CN109762767B - 一种污水复合微生物处理剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种污水复合微生物处理剂及其制备方法与应用，该处理剂中包括微生物菌体和吸附稳定剂，所述微生物菌体至少含有巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌以及短小乳杆菌。本发明的一种污水复合微生物处理剂，使用后能够显著降低高浓度养殖污水的粘度。污水经本处理剂处理一段时间以后，粘度降低可达60～95％以上；污水粘度的降低，显著减小了后续处理步骤中管路堵塞、流动不畅的风险，提高了污水处理效率；并且本发明的四种菌之间的竞争抑制作用不显著，而四种菌各自产生的胞外酶对降低粘度具有叠加增效的效果。

Description

一种污水复合微生物处理剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种污水复合微生物处理剂及其制备方法与应用，属于畜牧养殖污水处理技术领域。

背景技术

近年来，随着我国经济的飞速发展和人民生活水平的日益提高，市场对于肉、蛋、奶等畜禽产品的需求越来越大，旺盛的市场需求和养殖品种、养殖技术的革新带动了我国畜牧养殖业的蓬勃发展。

世界范围内，以澳大利亚、新西兰、加拿大等为代表的畜牧发达国家由于地广人稀，草场和自然资源丰富，畜牧养殖业以大规模的放牧管理为主，辅以现代化的产品深加工，单位土地的畜禽承载量较低，环境压力较小；而我国人口众多，土地、水等自然资源相对紧张，现阶段畜牧养殖业以规模化、集约化为主要发展方向，虽然单位生产效率相对较高，但是由此也造成了畜禽养殖废弃物总量巨大、高度集中、难于处理等问题，环境压力突出。

生猪、奶牛、肉牛等的规模化养殖耗水巨大，除动物饮用耗水以外，冲刷粪便、清洁挤奶厅、保持养殖区环境卫生等都会消耗大量的水资源。相应的，规模化养殖场产生的污水包括动物尿液、粪便混合物、场区冲刷水等多种来源，成分复杂，浓度较高，其COD可达5000-20000mg/L，BOD5可达2000-10000mg/L，氨氮可达800mg/L以上，总氮可达1500mg/L以上，总磷可达500mg/L以上，固形物含量可达10000mg/L以上，粘度可达300mPa/s以上。目前来看，高浓度养殖污水的无害化处理仍较为困难，且成本巨大。

由于养殖污水常混合有大量动物粪便、饲料、体毛等物质，其固形物含量高、粘度大，采用氧化塘、生物湿地等常规污水净化方式进行处理时，很容易堵塞管路、附着留滞在处理设备内部，严重影响处理效率甚至导致净化设备失效。虽然生产中可以通过增加和改进初沉池、二沉池的办法初步去除固形物，但是污水粘度却难以降低，高粘度养殖污水的处理一直是困扰行业发展的难题之一。

养殖污水富含多糖、蛋白质、丝状纤维等成分，这些成分彼此交联，极大增加了污水的粘度。而部分种类的乳酸菌、芽孢杆菌等具有较高的蛋白酶、多糖酶、纤维素酶活性，能够高效分解污水中的蛋白质、多糖、丝状纤维等，对于降低污水粘度可能存在一定帮助。

中国专利文献CN109010883A(申请号201810616325.0)公开了一种环保微生物除臭剂，分散于培养基中的活性成分包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌及酵母菌，所述植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌及酵母菌的有效活菌数之比为1：1：1：1。本发明通过对活性菌的选择搭配，活性成分含有含量相近的、相互适应的四个菌种组合，适用于城乡生活垃圾和生活废水复杂多变的除臭需要。

上述除臭剂中的微生物虽然可以利用废水中的N、S等物质进行除臭，但对于养殖废水中的高粘度问题，仍然无法解决。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种污水复合微生物处理剂及其制备方法与应用。

本发明的技术术语说明：

微生物处理剂：由一种或数种微生物菌株及其他辅助性原料按一定方法制成的活菌制剂，按照功能不同广泛应用于食品生产、饲料加工、污水处理等不同领域。

养殖污水：指规模化畜禽养殖产生、排放的污水，通常包含动物尿液、粪便、养殖场冲刷水等不同来源，浓度高，粘度大，含有大量的有机污染物。养殖污水的无害化处理是实现规模化畜禽养殖业绿色可持续发展的关键之一。

