CN112680487B

CN112680487B - 催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成l-2-氨基丁酸的方法

Info

Publication number: CN112680487B
Application number: CN202110149981.6A
Authority: CN
Inventors: 罗玮; 胡佳桂
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Shenzhen Small Molecule New Drug Innovation Center Co ltd
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN112680487A

Abstract

本发明涉及一种催化长侧链芳香族胺与2‑酮丁酸合成L‑2‑氨基丁酸的方法，本发明采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ω‑转氨酶作为催化剂催化长侧链芳香族胺与2‑酮丁酸合成L‑2‑氨基丁酸。本发明筛选得到的ω‑转氨酶，用于制备L‑2‑氨基丁酸，该ω‑转氨酶ppTA在利用无论是芳香族胺—苄胺，还是长侧链芳香族胺‑‑S‑苯基丁胺，在合成L‑2‑氨基丁酸方面有巨大潜力，在生物医药领域有较大的应用前景。

Description

催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法。

背景技术

手性胺化合物是一类重要的医药中间体，具有较高的科研和开发价值。手性胺L-2-氨基丁酸作为非天然氨基酸，是医药领域多种具有价值的化合物的手性前体，包括抗惊厥药物布瓦西坦和左乙拉西坦，以及用于结核病治疗的乙胺丁醇等。合成L-2-氨基丁酸的方法有很多，化学法反应条件苛刻、成本高昂、路线复杂。生物法进行催化合成或拆分相对于上述化学法具有明显优势，绿色环保，底物廉价，反应温和，选择性高。

ω-转氨酶(ω-transaminase，EC 2.6.1.X)是一类5’-磷酸吡哆醛依赖性酶，能介导酮的不对称还原胺化或手性胺动力学拆分。该酶相对于胺氧化还原酶，具有选择性高，无需辅因子，高芳香族胺活性的优点。最早的转氨酶于上个世纪中旬被发现，直至上世纪末在手性体研究方面出现了重大的进展，如今ω-转氨酶在不对称合成手性胺方面研究发挥了重要作用。该酶最早在河流弧菌中发现并筛选而来，后逐渐被发现存在人苍白杆菌、节杆菌、紫色杆菌中等，并且研究充分且具有代表性。

非杆菌来源的ω-转氨酶报道较少，并且活性与应用远不如杆菌来源的酶。但是杆菌来源ω-转氨酶具有强烈底物抑制，以及底物适用性低，尤其涉及大于两个C的长侧链底物时毫无活性。

发明内容

为解决上述问题，本发明利用基因挖掘的便利性，找到非杆菌来源的酶活高，稳定性强，底物耐受性好的ω-转氨酶，并用于制备L-2-氨基丁酸，在利用无论是芳香族胺—苄胺，还是长侧链芳香族胺--S-苯基丁胺，在合成L-2-氨基丁酸方面有巨大潜力，在生物医药领域有较大的应用前景。

本发明的第一个目的是提供一种催化芳香族长链胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法，包括采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ω-转氨酶作为催化剂催化芳香族长链胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸。

进一步地，编码所述的ω-转氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，催化反应的体系包括：1～5U/mL的ω-转氨酶、5～15mM芳香族长链胺与5～15mM 2-酮丁酸。

进一步地，催化反应的条件是在25～40℃、pH 7～8条件下搅拌反应。

进一步地，催化反应通过加酸进行终止反应。

进一步地，所述的ω-转氨酶通过如下方法进行制备：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ω-转氨酶编码基因与质粒连接后转入宿主菌中，得到表达ω-转氨酶的重组菌；

(2)采用步骤(1)构建的重组菌诱导发酵生产得到含有ω-转氨酶的发酵粗酶液；

(3)将步骤(2)的发酵粗酶液进行纯化得到ω-转氨酶。

进一步地，所述的宿主菌为大肠杆菌。

进一步地，所述的质粒为pET28a(+)。

进一步地，所述的诱导发酵是在发酵至OD为0.5～0.7时，加入IPTG在15～18℃进行低温诱导产酶。

进一步地，所述的纯化包括采用镍离子亲和层析柱上样，咪唑作为流动相进行梯度洗脱；洗脱液经G25脱盐柱脱盐后超滤浓缩。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明筛选得到的ω-转氨酶，用于制备L-2-氨基丁酸，该ω-转氨酶ppTA在利用无论是芳香族胺—苄胺，还是长侧链芳香族胺--S-苯基丁胺，在合成L-2-氨基丁酸方面有巨大潜力，在生物医药领域有较大的应用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。

