CN105219664B - 一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组基因工程菌构建及高活性β‑D‑1,4‑内切木聚糖酶的制备与应用。通过构建基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K‑xynAm CGMCC No.10696及代谢的高活性β‑D‑1,4‑内切木聚糖酶。较未删除MRTIKFLFALAITTVAKA和简单优化xynA活性提高1300倍，纯化后重组β‑D‑1,4‑内切木聚糖酶可以专一地水解低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4‑O‑Methyl‑D‑glucurono‑D‑Xylan，不水解地衣多糖和大麦β‑葡聚糖，在饲料和造纸等领域具有广泛的应用价值。

Description

一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的 制备与应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程及酶工程技术领域，具体地说，本发明涉及构建重组基因工程菌及制备与应用高活性木聚糖酶的技术领域。

背景技术

木聚糖是由β-D-1,4-木糖苷键连接并含有多种取代基的非淀粉多糖(Non-strachpolysaccharides，NSP)，是植物细胞壁半纤维素的重要组分。现有文献Mendoza G D,Loera-Corral O,Plata-P é rez F X,et al.2014.Considerations on the use ofexogenous fibrolytic enzymes to improve forage utilization.A ScientificWorldJournal,2014:247437.公开了由于动物本身并不产生降解木聚糖的酶类，因此除反刍动物外，畜禽对木聚糖的利用率较低。木聚糖水解酶系主要包括水解主链的β-D-1,4-内切木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-1,4-外切木糖苷酶和水解侧链的α-L-***呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶以及乙酰木聚糖酯酶等(Patel S J,Savanth V D.2015.Review on fungalxylanases and their applications.International Journal of Advanced Research,3(3):311-315.)。这些酶中，β-D-1,4-内切木聚糖酶对木聚糖降解起主要作用，在食品、造纸、能源、饲料以及生物转化等领域应用广泛。

Potera C.2006.Progress with biofuels will depend on,drivemicrobiology research.Microbe 1(7):317–322.报道：由于真菌可产生将木质纤维素转化为可发酵糖类的高活性酶类，因此被认为是最具研究价值和最有潜力微生物。Orpinomyces sp.PC-2属于多中心厌氧真菌，从其DNA中共分离出17个编码碳水化合物降解酶的基因(Ljungdahl L G.2008.The cellulase/hemicellulase system of theanaerobic fungus Orpinomyces PC-2 and aspects of its applied use.Annals ofthe New York Academy of Sciences,1125(1):308-321.)，其中β-D-1,4-内切木聚糖酶属于糖苷水解酶第11家族成员。Li et al(2007)在红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)中表达了来源于Orpinomyces sp.PC-2的β-D-1,4-内切木聚糖酶催化结构域，在发酵第5天，活性达到50～360U/mL。这表明，来源于Orpinomyces sp.PC-2的β-D-1,4-内切木聚糖酶具有潜在的开发价值。与其他来源的β-D-1,4-内切木聚糖酶相比，Orpinomyces sp.PC-2的β-D-1,4-内切木聚糖酶更具优势。研究发现，当以桦木木聚糖为底物时，Orpinomyces sp.PC-2的天然β-D-1,4-内切木聚糖酶比活性达到3500U/mg蛋白质，而其他来源的β-D-1,4-内切木聚糖酶比活性仅为20～600U/mg。如来源于绿色木霉(Trichoderma viride)和Aspergillussyndowii的β-D-1,4-内切木聚糖酶比活性分别为152U/mg和204U/mg。Teixeira等(2010)报道当以麸皮为碳源时，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)产生的β-D-1,4-内切木聚糖酶比活性达到490U/mg。

虽然Orpinomyces sp.PC-2的β-D-1,4-内切木聚糖酶具有开发价值，但是已经有的研究表明其天然和异源表达水平均较低，并不能满足工业化应用的需要。对外源基因的密码子进行优化是提高外源基因在宿主中表达的途径之一。通过对外源基因密码子优化后，大量外源基因在大肠杆菌、毕赤酵母中得到了高水平表达。如纤维素酶基因优化后酶活性提高1.24倍(Akcapinar G B,Gul O,Sezerman U.Effect of codon optimization onthe expression of Trichoderma reesei endoglucanase 1 in Pichiapastoris.Biotechnology Progress,2011,27(5):1257-1263)。对产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因进行密码子优化后，葡聚糖酶活性较优化前提高25.1％(杨玉霞,张慧玲,汪艳,等.2014.产琥珀酸丝状杆菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达.南京农业大学学报,37(4):123-130.)。

目前对密码子的优化主要限于根据毕赤酵母对密码子的偏爱性利用一些优化软件对密码子进行替换，大部分的密码子优化工具和软件也是基于上述原理而设计的。通过上述方法，一些基因的表达水平得到提高。然而，要使外源基因得到高水平的表达，仅仅依靠上述优化是不够的，还应考虑剔除酶非必需集团的编码区、基因的GC百分比、mRNA二级结构最低自由能、mRNA隐蔽剪接位点和不稳定基序等。而这些在目前的基因优化中并没有得到全面考虑，同时，相关研究还未见报道。

发明内容

针对现有技术中Orpinomyces sp.PC-2的β-D-1,4-内切木聚糖酶的开发价值以及其天然个异源表达产物酶活不高的技术现状，本发明旨在提供一种重组基因工程菌构建及高活性木聚糖酶的制备与应用。本发明通过删除部分非必需基团编码区和密码子多次优化，人工合成编码的厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因优化的核苷酸序列xynAm，构建分泌型酵母表达载体pPIC9K-xynAm，转化宿主细胞毕赤酵母GS115获得重组β-D-1,4-内切木聚糖酶基因工程菌GS115/pPIC9K-xynAm，并在酵母细胞中高效表达重组xynAm基因，获得高活性重组β-D-1,4-内切木聚糖酶，其活性较未删除MRTIKFLFALAITTVAKA和简单优化的xynA活性提高1300倍，在pH 4-10.6之间较为稳定，在饲料和造纸等领域具有广泛的应用价值。

本发明采用的主要技术方案：

通过删除β-D-1,4-内切木聚糖酶N端非必需基团MRTIKFLFALAITTVAKA的编码子，根据酵母对密码子的偏爱性、基因的GC百分比、mRNA二级结构最低自由能、限制性内切酶识别位点、mRNA隐蔽剪接位点和不稳定基序等，采用人工合成源于厌氧真菌Orpinomycessp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因优化的核苷酸序列xynAm，通过构建重组酵母表达载体pPI C9K-xynAm，转化毕赤酵母GS115获得基因工程菌株GS115/pPIC9K-xynAm，并进行高密度深层发酵生产，获得高活性的β-D-1,4-内切木聚糖酶。该重组酶在饲料和造纸等领域具有广泛的应用价值。

本发明具体提供一种产β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌-巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696。