粘度：又称为黏度，是流体对流动所表现出的阻力。当流体流动时，一部分在另一部分表面流动受到阻力，就是流体的内摩擦力。

芽孢杆菌：一般指芽孢杆菌属的微生物，革兰氏阳性，能够生成对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。广泛分布于土壤、植物表面、空气及动物肠道等环境中，对外界不良刺激抵抗力强，为兼性厌氧菌，在无氧和有氧环境中均可良好生存。

乳酸菌：乳酸菌不是分类学单位，通常指一类能够发酵糖类产生乳酸的***。乳酸菌在自然界中分布广泛，在医学、工业、农业等不同领域均有良好的应用前景。

菌落形成单位(CFU，Colony-Forming Units)：指通过平板计数法统计得到的单位面积内菌落总数，用来表示活菌总数。

本发明技术方案如下：

一种污水复合微生物处理剂，该处理剂中包括微生物菌体和吸附稳定剂，所述微生物菌体至少含有巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌以及短小乳杆菌，其中：

巨大芽孢杆菌，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

枯草芽孢杆菌，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

植物乳杆菌，活菌数不低于7.5×10⁹CFU/g；

短小乳杆菌，活菌数不低于2.5×10⁹CFU/g。

根据本发明优选的，所述吸附稳定剂组份如下，均为重量份：

海藻糖1～2份、琼脂粉3～6份，脱脂乳粉4～8份。

根据本发明进一步优选的，所述吸附稳定剂组份如下，均为重量份：

海藻糖1份、琼脂粉4份、脱脂乳粉5份。

根据本发明优选的，所述吸附稳定剂占处理剂总质量的质量百分比含量为40％～60％。

根据本发明优选的，所述巨大芽孢杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC 14945或ATCC 11562。

根据本发明优选的，所述枯草芽孢杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC 15134，或来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 1.821。

根据本发明优选的，所述植物乳杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC 8014，或来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 1.568。

根据本发明优选的，所述短小乳杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC367或ATCC 13648。

根据本发明优选的，所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌的活菌数之比为(2～4):(2～4):(2～4):(1～2)。

进一步优选，所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌的活菌数之比为4:4:3:1。

根据本发明优选的，所述微生物菌体为经过养殖污水驯化的微生物菌体。

上述污水复合微生物处理剂的制备方法，该制备方法包括：

(1)将巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌以及短小乳杆菌分别经活化培养、摇瓶震荡培养、种子培养和发酵培养，制得各活菌发酵液；

所述巨大芽孢杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液的活菌浓度为2.0～3.0×10⁹CFU/mL；

所述植物乳杆菌发酵液、短小乳杆菌发酵液的活菌浓度为1.0～2.0×10⁹CFU/mL；

(2)将巨大芽孢杆菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌发酵液和短小乳杆菌发酵液混合，制得混合菌液；向混合菌液中加入吸附稳定剂，经固液分离、干燥，制得复合微生物处理剂。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养条件如下：

活化培养条件均为：37℃静止培养24小时，活化培养的培养基为LB固体培养基；

摇瓶震荡培养条件均为：37℃、转速180r/min条件下培养24小时，摇瓶培养的培养基为LB液体培养基；

种子培养条件均为：37℃、转速180r/min条件下培养24小时，种子培养的培养基为LB液体培养基；

发酵培养条件均为：37℃、转速180r/min条件下培养24小时，发酵培养的培养基为添加质量百分比为2％葡萄糖的LB液体培养基。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中植物乳杆菌和短小乳杆菌的培养条件如下：

活化培养条件均为：30℃静止培养24小时，活化培养的培养基为MRS固体培养基；

三角瓶静止培养条件均为：30℃静止培养24小时，三角瓶静止培养的培养基为MRS液体培养基；

种子培养条件均为：30℃静止培养24小时，种子培养的培养基为MRS液体培养基；

发酵培养条件均为：30℃静止培养24小时，发酵培养的培养基为添加质量百分比为1％葡萄糖的MRS液体培养基。

根据本发明优选的，所述制备混合菌液前，还包括驯化步骤：

(i)取养殖污水，固液分离，取液体；灭菌，固液分离，获得灭菌污水；

(ii)将巨大芽孢杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液分别与步骤(i)中的灭菌污水分别按体积比1:(2～6)的比例混合，37℃条件下好氧培养24小时；固液分离，分别收集巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌体；

