CN109797107B

CN109797107B - 一种真菌菌丝精粉的制备方法

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Publication number: CN109797107B
Application number: CN201910085702.7A
Authority: CN
Inventors: 邢连喜; 张宏贵; 赵剑
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2039-01-29
Also published as: CN109797107A

Abstract

本发明提供一种真菌菌丝精粉的制备方法，解决了由液体培养获得的菌丝体的处理及保存问题。该方法是按照以下步骤进行的：1)通过液体扩大培养获得菌丝体；2)将液体菌丝体进行抽滤处理，制得菌饼；3)将菌饼置于真空干燥设备或微波设备干燥处理；4)菌饼干燥后，粉碎、过筛、保存。通过此种方法制得的真菌菌丝精粉，色泽明亮，无异味，且操作方法简单易行，生产成本低。

Description

一种真菌菌丝精粉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种真菌菌丝精粉的制备方法。

背景技术

将真菌的菌丝体制成菌丝精粉，是增加其保存时间的一种有效方法。这其中，对于真菌的扩大培养是基础环节，菌丝体与培养体系的分离、干燥是最终的产出环节，且该环节设计与培养体系密切相关。

常规的液体培养方法，大多是直接将真菌菌核接种于液体培养基中，虽然在接种前会用1％的次氯酸钠溶液进行消毒灭菌。但如果次氯酸钠浓度太低会造成灭菌消毒不彻底，容易污染的情况，浓度太大会又会使真菌子实体降低活性甚至失去生物活性。因此，常规的液体培养方法虽然真菌的生长速度优于固体培养方法，但由于不够稳定，某些菌种的培养在实际产业中的应用尚不理想。

对于菌丝体与发酵液的分离，目前实验室的做法有以下几种：离心法、过滤法、抽滤法，通过在实验室中对几种方法进行对比实验，得到了以下结果：离心法虽然能够达到固液分离，但此时的菌丝体仍含有大量液体，会增加真空干燥的时间；过滤法是使用纱布对菌丝发酵液进行分离，也能达到固液分离的目的，但由于发酵液本身较为粘稠，会耗费较多时间，而且也会增加烘干时间；抽滤法是利用真空真空泵所产生的压强对菌丝发酵液进行分离，具有分离速度快菌丝体含水量少的特点，是较为理想的方法。

发明内容

本发明提出一种真菌菌丝精粉的制备方法，以满足对该真菌进行进一步深入研究所需原料的使用需求。

该真菌菌丝精粉的制备方法，包括以下步骤：

1)通过液体培养方法获得菌丝体；其中用于接种菌丝母液的液体培养基的配方为：玉米糁35-45g/L，蛋白胨6-10g/L，葡萄糖10-20g/L，磷酸二氢钾2-4g/L；

2)将液体菌丝体进行抽滤处理，制得菌饼；

3)将菌饼置于真空干燥设备或微波干燥设备中干燥，温度控制在45℃至50℃之间；

4)菌饼烘干后，粉碎，过筛，装袋保存。

进一步的，步骤1)具体包括以下步骤：

1.1)将菌核接种在斜面培养基上活化，长出菌丝；

1.2)无菌条件下，将已活化的菌核菌丝接种在PDA液体培养基上，培养3-4天，即得菌丝母液；

1.3)将菌丝母液接种在液体培养基上，摇床培养7天，即得菌丝体。

进一步的，上述液体培养基的最佳配方为：玉米糁35g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖15g/L，磷酸二氢钾3g/L。

进一步的，步骤1.3)中，菌丝母液的接种量为5％；所述摇床培养在有氧的条件下进行，温度为24℃，转速为160r/min，pH值为培养基原始值5.5。

进一步的，步骤1.1)中，活化菌种时的培养温度为24-27℃。

进一步的，步骤2)中，所述抽滤处理具体是：用真空泵连接布氏漏斗，对菌丝体进行抽滤，得到菌饼。

进一步的，步骤4)中，具体是将烘干的菌饼粉碎，过40目筛，装袋密封保存。

本发明的制备方法尤其适用于申请人发现的一种新菌种Fibularhizoctoniasp.。

该新菌种在白蚁巢穴中采集得到，经过形态学和分子生物学鉴定为属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、阿太菌目(Atheliales)、阿太菌科(Atheliaceae)的Fibularhizoctonia sp.真菌，通过对真菌菌核部分进行组织培养，分离得到原始菌株。