本发明提供的高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌基因序列是一种源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因xynA优化的核苷酸序列，命名为xynAm，长度为1035bp，序列如SEQ ID NO.1所示，此序列是在SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3序列基础上优化而成，所编码的氨基酸密码子可以在巴斯德毕赤酵母中有效表达，该人工合成的DNA共编码344个氨基酸残基，氨基酸残基排列顺序如SEQ ID No.4所示。

具体地，本发明提供一种高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌菌株，命名为GS115/pPIC9K-xynAm。在删除β-D-1,4-内切木聚糖酶N端非必需基团MRTIKFLFALAITTVAKA的编码子后，再根据酵母对密码子的偏爱性、基因的GC百分比、mRNA二级结构最低自由能、限制性内切酶识别位点、mRNA隐蔽剪接位点和不稳定基序等对来源于厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因进行密码子调整和优化，通过人工合成方法获得β-D-1,4-内切木聚糖酶基因xynAm，并将其克隆到表达载体pPIC9K上，转化酵母菌GS115后筛选获得基因工程菌株GS115/pPIC9K-xynAm。经鉴定，此菌株属于产高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的巴斯德毕赤酵母工程菌。

本发明提供的基因工程菌菌株GS115/pPIC9K-xynAm已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2015年4月7日，保藏号是CGMCC No.10696。经微生物学鉴定为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。该菌株能在YPD培养基表面生长，菌落呈白色，突起于培养基表面，菌落表面湿润，有油脂光泽。该菌种可在28-32℃及pH 4.5-8.5范围内均可生长。该菌种表达高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶，获得重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的最适反应温度为55℃，最适反应pH为6.0，活力为3515U/mL。该酶在pH4.0-10.6之间具有较好的稳定性，耐碱性较强。重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm可以专一地水解水解低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Methyl-D-glucurono-D-Xylan。

进一步，本发明提供一种产β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌-巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm菌株的构建方法，具体的获得高效表达β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌构建方法步骤如下：

(1)在GenBank中检索出厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列，登录号：U57819。

(2)删除步骤(1)的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的N端编码MRTIKFLFALAITTVAKA的密码子。

(3)根据酵母密码子偏爱性对β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的密码子进行初步替换。

(4)采用Oligo 6.0分析步骤(3)替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、SnaB I和Avr II的切割位点。

(5)采用BioEdit 7.0分析步骤(4)调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、AAAAAA和TTTTTT以及mRNA不稳定基序，并计算GC百分比，根据GC百分比对密码子进一步调整，使其处于40％-50％之间。

(6)采用RNA Structure 3.2对步骤(5)的mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列，命名为xynAm。

(7)通过对步骤(6)筛选获得的xynAm基因序列采用全基因合成方法获得SEQ IDNo.1所示核苷酸序列。

(8)构建含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体pPIC9K-xynAm。

(9)将重组载体pPIC9K-xynAm转化宿主细胞GS115，获得重组菌株并在酵母细胞中表达，从而获得产β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌，即巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115/pPIC9K-xynAm。

同时，本发明提供一种重组载体pPIC9K-xynAm，所述的重组载体pPIC9K-xynAm的构建方法如下：

将合成的xynAm基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K均用SnaB I和Avr II双酶切，回收纯化酶切产物；纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经PCR以及BamH I和Sal I双酶切鉴定获得重组表达载体pPIC9K-xynAm。

本发明进一步提供一种高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶，通过β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌菌株表达获得。经检测，获得的高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶在摇瓶中表达96h时，酶活性达到3515U/mL，是未删除MRTIKFLFALAITTVAKA和简单优化的xynA的1300倍，与现有技术记载的水平相比有明显提高。

同时，本发明提供了一种高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶，即优化的Orpinomycessp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶，通过制备纯化所表达的β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的获得，具体制备方法步骤如下：

(1)利用基因工程菌，即利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696进行深层发酵，产生的发酵产物经离心后，取6ml上清加入超滤离心管Vivaspin 6中，放入低温高速离心机4℃、12000rpm离心，直到上清超滤浓缩至1ml为止。

(2)浓缩上清经G-75葡聚糖凝胶进行层析纯化，采用部分收集器对洗脱组分进行收集，采用pH5.0的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸缓冲液作为洗脱液；调节适合的流速，每个收集管处停留1min，每管取2μl样品采用Infinite M2000于280nm处测定吸光度，直至OD₂₈₀回至基线后停止收集；根据OD₂₈₀值将处于同一吸收峰的样品进行合并，并测定合并样品的酶活性。

进一步，本发明提供上述高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的详细制备方法，具体制备方法步骤如下：

(1)删除β-D-1,4-内切木聚糖酶基因N端编码MRTIKFLFALAITTVAKA的密码子；

(2)根据酵母密码子偏爱性对β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的密码子进行初步替换；

(3)采用Oligo 6.0分析替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、SnaB I和Avr II的切割位点；

(4)采用BioEdit 7.0分析调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点及mRNA不稳定基序，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、AAAAAA和TTTTTT以及mRNA不稳定基序，并计算GC百分比，再根据GC百分比对密码子最进一步调整，使其处于40-50％之间；

(5)采用RNA Structure 3.2对mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列SEQ ID No.1，并命名为xynAm；

(6)采用全基因合成方法获得SEQ ID No.1所示核苷酸序列；

(7)构建含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体pPIC9K-xynAm；

(8)将重组载体pPIC9K-xynAm转化宿主细胞GS115，获得重组菌株并在酵母细胞中表达；

(9)纯化所表达的木聚糖酶，优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶即获得高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶。

本发明提供经过上述方法获得优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶。所述的高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为6.0；该酶在pH4.0-10.6之间具有较好的稳定性，耐碱性较强；纯化后重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm可以专一地水解低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Methyl-D-glucurono-D-Xylan，但不水解地衣多糖和大麦β-葡聚糖。

本发明提供上述经过优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶用于在非治疗目的降解木聚糖中的应用，即利用上述优化的厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶用于非治疗目的降解木聚糖的应用，降解小麦的能力优于降解燕麦的能力。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:

(1)本发明提供了基因工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696能够高效表达β-D-1,4-内切木聚糖酶，经检测，表达的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm在表达96h时，酶活性达到3515U/mL，是未删除MRTIKFLFALAITTVAKA和简单优化xynA的1300倍，与现有技术记载的水平相比具有明显提高。

(2)本发明提供的一种纯化所表达的β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的方法。纯化后重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm，即获得优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶，所述的高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH为6.0；该酶在pH4.0～10.6之间具有较好的稳定性，耐碱性较强；该高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶可以专一性水解低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Methyl-D-glucurono-D-Xylan，但不水解地衣多糖和大麦β-葡聚糖。

附图说明

图1显示为平板刚果红法鉴定β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm活性图。

图2显示为在摇瓶条件下简单优化的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA和重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm活性比较图，图中A为简单优化的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA的活性图，B为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm活性图。

图3显示为在发酵罐条件下简单优化的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA与重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm活性较图，图中A为简单优化的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA的活性图，B为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm活性图。