将植物乳杆菌、短小乳杆菌发酵液与步骤(i)中的灭菌污水分别按体积比1:(2～6)的比例混合，37℃条件下厌氧培养24小时；固液分离，收集植物乳杆菌和短小乳杆菌菌体；

(iii)将湿菌体与蒸馏水按质量体积比1:(20～25)的比例混合，单位g/ml，震荡重悬。

根据本发明进一步优选的，上述固液分离均为采用5000～7000g/min条件下离心15～20min。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的吸附稳定剂由海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉按比例混合后，灭菌制得。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的固液分离为低温固液分离；干燥为低温干燥。

上述污水复合微生物处理剂在降低高浓度养殖污水粘度中的应用。

根据本发明优选的，所述高浓度养殖污水为奶牛场养殖污水、生猪养殖场污水和/或肉牛养殖场污水。

本发明的作用原理：

养殖污水成分复杂，其中混杂有动物粪便、饲料、动物毛发等物质，造成固形物含量高、粘度大问题。虽然增加沉淀步骤可以削减一部分污水中的固形物，但是污水粘度难以有效降低。养殖污水中富含多糖、蛋白质、丝状纤维等成分，这些物质混合在一起形成彼此交联的胶体，增大了污水的粘度，给后续处理步骤增加了难度。

巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌具有很强的胞外及胞内蛋白酶、β-葡萄糖苷酶等酶活性，可快速降解污水中的多糖、蛋白质、丝状纤维等成分，从而打破胶体结构，有效降低养殖污水粘度；巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌经灭菌养殖污水前期培养、有效驯化后，在高盐度、高有机成分、高氨氮含量的养殖污水中能够良好生存生长，保持高菌群浓度，可有效发挥其降低污水粘度的作用。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：

1.使用效果好。本发明的一种污水复合微生物处理剂，使用后能够显著降低高浓度养殖污水的粘度。污水经本处理剂处理一段时间以后，粘度降低可达60～95％以上；污水粘度的降低，显著减小了后续处理步骤中管路堵塞、流动不畅的风险，提高了污水处理效率；并且本发明的四种菌之间的竞争抑制作用不显著，而四种菌各自产生的胞外酶对降低粘度具有叠加增效的效果；

2.应用范围广。本发明一种污水复合微生物处理剂，适合各种不同养殖类型的规模化养殖场，如规模化奶牛养殖场、规模化肉牛养殖场、规模化生猪养殖场等，也可与目前使用的多种养殖污水处理工艺相契合，如生态湿地法、好氧曝气法、厌氧沼气法等不同污水处理工艺，提高污水处理效率，降低成本；

3.产品有效期久。本发明制备的一种污水复合微生物处理剂添加了海藻糖、琼脂粉和脱脂乳粉，易于储存运输，有效活菌数保持时间长，其初始活菌数高达2.5～3.5×10¹⁰CFU/g，常温储存24个月后，活菌数仍大于1.5×10¹⁰CFU/g，且活性芽孢杆菌/活性乳酸菌比例能够维持初始比例，仍可正常使用；菌粉产品可常温保存、运输，无特殊低温要求；

4.制备工艺简捷。本发明制备的一种污水复合微生物处理剂制备方法简单，所采用技术均为微生物学和环境工程常用技术，所使用设备也为常见微生物发酵设备，易于推广；

5.符合绿色环保的要求。本发明制备的一种污水复合微生物处理剂为活性微生物制剂，来源微生物安全、无毒，产品中不含有毒有害化学物质，不会造成二次污染。本品使用量较小，每立方米养殖污水中仅需要加入80～160g菌剂即可达到良好处理效果。菌剂为一次加入，不必反复添加，方法易于掌握；相对于化学絮凝法等方法，降低了成本，更符合绿色环保的要求。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 14945；或巨大芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 11562。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 15134；或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CGMCC 1.821。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 8014；或植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CGMCC 1.568。

