CN109777845B - 一种l-2-氨基丁酸的制备方法 - Google Patents
一种l-2-氨基丁酸的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109777845B CN109777845B CN201910246388.6A CN201910246388A CN109777845B CN 109777845 B CN109777845 B CN 109777845B CN 201910246388 A CN201910246388 A CN 201910246388A CN 109777845 B CN109777845 B CN 109777845B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phosphate
- dehydrogenase
- aminobutyric acid
- threonine
- formate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N L-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N 0.000 title claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 48
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108010028658 Leucine Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 18
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 16
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000003248 enzyme activator Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 15
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 15
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 15
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 101000642986 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) L-threonine dehydratase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 claims description 3
- LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N ammonium dihydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].OP(O)([O-])=O LFVGISIMTYGQHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000387 ammonium dihydrogen phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 235000019837 monoammonium phosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 102100030764 Inactive L-threonine 3-dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 108010043075 L-threonine 3-dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims description 2
- -1 phosphate radical ions Chemical class 0.000 claims description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- SEJXNPFTEXQNOU-UHFFFAOYSA-N 2-(oxomethylidene)butanoic acid Chemical compound CCC(=C=O)C(O)=O SEJXNPFTEXQNOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobutanoic acid Natural products CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-N 2-bromobutyric acid Chemical compound CCC(Br)C(O)=O YAQLSKVCTLCIIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 7-[(6,8-dichloro-1,2,3,4-tetrahydroacridin-9-yl)amino]-n-[2-(1h-indol-3-yl)ethyl]heptanamide Chemical compound C1CCCC2=NC3=CC(Cl)=CC(Cl)=C3C(NCCCCCCC(=O)NCCC=3C4=CC=CC=C4NC=3)=C21 ULGJWNIHLSLQPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003638 Glucose-6-Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010086800 Glucose-6-Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010003977 aminoacylase I Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002161 brivaracetam Drugs 0.000 description 1
