CN113481121A - 一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用，该双菌生物催化剂由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。用于合成西他列汀时，由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为西他列汀，其反应路线为，
Figure DDA0003140414620000011

Description

一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，具体领域为一种生物催化剂及西他列汀的生物合成方法。
背景技术
西他列汀(Sitagliptin)的化学名为(3R)-3-氨基-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-***并 [4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(结构式如下所示)。
Figure BDA0003140414600000011
磷酸西他列汀(sitagliptin phosphate)是一种新型抗II型糖尿病药物，服用方式为口服，毎次一片，一次约100mg剂量，在2006年10月由默沙东公司成功研制并开发，经美国 FDA批准上市，是史上第一个用于治疗II型糖尿病的二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂类药物。
西他列汀的化学制备法与生物制备法均有报道，其中以ATA177转氨酶用于制备西他列汀最为广泛，国内外多所企业、高校对ATA117转氨酶的优化进行了研究。如CN103608355A中，默沙东公司通过树脂固载ATA117，对转氨酶ATA117多次套用，降低了其生产成本。CN109777813A中，浙江工业大学通过将转氨酶-PLP共固定化，进行西塔列汀的制备，该方法稳定性好，固载酶使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用。
转氨酶催化反应是制备西他列汀的最后一步反应，大肠表达***制备转氨酶通常需要添加细菌内毒素的去除步骤，使用常规枯草芽孢表达***，虽然无细菌内毒素产生，但表达量过低，生产应用价值偏低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种双菌生物催化剂，由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。
其中，枯草芽孢杆菌的菌株为Bacillus subtili168，表达质粒为pHT43或pHT01。
其中，巨大芽孢杆菌的菌株为Bacillus megateriumATCC14581模式菌株(ATCC菌种库)。
其中，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：
(1)将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQ ID NO：2-3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90 s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix25μL；
(2)采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含的LB抗性平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant-01；
(3)将表达生物酶的Recombinant-01，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD600在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导22h；发酵液诱导结束后，于4℃， 12000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得枯草芽孢杆菌全细胞催化剂。
其中，所述巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：将BacillusmegateriumATCC14581模式菌株接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％， 37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得巨大芽孢杆菌全细胞催化剂。
本发明所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，具体为：
由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP(磷酸吡哆醛)、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为化合物I，其反应路线为，
Figure BDA0003140414600000031
其中，所述化合物II和双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的质量比为 1:1～30，优选为1:10～20。
其中，所述氨基供体选自丙氨酸、三乙醇胺、异丙胺、丙胺、乙胺、色氨酸、丁胺或α-氨基戊二酸中的一种或几种；优选为异丙胺或丙氨酸。
其中，所述化合物II与所述氨基供体的质量比为1:1～10；优选为1:1～5。
其中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；优选的，所述缓冲液为0.1～2M、pH值为8.0～8.5 的三乙醇胺盐酸盐缓冲液。
所述助溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸丁酯、DMSO中的任意一种，优选为DMSO；
所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～100，优选为1:10；
双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂与辅酶PLP的质量比5～30:1；
催化反应时，反应温度为0～60℃；优选为30～45℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种全新的双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的酶催化制备工艺，该方法一定程度上解决了现有技术中枯草芽孢杆菌作为全细胞相对于大肠杆菌反应体系反应率不高的问题，且枯草芽孢杆菌无细菌内毒素的生成，安全无污染。
本发明通过枯草芽孢杆菌全细胞催化剂与巨型芽孢杆菌全细胞催化剂协同催化，避免了添加甘油等添加剂导致的酶催化废水初始COD大幅度增加等问题。本发明方法，对环境友好、无污染，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1的载体构建示意图；