短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 367；或短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号：ATCC 13648。

培养基

LB固体培养基，每升组份如下：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂20g，pH自然，水定容至1L。

LB液体培养基，每升组份如下：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH自然，水定容至1L。

MRS固体培养基，每升组分如下：

葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏10g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钾1.63g，乙酸钾2.25g,七水硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL，115℃灭菌30min；

MRS液体培养基，每升组分如下：

葡萄糖20g，胰蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏10g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠3.12g，磷酸氢二钾1.63g，乙酸钾2.25g,七水硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，Tween-80 1mL，蒸馏水定容至1000mL，115℃灭菌30min；

实施例1

一种污水复合微生物处理剂，含有：

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)ATCC 14945，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 15134，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC 8014，活菌数不低于7.5×10⁹CFU/g；

短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)ATCC 367，活菌数不低于2.5×10⁹CFU/g；

且所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌的活菌数之比为4:4:3:1。

本发明的微生物处理剂还包括吸附稳定剂，吸附稳定剂的质量百分含量为50％，吸附稳定剂由如下重量份的组分构成：

海藻糖1份、琼脂粉4份、脱脂乳粉5份。

上述可降低高浓度养殖污水粘度的复合微生物处理剂的制备方法，步骤如下：

(1)将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)接种于LB固体培养基，在37℃静止活化培养24小时，然后转接至LB液体培养基，37℃、转速180r/min条件下摇瓶震荡培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至LB液体培养基，37℃、转速180r/min条件下种子培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至发酵培养基(添加质量百分比2％葡萄糖的LB液体培养基)，37℃、转速180r/min条件下发酵培养24小时，制得活菌浓度均为2.5×10⁹CFU/ml的巨大芽孢杆菌发酵液；

将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)接种于LB固体培养基，在37℃静止活化培养24小时，然后转接至LB液体培养基，37℃、转速180r/min条件下摇瓶震荡培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至LB液体培养基，37℃、转速180r/min条件下种子培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至发酵培养基(添加质量百分比2％葡萄糖的LB液体培养基)，37℃、转速180r/min条件下发酵培养24小时，制得活菌浓度均为2.5×10⁹CFU/ml的枯草芽孢杆菌发酵液；

(2)将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)接种于MRS固体培养基，在30℃静止活化培养24小时，然后转接至MRS液体培养基，30℃三角瓶静止培养培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至MRS液体培养基，30℃静止培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至发酵培养基(添加质量百分比1％葡萄糖的MRS液体培养基)，30℃静止发酵培养24小时，制得活菌浓度均为2.5×10⁹CFU/ml的植物乳杆菌发酵液；

将短小乳杆菌(Lactobacillus brevis)接种于MRS固体培养基，在30℃静止活化培养24小时，然后转接至MRS液体培养基，30℃三角瓶静止培养培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至MRS液体培养基，30℃静止培养24小时，然后按体积百分比5％的比例转接至发酵培养基(添加质量百分比1％葡萄糖的MRS液体培养基)，30℃静止发酵培养24小时，制得活菌浓度均为2.5×10⁹CFU/ml的短小乳杆菌发酵液；

(3)取奶牛场高浓度养殖污水，7000g/min条件下离心15min，除去大部分固形物；115℃，30min高温高压灭菌，再次5000g/min条件下离心20min，除去析出的固形物，冷却备用，获得灭菌污水；

(4)将步骤(1)、(2)中的含菌发酵液与步骤(3)中的灭菌污水分别按1:(2～6)的比例混合，37℃条件下培养24小时；5000g/min条件下离心20min，分别收集四种菌的菌体；

(5)将步骤(4)的菌体与蒸馏水按质量体积比1:(20～25)的比例混合，单位g/ml，震荡重悬，获得四种菌的重悬液；

(6)将步骤(5)中制得的巨大芽孢杆菌重悬液、枯草芽孢杆菌重悬液、植物乳杆菌重悬液、短小乳杆菌重悬液按照体积比4：4：2：1的比例混合，制得混合菌液；

(7)向步骤(6)中混合菌液加入吸附稳定剂，经低温固液分离、低温干燥，制得复合微生物处理剂。

所述吸附稳定剂由海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉按比例混合后，灭菌制得。加入吸附稳定剂后，活菌收获率可达97％。

