CN109777845B - 一种l-2-氨基丁酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于酶催化领域，尤其涉及一种L‑2‑氨基丁酸的制备方法，在底物中加入酶催化剂和酶激活剂，所述底物为苏氨酸和甲酸铵，所述酶催化剂为苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，所述酶激活剂为磷酸盐。上述制备L‑2‑氨基丁酸的方法，采用磷酸盐作为酶激活剂，与亮氨酸脱氢酶配合使用，将反应的中间产物迅速转化，使三种酶的催化速率相互匹配，提高了酶催化的转化效率，避免了副产物的堆积现象，不仅提高了产物的收率，更加有利于产物的分离提纯。
Description
技术领域
本发明属于酶催化领域，尤其涉及一种L-2-氨基丁酸的制备方法。
背景技术
L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸，具有抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用，是一种重要的化工原料和医药中间体，已经广泛应用于药物合成，例如抑菌抗结核药物乙胺丁醇盐酸盐、抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦等。
目前，国内外L-2-氨基丁酸的生产方法分为化学法和生物酶法，化学法是比较经典的方法，主要有化学合成和化学拆分。化学合成主要是以正丁酸和溴为起始原料，经过α卤代反应制得α-溴丁酸，在氨水中合成氨基丁酸，化学拆分法是用手型拆分剂，但是因为使用到昂贵的手型拆分试剂，成本比较高，工业生产不宜采用，而且产生大量的有机废溶剂污染环境。
生物酶法包括微生物发酵法和酶催化转化法，微生物发酵法反应产物成分复杂，分离繁琐，酶催化转化则是一种高选择性反应，从而达到定向转化的目的。
酶催化转化法制备L-2-氨基丁酸主要有两种：一是对消旋的α-氨基丁酸进行酶法拆分制备，主要是用醋酐乙酰化氨基丁酸，然后再用氨基酰化酶进行拆分，反应步骤多，收率偏低；二是以α-羰基丁酸为原料，此法反应底物浓度低，生产成本高。
申请号为201010146920.6，名称为“一种酶法制备L-2-氨基丁酸的方法”的中国专利，其公开的方案是：采用L-苏氨酸为起始原料，首先通过苏氨酸脱氨酶使其转化为2-酮丁酸，然后利用亮氨酸脱氢酶使2-酮丁酸转化生成L-2-氨基丁酸，反应中加入用于辅酶再生的甲酸脱氢酶。这种方法制备L-2-氨基丁酸，以结晶的方式进行产物分离，大大提高了产物纯度，但是却并未涉及到L-2-氨基丁酸的转化率的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高转化率、低成本且易于工业化大生产的L-2-氨基丁酸的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种L-2-氨基丁酸的制备方法，在底物中加入酶催化剂和酶激活剂，所述底物为苏氨酸和甲酸铵，所述酶催化剂为苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，所述酶激活剂为磷酸盐。
上述制备L-2-氨基丁酸的方法，采用磷酸盐作为酶激活剂，与亮氨酸脱氢酶配合使用，将反应的中间产物迅速转化，使三种酶的催化速率相互匹配，提高了酶催化的转化效率，避免了副产物的堆积现象，不仅提高了产物的收率，更加有利于产物的分离提纯。
作为优选方案，所述L-2-氨基丁酸的制备方法，其具体步骤为：
A)向水中加入苏氨酸和甲酸铵，配制成转化液A；
B)向转化液中加入磷酸盐得溶液B；
C)向溶液B中加入苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，在(30±5)℃条件下反应16～20h，反应结束后即得L-氨基丁酸溶液。
优选的，苏氨酸与甲酸铵的质量比为2：(1～2)。具体地，苏氨酸和甲酸铵加入后，二者浓度分别为100～200g/L和50～200g/L。合成过程中所用水为自来水，无需对用水作蒸馏或者去离子等处理，因此本发明的方法降低了对反应环境的要求，同时也降低了生产成本投入。
优选的，磷酸盐加入量为：磷酸根离子浓度为0.5mmol～20mmol/L。磷酸根离子作为酶激活剂，可以提高酶活性，配合亮氨酸脱氢酶使用，快速转化中间产物，进一步促进了初始反应的速率，三种酶的催化速率相互匹配，提高了酶催化的转化效率，避免了副产物的堆积现象。但是大量引入磷酸根离子后增加了去除难度，最终会影响产品纯度，因此在实现酶激活剂的作用的同时，需要尽可能少的引入磷酸根离子。具体地，所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的至少一种。加入磷酸盐后，加入pH调节剂调节混合溶液的pH值至7～8，所述pH调节剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
优选的，加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的微生物菌液后，总酶浓度为3～6U。其中，酶活定义为：每毫升转化液每分钟产生1μmol的L-2-氨基丁酸为一个酶活单位。
本发明方案中酶的来源为：将大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶(核苷酸序列是NCBI上Gene ID：948287)、芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶(NCBI上Gene ID：1206507)、博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶(NCBI上GenBank：KM454879.1)，通过基因工程菌的方法导入到大肠杆菌中，构建同时产L-苏氨酸脱氢酶、L-亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶的基因工程菌，避免酶的纯化步骤，使用更方便。
附图说明
图1为实施例1的反应过程中转化率随时间变化的折线图。
具体实施方式
一、制备
实施例1