图4显示为xynAm培养上清的SDS-PAGE电泳图谱。

图5显示为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA和重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的最适温度和温度稳定性比较图，图中A为简单优化的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA的最适温度和温度稳定性图，B为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的最适温度和温度稳定性图。

图6显示为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA和重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的最适pH和pH稳定性比较图，图中A为简单优化的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA的最适pH和pH稳定性图，B为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的最适pH和pH稳定性图。

图7显示为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的底物特异性。

图8显示为重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm对小麦和燕麦的降解能力比较图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

主要试验材料与试剂：分泌型表达载体pPIC9k及其宿主菌毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115，大肠杆菌DH5α为本实验室保存；限制性内切酶购自大连TaKaRa公司；培养基购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；木聚糖酶底物均购自Sigma公司；SephadexG-75购自美国Bio-Rad公司；超滤离心管Vivaspin6购自Millipore公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

常用培养基及溶液的配制：10×YNB(13.4％酵母氮源碱)：将17.0g YNB(无氨基酸无硫酸铵)，50g硫酸铵，溶于蒸馏水中，定容至500mL，针式过滤法除菌；500×B(0.02％生物素)：1.0g生物素，加500mL蒸馏水溶解，针式过滤法除菌；10×M(5％甲醇)：50mL甲醇，蒸馏水定容到1L，针式过滤法除菌；10×GY(10％甘油)：100mL甘油，蒸馏水定容到1L，高压蒸汽法灭菌；10×D(20％葡萄糖)：葡萄糖100g，蒸馏水定容到0.5L，高压蒸汽法灭菌；1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)：1M K₂HPO₄66mL，1M KH₂PO₄434mL，调pH至6.0(用磷酸或KOH调pH值)，高压蒸汽法灭菌；MD固体培养基：2g琼脂粉，蒸馏水80mL，高压蒸汽法灭菌，冷却至60℃，加入10×YNB 10mL，0.2mL 500×B，10×D 10mL，然后倒板；MM固体培养基：2g琼脂粉，蒸馏水80mL，高压蒸汽法灭菌，冷却至60℃，加入10×YNB 10mL，10×M 10mL，0.2mL 500×B，然后倒板；BMGY生长培养基：酵母浸出物10g，蛋白胨20g，高压蒸汽法灭菌后，分别添加除菌10×GY100mL，10×YNB 100mL，pH6.0的1M磷酸钾缓冲溶液100mL，2mL 500×B；BMMY诱导表达培养基：酵母浸出物10g，蛋白胨20g，高压蒸汽法灭菌后分别添加除菌10×M 100mL，10×YNB100mL，500×B 2mL，pH6.0的1M磷酸钾缓冲溶液100mL；FM22培养基：KH₂PO₄42.9g/L，CaSO₄·2H₂O 1g/L，(NH₄)2SO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O 11.7g/L，K₂SO₄14.3g/L，甘油40g/L，灭菌冷却后用1M KOH调pH至4.5；PMT4微量元素：FeSO₄·7H₂O 11.0g，CuSO₄·5H₂O 1.0g，Na₂MoO₄·2H₂O0.1g，NaI 0.04g，CoCl₂0.25g，MnSO₄·H₂O 1.5g，CaSO₄·2H₂O 0.25g，H₃BO₃0.01g，ZnCl₂3.5g，生物素0.1g，浓H₂SO₄0.5mL，FM₂₂0.5mL，定容至500mL，过滤除菌；0.2M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)：称取Na₂HPO₄·12H₂O 90.48g，柠檬酸15.48g，溶于蒸馏水中，定容到2L；10mg/mL低粘度***木聚糖：1.0g低粘度***木聚糖，加入80mL预热至60℃的0.2M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH6.0)，用磁力搅拌机加热搅拌到全部消融，定容至100mL；1mg/mL木糖标准液：称取0.1000g D-木糖完全溶解，蒸馏水定容至0.1L；DNS显色液：称取182g酒石酸钾钠500mL蒸馏水中，加热(≥45℃)溶解，待完全溶解后，加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，加入262mL提前配制好的2M NaOH溶液，待DNS完全溶解后加入5.12g苯酚和5.06g无水亚硫酸钠，用蒸馏水定容至1L，分装至棕色试剂瓶中，避光放置7～10天才能使用；30％丙烯酰胺溶液：分别Acrylamide 145g，甲叉双丙烯酰胺5.0g分别用蒸馏水溶解，最后合并用蒸馏水定容至500mL；1.0M Tris-HCl(pH6.8)：称取Tris 12.11g溶解在80mL水中，加HCl调pH至6.8，蒸馏水定容至100mL，4℃保存备用；1.5M Tris-HCl(pH8.8)：称取18.17gTris溶解在80mL水中，加HCl调pH至8.8，蒸馏水定容至100mL，4℃保存备用；10％(W/V)SDS：25g SDS，加200mL蒸馏水，搅拌至完全消融，蒸馏水定容至250mL；5×Tris甘氨酸电泳缓冲液：Tris15.1g，甘氨酸(电泳级pH8.3)94g，10％SDS(电泳级)50mL加水定容至1L；2×SDS上样缓冲液：0.5M Tris-Cl(pH6.8)2mL，10％SDS(电泳级)4mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，10％甘油2mL，加水定容至10mL；考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝(R-250)1.25g，甲醇250mL，冰乙酸50mL，蒸馏水定容至500mL；10％(W/V)AP：AP 0.10g，加1mL蒸馏水溶解；考马斯亮蓝G-250显色液：0.05g考马斯亮蓝G-250溶于25mL 90％乙醇，加入85％磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。

主要设备：ECM399型电转化仪(德国BTX公司)；高速冷冻离心机(DIGICEN20-R，西班牙Orto Alresa公司)；核酸蛋白检测仪(Gene Quant，德国GE公司)；酶标仪(InfiniteM200，瑞士TECEN公司)；梯度PCR仪(My Cycler，美国BIO-RAD公司)；半自动部分收集器(Frac-920，美国Amersham公司)；制冷循环器(F12-ED，德国Julabo公司)；GUJS-10L型全自动发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)。

本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

实施例一：β-D-1,4-内切木聚糖酶基因xynAm的获得

β-D-1,4-内切木聚糖酶基因xynAm通过如下方法制备获得，具体的制备方法步骤如下：

(1)在GenBank中检索出厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因，其登录号为U57819。

(2)删除步骤(1)的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的N端编码MRTIKFLFALAITTVAKA的密码子。

(3)根据酵母密码子偏爱性对β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的密码子进行初步替换。

(4)采用Oligo 6.0分析步骤(3)替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、SnaB I和Avr II的切割位点。

(5)采用BioEdit 7.0分析步骤(4)调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、AAAAAA和TTTTTT以及mRNA不稳定基序，并计算GC百分比，根据GC百分比对密码子进一步调整，使其处于40％-50％之间。

(6)采用RNA Structure 3.2对步骤(5)的mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列，命名为xynAm。