实施例2

如实施例1所述的污水复合微生物处理剂，不同之处在于微生物菌体的选用：

巨大芽孢杆菌Bacillus megateriumATCC 11562，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CGMCC 1.821，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

植物乳杆菌Lactobacillus plantarumCGMCC 1.568，活菌数不低于7.5×10⁹CFU/g；

短小乳杆菌Lactobacillus brevis ATCC 13648，活菌数不低于2.5×10⁹CFU/g。

吸附稳定剂，制备过程等均同实施例1。

实施例3

如实施例1所述的污水复合微生物处理剂，不同之处在于：

所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌的活菌数之比为1:1:1:1。

实施例4

如实施例1所述的污水复合微生物处理剂，不同之处在于：

所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌的活菌数之比为4:4:1:1。

实施例5

如实施例1所述的污水复合微生物处理剂，不同之处在于，所述吸附稳定剂组份如下，均为重量份：

海藻糖2份、琼脂粉3份，脱脂乳粉8份。

实施例6

如实施例1所述的污水复合微生物处理剂，不同之处在于，所述吸附稳定剂组份如下，均为重量份：

海藻糖1份、琼脂粉6份，脱脂乳粉4份。

对比例1

如实施例1所述的复合微生物处理剂，不同之处在于，将巨大芽孢杆菌替换为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，处理剂具体含有如下菌株：

地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC 9945，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 15134，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

植物乳杆菌Lactobacillus plantarumATCC 8014，活菌数不低于7.5×10⁹CFU/g；

短小乳杆菌Lactobacillus brevis ATCC 367，活菌数不低于2.5×10⁹CFU/g。

吸附稳定剂，制备过程等均同实施例1。

对比例2

如实施例1所述的复合微生物处理剂，不同之处在于，将植物乳杆菌杆菌替换为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，处理剂含有如下菌株：

巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium ATCC 14945，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 15134，活菌数不低于1.0×10¹⁰CFU/g；

嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus ATCC 4356，活菌数不低于7.5×10⁹CFU/g；

短小乳杆菌Lactobacillus brevis ATCC 367，活菌数不低于2.5×10⁹CFU/g。

吸附稳定剂，制备过程等均同实施例1。

对比例3

如实施例1所述的复合微生物处理剂，不同之处在于，将海藻糖替换为蔗糖。

菌株组成，制备步骤等均同实施例1。

对比例4

如实施例1所述的复合微生物处理剂，不同之处在于，将琼脂粉替换为硅藻土。

菌株组成，制备步骤等均同实施例1。

实验例1

下面以实验例，进一步具体说明本发明所述污水复合微生物处理剂的有益效果，此部分为污水处理效果实验。

取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5、实施例6以及对比例1、对比例2、对比例3和对比例4分别获得的污水复合微生物处理剂，分别以奶牛场高浓度养殖污水、生猪场高浓度养殖污水和肉牛场高浓度养殖污水为实验对象测试其在降低污水粘度方面的效果。

奶牛场高浓度养殖污水、生猪场高浓度养殖污水和肉牛场高浓度养殖污水基本理化性质如表1所示。其中，污水COD(化学需氧量)测定方法按照行业标准《水质化学需氧量的测定重铬酸盐法》(HJ828-2017)；氨氮测定方法按照行业标准《水质氨氮的测定连续流动-水杨酸分光光度法》(HJ665-2013)；总氮测定方法按照行业标准《水质总氮的测定连续流动-盐酸萘乙二胺分光光度法》(HJ667-2013)；粘度测定方法按照国家标准《粘度测量方法》(GBT10247-2008)。

所有数据为三次测定的平均值。

表1实验用养殖污水基本理化性质

实验过程为：

(1)奶牛场高浓度养殖污水降粘度处理实验：

实验分为11组，每组设置3个平行。从奶牛场污水初沉池中取高浓度养殖污水16.5m³，平均分为33份(每份0.5m³)，按照100g/m³(质量体积比)的比例分别投加实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5、实施例6以及对比例1、对比例2、对比例3和对比例4所述的污水复合微生物处理剂，同时，设置对比例5，为以100ml蒸馏水代替微生物处理剂加入污水。混合均匀后，处理温度为25～40℃，处理时间为24h；实验开始和结束时，分别测定污水粘度值，实验结果如表2所示。