附图说明

图1为7种理论表达ω-转氨酶蛋白的基因工程菌粗酶液SDS-PAGE电泳图。

图2为ω-转氨酶纯化SDS-PAGE电泳图。

图3为ω-转氨酶的最适温度以及在相应条件下的稳定性。

图4为ω-转氨酶的最适pH以及在相应条件下的稳定性。

图5为ω-转氨酶在4℃下的一阶指数衰减函数图。

图6为ω-转氨酶在金属离子影响下的活性。

图7为ω-转氨酶利用苄胺参与合成L-2-氨基丁酸的HPLC检测结果。

图8为ω-转氨酶利用长侧链胺合成L-2-氨基丁酸的结果。

具体实施方式

实施例1：

根据已报道的高活性来源ω-转氨酶氨基酸序列为探针，在NCBI蛋白数据库中进行同源比对，经过BLAST选择氨基端序列一致性范围在20％-100％之间的19个理论氨基酸序列。经氨基酸关键序列分析，复筛7个候选的理论ω-转氨酶序列。见下表1。

表1

实施例2：

本实施例说明ω-转氨酶编码基因的克隆方法。引入见表2。设计50μL的PCR反应体系，反应体系中加入25μL 2хEs Taq MasterMix、2μL的上下游引物、1μL全基因组模板以及20μL无菌水。PCR反应条件为95℃预变性5min后开始30轮循环：95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸25秒。最后终延伸5min。PCR产物进行电泳鉴定以决定采取胶回收片段或产物纯化片段。纯化后进行TA克隆至pMD18-T载体。利用CaCl₂法热激转化至大肠杆菌E.coliJM109。经过菌P验证转化子与提取质粒双酶切验证，测序验证。

表2

实施例3：

本实施例说明产ω-转氨酶基因工程菌的构建与产酶分析。将验证正确的目的基因片段与质粒pET28a(+)都进行双酶切，片段回收纯化后用T4连接酶16℃过夜连接，利用CaCl₂法热激转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。经过菌P验证转化子与提取质粒双酶切验证。选择正确的产ω-转氨酶的菌株BL21(DE3)(pET28a-TA)于37℃LB抗性培养基中培养至OD＝0.6时，加入0.1mM终浓度IPTG并于16℃低温诱导12h。低温高速离心收集菌体细胞并用PBS缓冲液清洗三次，至于高压匀浆机破壁，收集破碎液低温高速离心，上清过0.22μm水膜得粗酶样品。粗酶上样SDS-PAGE进行蛋白分析，取5μL酶液于15μL蛋白上样缓冲液，沸水浴10min离心。根据蛋白胶制作说明书浓度配制分离胶与浓缩胶。待凝固后上样电泳即可。电泳完毕加入考马斯亮蓝R250染色30min，用水过夜脱色即可。观察表达情况，见图1。结合酶活检测筛选最适合的ω-转氨酶。酶活定义为1min催化10mM底物(苄胺+2-酮丁酸)形成1μmol产物所需的酶量。

实施例4：

本实施例说明产ω-转氨酶基因工程菌的表征。取发酵破碎液，经膜过滤后上样至Ni-NTA亲和层析柱，用低浓度咪唑(20mM)冲洗杂蛋白，再利用咪唑溶液以3.0mL·min^-1的浓度从20mM至500mM进行梯度洗脱，出峰收集洗脱液。在洗脱液中加入足量PLP上样至G-25脱盐柱中，PBS缓冲液洗脱至出峰收集,超滤浓缩即得纯酶液，见图2。收集的纯ω-转氨酶的表征步骤见发明内容对应部分，见图3与图4，低温时酶活性随着温度上升变化不大，在37℃左右酶活达到最大，之后随着温度继续上升，酶活迅速下降。同样ppTA的温度稳定性随着温度的上升持续下降，在小于35℃培养2h依旧可以保持80％活性；ppTA的最适pH是9，与其他大部分ω-转氨酶一样喜碱厌酸，但是考察其pH稳定性发现，在pH＝7左右酶可以保持很强的稳定性，而不是其最适pH处，因此进行长时间催化时选择的pH应当选择pH＝8左右。测量该酶的稳定性时，将加入PLP与未加入两组样品一起置于4℃贮存，每隔一段时间取出置于30℃复苏30min进行检测，根据一阶指数衰减函数(公式1)和失活半衰期公式(公式2)计算出ppTA在不同条件下的失活速率常数(k_D)和半衰期(t_1/2)。见图5，可知ppTA有PLP存在下半衰期高达1650h。