经分子生物学测定其ITS分子序列，通过比对我们发现，数据库中编号为DQ276871Fibulorhizoctonia sp.的ITS区段序列与新型真菌菌核的相应序列最相似，相似值达595/597(99％)。所以证实了新型真菌为Fibulorhizoctonia属。其具有以下形态特征：菌落直径68-70mm，白色至浅褐色，中部致密，毡状，边缘疏松，具明显同心轮纹及放射状皱褶，表面产生大量浅褐色菌核，菌落背面白色到浅褐色，无水溶性色素。营养菌丝壁光滑，薄壁，具锁状联合，多分枝，宽0.9-4.0μm，液体培养状态下不产孢。

该真菌菌株的保藏编号：CCTCC M 2018446，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期：2018年07月04日。

本发明具有以下有益效果：

1.菌丝精粉能长时间保存。本发明采用将液体培养液进行抽滤，获得菌饼，并在45℃-50℃下真空干燥，使菌丝完全脱水，既不影响将菌丝制成菌粉，也不会对菌丝中的有效活性成分造成损失。因为处于脱水状态，精粉状态的菌丝不会发生霉变等情况，制得的菌丝精粉色泽明亮、无异味且方便携带、生产成本低、操作简便，在后续进行药理、毒理及功效实验时，菌丝精粉可作为制剂或溶液溶于水中，直接灌胃作用于小鼠，完全可以在工厂生产中实际应用，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

2.菌丝体是采用玉米糁与其他基础营养配方通过液体培养的制作而成，化学配方较少，不会对人体产生一些毒副作用，而且价格也很低廉。

3.本发明中涉及到的菌种液体培养方法，明显缩短了生产周期且菌种在三角瓶里形态大小一致、生产成本低、接种简便。菌丝产量高，且产量可以达到19g/L。

4.用到的培养基原料与抽滤烘干设备相对简单易得，具有制备成本低，易保存，成色好，无异味且营养成分高等优点。

5.本发明具有通用性。

具体实施方式

下面以申请人发现的一种新菌种Fibularhizoctonia sp.为例，详细介绍该真菌菌丝精粉的制备方法：

(1)菌种的活化及菌丝母液的制备

将收集到的真菌菌核用1％(v/v)的NaClO溶液冲洗数次，每次浸泡2-3min，倒掉废液后，再用无菌水洗掉其表面残留液，然后接种在制备好的斜面培养基上，放在24-27℃下培养3-4天后，培养完成，挑选长势较好的菌种，放入4℃保存，备用。其中，斜面培养基可采用常规方法制备。

在无菌操作台中用无菌接种针将保存的菌丝菌种接到PDA液体培养基(可不加琼脂)中，放入24-27℃摇床振荡培养3-4d，即得菌丝母液。

(2)液体培养基的制备(最佳配方)

称取玉米糁35g，煮沸20min使其熟而不烂，过滤，去残渣，加入葡萄糖15g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾3g，溶解于滤液中，最后将滤液定容至1000mL。在250mL三角瓶中加入100mL以上液体培养基。灭菌，121℃，保持20min。

(3)接种

在无菌操作台中，用无菌试管吸取5mL菌丝母液接入三角瓶中，接种后，三角瓶瓶口必须用塑封薄膜封好，以免染菌。

(4)培养

将接种后的三角瓶置于恒温摇床培养箱中培养。温度控制在24-27℃，转速160r/min下，培养一周左右。即可看到三角瓶中有大量的菌丝产生。

(5)制备真菌菌丝菌饼

将装有菌丝培养液的三角瓶从摇床培养箱中取出，倒入布氏漏斗中，利用真空泵，对菌丝培养液进行抽滤，以达到培养液与菌丝体分离的目的，待抽滤完成后，菌丝与之分离，形成圆形菌饼。

(6)制备菌丝精粉

将所有生长有真菌菌丝体的发酵液按上述方法制成菌饼后，置于真空干燥箱中，45℃-50℃烘干。待菌饼完全烘干后，进行粉碎，过40目筛，装袋密封保存，即为菌丝精粉。

上述真菌菌丝精粉的制备方法中的液体培养环节(上述(2)-(4))，没有直接将真菌菌核接种于液体培养基中，而是在进行液体培养前进行真菌菌种的活化，并筛选得到液体培养基的最佳配方。

以下简要介绍获得最优液体培养基的筛选实验：

对照组1：

碳源的筛选：改变液体培养基中碳源的来源，依次选用含量为2％的玉米糁、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精作为碳源来源，将作为氮源来源的蛋白胨含量设置成1％，无机盐含量为0.2％，pH为自然值。

对照组2：

氮源的筛选：改变液体培养基中氮源的来源，分别选用浓度为1％的蛋白胨，酵母膏，硝酸铵，黄豆粉，尿素，麸皮作为氮源，以2％的葡萄糖作为碳源，无机盐浓度为0.2％，PH取自然即可。