(7)通过对步骤(6)筛选获得的xynAm基因序列采用全基因合成方法获得SEQ IDNo.1所示核苷酸序列。

所述xynAm的编码区全长为1035bp，共编码344个氨基酸残基；优化后的序列xynAm与原始序列U57819的相似性为78.55％；与U57819相比，xynAm中共对177个氨基酸残基进行了优化的，有221个密码子被替换；同时，利用Jcat软件对U57819序列进行在线优化，并采用全基因合成方法获得SEQ ID No.3所示的简单优化的xynA核苷酸序列。

实施例二：表达高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696的构建

(1)将实施例一合成的xynAm基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K用SnaB I和Avr II双酶切，回收纯化酶切产物，纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和限制性内切酶鉴定获得重组表达载体pPIC9K-xynAm；

(2)采用SacI对pPIC9K-xynAm进行线性化，并电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。

(4)将转化后的菌液分别涂布在MD平板上，于28-30℃培养48h，挑选生长正常的菌落进行甲醇利用表型鉴定。对甲醇利用表型正确的克隆通过遗传霉素G418硫酸盐筛选获得含高拷贝目的基因的重组酵母工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696。

其中重组酵母工程菌共有18个转化xynAm基因的转化子抗6mg/mL G418硫酸盐，有16个转化xynA基因的转化子抗3mg/mL G418硫酸盐。

本发明提供的基因工程菌菌株GS115/pPIC9K-xynAm已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2015年4月7日，保藏号是CGMCC No.10696。经微生物学鉴定为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。该菌株能在YPD培养基表面生长，菌落呈白色，突起于培养基表面，菌落表面湿润，有油脂光泽。该菌种可在28-32℃及pH 4.5-8.5范围内均可生长。该菌种表达高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶，获得重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的最适反应温度为55℃，最适反应pH为6.0，活力为3515U/mL。该酶在pH4.0-10.6之间具有较好的稳定性，耐碱性较强。xynAm可以专一地水解水解低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Methyl-D-glucurono-D-Xylan。

同时，提供简单优化的xynA重组酵母工程菌的构建：

(1)将厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因xynA和毕赤酵母表达载体pPIC9K用EcoR I和Not I双酶切，回收纯化酶切产物，纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和限制性内切酶鉴定获得重组表达载体pPIC9K-xynA；

(2)采用SacI对pPIC9K-xynA进行线性化，并电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞。

(3)将转化后的菌液分别涂布在MD平板上，于28～30℃培养48h，挑选生长正常的菌落进行甲醇利用表型鉴定。对甲醇利用表型正确的克隆通过遗传霉素G418硫酸盐筛选获得含高拷贝目的基因的重组酵母工程菌。

进一步，本发明提供详实的产β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌-巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm菌株的构建方法，具体的获得高效表达β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌构建方法详细步骤如下：

(1)在GenBank中检索出厌氧真菌Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列，登录号：U57819。

(2)删除步骤(1)的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的N端编码MRTIKFLFALAITTVAKA的密码子。

(3)根据酵母密码子偏爱性对β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的密码子进行初步替换。

(4)采用Oligo 6.0分析步骤(3)替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、SnaB I和Avr II的切割位点。

(5)采用BioEdit 7.0分析步骤(4)调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、AAAAAA和TTTTTT以及mRNA不稳定基序，并计算GC百分比，根据GC百分比对密码子进一步调整，使其处于40％-50％之间。

(6)采用RNA Structure 3.2对步骤(5)的mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列，命名为xynAm。

(7)通过对步骤(6)筛选获得的xynAm基因序列采用全基因合成方法获得SEQ IDNo.1所示核苷酸序列。

(8)构建含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体pPIC9K-xynAm。

(9)将重组载体pPIC9K-xynAm转化宿主细胞GS115，获得重组菌株并在酵母细胞中表达，从而获得产β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌，即巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115/pPIC9K-xynAm。

实施例三：重组xynAm毕赤酵母β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的分子生物学验证

xynA和xynAm的分子生物学验证流程相同，具体的分子生物学验证流程如下：

用灭菌的牙签挑取G418-YPD板上的单菌落，在20μL Triton-X100缓冲液中反复吹吸数次，沸水浴5min；3000rpm离心5min，上清液为酵母染色体DNA溶液。

将获得的上清液作为PCR的模板，按毕赤酵母表达载体pPIC9K的序列设计引物5'AOX1(5'-GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC-3')与3'-AOX1(5'-GCA AAT GGC ATT CTG ACATCC-3')进行PCR验证。PCR体系为dNTP 2.0μL、10×PCR Buffer 2.0μL、5’AOX11.0μL、3’AOX11.0μL、Taq酶1.0μL、DNA 2.0μL、ddH2O补足至20μL。

PCR反应条件为：95℃预变性10min；然后94℃，60s、62℃，60s、72℃，60s运行30cycle；最后72℃延伸5min。5μL样品点于0.8％琼脂糖胶检测。

实施例四：优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备

利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696发酵代谢制备高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶，即优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶，通过制备纯化所表达的β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的获得，具体制备方法步骤如下：

(1)利用基因工程菌，即利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696进行深层发酵，产生的发酵产物经离心后，取6ml上清加入超滤离心管Vivaspin 6中，放入低温高速离心机4℃、12000rpm离心，直到上清超滤浓缩至1ml为止。

(2)浓缩上清经G-75葡聚糖凝胶进行层析纯化，采用部分收集器对洗脱组分进行收集，采用pH5.0的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸缓冲液作为洗脱液；调节适合的流速，每个收集管处停留1min，每管取2μl样品采用Infinite M2000于280nm处测定吸光度，直至OD₂₈₀回至基线后停止收集；根据OD₂₈₀值将处于同一吸收峰的样品进行合并，并测定合并样品的酶活性。

进一步，本发明提供上述高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的详细制备方法，具体制备方法步骤如下：

(1)删除β-D-1,4-内切木聚糖酶基因N端编码MRTIKFLFALAITTVAKA的密码子；

(2)根据酵母密码子偏爱性对β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的密码子进行初步替换；

(3)采用Oligo 6.0分析替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、SnaB I和Avr II的切割位点；

(4)采用BioEdit 7.0分析调整后基因序列中mRNA隐蔽剪接位点及mRNA不稳定基序，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、AAAAAA和TTTTTT以及mRNA不稳定基序，并计算GC百分比，再根据GC百分比对密码子最进一步调整，使其处于40-50％之间；

(5)采用RNA Structure 3.2对mRNA二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列SEQ ID No.1，并命名为xynAm；

(6)采用全基因合成方法获得SEQ ID No.1所示核苷酸序列；

(7)构建含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的重组载体pPIC9K-xynAm；

(8)将重组载体pPIC9K-xynAm转化宿主细胞GS115，获得重组菌株并在酵母细胞中表达；

(9)纯化所表达的木聚糖酶，优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶即获得高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶。

上述方法获得优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶。最适反应温度为55℃，最适反应pH为6.0；该酶在pH4.0-10.6之间具有较好的稳定性，耐碱性较强。

