高了重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率,提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。

附图说明

图1是Cel6A(a)，Cel7A(b)的PCR扩增图；

图2是Ppic9k-Cel6A(a)，Cel7A(b)的菌落PCR验证图；

图3是Ppic9k-Cel6A(a)，Cel7A(b)表达质粒图谱；

图4是线性化核酸电泳图Cel6A(a)，Cel7A(b)；

图5是Cel6A(a)，Cel7A(b)重组毕赤酵母的基因组PCR图；

图6是刚果红-CMC验证诱导酶是否活性EGⅡ(a)，Cel7A(b)；

图7是Cel6A(a)，Cel7A(b)菌株发酵液上清的SDS-PAGE图；

图8是PCR扩增Cel6A(a)，Cel7A(b)的测序对比图。

具体实施方式

实施案例1目的基因的克隆

1.将保存于甘油管的里氏木霉QM9414孢子悬液，从-80℃冰箱中取出置于冰(或4℃冰箱)中解冻，至孢子悬液完全融化。将孢子悬液振荡混合均匀，接种环沾取少量菌液，在PDA培养基平板上划线接种。用封口膜将平板封口后，正置于28℃培养箱中培养。培养约5-7天，至培养基表面上布满绿色孢子。将平板从培养箱中取出，置于4℃冰箱中备用。

2.将新鲜孢子接种于纤维素酶固体诱导培养，表面铺上灭菌的玻璃纸，静置培养，直到菌丝长出来。从玻璃纸上刮下菌丝，用液氮冷冻研磨仪处理后，RNA的提取用UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒，RNA的反转录用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。

3.以合成的的里氏木霉cDNA模板，通过同源引物PCR扩增出QM9414的Cel6A,Cel7A所对应的基因序列,扩增PCR图见图1，测序对比结果见图8。

实施案例2 Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体的构建

1.先将Buffer置于冰中，待其充分融化并混合均匀后，配制双酶切反应体系，配制完毕后混合均匀，置于37℃水浴锅内，酶切30min。酶切结束后，使用纯化回收试剂盒回收酶切产物，以去除酶切产物中的残余酶与寡链核苷酸，以免影响后续的质粒与目的基因的连接。

2.以5'端EcoRⅠ为酶切位点,3'端NotⅠ为酶切位点，***Ppic9k质粒载体启动子AOX1下游,构建表达载体Ppic9k-Cel6A,Cel7A,表达载体图谱见图3。菌落PCR验证见图2。并通过单酶切对表达载体进行验证,以确定表达载体Ppic9k-Cel6A,Cel7A构建成功。

实施案例3线性化表达载体Ppic9k-Cel6A,Cel7A并进行电转化

1.以SaIⅠ为Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体线性化位点,实现表达载体线性化,核酸电泳对线性化后的质粒进行验证,见图4。通过电转化转入毕赤酵母GS115，涂板得到转化子。

2.利用SDS热裂解法粗提1得到的重组酵母转化子的基因组，通过PCR验证其正确性和表型，基因组PCR核酸图见图5.利用抗生素浓度梯度筛选多拷贝转化子,将能在高浓度抗性平板上正常生长的菌落筛选出来。

实施案例4重组毕赤酵母诱导产酶并验证其酶活性

1.将高拷贝转化子的单菌落，接种于25mlBMGY种子培养基，29℃290rpm培养至OD600＝2(约16-18h)，离心5min后收集菌体，用BMYY培养基重悬至OD600＝1为止。灭菌纱布盖住，放入摇床29℃继续培养，每24小时，加甲醇至0.5％浓度，直至到达最佳诱导时间。定时取样1ml，室温离心，收集上清。

2.将100ul上清加到含0.5％CMC的琼脂平板的空穴中，50℃培养1h。用0.1％刚果红染色1h，再用1mol/LNacl脱色40min。，Nacl就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大小不一的透明圈，大的透明圈分解纤维素的能力就强，如图6。

3.采5％浓缩酵；12％分离胶，加入处理好的样品上清，其SDS-PAGE见图7的。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A的构建方法