测量金属离子的影响时，先配制200mM Fe²⁺、Fe³⁺、K⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Zn²⁺的母液，在反应体系中加入适量的母液配置成终浓度1mM或10mM。按照酶活测量方法检测酶活即可。结果见图6，高浓度的Na⁺与Fe²⁺对酶活有积极的正向作用，而金属离子螯合剂，高浓度Cu²⁺和低浓度Fe离子有抑制效果，因此在进行催化时加入适量的Na⁺是必需的。

实施例5：

表3 ppTA的氨基供体

注：[a]以2-酮丁酸为氨基受体，底物浓度20mM；[b]初始反应速率为43μM·min^-1；[c]n.r.：not reactive(或者反应活性<1％).

本实施例说明该新型ω-转氨酶进行L-2-氨基丁酸合成试验。当采用苄胺作为氨基供体，反应体系10mL，由0.01M pH7.5的PBS缓冲液配制而成的10mM苄胺与2-酮丁酸组成底物，加入终浓度2U/mL的ω-转氨酶作为催化剂。在180rpm、30℃条件下反应，间或取样加入10％体积的1M HCl终止反应，通过HPLC检测产物产量。如图7所示，在0.5h后反应放缓，4h最终完成87％的产率，ee值大于99％。当采用大于乙烷的侧链氨基供体进行反应时，以S-苯基丁胺为例，反应体系10mL，由0.01M pH7.5的PBS缓冲液配制而成的10mM S-苯基丁胺与2-酮丁酸为底物，加入终浓度10U/mL的ppTA作为催化剂，如图8所示，反应24h后，产率大于80％，ee值大于99％。而文献研究中杆火热的人苍白杆菌来源ω-转氨酶几乎无反应，产率小于1％。说明该ω-转氨酶ppTA在利用无论是研究火热的芳香族胺—苄胺，还是长侧链芳香族胺--S-苯基丁胺，在合成L-2-氨基丁酸方面有巨大潜力，在生物医药领域有较大的应用前景。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> 催化长侧链芳香族胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 453

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Asn Gln Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Val His Gln Arg Gly Thr Val Val

20 25 30

Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val His Gly Arg Arg

35 40 45

Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp

50 55 60

His Arg Gly Leu Ile Glu Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Asp Arg Phe Pro

65 70 75 80

Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu

85 90 95

Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Glu Ser Gly Arg Val Phe

100 105 110

Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu

115 120 125

Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu

130 135 140

Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met

145 150 155 160

Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe

165 170 175

Ile His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu

180 185 190

Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Asp Thr

195 200 205

Ile Thr Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro

210 215 220

Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Gln Gly Tyr Phe Gln

225 230 235 240

Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys His Asp Ile Pro Met Ile Ser Asp

245 250 255

Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Ser Thr Trp Gly Cys Leu

260 265 270

Thr Tyr Asp Phe Met Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr

275 280 285

Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Asp Leu Ala

290 295 300

Lys Arg Val Glu Ala Ala Val Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly

305 310 315 320

Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala

325 330 335

Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu

340 345 350

Ala Pro Arg Phe Glu Ala Gly Leu Gln Arg Ile Ala Asp Arg Pro Asn

355 360 365

Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu Glu Ala Val

370 375 380

Lys Asp Lys Pro Ser Lys Thr Pro Phe Asp Gly Asn Leu Ser Val Ser

385 390 395 400

Glu Arg Ile Ala Asn Thr Cys Thr Asp Leu Gly Leu Ile Cys Arg Pro

405 410 415

Leu Gly Gln Ser Ile Val Leu Cys Pro Pro Phe Ile Leu Thr Glu Ala

420 425 430

Gln Met Asp Glu Met Phe Glu Lys Leu Glu Lys Ala Leu Asp Lys Val

435 440 445

Phe Ala Glu Val Ala

450

<210> 2

<211> 1362

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgaaccaac cgcaaagctg ggaagcccgc gccgagacct attcgctcta cggcttcacc 60