实施例五：重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm活性的测定

采用DNS法测定木聚糖酶活性。取适当稀释的酶液200μL，1.0％的底物400μL，于55℃反应3min，立即加入1mL DNS，振荡混匀后于95℃水浴5min显色。冷却后加入3.4mL去离子水，振荡混匀后于540nm处测定吸光度。参照GB/T 23874-2009测定木聚糖酶的活性。

实施例六：xynA和xynAm在摇甁水平条件下的表达

将实施例二获得的重组酵母菌划线接种于YPD固体培养基上，29℃培养2天直至单克隆出现；挑取单克隆接种到装有25mL BMGY培养基的250mL锥形瓶中，29.5℃、280rpm培养18h至菌液在600nm波长处的吸光值为2-6；将2.5mL的菌液接种至含有100mL BMGY的500mL锥形瓶中，29.5℃、280rpm培养至菌液在600nm波长处的吸光值为2-6，即菌种处于对数生长期；6000rpm离心10min，用BMMY重悬细胞至菌液在600nm波长处的吸光值为1；将所得的菌液置于500mL的锥形瓶中，以双层干酪包布封口，相同条件下继续诱导培养96h，每24h添加甲醇一次，至甲醇终浓度为0.5％；每12h留取菌液样品1mL，最大转速离心，上清液存于-80℃备用。

取20μl上清液加入到含有5mg/mL燕麦木聚糖的琼脂平板的孔中，在37℃下孵育5h，用0.1％的刚果红染色液染色45min，再用1M的NaCl溶液脱色30min。取各时间点收集的上清液，按照实施例四的方法测定各时间点样品的酶活性。

平板刚果红法定性判断β-D-1,4-内切木聚糖酶活性的结果参见附图1所示。宿主菌毕赤酵母GS115和转化空载体pPIC9K的重组酵母GS115-pPIC9K培养上清液均未产生透明圈，而GS115-pPIC9K-xynAm的培养上清液产生明显的透明圈，表明在摇甁水平添加下，GS115-pPIC9K-xynAm可表达重组β-D-1,4-内切木聚糖酶。

随诱导时间的延长，xynA和xynAm酶活性的变化曲线参见附图2所示。在摇瓶水平条件下，xynA在诱导表达60h时活性最高，为1.98U/mL，xynAm在诱导表达108h时活性最高，为612U/mL。

实施例七：xynA和xynAm在7L发酵罐中的高效表达

(1)种子液的制备

从-80℃冰箱中取重组酵母菌的菌种以划线方式接种于YPD固体培养板上，29℃培养2天直到菌落出现；挑取长势最好的单菌落接种于含有5mL YPD液体培养基的50mL试管中，29℃，240rpm振荡培养过夜；次日，取6mL新鲜菌液，平均的接种于6个含有100mL YPD液体培养基500mL锥形瓶中，29℃，280rpm，48h，培养至菌液在600nm波长处的吸光值6。

(2)菌体生长阶段

按照发酵罐使用说明书的要求对发酵罐的空气流经管道及罐体进行灭菌，降温至28℃加入经高压灭菌冷却的FM22培养基、微量元素PMT4、消泡剂及已准备好的种子液，控制转速600rpm，DO35％，温度27.7℃，培养20h。

(3)甘油生长阶段

以1.5mL/min流速流加50％甘油，持续4h，手动控制DO在35-60％之间。流加期间，在0.5、1.0、2.0、4.0h时观察DO的变化曲线，确保甘油不积累。

(4)甲醇诱导阶段

当甘油耗尽，即DO迅速上升，以300μL/min流速流加12:1的甲醇和微量元素PMT4，并加入6mL吐温-80，控制转速800rpm，DO40％，29.2℃发酵6天。发酵过程中，每12h收样一次，-80℃冰箱保存备用。

(5)样品采集与分析

参考实施例五的方法测定酶活性。以牛血清白蛋白为标准，采用Bradford法测定发酵上清液中的蛋白质含量，用于计算比活性。

SDS-PAGE分析：分别为诱导前、诱导后12、24、36、48、60、72、84和96h的浓缩培养上清进行SDS-PAGE电泳。

xynA和xynAm活性和比活性的比较参见附图3所示。xynA在诱导96h时酶活性和比活力均达到最大值，分别为2.7IU/mL和3.7IU/mg；xynAm在诱导第96h时发酵液中的酶活性和比活力均达到最大值，分别为3515IU/mL和2411IU/mg。xynAm的活性是xynA的1300倍。

不同时间点xynAm的SDS-PAGE结果参见附图4所示，随着诱导时间的延长培养上清中分子量42.7KD附近有一条蛋白质条带，接近xynAm酶蛋白的理论分子量。

实施例八：重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA和重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的纯化

(1)产β-D-1,4-内切木聚糖酶的基因工程菌-巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)CGMCC No.10696进行深层发酵，产生的发酵产物经离心后，取6ml上清加入超滤离心管Vivaspin 6中，放入低温高速离心机4℃、12000rpm离心，直到上清超滤浓缩至1ml为止。

(2)浓缩上清经G-75葡聚糖凝胶进行层析纯化，采用部分收集器对洗脱组分进行收集，采用pH5.0的0.2M磷酸氢二钠/0.1M柠檬酸缓冲液作为洗脱液。调节适合的流速，每个收集管处停留1min，每管取2μl样品采用Infinite M2000于280nm处测定吸光度，直至OD₂₈₀回至基线后停止收集。根据OD₂₈₀值将处于同一吸收峰的样品进行合并，并测定合并样品的酶活性。

实施例九：重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynA和重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的酶学特性

(1)最适温度及最适pH

最适温度的测定：取纯化的β-D-1,4-内切木聚糖酶酶液适当稀释，分别在30、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90℃下测定其酶活性。以酶活性最高的为100％计算相对酶活性。

最适pH的测定：取纯化的β-D-1,4-内切木聚糖酶酶液适当稀释，分别在pH为2.2、3、4、5、5.6、6、6.5、7、8、9、10、10.6下在最适温度条件下测定酶活性。以酶活性最高者为100％计算相对酶活性。

(2)温度稳定性及pH值的稳定性

温度稳定性的测定：取纯化的β-D-1,4-内切木聚糖酶酶液适当稀释，分别在30、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90℃条件下放置1h，在最适温度及pH值条件下测定其剩余酶活性，以0min时取出的酶液的酶活性为100％，并计算相对酶活性。

pH值稳定性的测定：取纯化的β-D-1,4-内切木聚糖酶酶液适当稀释，分别用pH为2.2、3、4、5、5.6、6、6.5、7、8、9、10、10.6的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液适当稀释，室温放置1h，在最适温度及pH值条件下测定其剩余酶活性。以最适pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释酶液酶活性为100％，并计算相对酶活性。

参见附图5所示，xynA和xynAm的最适反应温度为50℃和55℃。二者对温度的稳定性均较差。

参见附图6所示，xynA和xynAm的最适反应pH为5.0和6.0，xynA在pH4.0～6.5之间较为稳定，xynAm在pH 4.0～10.6之间较为稳定。xynAm的耐碱能力优于xynA。