向10L反应釜中加入1200g苏氨酸、1200g甲酸铵、磷酸二氢铵，加水搅拌溶解，然后用20-25％氨水调节pH至7.5，升温至30℃，然后加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的菌泥，其中，磷酸根离子浓度为20mmol/L，混合液中总酶浓度为6U，将混合液置于30℃恒温条件下搅拌反应，16h后反应结束，得到L-氨基丁酸溶液。
实施例2
向10L反应釜中加入1200g苏氨酸、600g甲酸铵、磷酸氢二铵，加水搅拌溶解，然后用20-25％氨水调节pH至7.5，升温至30℃，然后加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的菌泥，其中，磷酸根离子浓度为10mmol/L，混合液中总酶浓度为4U，将混合液置于30℃恒温条件下搅拌反应，20h后反应结束，得到L-氨基丁酸溶液。
实施例3
向10L反应釜中加入1200g苏氨酸、800g甲酸铵、焦磷酸钠，加水搅拌溶解，然后用20-25％氨水调节pH至7.7，升温至30℃，然后加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的菌泥，其中，磷酸根离子浓度为15mmol/L，混合液中总酶浓度为6U，将混合液置于30℃恒温条件下搅拌反应，18h后反应结束，得到L-氨基丁酸溶液。
二、检测
将实施例1反应过程中，每隔两小时用液相色谱仪检测反应体系中苏氨酸和L-氨基丁酸的含量，并计算转化率。
检测方法如下：在EP管中依次加入PH＝9.5的硼酸缓冲液300ul，转化液样品250ul，衍生剂200ul(取0.3430g邻苯二甲醛+5ml无水乙醇+0.1472gN-乙酰-L半胱氨酸，用0.1mol/L硼砂缓冲液(PH＝9.5)定溶到25ml，避光备用)，混匀后等待2分钟，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。所需的化合物用0.05mol/L醋酸钠缓冲液∶甲醇＝63∶35进行洗脱，流速1.0ml/min，采集时间为10min。色谱条件为XDB-C8(150mm)中性柱，柱温30℃，检测波长334nm。
各个时间点所得的转化率记录入表1中，并作出转化率随时间变化的折线图，见附图1。
表1实施例1各时间点的转化率
| 反应时间/h | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 |
| 转化率/％ | 25.2 | 40.0 | 55.3 | 70.1 | 80.5 | 87.2 | 93.4 | 98.0 | 98.4 | 98.6 |
由表1可知，采用实施例1的制备方法制备的L-氨基丁酸溶液，苏氨酸转化为L-氨基丁酸的转化率为98.6％。
按照上述方法，检测实施例2和实施例3反应过程中和反应结束后体系的转化率，得到最终结果：实施例2中反应的转化率为98.1％，实施例3中反应的转化率为98.4％，可见，本发明的制备方法制备L-氨基丁酸，转化率高达98％以上。
Claims (5)
1.一种L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：在底物中加入酶催化剂和酶激活剂，在30±5℃条件下反应16～20h；
所述底物为苏氨酸和甲酸铵，苏氨酸和甲酸铵的浓度分别为100～200g/L和50～200g/L；
所述酶催化剂为产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的微生物菌液；加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的微生物菌液后，混合溶液中总酶浓度为3～6U；将大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶，通过基因工程菌的方法导入到大肠杆菌中，构建同时产L-苏氨酸脱氢酶、L-亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶的微生物；所述大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列是NCBI上Gene ID：948287的核苷酸序列，所述芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上Gene ID：1206507的核苷酸序列，所述博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上GenBank：KM454879.1的核苷酸序列；
所述酶激活剂为磷酸盐，磷酸盐加入量为：磷酸根离子浓度为10mmol～20mmol/L；加入磷酸盐后，加入pH调节剂调节混合溶液的pH值至7～8；所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸氢钙、磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钠中的至少一种。
2.根据权利要求1所述L-2-氨基丁酸的制备方法，其具体步骤为：
A)向水中加入苏氨酸和甲酸铵，配制成转化液A；
B)向转化液中加入磷酸盐得溶液B；
C)向溶液B中加入苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，在30±5℃条件下反应16～20h，反应结束后即得L-2-氨基丁酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述的L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：苏氨酸与甲酸铵的质量比为2：1～2。
4.根据权利要求1所述L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：所述pH调节剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
5.根据权利要求1或2所述L-2-氨基丁酸的制备方法，其特征在于：制备过程中所用水为自来水。
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