对照组3：

无机盐的筛选：改变液体培养基中无机盐的来源，分别选用0.2％的KH₂PO₄，MgSO₄，FeSO₃，NaH₂PO₄，ZnSO₄作为无机盐来源，取1％的最佳氮源，2％的最佳碳源，PH取自然即可。

本发明：

液体培养基组分确定后，通过正交实验对培养基组分配比进行优化筛选(见下表)。

正交实验因素水平表

生长情况：

对照组1：

各小组培养瓶中的菌丝生长速度缓慢，菌丝球体积较小，其中玉米糁作为碳源时，生长速度较其他比较快，其菌丝产量是1.41g。

对照组2：

各小组培养瓶中菌丝生长速度缓慢，菌丝球体积较小且少，其中蛋白胨作为氮源时，生长速度较快，其菌丝产量是0.81g。

对照组3：

各小组培养瓶中菌丝生长速度缓慢，菌丝球体积较小，其中磷酸二氢钾作为无机盐时，其菌丝生长速度较快，其菌丝产量为1.24g。

本发明：

正交实验的各小组培养瓶中菌丝生长速度较快，菌种瓶中菌丝生长达饱和状态的时间最快为7d，菌种在三角瓶里形态大小一致、菌丝球体积大小均匀且数量较多，其最大生长量能达到1.91g。确定其中的最佳培养配方为：玉米糁35g，蛋白胨10g，葡萄糖15g，磷酸二氢钾3g。

该该真菌菌丝精粉的制备方法，生产成本低、操作简便，制得的菌丝精粉色泽明亮、无异味且方便携带。

以上制备方法尤其适用于申请人发现的新菌种Fibularhizoctonia sp.(保藏编号：CCTCC M 2018446)。经实验，上述制备方法对于同类的其他真菌(特别是阿太菌科)同样适用，也能够取得较好的精粉产品。

申请人对该真菌菌丝体的成分进行检测的结果：真菌菌丝体中含有多种具有生物活性的有效成分，如多糖，三萜类化合物，蛋白质等，其中多糖类成分和三萜类化合物含量较高，其中三萜类化合物含量为144.23mg/g，多糖含量为124mg/g。目前已知多糖有抗肿瘤、提高免疫力、降血糖、抗衰老等作用，三萜类化合物在溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物等方面具有很强的活性。

在后续进行的药理、毒理及功效实验中确认，制得的菌丝精粉可作为制剂或溶液溶于水中，直接灌胃作用于小鼠，完全可以在工厂生产中实际应用，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

Claims

1.一种真菌菌丝精粉的制备方法，其特征在于，所述真菌的菌株的分类命名为Fibulorhizoctonia sp.，保藏编号为：CCTCC M 2018446；该制备方法包括以下步骤：

1）通过液体培养方法获得菌丝体；其中用于接种菌丝母液的液体培养基的配方为：玉米糁35-45 g/L，蛋白胨6-10 g/L，葡萄糖10-20 g/L，磷酸二氢钾2-4 g/L；

2）将液体菌丝体进行抽滤处理，制得菌饼；

3）将菌饼置于真空干燥设备或微波干燥设备中干燥，温度控制在45 ℃至50 ℃之间；

4）菌饼烘干后，粉碎，过筛，装袋保存。

2.根据权利要求1所述的真菌菌丝精粉的制备方法，其特征在于，步骤1）具体包括以下步骤：

1.1）将菌核接种在斜面培养基上活化，长出菌丝；

1.2）无菌条件下，将已活化的菌核菌丝接种在PDA液体培养基上，培养3-4天，即得菌丝母液；

1.3）将菌丝母液接种在液体培养基上，摇床培养7天，即得菌丝体。

3. 根据权利要求2所述的真菌菌丝精粉的制备方法，其特征在于，步骤1.3）中，所述液体培养基的组成为：玉米糁35 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖15 g/L，磷酸二氢钾3 g/L。

4. 根据权利要求2所述的真菌菌丝精粉的制备方法，其特征在于，步骤1.3）中，菌丝母液的接种量为5 %；所述摇床培养在有氧的条件下进行，温度为24 ℃，转速为160 r/min，pH值为培养基原始值5.5。

5.根据权利要求2所述的真菌菌丝精粉的制备方法，其特征在于，步骤1.1）中，活化菌种时的培养温度为24-27℃。

6.根据权利要求1所述的真菌菌丝精粉的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述抽滤处理具体是：用真空泵连接布氏漏斗，对菌丝体进行抽滤，得到菌饼。

7.根据权利要求1所述的真菌菌丝精粉的制备方法，其特征在于，步骤4）中，具体是将烘干的菌饼粉碎，过40目筛，装袋密封保存。