(2)生猪场高浓度养殖污水降粘度处理实验：

实验分为11组，每组设置3个平行。从生猪场污水初沉池中取高浓度养殖污水16.5m³，平均分为33份(每份0.5m³)，按照100g/m³(质量体积比)的比例分别投加实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5、实施例6以及对比例1、对比例2、对比例3和对比例4所述的污水复合微生物处理剂，同时，设置对比例5，为以100ml蒸馏水代替微生物处理剂加入污水。混合均匀后，处理温度为25～40℃，处理时间为24h；实验开始和结束时，分别测定污水粘度值，实验结果如表3所示。

(3)肉牛场高浓度养殖污水降粘度处理实验：

实验分为11组，每组设置3个平行。从肉牛场污水初沉池中取高浓度养殖污水16.5m³，平均分为33份(每份0.5m³)，按照100g/m³(质量体积比)的比例分别投加实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5、实施例6以及对比例1、对比例2、对比例3和对比例4所述的污水复合微生物处理剂，同时，设置对比例5，为以100ml蒸馏水代替微生物处理剂加入污水。混合均匀后，处理温度为25～40℃，处理时间为24h；实验开始和结束时，分别测定污水粘度值，实验结果如表4所示。

表2奶牛场高浓度养殖污水降粘度处理实验

注：粘度降低程度(％)＝(处理后粘度-处理前粘度)/处理前粘度×100％

表3生猪场高浓度养殖污水降粘度处理实验

注：粘度降低程度(％)＝(处理后粘度-处理前粘度)/处理前粘度×100％

表4肉牛场高浓度养殖污水降粘度处理实验

注：粘度降低程度(％)＝(处理后粘度-处理前粘度)/处理前粘度×100％

通过以上实验可见，本发明所述的一种污水复合微生物处理剂对奶牛场高浓度养殖污水、生猪场高浓度养殖污水和肉牛场高浓度养殖污水均有良好的降低粘度处理效果：

实验条件下，使用实施例1-6所述的污水复合微生物处理剂处理奶牛场高浓度养殖污水，可使污水粘度分别降低90.0％、90.0％、74.5％、83.5％、83.3％和82.5％，处理效果显著好于对比例1、对比例2、对比例5的14.5％、9.6％、1.1％；特别是巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌按4:4:3:1混合，吸附稳定剂由海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉按1:4:5构成的实施例1、实施例2所述污水复合微生物处理剂，取得的处理效果最优；以生猪场高浓度养殖污水和肉牛场高浓度养殖污水为实验对象，也取得了类似的实验结果。

对比例1-2的污水处理效果实验说明，将巨大芽孢杆菌替换为地衣芽孢杆菌(对比例1)或将植物乳杆菌替换为嗜酸乳杆菌(对比例2)后，处理剂的污水处理效果大大降低。说明由巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌组成的本复合微生物处理剂，才能有效起到降低养殖污水粘度的效果。

而对比例3、对比例4，当吸附稳定剂中把海藻糖替换为蔗糖(对比例3)，或把琼脂粉替换为硅藻土(对比例4)时，处理效果比实施例1和实施例2略差，则进一步说明吸附稳定剂的选择对于降粘度效果也有一定影响。

以上实验说明本发明所述的一种污水复合微生物处理剂所含的巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌在特定菌群比例、吸附稳定剂的条件下，能够通过分泌蛋白酶、多糖酶、纤维素酶等活性，高效分解污水中的蛋白质、多糖、丝状纤维等，且各菌株之间竞争抑制作用较弱，可协同作用，从而发挥良好的降低高浓度养殖污水粘度的效果；而若改变处理剂所含活性微生物种类和改变吸附稳定剂种类构成，则由于菌株间较强的竞争抑制作用等原因，导致处理效果相对较差。