- MSYKRHVOOPPJKU-BDAKNGLRSA-N brivaracetam Chemical compound CCC[C@H]1CN([C@@H](CC)C(N)=O)C(=O)C1 MSYKRHVOOPPJKU-BDAKNGLRSA-N 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- JUNWLZAGQLJVLR-UHFFFAOYSA-J calcium diphosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O JUNWLZAGQLJVLR-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940043256 calcium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013064 chemical raw material Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 235000019821 dicalcium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019820 disodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- GYQBBRRVRKFJRG-UHFFFAOYSA-L disodium pyrophosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O GYQBBRRVRKFJRG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 229960001618 ethambutol hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229960004002 levetiracetam Drugs 0.000 description 1
- HPHUVLMMVZITSG-ZCFIWIBFSA-N levetiracetam Chemical compound CC[C@H](C(N)=O)N1CCCC1=O HPHUVLMMVZITSG-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000006012 monoammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000010815 organic waste Substances 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N phthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1C=O ZWLUXSQADUDCSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003339 sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/584—Recycling of catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于酶催化领域,尤其涉及一种L‑2‑氨基丁酸的制备方法,在底物中加入酶催化剂和酶激活剂,所述底物为苏氨酸和甲酸铵,所述酶催化剂为苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶,所述酶激活剂为磷酸盐。上述制备L‑2‑氨基丁酸的方法,采用磷酸盐作为酶激活剂,与亮氨酸脱氢酶配合使用,将反应的中间产物迅速转化,使三种酶的催化速率相互匹配,提高了酶催化的转化效率,避免了副产物的堆积现象,不仅提高了产物的收率,更加有利于产物的分离提纯。
Description
技术领域
本发明属于酶催化领域,尤其涉及一种L-2-氨基丁酸的制备方法。
背景技术
L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸,具有抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用,是一种重要的化工原料和医药中间体,已经广泛应用于药物合成,例如抑菌抗结核药物乙胺丁醇盐酸盐、抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦等。
目前,国内外L-2-氨基丁酸的生产方法分为化学法和生物酶法,化学法是比较经典的方法,主要有化学合成和化学拆分。化学合成主要是以正丁酸和溴为起始原料,经过α卤代反应制得α-溴丁酸,在氨水中合成氨基丁酸,化学拆分法是用手型拆分剂,但是因为使用到昂贵的手型拆分试剂,成本比较高,工业生产不宜采用,而且产生大量的有机废溶剂污染环境。
生物酶法包括微生物发酵法和酶催化转化法,微生物发酵法反应产物成分复杂,分离繁琐,酶催化转化则是一种高选择性反应,从而达到定向转化的目的。
酶催化转化法制备L-2-氨基丁酸主要有两种:一是对消旋的α-氨基丁酸进行酶法拆分制备,主要是用醋酐乙酰化氨基丁酸,然后再用氨基酰化酶进行拆分,反应步骤多,收率偏低;二是以α-羰基丁酸为原料,此法反应底物浓度低,生产成本高。
申请号为201010146920.6,名称为“一种酶法制备L-2-氨基丁酸的方法”的中国专利,其公开的方案是:采用L-苏氨酸为起始原料,首先通过苏氨酸脱氨酶使其转化为2-酮丁酸,然后利用亮氨酸脱氢酶使2-酮丁酸转化生成L-2-氨基丁酸,反应中加入用于辅酶再生的甲酸脱氢酶。这种方法制备L-2-氨基丁酸,以结晶的方式进行产物分离,大大提高了产物纯度,但是却并未涉及到L-2-氨基丁酸的转化率的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高转化率、低成本且易于工业化大生产的L-2-氨基丁酸的制备方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:一种L-2-氨基丁酸的制备方法,在底物中加入酶催化剂和酶激活剂,所述底物为苏氨酸和甲酸铵,所述酶催化剂为苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶,所述酶激活剂为磷酸盐。
上述制备L-2-氨基丁酸的方法,采用磷酸盐作为酶激活剂,与亮氨酸脱氢酶配合使用,将反应的中间产物迅速转化,使三种酶的催化速率相互匹配,提高了酶催化的转化效率,避免了副产物的堆积现象,不仅提高了产物的收率,更加有利于产物的分离提纯。
作为优选方案,所述L-2-氨基丁酸的制备方法,其具体步骤为:
A)向水中加入苏氨酸和甲酸铵,配制成转化液A;
B)向转化液中加入磷酸盐得溶液B;
C)向溶液B中加入苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶,在(30±5)℃条件下反应16~20h,反应结束后即得L-氨基丁酸溶液。
优选的,苏氨酸与甲酸铵的质量比为2:(1~2)。具体地,苏氨酸和甲酸铵加入后,二者浓度分别为100~200g/L和50~200g/L。合成过程中所用水为自来水,无需对用水作蒸馏或者去离子等处理,因此本发明的方法降低了对反应环境的要求,同时也降低了生产成本投入。
优选的,磷酸盐加入量为:磷酸根离子浓度为0.5mmol~20mmol/L。磷酸根离子作为酶激活剂,可以提高酶活性,配合亮氨酸脱氢酶使用,快速转化中间产物,进一步促进了初始反应的速率,三种酶的催化速率相互匹配,提高了酶催化的转化效率,避免了副产物的堆积现象。但是大量引入磷酸根离子后增加了去除难度,最终会影响产品纯度,因此在实现酶激活剂的作用的同时,需要尽可能少的引入磷酸根离子。具体地,所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸氢钙、磷酸钙、焦磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、酸式焦磷酸钠、磷酸钠、焦磷酸钠中的至少一种。加入磷酸盐后,加入pH调节剂调节混合溶液的pH值至7~8,所述pH调节剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