<130> 2019

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2022

<212> DNA

<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）

<400> 1

caaaaaacaa ctaattattc gaaggatcca aacgatgaga tttccttcaa tttttactgc 60

agttttattc gcagcatcct ccgcattagc tgctccagtc aacactacaa cagaagatga 120

aacggcacaa attccggctg aagctgtcat cggttactca gatttagaag gggatttcga 180

tgttgctgtt ttgccatttt ccaacagcac aaataacggg ttattgttta taaatactac 240

tattgccagc attgctgcta aagaagaagg ggtatctctc gagaaaagag aggctgaagc 300

ttacgtagaa ttcatgcagt cggcctgcac tctccaatcg gagactcacc cgcctctgac 360

atggcagaaa tgctcgtctg gtggcacgtg cactcaacag acaggctccg tggtcatcga 420

cgccaactgg cgctggactc acgctacgaa cagcagcacg aactgctacg atggcaacac 480

ttggagctcg accctatgtc ctgacaacga gacctgcgcg aagaactgct gtctggacgg 540

tgccgcctac gcgtccacgt acggagttac cacgagcggt aacagcctct ccattggctt 600

tgtcacccag tctgcgcaga agaacgttgg cgctcgcctt taccttatgg cgagcgacac 660

gacctaccag gaattcaccc tgcttggcaa cgagttctct ttcgatgttg atgtttcgca 720

gctgccgtgc ggcttgaacg gagctctcta cttcgtgtcc atggacgcgg atggtggcgt 780

gagcaagtat cccaccaaca ccgctggcgc caagtacggc acggggtact gtgacagcca 840

gtgtccccgc gatctgaagt tcatcaatgg ccaggccaac gttgagggct gggagccgtc 900

atccaacaac gcgaacacgg gcattggagg acacggaagc tgctgctctg agatggatat 960

ctgggaggcc aactccatct ccgaggctct taccccccac ccttgcacga ctgtcggcca 1020

ggagatctgc gagggtgatg ggtgcggcgg aacttactcc gataacagat atggcggcac 1080

ttgcgatccc gatggctgcg actggaaccc ataccgcctg ggcaacacca gcttctacgg 1140

ccctggctca agctttaccc tcgataccac caagaaattg accgttgtca cccagttcga 1200

gacgtcgggt gccatcaacc gatactatgt ccagaatggc gtcactttcc agcagcccaa 1260

cgccgagctt ggtagttact ctggcaacga gctcaacgat gattactgca cagctgagga 1320

ggcagaattc ggcggatcct ctttctcaga caagggcggc ctgactcagt tcaagaaggc 1380

tacctctggc ggcatggttc tggtcatgag tctgtgggat gattactacg ccaacatgct 1440

gtggctggac tccacctacc cgacaaacga gacctcctcc acacccggtg ccgtgcgcgg 1500

aagctgctcc accagctccg gtgtccctgc tcaggtcgaa tctcagtctc ccaacgccaa 1560

ggtcaccttc tccaacatca agttcggacc cattggcagc accggcaacc ctagcggcgg 1620

caaccctccc ggcggaaacc cgcctggcac caccaccacc cgccgcccag ccactaccac 1680

tggaagctct cccggaccta cccagtctca ctacggccag tgcggcggta ttggctacag 1740

cggccccacg gtctgcgcca gcggcacaac ttgccaggtc ctgaaccctt actactctca 1800

gtgcccacca ccaccaccac cactgagcgg ccgcaaaatc gtcgacctgc aggcatgcaa 1860

gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 1920

ttaatcgcct tgcagcacat cccgaattcc ctagggcggc cgcgaattaa ttcgccttag 1980

acatgactgt tcctcagttc aagttgggca ctacgagaag ac 2022

<210> 2

<211> 1397

<212> DNA

<213> 里氏木霉（Trichoderma reesei）

<400> 2

tttgcggccg cttagtggtg gtggtggtgg tgcaggaacg atgggtttgc gtttgtgaga 60

agctgcacaa agtaggcttg gaaccaagca ccagcttgag gcgccggttg caaggcatct 120

gggagcgcac agtgggagtc aaatcgtggc gcactgctgt cgctggtgcc gtcacactcg 180

ccgcctggct tgacccagac aaacgaatcc agcaacgagt ccccagtgtt tgcggatggg 240