实验例2

此部分测试本发明的吸附稳定剂对于维持菌剂微生物活性、特定比例的有益效果。

对于实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5、实施例6以及对比例1、对比例2、对比例3和对比例4分别获得的污水复合微生物处理剂，在制备完成后，立即测定其总活菌密度、初始活性芽孢杆菌密度及初始活性乳酸菌密度；各菌剂在常温条件下，于实验室中储存24个月。然后分别测定总活菌密度、初始活性芽孢杆菌密度及初始活性乳酸菌密度；同时按照实施例所述的方法，制备巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌混合干粉，不添加任何吸附保护剂，作为对比例6，测定其刚制备完成和储存24个月后的活菌数据。

活性菌株测定方法如下所述：

(1)活性芽孢杆菌密度测定：

无菌条件下分别取污水复合微生物处理剂，以无菌蒸馏水进行梯度稀释，取合适的梯度稀释液涂布LB固体平板，放入恒温培养箱，培养温度为37℃，培养24小时，统计菌落数量，即得芽孢杆菌活菌数。

(2)活性乳酸菌密度测定：

无菌条件下分别取污水复合微生物处理剂，以无菌蒸馏水进行梯度稀释，取合适的梯度稀释液涂布MRS固体培养基(额外添加0.5％碳酸钙)平板，放入厌氧手套箱，培养温度为37℃，在无氧条件下培养24小时，统计形成透明圈的菌落，即得乳酸菌活菌数。

(3)总活菌密度测定：

上述芽孢杆菌活菌数与乳酸菌活菌数相加，即得污水复合微生物处理剂总活菌数。

所有数据为三次测定的平均值，结果如表5所述。

表5

通过污水复合微生物处理剂长期储存实验，可以发现，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和实施例5、实施例6以及对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例6制得的污水复合微生物处理剂所含初始总活菌数均可达3.0×10¹⁰CFU/g左右，但常温储存24个月后，各实验组总活菌数及活性芽孢杆菌/活性乳酸菌比例可能会发生较大变化。

使用由海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉按1:4:5组成的吸附稳定剂时，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4所述的污水复合微生物处理剂经24个月储存后，总活菌数仍可达1.5×10¹⁰CFU/g左右，且活性芽孢杆菌/活性乳酸菌比例能够维持菌剂初始比例。足够的总活菌数和合适的活性芽孢杆菌/活性乳酸菌比例能够确保其发挥降低污水粘度的活性作用；而吸附保护剂中海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉的比例变为2:3:8(实施例5)或1:6:4(实施例6)时，经24个月储存，总活菌数分别为1.3×10¹⁰CFU/g和1.2×10¹⁰左右，活性芽孢杆菌/活性乳酸菌比例则由2:1变为4:1和10:3，总活菌数相对于实施例1-4有所降低，活性芽孢杆菌/活性乳酸菌也相对于起始状态发生较大变化，说明了海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉按1:4:5混合，是较为合适的吸附稳定剂比例。

对比例1、对比例2中，经24个月储存后，总活菌数也仍可达1.5×10¹⁰CFU/g，且性芽孢杆菌/活性乳酸菌比例亦能维持菌剂初始比例，说明由海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉按1:4:5组成的吸附稳定剂对于其他种类的芽孢杆菌、乳酸菌也具有突出的活性保护作用。

而对比例3、对比例4及对比例6，当吸附稳定剂中把海藻糖替换为蔗糖(对比例3)，或把琼脂粉替换为硅藻土(对比例4)时，或者不采用任何吸附稳定剂(对比例6)时，经24个月储存总活菌数分别下降为5.0×10⁸CFU/g、5.0×10⁸CFU/g和2.0×10⁸CFU/g，仅分别相当于初始室的1.67％、1.67％和0.67％，且乳酸菌已全部死亡，已完全丧失使用价值。

本实验说明由海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉(1:4:5)组成的吸附稳定剂，可以有效保护菌剂微生物的存活及特定比例具有相应的技术效果，若替换为其他类似成分，将会严重影响微生物活性和有效活菌比例。

Claims (13)

1.一种污水复合微生物处理剂，其特征在于，该处理剂中包括微生物菌体和吸附稳定剂，所述吸附稳定剂占处理剂总质量的质量百分比含量为40%～60%；所述微生物菌体由巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌以及短小乳杆菌组成，其中：

巨大芽孢杆菌，活菌数不低于1.0×10¹⁰ CFU/g；所述巨大芽孢杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC 14945或ATCC 11562；