图2为西他列汀纯品图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组枯草芽孢杆菌的制备
重组枯草芽孢杆菌的工程菌制备方法为：
将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQID NO：2-3所示；进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90s，72℃ 90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL， PrimerSTARMix25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL， 16℃过夜连接；将构建好的载体(如图1所示)通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含氨苄霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant-01。
实施例2枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备
将表达生物酶的重组工程菌Recombinant-01，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液。将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD600在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导22h。发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体。用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后获得枯草芽孢杆菌全细胞催化剂。
实施例3巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的制备
将Bacillus megateriumATCC14581模式菌株接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，收集菌体。用pH7.0，0.1M的 PBS缓冲液洗涤后获得巨大芽孢杆菌全细胞催化剂。
其中，Bacillus megateriumATCC14581模式菌株购自上海北诺生物科技有限公司。
实施例4西他列汀的制备
Figure BDA0003140414600000061
将实施例2制备枯草芽孢杆菌全细胞催化剂与实施例3制备的巨型芽孢杆菌全细胞催化剂按照质量比1：0.3的比例，使用95mL的缓冲液(0.2M三乙醇胺盐酸盐，pH8.0)溶解混匀，反应时加入含有底物的55mLDMSO，即总体系为150mL，使得反应体系中化合物II终浓度1g/L，枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的终浓度10g/L。最后加入终浓度为1mM 的辅酶PLP(磷酸吡哆醛)和终浓度为1g/L的异丙胺，0.1％NaOH调节pH，体系pH值为8.0，40℃过夜反应后，终止反应，乙酸乙酯萃取，经液相检测化合物I，即西他列汀，产率为92％，进一步纯化后纯度为99.7％，如图2所示。
对比例1西他列汀的制备
将实施例2制备的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂首先使用95mL的缓冲液(0.2M三乙醇胺盐酸盐，pH8.0)溶解混匀，反应时加入含有底物的55mLDMSO，使得反应体系中化合物II终浓度1g/L，枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的终浓度10g/L。最后加入终浓度为1mM 的磷酸吡哆醛和终浓度为1g/L的异丙胺，0.1％NaOH调节pH，体系pH值为8.0，40℃过夜反应后，终止反应，乙酸乙酯萃取，经液相检测化合物I，即西他列汀，产率为68％，进一步纯化后纯度为97.6％。
对比例2
将实施例3制备的巨大芽孢杆菌全细胞催化剂首先使用95mL的缓冲液(0.2M三乙醇胺盐酸盐，pH8.0)溶解混匀，反应时加入含有底物的55mLDMSO，使得反应体系中化合物II终浓度1g/L，巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的终浓度10g/L。最后加入终浓度为1mM 的磷酸吡哆醛和终浓度为1g/L的异丙胺，0.1％NaOH调节pH，体系pH值为8.0，40℃过夜反应后，终止反应，乙酸乙酯萃取，经液相检测化合物I，无西他列汀产生，且无明显杂质产生。
通过实施例4与对比例1-2的对比可以看出，单独使用巨大芽孢杆菌全细胞催化剂则无催化效果，而枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌双菌体系进行生物催化反应，催化效率大幅度增加，且无明显其他杂质产生，远远优于单独使用枯草芽孢杆菌全细胞催化剂。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种双菌生物催化剂及在合成西他列汀中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 993
<212> DNA
<213> 生物酶基因序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggcattct cagcagacac gccggaaatt gtttacaccc acgatacggg cctggactac 60
attacctaca gcgactacga actggacccg gcaaacccgc tggctggcgg tgcagcatgg 120
attgagggtg cgtttgtgcc gccgagtgaa gcccgtattt ccatctttga tcagggtttc 180
tatacgtctg acgcaaccta caccacgttt catgtttgga acggtaatgc tttccgtctg 240
ggcgaccaca ttgaacgcct gttcagcaat gcagaatcta ttcgcctgat cccgccgctg 300
acgcaagatg aagtcaaaga aatcgcgctg gaactggtgg ccaagaccga actgcgtgaa 360
gccatggtca ccgtgacgat tacccgcggc tatagctcta cgccgtttga acgtgatatc 420
accaaacatc gcccgcaggt gtatatgagt gcgtgcccgt accaatggat tgttccgttc 480
gatcgtatcc gcgacggtgt gcacctgatg gttgcacaga gcgtccgtcg caccccgcgt 540