cgaataccaa atccggtgcc gatcacattg caccagtctc cccactgttg ctgtccggta 300

ggctgctttc ccgatcgacc ttgatcagtg atgaagaagg cgttggacca gccgtgattg 360

gcaagaagag gtccaatagc gtggatgtac agcttctcgt tgtagacagc gttgccttgc 420

gtgtacgatg ggggggctgg taatgttcca cccgttgtag ttggcgacat tggttgccaa 480

tccgcgaaga gctctcggag acgatgcatt cttgtaaaca tttgcaaata gctgagcggc 540

cgggtcttgg tttgccggcc agccaagcca tcctgcatgg ccagcgtcca aatacatcgc 600

aacatttgga aggttcagct gtgtgacggc gtagttgatg cactcaaggt aggctgactg 660

agcattggca cactttggag taccgaggtt ggtcaccagg ttggcaagag agtcaggctc 720

aataaccagg agggtccgga tatcggaata ttccacgaca atttgacgaa tggtgtcgat 780

atagttctta tatttggcga cgccaccatc ggcaatagag tattcgccat tcgaggcaag 840

ggcagcgcaa tcgcgatccg gcaagtcata caccacaaac tgtccggcat agttaccgcc 900

attcttgttg gcggtgcgga tgtcggccaa ggtttgctcc atgagagggg tcttgtcaag 960

agtatctagc cacataaaag agggaacctt tgcgacagct gctgcagcag tggccatggc 1020

tccagtcaag ctaggaatag cgaggctgct aacttcagag gcgtaatatg cattggccca 1080

aggagtgacc ccaacaaaag ggttgcctga atacgtagcg gttcccgatc cgactggagg 1140

tactctggta gtagtagaac caggtggagg cgtcgcggag ctcgaccggg atgttgtggg 1200

ggatactcga gaagtcgtcg acgcggcgcg cgtggacgag cttgagcttg cagcgccggg 1260

aagacactgg gagtaatagt cgttggagta gacgcatgtg cttccggaag cacagcaagt 1320

cggacccgac caattctggc caccacattg gccccagacg cttgagcaag cttgcatgaa 1380

ttccgaatct ctagagg 1397

Claims (7)

1.一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，包括以下步骤：

(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:将里氏木霉QM9414培养,直至出绿色孢子，然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；

(2)目的基因的克隆:利用合理同源引物，合适条件，PCR扩增出Cel6A,Cel7A的基因；

(3)构建表达载体:以Ppic9k质粒为载体,将Cel6A,Cel7A基因***启动子AOX1下游,5'端酶切位点为EcoRⅠ,3'端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体；

(4)获取重组菌株:以SalⅠ为Ppic9k-Cel6A,Cel7A表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,然后通过电转化转入毕赤酵母，得到Cel6A,Cel7A的重组酵母；

(5)重组菌株的诱导产酶：将筛选后的菌株，摇瓶发酵，加入适当甲醇诱导产酶；

(6)重组蛋白活性检测：刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶；SDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量。

2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，采用同源重组的方法构建载体，较传统方法更为简便快速，大大缩短构建周期。

3.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，优化了目的基因的引物序列,合理引入6个组氨酸(His)对应的密码子，以使得表达的目的蛋白中含组氨酸，可以与镍柱结合，便于后续利用镍柱对其进行纯化。

4.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A的构建方法，其特征在于，获得提取里氏木霉QM9414总RNA时，采用固体诱导培养基(表面铺玻璃纸)培养菌丝。

5.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A的构建方法，其特征在于，检测重组蛋白是否具有纤维素酶降解作用时，采用刚果红-cmc的定性检测，相比DNS法更简洁迅速，误差少。

6.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，构建表达载体时,酶切***启动子AOX1的下游，添加适量的诱导剂甲醇，提高重组毕赤酵母菌表达效率。

7.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达Cel6A,Cel7A蛋白的构建方法，其特征在于，实现了纤维素酶蛋白Cel6A,Cel7A在毕赤酵母中的异源表达,提高了重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率,提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。