枯草芽孢杆菌，活菌数不低于1.0×10¹⁰ CFU/g；所述枯草芽孢杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC 15134，或来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 1.821；

植物乳杆菌，活菌数不低于7.5×10⁹ CFU/g；所述植物乳杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC 8014，或来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CGMCC 1.568；

短小乳杆菌，活菌数不低于2.5×10⁹ CFU/g；所述短小乳杆菌来源于美国典型培养物保藏中心，菌种编号为ATCC367或ATCC 13648；

所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌的活菌数之比为（2～4）:（2～4）:（2～4）:（1～2）；

所述吸附稳定剂组份如下，均为重量份：

海藻糖1～2份、琼脂粉3～6份，脱脂乳粉4～8份。

2.如权利要求1所述的污水复合微生物处理剂，其特征在于，所述吸附稳定剂组份如下，均为重量份：

海藻糖1份、琼脂粉4份、脱脂乳粉5份。

3.如权利要求1所述的污水复合微生物处理剂，其特征在于，所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、短小乳杆菌的活菌数之比为4:4:3:1。

4.如权利要求1所述的污水复合微生物处理剂，其特征在于，所述微生物菌体为经过养殖污水驯化的微生物菌体。

5.权利要求1所述污水复合微生物处理剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：

（1）将巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌以及短小乳杆菌分别经活化培养、摇瓶震荡培养、种子培养和发酵培养，制得各活菌发酵液；

所述巨大芽孢杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液的活菌浓度为2.0～3.0×10⁹ CFU/mL；

所述植物乳杆菌发酵液、短小乳杆菌发酵液的活菌浓度为1.0～2.0×10⁹ CFU/mL；

（2）将巨大芽孢杆菌发酵液、枯草芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌发酵液和短小乳杆菌发酵液混合，制得混合菌液；向混合菌液中加入吸附稳定剂，经固液分离、干燥，制得复合微生物处理剂。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的培养条件如下：

活化培养条件均为：37℃静止培养24小时，活化培养的培养基为LB固体培养基；

摇瓶震荡培养条件均为：37℃、转速180r/min条件下培养24小时，摇瓶培养的培养基为LB液体培养基；

种子培养条件均为：37℃、转速180r/min条件下培养24小时，种子培养的培养基为LB液体培养基；

发酵培养条件均为：37℃、转速180r/min条件下培养24小时，发酵培养的培养基为添加质量百分比为2 %葡萄糖的LB液体培养基。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中植物乳杆菌和短小乳杆菌的培养条件如下：

活化培养条件均为：30℃静止培养24小时，活化培养的培养基为MRS固体培养基；

三角瓶静止培养条件均为：30℃静止培养24小时，三角瓶静止培养的培养基为MRS液体培养基；

种子培养条件均为：30℃静止培养24小时，种子培养的培养基为MRS液体培养基；

发酵培养条件均为：30℃静止培养24小时，发酵培养的培养基为添加质量百分比为1 %葡萄糖的MRS液体培养基。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，制备混合菌液前，还包括驯化步骤：

（i）取养殖污水，固液分离，取液体；灭菌，固液分离，获得灭菌污水；

（ii）将巨大芽孢杆菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液分别与步骤（i）中的灭菌污水分别按体积比1:（2～6）的比例混合，37℃条件下好氧培养24小时；固液分离，分别收集巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌体；

将植物乳杆菌、短小乳杆菌发酵液与步骤（i）中的灭菌污水分别按体积比1: （2～6）的比例混合，37℃条件下厌氧培养24小时；固液分离，收集植物乳杆菌和短小乳杆菌菌体；

（iii）将湿菌体与蒸馏水按质量体积比1 :（20～25）的比例混合，单位g/ml，震荡重悬。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（i）中，固液分离均为采用5000～7000 g/min条件下离心15～20 min。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的吸附稳定剂由海藻糖、琼脂粉、脱脂乳粉按比例混合后，灭菌制得。

11.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的固液分离为低温固液分离；干燥为低温干燥。

12.权利要求1所述污水复合微生物处理剂在降低养殖污水粘度中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述养殖污水为奶牛场养殖污水、生猪养殖场污水和/或肉牛养殖场污水。