agttccattg atccgcaggt gaagaacttt caatggggcg acctgattcg tgcaatccaa 600
gaaacccatg atcgcggttt cgaactgccg ctgctgctgg attgtgacaa cctgctggct 660
gaaggtccgg gctttaatgt ggttgtcatc aaagatggtg tggttcgtag cccgggtcgt 720
gcagctctgc cgggtattac gcgcaagacc gttctggaaa tcgcggaatc tctgggccac 780
gaagcgattc tggccgatat cacgccggca gaactgtacg atgctgacga agttctgggt 840
tgctcaaccg gcggtggcgt ctggccgttc gtttcggtcg atggtaattc aatttcggac 900
ggtgtgccgg gtccggttac ccagagcatt atccgtcgtt actgggaact gaatgtggaa 960
ccgtcgtcgc tgctgacccc ggtgcaatac tga 993
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物F(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcggatcca tggcattctc agcagacac 29
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物R(Artificial Sequence)
<400> 3
gacgtctcag tattgcaccg gggt 24

Claims (10)

1.一种双菌生物催化剂，其特征在于：由枯草芽孢杆菌全细胞催化剂和巨大芽孢杆菌全细胞催化剂组成，二者的质量比为1:0.1～1，所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂由含有如SEQ ID NO：1所示外源基因的重组枯草芽孢杆菌的工程菌制得。
2.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：枯草芽孢杆菌的菌株为Bacillus subtili168，表达质粒为pHT43或pHT01。
3.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：巨大芽孢杆菌的菌株为Bacillus megateriumATCC14581模式菌株。
4.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：
(1)将如SEQ ID NO：1所示的生物酶基因进行全合成后，设计上下游引物F、R，如SEQ IDNO：2-3所示，进行PCR扩增，PCR条件为：98℃3min，95℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
(2)采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；BamHI和ZraI酶切胶回收产物及pHT01质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因与载体pHT01连接，连接体系：目的基因4μL，载体pHT01 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过转化技术导入Bacillus subtilis168中，涂布在含的LB抗性平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含生物酶基因的重组工程菌Recombinant-01；
(3)将表达生物酶的Recombinant-01，接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，作为种子液；将新鲜的种子液接入TB培养基中发酵培养，37℃的条件下，220rpm摇床中培养至OD600在0.6～0.8时向培养基中加入IPTG，IPTG的浓度为0.5mM，再于18℃诱导22h；发酵液诱导结束后，于4℃，12000rpm离心5min，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得枯草芽孢杆菌全细胞催化剂。
5.根据权利要求1所述的双菌生物催化剂，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的制备方法具体为：将Bacillus megateriumATCC14581模式菌株接种至LB液体培养基中，接种量为培养基体积的1％，37℃的条件下，220rpm摇床中过夜培养后，收集菌体；用pH7.0，0.1M的PBS缓冲液洗涤后，获得巨大芽孢杆菌全细胞催化剂。
6.权利要求1-5任一所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：由化合物II作为起始原料，在缓冲液、助溶剂、辅酶PLP、氨基供体的存在下，经双菌生物催化剂催化转化为化合物I，即西他列汀，其反应路线为，
Figure FDA0003140414590000021
7.根据权利要求6所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述助溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸丁酯、DMSO中的任一种；
所述氨基供体选自丙氨酸、三乙醇胺、异丙胺、丙胺、乙胺、色氨酸、丁胺或α-氨基戊二酸中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述助溶剂为DMSO；所述氨基供体为异丙胺或丙氨酸；所述缓冲液为0.1～2M、pH值为8.0～8.5的三乙醇胺盐酸盐。
9.根据权利要求6所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述化合物II和双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂的质量比为1:1～30；
所述化合物II与所述氨基供体的质量比为1:1～10；
所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～100；
催化反应时的反应温度为0～60℃。
10.根据权利要求9所述的双菌生物催化剂在合成西他列汀中的应用，其特征在于：所述化合物II和双菌生物催化剂中的巨大芽孢杆菌全细胞催化剂的质量比为1:1～20；
所述化合物II与所述氨基供体的质量比为1:1～5；
所述助溶剂与缓冲液的体积比为1:1～10；
双菌生物催化剂中的枯草芽孢杆菌全细胞催化剂与辅酶PLP的质量比5～30:1；
催化反应时的反应温度为30～45℃。
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