实施例十：重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的底物特异性

取实施例八纯化的酶液适当稀释，用最适pH的缓冲液分别配制10mg/mL的燕麦木聚糖、可溶性木聚糖、桦木木聚糖、低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、大麦β-葡聚糖和地衣多糖作为反应底物，于最适温度测定酶活性。

参见附图7所示，xynAm可以专一性水解低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Methyl-D-glucurono-D-Xylan，但不水解地衣多糖和大麦β-葡聚糖。

实施例十一：重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm对小麦和燕麦的降解能力比较

分别称取2.0g小麦粉和燕麦粉放入两个250mL的摇瓶中，加入适量pH2.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。试验组分别加重组木聚糖酶液xynAm至饲料原料50U/g，对照组加入等体积的缓冲液，调pH值至2.6，用pH2.6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液补足到30mL，加入100mg/mL的胃蛋白酶100μL，在120rpm，37℃水浴振荡培养2h，每30min收样一次。随后，调pH值为6.5，加入100mg/mL的胰蛋白酶100μL，同样的条件下，继续培养2h，每30min收样一次。6000rpm离心10min，取上清测定其中释放的还原糖量。

参见附图8所示，随着酶解时间的延长，小麦组和燕麦组中还原糖的含量均呈现增长趋势，但小麦组明显增长速度很快，而且释放还原糖的量始终比燕麦组高。说明xynAm降解小麦的能力优于对燕麦的降解能力。

通过上述系列实施例验证本发明提供了基因工程菌巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115/pPIC9K-xynAm CGMCC No.10696能够高效表达β-D-1,4-内切木聚糖酶，经检测，表达的重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm在表达96h时，酶活性达到3515U/mL，是未删除MRTIKFLFALAITTVAKA和简单优化xynA的1300倍，与现有技术记载的水平相比具有显著明显提高。利用纯化所表达的β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm的制备，获得纯化后重组β-D-1,4-内切木聚糖酶xynAm，即获得优化的Orpinomyces sp.PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶，最适反应温度为55℃，最适反应pH为6.0；该酶在pH4.0～10.6之间具有较好的稳定性，耐碱性较强；该高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶可以专一性水解低粘度***木聚糖、高粘度***木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Methyl-D-glucurono-D-Xylan，但不水解地衣多糖和大麦β-葡聚糖，在饲料和造纸等领域具有广泛的应用价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQ ID NO ：1

<110> OrganizationName : 新疆农业大学，张慧玲

<120> Title : 一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备与应用

<130> AppFileReference : 高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶在毕赤酵母中的整合表达

<213> OrganismName :Pichia pastoris GS115

<400> PreSequenceString :

CAGTGGGGTG GTAATGGTGG AGCATCAGCA GGACAGAGAC TTAGTGTTGG TGGTGGACAG 60

AATCAGCACA AGGGAGTTTT TGACGGATTC TCTTACGAAA TTTGGTTGGA TAACACTGGT 120

GGATCAGGAA GTATGACTTT GGGTAAAGGA GCAACATTCA AAGCTGAGTG GTCAGCTGCC 180

GTTAACCGTG GTAACTTTTT GGCTAGAAGA GGACTTGACT TCGGTAGTAC TAAGAAAGCA 240

ACAGCTTACG AATATATCGG TTTGGATTAC GAGGCTTCTT ATAGACAAAC TGCCTCTGCA 300

TCCGGAAATT CCAGATTGTG TGTTTATGGT TGGTTTCAAA ACAGAGGAGT TCAGGGTGTC 360

CCACTTGTTG AATACTATAT TATCGAGGAC TGGGTCGATT GGGTTCCTGA CGCACAAGGA 420

AAGATGGTTA CTATTGATGG TGCTCAATAC AAAATCTTTC AGATGGACCA TACAGGACCA 480

ACCATTAACG GTGGAAACGA AACTTTTAAG CAATACTTCT CCGTCAGACA ACAGAAAAGA 540

ACCTCAGGTC ATATTACTGT TAGTGATCAC TTCAAGGCTT GGTCTAACCA GGGTTGGGGA 600

ATCGGTAATT TGTACGAAGT CGCTCTTAAC GCCGAGGGAT GGCAATCTTC CGGTGTCGCC 660

GACGTTCCAA AGTTGGATGT TTATACTACA AAACAGGGTT CTGCTCCTAG AACCACTACA 720

ACCACTACAA GAACTACCAC AAGAACCACT ACAAAAACCC TTCCAACCAC TAATAAGAAA 780

TGTTCAGCCA AGATTACTGC ACAAGGTTAC AAATGTTGCA GTGACCCTAA CTGCGTTGTC 840

TACTATACAG ACGAAGATGG AACCTGGGGT GTCGAGAACA ATCAATGGTG TGGATGCGGT 900

GTTGAAGCTT GTTCTGGAAA GATCACAGCC CAGGGTTATA AGTGTTGCTC CGATCCTAAA 960

TGTGTTGTCT ACTATACTGA TGACGATGGA AAATGGGGTG TTGAAAACAA TGAGTGGTGT 1020

GGATGCGGTT TGTAA 1035

<212> Type : DNA

<211> Length : 1035

CAGTGGGGTGGTAATGGTGGAGCATCAGCAGGACAGAGACTTAGTGTTGGTGGTGGACAGAATCAGCACAAGGGAGTTTTTGACGGATTCTCTTACGAAATTTGGTTGGATAACACTGGTGGATCAGGAAGTATGACTTTGGGTAAAGGAGCAACATTCAAAGCTGAGTGGTCAGCTGCCGTTAACCGTGGTAACTTTTTGGCTAGAAGAGGACTTGACTTCGGTAGTACTAAGAAAGCAACAGCTTACGAATATATCGGTTTGGATTACGAGGCTTCTTATAGACAAACTGCCTCTGCATCCGGAAATTCCAGATTGTGTGTTTATGGTTGGTTTCAAAACAGAGGAGTTCAGGGTGTCCCACTTGTTGAATACTATATTATCGAGGACTGGGTCGATTGGGTTCCTGACGCACAAGGAAAGATGGTTACTATTGATGGTGCTCAATACAAAATCTTTCAGATGGACCATACAGGACCAACCATTAACGGTGGAAACGAAACTTTTAAGCAATACTTCTCCGTCAGACAACAGAAAAGAACCTCAGGTCATATTACTGTTAGTGATCACTTCAAGGCTTGGTCTAACCAGGGTTGGGGAATCGGTAATTTGTACGAAGTCGCTCTTAACGCCGAGGGATGGCAATCTTCCGGTGTCGCCGACGTTCCAAAGTTGGATGTTTATACTACAAAACAGGGTTCTGCTCCTAGAACCACTACAACCACTACAAGAACTACCACAAGAACCACTACAAAAACCCTTCCAACCACTAATAAGAAATGTTCAGCCAAGATTACTGCACAAGGTTACAAATGTTGCAGTGACCCTAACTGCGTTGTCTACTATACAGACGAAGATGGAACCTGGGGTGTCGAGAACAATCAATGGTGTGGATGCGGTGTTGAAGCTTGTTCTGGAAAGATCACAGCCCAGGGTTATAAGTGTTGCTCCGATCCTAAATGTGTTGTCTACTATACTGATGACGATGGAAAATGGGGTGTTGAAAACAATGAGTGGTGTGGATGCGGTTTGTAA