优选的,加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的微生物菌液后,总酶浓度为3~6U。其中,酶活定义为:每毫升转化液每分钟产生1μmol的L-2-氨基丁酸为一个酶活单位。
本发明方案中酶的来源为:将大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶(核苷酸序列是NCBI上Gene ID:948287)、芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶(NCBI上Gene ID:1206507)、博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶(NCBI上GenBank:KM454879.1),通过基因工程菌的方法导入到大肠杆菌中,构建同时产L-苏氨酸脱氢酶、L-亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶的基因工程菌,避免酶的纯化步骤,使用更方便。
附图说明
图1为实施例1的反应过程中转化率随时间变化的折线图。
具体实施方式
一、制备
实施例1
向10L反应釜中加入1200g苏氨酸、1200g甲酸铵、磷酸二氢铵,加水搅拌溶解,然后用20-25%氨水调节pH至7.5,升温至30℃,然后加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的菌泥,其中,磷酸根离子浓度为20mmol/L,混合液中总酶浓度为6U,将混合液置于30℃恒温条件下搅拌反应,16h后反应结束,得到L-氨基丁酸溶液。
实施例2
向10L反应釜中加入1200g苏氨酸、600g甲酸铵、磷酸氢二铵,加水搅拌溶解,然后用20-25%氨水调节pH至7.5,升温至30℃,然后加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的菌泥,其中,磷酸根离子浓度为10mmol/L,混合液中总酶浓度为4U,将混合液置于30℃恒温条件下搅拌反应,20h后反应结束,得到L-氨基丁酸溶液。
实施例3
向10L反应釜中加入1200g苏氨酸、800g甲酸铵、焦磷酸钠,加水搅拌溶解,然后用20-25%氨水调节pH至7.7,升温至30℃,然后加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的菌泥,其中,磷酸根离子浓度为15mmol/L,混合液中总酶浓度为6U,将混合液置于30℃恒温条件下搅拌反应,18h后反应结束,得到L-氨基丁酸溶液。
二、检测
将实施例1反应过程中,每隔两小时用液相色谱仪检测反应体系中苏氨酸和L-氨基丁酸的含量,并计算转化率。
检测方法如下:在EP管中依次加入PH=9.5的硼酸缓冲液300ul,转化液样品250ul,衍生剂200ul(取0.3430g邻苯二甲醛+5ml无水乙醇+0.1472gN-乙酰-L半胱氨酸,用0.1mol/L硼砂缓冲液(PH=9.5)定溶到25ml,避光备用),混匀后等待2分钟,严格控制时间和试剂添加量,然后进样。所需的化合物用0.05mol/L醋酸钠缓冲液∶甲醇=63∶35进行洗脱,流速1.0ml/min,采集时间为10min。色谱条件为XDB-C8(150mm)中性柱,柱温30℃,检测波长334nm。
各个时间点所得的转化率记录入表1中,并作出转化率随时间变化的折线图,见附图1。
表1实施例1各时间点的转化率
反应时间/h | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 |
转化率/% | 25.2 | 40.0 | 55.3 | 70.1 | 80.5 | 87.2 | 93.4 | 98.0 | 98.4 | 98.6 |
由表1可知,采用实施例1的制备方法制备的L-氨基丁酸溶液,苏氨酸转化为L-氨基丁酸的转化率为98.6%。
按照上述方法,检测实施例2和实施例3反应过程中和反应结束后体系的转化率,得到最终结果:实施例2中反应的转化率为98.1%,实施例3中反应的转化率为98.4%,可见,本发明的制备方法制备L-氨基丁酸,转化率高达98%以上。
Claims (5)
1.一种L-2-氨基丁酸的制备方法,其特征在于:在底物中加入酶催化剂和酶激活剂,在30±5℃条件下反应16~20h;
所述底物为苏氨酸和甲酸铵,苏氨酸和甲酸铵的浓度分别为100~200g/L和50~200g/L;
所述酶催化剂为产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的微生物菌液;加入产苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的微生物菌液后,混合溶液中总酶浓度为3~6U;将大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶,通过基因工程菌的方法导入到大肠杆菌中,构建同时产L-苏氨酸脱氢酶、L-亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶的微生物;所述大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶的核苷酸序列是NCBI上Gene ID:948287的核苷酸序列,所述芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上Gene ID:1206507的核苷酸序列,所述博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶的核苷酸序列是NCBI上GenBank:KM454879.1的核苷酸序列;
所述酶激活剂为磷酸盐,磷酸盐加入量为:磷酸根离子浓度为10mmol~20mmol/L;加入磷酸盐后,加入pH调节剂调节混合溶液的pH值至7~8;所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸氢钙、磷酸钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钠中的至少一种。
2.根据权利要求1所述L-2-氨基丁酸的制备方法,其具体步骤为:
A)向水中加入苏氨酸和甲酸铵,配制成转化液A;
B)向转化液中加入磷酸盐得溶液B;
C)向溶液B中加入苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶,在30±5℃条件下反应16~20h,反应结束后即得L-2-氨基丁酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述的L-2-氨基丁酸的制备方法,其特征在于:苏氨酸与甲酸铵的质量比为2:1~2。
4.根据权利要求1所述L-2-氨基丁酸的制备方法,其特征在于:所述pH调节剂为氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
5.根据权利要求1或2所述L-2-氨基丁酸的制备方法,其特征在于:制备过程中所用水为自来水。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910246388.6A CN109777845B (zh) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 一种l-2-氨基丁酸的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910246388.6A CN109777845B (zh) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 一种l-2-氨基丁酸的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109777845A CN109777845A (zh) | 2019-05-21 |