gacatgcctt cggtccatca gcgaggcacc gtcgtcgtga cccatggcga gggcccctat 120

atcgtcgatg tgcatggccg ccgctatctg gatgccaatt cggggctgtg gaacatggtc 180

gccggcttcg accacagggg cctgatcgag gctgccaagg cgcaatacga ccgctttccc 240

ggctatcacg cctttttcgg ccgcatgtcc gaccagaccg tgatgctgtc ggaaaagctg 300

gtagaggtct cgcccttcga atcgggccgg gtcttctata ccaattccgg ctccgaggcg 360

aacgacacca tggtcaagat gctgtggttc ctgcatgccg ccgagggcaa gccgcaaaag 420

cgcaagatcc tgacgcgctg gaacgcctat cacggcgtga ccgcggtttc cgcctcgatg 480

accggcaagc cctacaactc ggtcttcggc ctgccgctgc ccggcttcat ccacctgacc 540

tgcccgcatt actggcgcta tggcgaggag ggcgagaccg aggaacaatt cgtcgcccgc 600

ctggcccgcg aattggagga caccatcacc cgcgagggcg ccgacaccat cgccggcttc 660

ttcgccgagc cggtgatggg cgcggggggc gtgatcccgc cggcccaggg ctatttccag 720

gccatcctgc cgatcttgcg caagcacgac attccgatga tctcggacga ggtgatctgc 780

ggcttcgggc gcaccggcag cacctggggc tgcctgacct atgacttcat gcccgatgcc 840

atcatctcgt ccaagaacct gacggcgggc tttttcccca tgggcgcggt gatcctcggc 900

cccgacctcg cgaaacgggt cgaggccgcc gtcgaggcga tcgaggagtt tccgcacggc 960

ttcaccgcct cgggccatcc ggtcggctgc gccatcgcgc tgaaggccat cgacgtggtg 1020

atgaacgagg ggctggccga gaacgtgcgc cgcctcgccc cccgcttcga ggcggggctg 1080

cagcgcatcg ccgaccgccc gaacatcgga gaataccgcg gcatcggctt catgtgggcg 1140

ctggaggcgg tcaaggacaa gccgagcaag acccccttcg acggcaatct ctcggtcagc 1200

gagcgcatcg ccaatacctg caccgacctg gggctgatct gccggccgct gggccagtcc 1260

atcgtgctct gcccgccctt catcctgacc gaggcgcaga tggacgagat gttcgagaag 1320

ctggaaaagg cgctcgacaa ggtcttcgcc gaggtcgcct ga 1362

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

cgagctcatg aaccaaccgc aaagctg 27

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

acgcgtcgac ttaggcgacc tcggcgaag 29

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

ggaattccat atgatgtatc cggatttaaa aggaaaag 38

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

ccctcgagtt aaccgcggcc tgc 23

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

cgcggatccg atgattaaag cctacgctgc 30

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

cgagctccta atttttacta tggctgagca c 31

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

accgggatcc atggctgact cgcaacccct 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

cccaagcttt taacccgcca aaaagaacct g 31

Claims

1.一种催化芳香族胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括采用氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ω-转氨酶作为催化剂催化芳香族胺与2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸；所述芳香族胺为苄胺、(S)-苯乙胺、(S)-***或(S)-苯基丁胺。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述的ω-转氨酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化反应的体系包括：1~5U/mL的ω-转氨酶、5~15mM芳香族胺与5~15mM 2-酮丁酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化反应的条件是在25~40℃、pH 7~8条件下搅拌反应。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，催化反应通过加酸进行终止反应。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的ω-转氨酶通过如下方法进行制备：

（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的ω-转氨酶编码基因与质粒连接后转入宿主菌中，得到表达ω-转氨酶的重组菌；

（2）采用步骤（1）构建的重组菌诱导发酵生产得到含有ω-转氨酶的发酵粗酶液；

（3）将步骤（2）的发酵粗酶液进行纯化得到ω-转氨酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的质粒为pET28a(+)。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的诱导发酵是在发酵至OD为0.5~0.7时，加入IPTG在15~18℃进行低温诱导产酶。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的纯化包括采用镍离子亲和层析柱上样，咪唑作为流动相进行梯度洗脱；洗脱液经G25脱盐柱脱盐后超滤浓缩。