SEQ ID NO ：2

<110> OrganizationName : 新疆农业大学，张慧玲

<120> Title : 一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备与应用

<130> AppFileReference : Orpinomyces sp. PC-2 xylanase (xynA) gene

<213> OrganismName : Orpinomyces sp. PC-2

<400> PreSequenceString :

ATGAGAACTA TTAAATTTTT ATTCGCATTA GCTATTACAA CCGTTGCTAA GGCCCAATGG 60

GGTGGAAACG GTGGTGCCTC TGCTGGTCAA AGATTAAGCG TTGGTGGTGG TCAAAACCAA 120

CATAAAGGTG TTTTTGATGG CTTCAGTTAT GAAATCTGGT TAGATAACAC CGGTGGTAGT 180

GGTTCCATGA CCCTTGGTAA AGGTGCAACC TTCAAGGCTG AATGGAGTGC AGCTGTTAAC 240

CGTGGTAACT TCCTTGCCCG TCGTGGTCTT GATTTCGGTT CTACCAAAAA GGCAACCGCT 300

TACGAATACA TCGGATTGGA TTATGAAGCA AGTTACAGAC AAACTGCCAG CGCAAGTGGT 360

AACTCCCGTC TTTGTGTATA CGGCTGGTTC CAAAACCGTG GAGTTCAAGG CGTACCTTTG 420

GTAGAATACT ACATCATTGA AGATTGGGTT GACTGGGTAC CAGATGCACA AGGAAAAATG 480

GTAACCATCG ATGGTGCACA ATATAAGATT TTCCAAATGG ATCACACTGG TCCAACTATC 540

AATGGTGGTA ATGAAACCTT TAAGCAATAC TTCAGTGTCC GTCAACAAAA GAGAACTTCT 600

GGTCATATTA CTGTATCAGA TCACTTTAAG GCATGGTCCA ATCAAGGTTG GGGTATTGGA 660

AACCTCTATG AAGTTGCATT GAACGCAGAA GGTTGGCAAA GTAGTGGTGT CGCTGACGTC 720

CCCAAGTTGG ATGTCTACAC CACCAAACAA GGTTCTGCTC CTCGTACTAC CACCACCACT 780

ACCCGTACTA CTACCCGTAC TACTACAAAA ACACTTCCAA CCACTAATAA AAAATGTTCT 840

GCCAAGATTA CTGCCCAAGG TTACAAGTGT TGTAGTGATC CAAATTGTGT TGTTTACTAC 900

ACTGATGAAG ATGGTACCTG GGGTGTTGAA AACAATCAAT GGTGTGGATG TGGTGTTGAA 960

GCATGTTCTG GCAAGATTAC TGCCCAAGGT TACAAGTGTT GTAGTGATCC AAAGTGTGTT 1020

GTTTACTACA CTGATGACGA TGGTAAATGG GGTGTTGAAA ACAACGAATG GTGTGGTTGT 1080

GGTTTATAA 1089

<212> Type : DNA

<211> Length : 1089

ATGAGAACTATTAAATTTTTATTCGCATTAGCTATTACAACCGTTGCTAAGGCCCAATGGGGTGGAAACGGTGGTGCCTCTGCTGGTCAAAGATTAAGCGTTGGTGGTGGTCAAAACCAACATAAAGGTGTTTTTGATGGCTTCAGTTATGAAATCTGGTTAGATAACACCGGTGGTAGTGGTTCCATGACCCTTGGTAAAGGTGCAACCTTCAAGGCTGAATGGAGTGCAGCTGTTAACCGTGGTAACTTCCTTGCCCGTCGTGGTCTTGATTTCGGTTCTACCAAAAAGGCAACCGCTTACGAATACATCGGATTGGATTATGAAGCAAGTTACAGACAAACTGCCAGCGCAAGTGGTAACTCCCGTCTTTGTGTATACGGCTGGTTCCAAAACCGTGGAGTTCAAGGCGTACCTTTGGTAGAATACTACATCATTGAAGATTGGGTTGACTGGGTACCAGATGCACAAGGAAAAATGGTAACCATCGATGGTGCACAATATAAGATTTTCCAAATGGATCACACTGGTCCAACTATCAATGGTGGTAATGAAACCTTTAAGCAATACTTCAGTGTCCGTCAACAAAAGAGAACTTCTGGTCATATTACTGTATCAGATCACTTTAAGGCATGGTCCAATCAAGGTTGGGGTATTGGAAACCTCTATGAAGTTGCATTGAACGCAGAAGGTTGGCAAAGTAGTGGTGTCGCTGACGTCCCCAAGTTGGATGTCTACACCACCAAACAAGGTTCTGCTCCTCGTACTACCACCACCACTACCCGTACTACTACCCGTACTACTACAAAAACACTTCCAACCACTAATAAAAAATGTTCTGCCAAGATTACTGCCCAAGGTTACAAGTGTTGTAGTGATCCAAATTGTGTTGTTTACTACACTGATGAAGATGGTACCTGGGGTGTTGAAAACAATCAATGGTGTGGATGTGGTGTTGAAGCATGTTCTGGCAAGATTACTGCCCAAGGTTACAAGTGTTGTAGTGATCCAAAGTGTGTTGTTTACTACACTGATGACGATGGTAAATGGGGTGTTGAAAACAACGAATGGTGTGGTTGTGGTTTATAA

SEQ ID NO：3

<110> OrganizationName : 新疆农业大学，张慧玲

<120> Title : 一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备与应用

<130> AppFileReference :

<213> OrganismName :Pichia pastoris GS115

<400> PreSequenceString :