CN109777845B true CN109777845B (zh) | 2023-06-30 |
Family
ID=66490753
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910246388.6A Active CN109777845B (zh) | 2019-03-29 | 2019-03-29 | 一种l-2-氨基丁酸的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109777845B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109999016B (zh) * | 2019-05-23 | 2021-09-21 | 浙江药苑生物科技有限公司 | 盐酸乙胺丁醇在治疗难治性癫痫中的应用 |
CN111172213B (zh) | 2020-01-18 | 2022-03-04 | 江南大学 | 一种用双酶串联制备l-2-氨基丁酸的方法 |
CN112680487B (zh) * | 2021-02-03 | 2022-07-12 | 江南大学 | 催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成l-2-氨基丁酸的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101818178A (zh) * | 2010-04-15 | 2010-09-01 | 尚科生物医药(上海)有限公司 | 一种酶法制备l-2-氨基丁酸的方法 |
CN106399216A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-02-15 | 江南大学 | 一种高效合成α‑氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102212567B (zh) * | 2010-04-02 | 2014-02-05 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心 | 一种l-2-氨基丁酸的生产方法 |
CN102605014B (zh) * | 2012-03-14 | 2013-05-15 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种l-2-氨基丁酸的生物制备方法 |
CN104531793B (zh) * | 2014-12-20 | 2018-04-27 | 郁庆明 | 全细胞生物转化制备l-2-氨基丁酸的方法 |
CN109266595B (zh) * | 2018-09-25 | 2020-12-29 | 江南大学 | 一种转化l-苏氨酸生产l-2-氨基丁酸的重组菌的构建及应用 |
-
2019
- 2019-03-29 CN CN201910246388.6A patent/CN109777845B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101818178A (zh) * | 2010-04-15 | 2010-09-01 | 尚科生物医药(上海)有限公司 | 一种酶法制备l-2-氨基丁酸的方法 |
CN106399216A (zh) * | 2016-11-16 | 2017-02-15 | 江南大学 | 一种高效合成α‑氨基丁酸的单细胞工厂及其构建与应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109777845A (zh) | 2019-05-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109777845B (zh) | 一种l-2-氨基丁酸的制备方法 | |
CN106191170B (zh) | 一种酶法制备三磷酸腺苷的方法 | |
EP3533862B1 (en) | Methylopila sp. and use thereof in selective resolution and preparation of (s)-alpha-ethyl-2-oxo-1 -pyrrolidine acetate | |
CN111363775A (zh) | 一种生物酶法去消旋化制备l-草铵膦的方法、草铵膦脱氢酶突变体及应用 | |
CN113355367B (zh) | 酮酸还原酶在合成手性芳香2-羟酸中的应用 | |
CN107326061B (zh) | 一种采用生物酶催化立体选择性拆分卡洛芬对映体的方法 | |
CN108018252B (zh) | 一种中间体2’-脱氧鸟苷的制备方法 | |
CN107586793B (zh) | 制备具有多个手性中心的醇化合物的方法 | |
CN109679978B (zh) | 一种用于制备l-2-氨基丁酸的重组共表达体系及其应用 | |
CN110951706B (zh) | 重组R-ω-转氨酶、突变体及在不对称合成西他列汀中的应用 | |
CN116814572A (zh) | 一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用 | |
CN106119224B (zh) | 一种酯酶EstP00714及其编码基因和应用 | |
CN113930457B (zh) | 一种双酶偶联合成(s)-香茅醇的方法 | |
EP4394035A1 (en) | Lipase mutant and application thereof | |
CN114457130A (zh) | 一种重组工程菌及其构建方法和其应用 | |
CN110713965A (zh) | 一种利用全细胞转化生产1,2-氨基醇类化合物的方法 | |
CN114958878B (zh) | 一种固定化酶及其在合成nmn中的应用 | |
CN114591991B (zh) | 一种基于短链羰基还原酶制备钙泊三醇关键手性中间体的方法 | |
CN109321609B (zh) | 一种利用微通道反应装置制备r-扁桃酸的方法 | |
CN102660625A (zh) | R-邻氯扁桃酸及其醇酯的制备方法 | |
CN118291412A (zh) | 一种亮氨酸脱氢酶及其应用 | |
CN116103360A (zh) | 一种酶法制备硒代氨基酸的方法 | |
CN117384222A (zh) | 一种从发酵液中分离纯化核苷酸的方法 | |
CN113481121A (zh) | 一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用 | |
CN117402843A (zh) | 一种来源于日本裂殖酵母yFS275的酮还原酶及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
OL01 | Intention to license declared | ||
OL01 | Intention to license declared |