ATGAGAACTA TCAAGTTCTT GTTCGCTTTG GCTATCACTA CTGTTGCTAA GGCTCAATGG 60

GGTGGTAACG GTGGTGCTTC TGCTGGTCAA AGATTGTCTG TTGGTGGTGG TCAAAACCAA 120

CACAAGGGTG TTTTCGACGG TTTCTCTTAC GAAATCTGGT TGGACAACAC TGGTGGTTCT 180

GGTTCTATGA CTTTGGGTAA GGGTGCTACT TTCAAGGCTG AATGGTCTGC TGCTGTTAAC 240

AGAGGTAACT TCTTGGCTAG AAGAGGTTTG GACTTCGGTT CTACTAAGAA GGCTACTGCT 300

TACGAATACA TCGGTTTGGA CTACGAAGCT TCTTACAGAC AAACTGCTTC TGCTTCTGGT 360

AACTCTAGAT TGTGTGTTTA CGGTTGGTTC CAAAACAGAG GTGTTCAAGG TGTTCCATTG 420

GTTGAATACT ACATCATCGA AGACTGGGTT GACTGGGTTC CAGACGCTCA AGGTAAGATG 480

GTTACTATCG ACGGTGCTCA ATACAAGATT TTCCAAATGG ACCACACTGG TCCAACTATC 540

AACGGTGGTA ACGAAACTTT CAAGCAATAC TTCTCTGTTA GACAACAAAA GAGAACTTCT 600

GGTCACATCA CTGTTTCTGA CCACTTCAAG GCTTGGTCTA ACCAAGGTTG GGGTATCGGT 660

AACTTGTACG AAGTTGCTTT GAACGCTGAA GGTTGGCAAT CTTCTGGTGT TGCTGACGTT 720

CCAAAGTTGG ACGTTTACAC TACTAAGCAA GGTTCTGCTC CAAGAACTAC TACTACTACT 780

ACTAGAACTA CTACTAGAAC TACTACTAAG ACTTTGCCAA CTACTAACAA GAAGTGTTCT 840

GCTAAGATCA CTGCTCAAGG TTACAAGTGT TGTTCTGACC CAAACTGTGT TGTTTACTAC 900

ACTGACGAAG ACGGTACTTG GGGTGTTGAA AACAACCAAT GGTGTGGTTG TGGTGTTGAA 960

GCTTGTTCTG GTAAGATCAC TGCTCAAGGT TACAAGTGTT GTTCTGACCC AAAGTGTGTT 1020

GTTTACTACA CTGACGACGA CGGTAAGTGG GGTGTTGAAA ACAACGAATG GTGTGGTTGT 1080

GGTTTGTAA 1089

<212> Type : DNA

<211> Length : 1089

ATGAGAACTATCAAGTTCTTGTTCGCTTTGGCTATCACTACTGTTGCTAAGGCTCAATGGGGTGGTAACGGTGGTGCTTCTGCTGGTCAAAGATTGTCTGTTGGTGGTGGTCAAAACCAACACAAGGGTGTTTTCGACGGTTTCTCTTACGAAATCTGGTTGGACAACACTGGTGGTTCTGGTTCTATGACTTTGGGTAAGGGTGCTACTTTCAAGGCTGAATGGTCTGCTGCTGTTAACAGAGGTAACTTCTTGGCTAGAAGAGGTTTGGACTTCGGTTCTACTAAGAAGGCTACTGCTTACGAATACATCGGTTTGGACTACGAAGCTTCTTACAGACAAACTGCTTCTGCTTCTGGTAACTCTAGATTGTGTGTTTACGGTTGGTTCCAAAACAGAGGTGTTCAAGGTGTTCCATTGGTTGAATACTACATCATCGAAGACTGGGTTGACTGGGTTCCAGACGCTCAAGGTAAGATGGTTACTATCGACGGTGCTCAATACAAGATTTTCCAAATGGACCACACTGGTCCAACTATCAACGGTGGTAACGAAACTTTCAAGCAATACTTCTCTGTTAGACAACAAAAGAGAACTTCTGGTCACATCACTGTTTCTGACCACTTCAAGGCTTGGTCTAACCAAGGTTGGGGTATCGGTAACTTGTACGAAGTTGCTTTGAACGCTGAAGGTTGGCAATCTTCTGGTGTTGCTGACGTTCCAAAGTTGGACGTTTACACTACTAAGCAAGGTTCTGCTCCAAGAACTACTACTACTACTACTAGAACTACTACTAGAACTACTACTAAGACTTTGCCAACTACTAACAAGAAGTGTTCTGCTAAGATCACTGCTCAAGGTTACAAGTGTTGTTCTGACCCAAACTGTGTTGTTTACTACACTGACGAAGACGGTACTTGGGGTGTTGAAAACAACCAATGGTGTGGTTGTGGTGTTGAAGCTTGTTCTGGTAAGATCACTGCTCAAGGTTACAAGTGTTGTTCTGACCCAAAGTGTGTTGTTTACTACACTGACGACGACGGTAAGTGGGGTGTTGAAAACAACGAATGGTGTGGTTGTGGTTTGTAA

SEQ ID NO：4

<110> OrganizationName : 新疆农业大学，张慧玲

<120> Title : 一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备与应用

<211> 344

<212> PRT

<213> Orpinomyces sp. PC-2

<400> PreSequenceString :

QWGGNGGASA GQRLSVGGGQ NQHKGVFDGF SYEIWLDNTG GSGSMTLGKG ATFKAEWSAA 60

VNRGNFLARR GLDFGSTKKA TAYEYIGLDY EASYRQTASA SGNSRLCVYG WFQNRGVQGV 120

PLVEYYIIED WVDWVPDAQG KMVTIDGAQY KIFQMDHTGP TINGGNETFK QYFSVRQQKR 180

TSGHITVSDH FKAWSNQGWG IGNLYEVALN AEGWQSSGVA DVPKLDVYTT KQGSAPRTTT 240

TTTRTTTRTT TKTLPTTNKK CSAKITAQGY KCCSDPNCVV YYTDEDGTWG VENNQWCGCG 300

VEACSGKITA QGYKCCSDPK CVVYYTDDDG KWGVENNEWC GCGL

Claims (8)

1.一种基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm ，其特征在于，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm 菌种保藏编号为CGMCCNo.10696。

2.如权利要求1 所述基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm的β-D-1,4-内切木聚糖酶氨基酸序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID No.4 所示。

4.如权利要求1 所述一种基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm在制备β-D-1,4-内切木聚糖酶中的应用。

5.一种如权利要求2所述的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列优化方法，其特征在于，所述的具体优化方法步骤如下：

（1）在GenBank中检索出厌氧真菌Orpinomyces sp. PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列，登录号：U57819；

（2）删除步骤（1）的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的N端编码MRTIKFLFALAITTVAKA的密码子；

（3）根据酵母密码子偏爱性对β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的密码子进行初步替换；

（4）采用Oligo 6.0分析步骤（3）替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、SnaB I和Avr II的切割位点；

（5）采用BioEdit 7.0 分析步骤（4）调整后基因序列中mRNA 隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、AAAAAA和TTTTTT以及mRNA不稳定基序，并计算GC百分比，根据GC百分比对密码子进一步调整，使其处于40%-50%之间；

（6）采用RNA Structure 3.2 对步骤（5）的mRNA 二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列，命名为xynAm；

（7）通过对步骤（6）筛选获得的xynAm基因序列采用全基因合成方法获得SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。

6.根据权利要求2所述优化的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因xynAm的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9K-xynAm，所述重组载体pPIC9K-xynAm的具体构建方法为：将权利要求5提供的xynAm基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K均用SnaB I和Avr II双酶切，回收纯化酶切产物，纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经PCR以及BamH I 和 Sal I双酶切鉴定获得重组表达载体pPIC9K-xynAm。

7.一种如权利要求1所述基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm制备的高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶。

8.如权利要求7所述高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶在用于非治疗目降解木聚糖中的应用。